EXTRA ANFORDERUNG. Apoptose

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1 Apoptose Einleitung (Bild 0) Organismen entwickeln sich aus einer einzelnen Zelle und bilden eine komplexe Anatomy dabei. Dieser Prozess beinhaltet nicht nur die Bildung neuer Zellen, sondern auch die Entfernung der Zellen, die nicht mehr gebraucht werden.ausgewachsene Organismen müssen auch ihre alten und fehlfunktionieren de Zellen entsorgen, um den Ersatz zu ermöglichen. Zusätzlich begehen virale infizierte Zellen Selbstmord, um einer Ausbreitung zuvorzukommen. Apoptose ist der Hauptmechanismus bei dem Zellen physiologisch beseitigt werden. Während apoptotischem Zelltod werden Zellen auf kleinste Stücke durch sog. Caspasen zerteilt, diese nennt man apoptotic bodies. Der Sinn dahinter ist eine Vermeidung von Immunisierung gegen körpereigene Substanzen. Sobald der Zelltod vollendet wurde, müssen die Überbleibsel durch Macrophagen beseitigt werden. Es gibt zwei Hauptsignalwege, die die Apoptose kontollieren: den intrinsischen Weg (mitochondrial gestartet) und den extrinsischen Weg (Todesrezeptor, über die Zellmembran). Apoptotische Signalwege (Bild 3) (1) Der intrinsische Weg wird durch innere Überwachungsmechanismen oder gesendete/ nichtgesendete Signale andere Zellen aktiviert. (1a) Signale, die diesen Weg induzieren beinhalten DNA Schäden, Aussetzung zu bestimmten Chemikalien, die mit verschiedenen zellulären Signalwegen interferieren, exzessive Aktivierung von Faktoren, die Zellzyklus Progression fördern, und Erhalt von bestimmten pro-apoptotischen Signalen aus der näheren Umgebung. (1b) Nährstoffmangel Steuersignale der Umgebung aktivieren den intrinsischen Weg. Überlebensfaktoren einschließlich interleukin-2 und interleukin-3, welche für das Überleben von Thymozyten essenziell sind; nerve growth factor, welcher für das Überleben vieler Neuronen von Bedeutung ist, und extrazelluläre Matrix, welche für das Überleben von Epithelzellen essenziell ist. Signale, die den intrinsischen Weg auslösen, konvergieren auf den Mitochondrien, die Schlüsselfaktoren zur Apoptose liefern. Mitochondrien integrieren das Schicksal einer Zelle Leben oder Tod. (2) Signale von anderen Zellen sind die primären Auslöser des extrinsischen Signalwegs. Direkter Kontakt mit der Zielzelle aktiviert spezifische Rezeptoren, die diesen Weg initiieren. Aktivierung des extrinsischen Wegs ist eine Strategie, die zytotoxische T Zellen verwenden, um Zellen zu töten, die als fremd erkannt wurden oder ein Pathogen enthalten. Dieser Weg wird auch weitverbreitet genutzt, um Zellpopulationen im Immunsystem zu kontrollieren. Programmierter Zelltod (Apoptose und Autophagie) gegenüber akzidentellen Zelltod (Nekrose) Es gibt viele verschiedene beobachtbare morphologische und biochemische Unterschiede zwischen Apoptose und Nekrose (Bild1). (1) Nekrose (Bild 1) entsteht, wenn Zellen extremen Veränderungen physiologischer Bedingungen ausgesetzt sind (z.b., Hypothermie, Hypoxie) was zum membranschaden führt. Unter physiologischen Bedingungen kann direkter Schaden an der Plasmamembran durch Komplement oder Viren ausgelöst werden. Necrose beginnt mit Einschränkung der Zellfähigkeit Homeostase zu erhalten, was zu Wasser- und Elektrolyteintritt führt. Intrazelluläre Organellen, besonders Mitochondrien, und die gesamte Zelle schwellen an und werden letztendlich gesprengt (Zelllyse). Aufgrund des ultimativen Abbaus der Plasmamembran gelangen der zytoplasmische Inhalt samt lysosomalen Enzymen in die extrazelluläre Matrix. Daher in vivo tritt nekrotischer Zelltod oft mit extensiven Gewebeschaden auf, was in intensive Entzündung resultiert. Lange galt Nekrose als eine unorganisierte Form von Zelltod. Dioch wurde kürzlich diese Sicht modifiziert Nekrose als alternative Form von Zelltod um bewuust eine Entzündingsreaktion auszulösen (!). APOPTOSIS oldal 1

2 (2) Apoptose dagegen ist ein Zelltod Modus, der unter normalen phsiologischen Bedingungen stattfindet und die Zelle ist ein aktiver Teilnehmer am Untergang. Man trifft diese am häufigsten während normaler Zelldurchsatz und Gewebeerhalts an, darüberhinaus bei Embryogenese, Induktion und Erhalt der Immuntoleranz, Entwicklung im Nervensystem und endokrine Gewebeatrophie. Zellen, die Apoptose begehen, zeigen charakteristische morphologische und bochemische Veränderungen. Dieses beinhaltet Chromatin Aggregation, nukleare und zytoplasmische Kondensation, Partition von Zytoplasma und Nukleus in membrangebundene Vesikel (apoptotic bodies) welche Ribosome, morphologische intakte Mitochondrien und nukleares Material beinhalten. Diese apoptotic bodies werden schnell erkannt und anschließend phagozytiert, entweder durch Makrozyten oder anliegende Epithelzellen. Durch diesen effizienten Mechanismus zur Zellentfernung in vivo, kann eine Entzündungsreaktion verhindert werden. Aktivität die zur Apoptose einer Zelle führt wird als pro-apoptotisch bezeichnet; Aktivitäten, die eine Zelle vor Apoptose bewahren, nennt man anti-apoptotisch. (3) Autophagie resultiert in totaler Zerstörung der Zelle und ist ein andere Typ von programmiertem Zelltod; doch existiert noch kein absoluter Beweis für diesen Prozess. Autophagie ist der Prozess, der den Abbau der zelleigenen Komponenten durch lysosomale Mechanismen umfasst. Eine Variante von autophagen Prozessen existiert. Der bekannteste Mechanismus beeinhaltet die Bildung einer Membran um die Zielregion der Zelle, separiert die Zellbestandteile vom Rest des Zytoplasma. Das entstehende Vesikel fusioniert dann mit einem Lysosom und wird anschließend abgebaut. Zellklassen, die programmierten Zelltod begehen Mindestens fünf Zellklassen gehöhren dazu: (1) sich entwickelnde Zellen mit Defekt; (2) überflüssige Zellen; (3) Zellen, die keine Funktion mehr haben; (4) Zellen, deren Zellzyklus gestört ist; und (5) virusinfizierte Zellen. (I.) Der mitochondriale (intrinsische) Signalweg (Bild 3) zur Kontrolle der Apoptose involviert die Mitochondrien der Zelle. Dieses Organell ist instrumental im normalen zellulären Metabolismus als Hauptproduktionsstelle von ATP. Doch gibt es neben dieser wichtigen Aufgabe noch eine Sensor Funktion der zellulären Gesundheit. Mit anderen Worten Mitochondrien tragen einen grossen Teil zum Überleben oder Absterben einer Zelle bei. Wenn eine Zelle eine Beschädigung erfährt und diese nicht zu reparieren ist, lösen Mitochondrien Apoptose aus. Durch DNA Schäden, Topoisomerase Inhibition, zytoplasmischen Stress und viele andere Stimuli,werden Mitochondrien durchlässig und schütten viele Proteine ins Zytoplasma aus. Die Durchlässigkeits bildung wird durch die Bcl-2 Proteinfamilie vermittelt. Caspasen (Bild 4) Die Hauptteilnehmer in der Apoptose sind die Caspasen, welche das Schrumpfen der Zelle, DNA Fragmentierung und andere Veränderungen vermitteln. Diese Moleküle sind allerdings auch an anderen Zellfunktionen beteiligt. Caspasen sind Cystein Proteasen, was bedeutet, dass diese Cycteinreste an ihren aktiven Stellen besitzen. Es gibt 14 bekannte Caspasen in Säugetieren, 11 davon wurden im Menschen gefunden. Die Aktivierung der Caspasen ist selbst eine proteolytische Spaltung; eine Caspase kann eine andere Caspase spalten und somit aktivieren, was zur Aktivierung der Caspasen Kaskade führt. Deshalb werden inaktive Caspasen, die nicht gespalten wurden, als Pro-Caspasen bezeichnet. Die erste Spaltung ist eine autokatalytische, in der die Caspase sich selbst spaltet und sich aktiviert. Das führt zu einer anderen Klassifizierung der Caspasen, entweder als Initiator caspasen oder Effektor caspasen. Die Initiator Caspasen können zu Beginn einer Caskade stehen, wogegen sich Effektor Caspasen downstream im Signalweg befinden. Permeabilisierung der Mitochondrien durch Bcl-2 Proteine ermöglicht den Ausfluss von vielen Proteinen, einschließlich Zytochrom C (Cyt C). Die Ausschüttung von Zytochrom C hat zwei Effekte. Erstens, es kann als Signalmolekül in der Apoptose agieren und zweitens, es kann nicht mehr in der Atmungskette funktionieren, sodass die ATP Produktion eingeschränkt wird. (Bild ) Die freien Zytochrome binden an Apaf-1 und Procaspase 9, was in die Aktivierung von Caspase 9 resultiert, die wiederum Caspase 3 aktiviert. APOPTOSIS oldal 2

3 Bcl-2 proteine (Bild 5) können in drei Gruppen eingeteilt werden. (1) Bcl-2 Protektoren (z.b. Bcl-2 und Bcl-X L ) beschützen die Zelle vor Apoptose. (2) Bcl-2 Killer (z.b. Bax und Bak) sind pro-apoptotische Proteine, die aktiv Zellen töten. (3) Bcl-2 Regulatoren (z.b. Bad, Bid) förden Zell Tötung durch entweder Beeinflussung von Protektoren oder Aktivierung von Killerns. Diese Proteine regulieren primär die Ausschüttung von Tod-fördernden Faktoren von Mitochondrien, wenn Zellen Signale erhalten, die den intrinsischen Weg aktivieren. Bcl-2 Familienmitglieder sind definiert durch das Vorhandensein von ein bis vier kurzen Blöcken von konservierten Proteinsequenzen, genannt BH domains (Bcl-2 homology domains). Die Rolle von Zytochrom c als Redoxprotein in Mitochondrien wurde vor vielen Jahren bestätigt und man könnte sagen, dass es ein sehr gut beschriebenes Protein ist. Hingegen scheint sich die Aufgabe in der Apoptose doch sehr zu unterscheinden von der Redoxrolle. Das veranschaulicht eine weite Bandbreite an Proteinen in der Signaltransduktion involviert sind, sogar solche, bei denen noch keine Funktion bekannt ist. Diese multifaktorielle Rolle der Proteine wird in der Zukunft noch häufiger beschrieben, weil andauernd neue Funktionen zu einem bekannten Protein veröffentlicht werden. Nucleasen in Apoptose Während der Apoptose wird die chromosolmale DNA zerstört. Die vielen an der Apoptose beteiligten Nukleasen fallen in zwei Kategorien. (1) Zell autonome Nukleasen degradieren die DNA von innen der sterbenden Zelle. Die bekannteste ist die caspase-activated DNase (CAD). CAD ist normalerweise im Komplex mit ICAD (inhibitor of CAD). ICAD ist eine Chaperon, das für CAD vorhanden sein muss, damit es in die aktive Konformation während der Translation im Ribosom gefaltet werden kann. Allerdings kann ICAD auch die Nukleaseaktivität von CAD hemmen. Diese Dualfunktion von ICAD garantiert, dass nur inaktives CAD in gesunden Zellen produzier werden kann. Während der Apoptose spaltet Caspase 3 ICAD und entlässt aktive CAD Nuklease. Zell autonome Nukleasen sind entbehrlich für Apoptose und Leben der Zelle. (2) Waste management nucleases bereiningen den Abfall nachdem die Zelle abgestorben ist. Diese funktionieren entweder innerhalb Lysosomen der Phagozyten oder werden sezerniert un funktionieren in der extrazellulären Matrix. DNase II, eine der wichtigsten waste management nucleasen, ist essenziell für Leben. Mausembryos, die dieses Enzym fehlt, werden von der anfallenden DNA überladen und sterben. Regulation der Apoptose durch Bcl-2 Proteine (Bild 6) (A) In der Abwesenheit eines apoptotischen Stimulus binden und hemmen anti-apoptotische Bcl-2 Proteine das BH123 Protein auf der äußeren mitochondrien Membran (und im Zytosol). (B) In Gegenwart von einem apoptotischen Stimulus werden BH-3 only Proteine aktiviert und binden an anti-apoptotische Bcl-2 Proteine, sodass diese nicht länger BH123 Proteine hemmen können. Diese werden nunaktiv und sammeln sich in der äußeren mitochondrien Membran und fördern die Ausschüttung von intermembrnären mitochondiralen Proteinen ins Zytosol. Einige aktivierte BH3-only Proteine können mitochondriale Ausschüttung direkt stimulieren, in dem diese BH123 binden und aktivieren. Aufgaben von IAPs und anti-iaps in Apoptose (Bild 7) (A) In Abwesenheit eines apoptotischen Stimulus verhindern IAPs versehentliche Apoptose, die durch spontane Aktivierung von Procaspasen geschieht. Die IAPs sind im Zytosol lokalisiert und binden an und hemmen jede spontane Caspase. Einige IAPs sind auch Ubiquitin Ligasen, die die zum Abbau in Proteasomen bestimmten Caspasen markieren. (B) Wenn ein apoptotischer Stimulus den intrinsischen Weg aktiviert, sind unter den freigesetzten Proteinen des mitochondrialen intermembranären Raums anti-iaps, die an IAPs binden und deren hemmende Aktivität blockieren. Zur gleichen Zeit löst das freigesetzte Zytochrom c den Aufbau des Apoptosoms aus, das nun eine Caspase Kaskade aktivieren kann und somit die Apoptose auslöst. APOPTOSIS oldal 3

4 Caspase Inhibitoren und Aktivatoren (Bild 8) Weil die meisten gesunden Zellen Initiator Procaspasen exprimieren, mit dem Potenzial unabsichtlich zu oligomerisieren, ist es wichtig einen Mechanismus zu haben, der diese Störungen in pro-apoptotischen Wegen abfangen kann. Der Initiator der Apoptose Proteine (IAP) inaktiviert Caspasen über zwei Wege. Erstens, bindendiese die Caspase und dringen ins aktive Zentrum, sodass der Zugang zum Substrat blockiert wird. Zweitens, verschieden IAPs sind ebenfalls Ubiquitin Ligasen, die Caspasen für den Abbau durch Proteasome markieren. Wenn IAP Proteine Caspasen inaktivieren, wie ist es dann möglich, dass das apoptotische Signal jemals ausgeführt werden kann? Zellen exprimieren auch ein Antidot für die IAPs. Dieses Protein auch als second mitochondrial activator of caspases (smac or DIABLO) bekannt, ist normalerweise in den Mitochondrien eingeschlossen. Es wird freigesetzt, wenn der intrinsische Signalweg initiiert wurde. Der ER Stress (Bild 9) In Ruhebedingungen werden die pro-apoptotischen Bax und Bak (Bax/Bak) inaktiv gehalten und zwar durch Interaktion mit BCL2 beiderseits auf mitochondrialen und endoplasmischen Reticulum (ER) Membranen, wohingegen Bim (BH3) durch Bindung von zytosolischem Dynein gehemmt wird. Schwerer ER Stress führt zur Aktivierung von c-jun N- terminaler Kinase (JNK) und Induktion von C/EBP homologous protein (CHOP; Initiationsphase). Beide JNK und CHOP eliminieren den anti-apoptotischen Effekt von BCL2; CHOP blockiert die Expression von BCL2, wohingegen JNK es phosphoryliert. JNK phosphoryliert auch Bim, was zur Ausschüttung vom Zytoskelett führt und die eigene Aktivierung nach sich zieht (commitment phase). Zusammengenommen erlauben diese Veränderungen die Aktivierung von Bax und Bak, die Transmission vom Signal des ER zu den Mitochondrien und die Ausführung des Absterbens (execution phase). Caspasen werden vermutlich selbst auf der ER Membran aktiviert, abder auch im Apoptosom, nachdem die Transmission des Todessignals zu den Mitochondrien gesendet wurde und die Ausschüttung von Zytochrome c erfolgt ist. Blaue Bezeichnungen zeigen inaktive Moleküle, wogegen rote Bezeichnungen aktive Moleküle indizieren. Die runden Formen repräsentieren proapoptotische Moleküle und rechteckige anti-apoptotische Moleküle. ATF6, activating transcription factor 6; IRE1, inositol-requiring enzyme 1; PERK, pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase; TRAF2, TNF-receptor-associated factor 2; UP, uniporter. (II.) Der Todesrezeptor Signalweg (extrinsisch) (Bild 10) wird aktiviert durch Bindung von Fas oder TRAIL Liganden an ihre Todesrezeptoren (DR4 or DR5), das stimuliert Rezeptor Aggregation. Diese Aggregation stimuliert Rekrutierung von FADD und Caspase (casp) 8 Aktivierung. Casp 8 Aktivierung führt zu casp 3 Spaltung, was multiple proapoptotische Prozesse initiiert, einschließlich CAD Stimulation von DNA Spaltung. Granzyme sind Serin Proteasen, die durch zytoplasmische Granula von T Zellen und natürlichen Killerzellen ausgeschüttet werden. Ihre Funktion besteht in der Induktion von Apoptose in Virusinfizierten Zellen. Granzyme spalten Caspasen (besonders caspase-3), welche abermals caspaseactivated Dnase aktivieren. Dieses Enzym baut DNA ab und induziert somit die apoptotische Kaskade. Todesrezeptor Signale : Todesrezeptoren sind Zelloberflächenrezeptoren, die apoptotische Signale übertragen, die durch spezifische Liganden wie Fas, TNFα und TRAIL ausgelöst wurden. Diese spielen eine wichtige Rolle in derapoptose und können Caspase Kaskaden innerhalb weniger Sekunden auslösen. Induktion von Apoptose über diesen Mechanismus läuft daher sehr schnell ab. Obwohl es Unterschiede in den Signalwegen gibt, die durch verschiedene Todesrezeptoren ausgelöst wurden, ist es möglich einen allgemeinen Apoptose Signalweg zu beschreiben. Binden des Todessignal induzierenden Liganden kann zur Fusion von Lipid rafts führen, welches in Clustern von Todesrezeptoren resultiert. Die massive Ansammlung von Todesrezeptoren hilft das Signal zu amplifizieren. Wenn Rezeptor Cluster ausbleiden, sind manche Zellen dennoch in der Lage Apoptose auszuführen, wie z.b. Lymphozyten, doch in den meisten Fällen wird eine Amplifizierung APOPTOSIS oldal 4

5 des Signals benötigt. Nach erfolgter Liganden Bindung findet ein Konformationswechsel in den interzellulären Domänen der Rezeptoren statt, was die Todesdomänen freilegt und die Rekrutierung von verschiedenen apoptotischen Proteinen startet. Dieser Proteinkomplex wird oft DISC (Death Inducing Signaling Complex) genannt. Der letzte Schritt in diesem Prozess ist die Rekrutierung einer der Caspasen, typischerweise Caspase 8, an DISC. Das resultiert in Aktivierung von Caspase 8 und in die Intiierung der Apoptose. Signaltransmission durch den Fas Rezeptor ist etwas simpler als durch den TNF Rezeptor. Das Apapterprotein FADD kann direkt an die Todesdomäne des Fas Rezeptoers rekrutiert werden, ohnevorige Rekrutierung von TRADD. Im übrigen ist der Fas Rezeptor nur für Apoptose Aktivierung und für keine andere Funktion zuständig. Die Antwort auf den extrinsischen Weg kann durch Interaktion mit dem intrinsischen Weg verstärkt werden. (Details in Bild 11). TNF Rezeptor Signale TNF wird produziert von T-Zellen und aktiviert Macrophagen wenn eine Infektion vorliegt. Durch Aktivierung des Rezeptors, TNFR1, kann TNF verschiedene Effekte haben. In einigen führt es zur Aktivierung von NF-kB und AP-1 welche in der Induktion vieler verschiedener Gene resultiert. In einigen Zellen kann dagegen TNF auch Apoptose einleiten, obwohl Rezeptor Bindung selten ausreicht, um alleine Apoptose zu starten, wie im Fall mit Fas Rezeptor Bindung. Bindung von TNF alpha an TNFR1 resultiert in Rezeptor Trimerisierung und Cluster-Bildung von intrazellulären Todesdomänen. Das erlaubt die Bindung eines intrazellulären Adaptermoleküls, genannt TRADD (TNFR-associated death domain) über Interaktionen zwischen den Todesdomänen. TRADD hat die Fähigkeit eine Reihe von verschiedenen Proteinen zum aktivierten Rezeptor hin zu rekrutieren. Rekrutierung von TRAF2 (TNF-associated factor 2) kann zur Aktivierung von z.b. NF-kB Signalweg führen. TRADD kann auch mit FADD assoziieren, was zur Induktion von Apoptose über Rekrutierung und Teilung von Pro-caspase 8 führt. Keine Überlebenssignale, Der 3 kinase/akt Signalweg (Bild 12) Ein extrazelluläres Überlebenssignal (z.b. IGF, insulin-like growth factor) aktiviert eine Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK), welche PI 3-kinase rekrutiert und aktiviert. Pi 3 kinase produziert. PIP3 (aus PIP2), dient als Andockstelle für zwei Serin/Threonin Kinasen, PDK1 (phoshoinositol-abhängige kinase) und Akt. Akt wird phosphoryliert durch eine dritte kinase (mtor) an einem Serin, das die Konformation von Akt ändert, sodass es an einem Threonin phosphoryliert werden kann (durch PDK1, welche Act aktiviert). Das aktivierte Akt dissoziert nun von der Plasmamembran und phosphoryliert verschiedenen Zielproteine, einschließlich das BAD Protein. Unphosphoryliert hält BAD ein oder mehrere Apoptose- Hemmende Faktoren im inaktiven Zustand. Nach Phosphorylierung lässt BAD die Hemmungsproteine frei, die nun Apoptose blockieren und das Zellüberleben ermöglichen. BAD bindet an ein ubiquitäres zytoplasmisches Protein, genannt , das BAD blockiert. Es gibt zwei weitere Wege, durch die extrazelluläre Signale Apoptose hemmen können, (Bild 13). Die Role von p53 in Apoptose (Bild 14(9)) In vielen Zelltypen ist vermittelte p53 Wachstumshemmung abhängig von p21 Induktion, welches als Hemmer von Cyclin-abhängigen Kinasen wirkt, die zur Fortführung des Zellzyklus von Bedeutung sind. Bei Versagen von mutiertem p53 p21 zu transaktivieren, kann unkontrollierte Proliferation entstehen. (1) In dem zytosolischen p53 apoptotischen Signalweg induziert nukleares p53 Puma Expression, welches wiederum zytosolisches durch Bcl-X L Bindung inaktives p53 freisetzt. Anschließend induziert das zytosolische p53 Bax Oligomerisation und mitochondriale Translokation. Anhäufung von p53 im Zytosol als Konsequenz aus normalem intrazellulären Transport oder stabiler Monoubiquitination ist die Hauptquelle von mitochondrialem p53. (2) Mitochondrialer apoptotischer Weg In den Mitochondrien induziert p53 Bax und Bak Oligomerisation, antagonisiert Bcl-2 und Bcl-X L antiapoptotischen Effekt, und blidet einen Komplex mit Cyclophilin D in der mitochondrialen inneren Membran. Diese Veränderungen resultieren in starke Risse in der mitochondrialen Membran und nachfolgenden Ausschüttungen von löslichen und unlöslichen apoptogenen Faktoren. MPTP, mitochondrial permeability transition pore; U, ubiquitin. APOPTOSIS oldal 5