APOPTOSE - Zellbiologievorlesung. Dr. Ralf Kriehuber Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik Lehrstuhl für Tierphysiologie Universität Rostock

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1 APOPTOSE - Zellbiologievorlesung Dr. Ralf Kriehuber Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik Lehrstuhl für Tierphysiologie Universität Rostock

2 APOPTOSE - der genetisch kontrollierte Zelltod

3 APOPTOSE - der genetisch kontrollierte Zelltod APO, gr. = weg PTOSIS, gr. = fallen fallende Blätter Entwicklung, Homöostase v. Geweben und Organen Selbst toleranz des Immunsystems, Eliminierung von unkontrolliert teilenden Zellen Morphologisch und biochemisch wohl definiert Integrität der Zellmembran bleibt erhalten, Apoptose ist energieverbrauchend!

4 APOPTOSE - der genetisch kontrollierte Zelltod - kann in allen Zellen von Mehrzellern auftreten - in der Evolution wohl konserviert - an immunkompetenten Zellen am besten beschrieben - sehr komplex (aufsteigend in der Evolution) reguliert - extrinsische (rezeptor-vermittelte) und intrinsische (DNA-Schaden-vermittelte) Apoptoseinduktion

5 Unterschiede APOPTOSE vs. NEKROSE Apoptose Chromatin Kondensation Cell shrinkage Organellen und Membran bleiben intakt Schnelle Phagozytierung - keine Entzündung DNA-Fragmentierung Nekrose Zellkern schwillt an Zelle schwillt an Organellen platzen, Zellen reißen auf, Freisetzung zellulärer Komponenten Entzündung

6 Fortlaufende Chromatinkondensation in einer lebenden Einzelzelle b f ca. 60 min; supravitale UV- Fluoreszenzmikroskopie SCL-II Zellen nach Exposition mit IR

7 Chromatin Kondensierung Syto-14 DNA-Lebendfärbung Bisbenzimid DNA-Färbung von SCL-II Zellen 20 µm

8 Cell shrinkage 10 µm SCL-II Zelle nach UV-Exposition

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10 Intrinsischer Apoptoseweg Intrazellulärer Auslöser - Physikalische und chemische Noxen (z.b. Induktion von DNA-Schäden), - Zellteilung verläuft nicht korrekt Zelle stirbt apoptotisch ab

11 Physikalische Stressoren Ku70/80 DNA PKcs ATR ATM NEMO NEMO P

12 ATM Ataxia Telangectasia Mutated DNA-PK DNA-abhängige Protein Kinase c-abl PI(3)K PKC PKB MAPK JNK STAT Abelson mouse lymphoma protein Phosphoinositide 3-OH Kinase Protein-Kinase C Protein-Kinase B Mitogen-Activated- Protein-Kinase c-jun-n-terminal-kinase Signal-Transducer and Activator of Transcription

13 Proteinstatus in SCL-II Zellen? DNAdamage ATM ATR p53 p21 cip1/waf1 bcl-2 Bax p16 ink4a CDKs Effector Casp. Casp. 3,6,7 cytochrome c APAF 1 Caspase 9 Survivin IAPs E2F prb Apoptosis G1/S Cell cycle stop

14 G1 Zellzyklusregulierung S G2 M p21 Nbs1 p p73 rad51 rpa chk 1 p chk 2 p p53 p c-abl p Caffeine p53 hdm-2 ATM BRCA-1 / CTIP.. Repair... GADD45 DNA-repair hdm-2 p bax c-abl p73 p Apoptose I-ka NF-kB NF-kB I-ka p

15 Extrinsischer Apoptoseweg Zelle bekommt über einen Rezeptor von außen ein Todes -signal Zelle stirbt apototisch ab

16 TNF Rezeptor Familie besitzen 1-5 Cysteine reiche Regionen im extrazellulären Bereich und eine Todes -Domaine im intrazellulären Bereich

17 CD95 CD95L DISC FADD/MORT1 FLIP FLICE AIF = FAS/APO-1 CD95 Ligand Death Inducing Signalling Complex Fas-Associated-Death- Domain FLICE-inhibitory protein = Procaspase-8 formerly known as: FADD-homologous ICE/CED-3-like protease Apoptosis Inducing Factor

18 Physikalische Stressoren Ku70/80 DNA PKcs ATR ATM NEMO NEMO P

19 IKK = Cytokine-activated IkappaB-Kinase Membran - Schaden NF-kB = Nuclear Factor kappab NF-AT = Nuclear Factor of Activated T cells AP-1 = Activator Protein-1 EGR = Early growth response protein Fos= v-fosfbj murine osteosarcoma viral oncogene homolog APOPTOSE Jun = v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog Calcineurin = protein phosphatase

20 Die cytotoxischen T-Zellen induzieren Apoptose über den CD95L-Weg und/oder über den Granzym B / Perforin Weg TCR T-cell antigen receptor MHC Major histocompatibility complex MHCAg MHC-Antigen CD95L = FasL = APO-1 L

21 Cytotoxische T-Zellen killen Zielzellen über Granzyme B / Perforin vermittelte Apoptoseinduktion Perforin befreit die in Vesikeln eingeschloßenen Granzym B und rab4+/5+ Moleküle; löchert aber auch die Membran der Zielzelle rab = member RAS oncogene family

22 Bcl-2 = besonderes Onkogen, führt zur Tumorentstehung weil: APOPTOSE effektiv gehemmt wird! Membranproteine: - Mitochondrienmembran -ER (selten) BH Domänen = Bcl-2 homolog Bcl-2 = Mcl-1 = B-cell CLL(chronic lymphatic leukemia/lymphoma type 2 = häufigste maligne Leukämie) wobei 85 % der Krebszellen die Translokation t(14;18) besitzen, dem GO von bcl-2 18q21.3 myeloid cell leukemia sequence (bcl-2 related) Bax = Bcl-2 associated X protein Bak = Bcl-2-antagonist/killer 1 Bik = Bcl-2 interacting killer (apo inducing) Bad = Bcl-2 antagonist of cell death Bid = BH3 interacting domain death agonist

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25 AKT = v-akt murine thymoma viral oncogene homologue 1 (from a AKR-mouse) = Chaperone Bad = pro-apoptotisches Bcl-2 verwandtes Protein Bcl-x L = anti-apoptotoisches Bcl-2 verwandtes Protein Bcl-2 = anti-apoptotisch Bax = pro-apoptotisches Bcl-2 verwandtes Protein

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27 Bcl-2 Bcl-2 cy cy = Cytochrome c AIF = Apoptosis Inducing Factor APAF-1 = Apoptosis Protease Activating Factor 1 AIF cy APAF-1 Bax Bax APAF-1 cy Bax cy Bcl-2 Bid t- Bid t- IAPs SMAC/ Diablo Bid Caspase - 8 t-bid cy

28 Bcl-2 >1.5 kd Porin ANT VDAC VDAC = Voltage dependent Anion Channel (Permeabilty transition pore complex) ANT = adenine nucleotide translocator cy APAF-1 AIF Bax Bax APAF-1 cy Bax cy Bcl-2 cy Bid Bid SMAC/ Diablo t- t- cy

29 Caspasen - charakteristische Protease-Familie (Cysteine containing aspartic acid cleaving enzymes) Proteasen, die durch Cystein im aktiven Zentrum charakterisiert sind und strikt (nur) Proteine nach einem Asparagin schneiden

30 Aktivierung von Caspasen a) Schneiden der Pro-Caspasen, die als Zymogene bereits vorliegen, durch Inititator-Caspasen b) Aktivierung der Caspasen durch Konformationsänderung durch interagierende Proteine und anschließender autokatalytischen Spaltung c) Bildung komplexer Caspasenaggregationen (Apoptosom) durch Apoptose Protease aktivierenden Faktoren

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34 SCL-II Zellen PARP 8 Gy Kon e 113 kda 65 kda 50 kda

35 Caspase 3 CAD Caspase-aktivierte DNAse icad inhibitor der CAD DNA die um Histone gewickelt entspricht ca. 180 bp da nicht zwischen jedem Nukleosom geschnitten wird, tauchen 180 bp und Vielfache davon im Gel auf

36 DNA im Agarosegel - M APO KON U 1 kbp 200 bp +

37 Apoptotic bodies in SCL-II Zellen 15 µm Bisbenzimid DNA Färbung

38 Phosphatidylserin klappt auf die Außenseite der Zellmembran während der Apoptose Annexin V bindet spezifisch an PS Annexin V-FITC + PI PI 25 µm SCL-II Zellen nach 8 Gy ionisierender Strahlung

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41 Nematode Caenorhabditis elegans (959 somatische Zellen) Hominide Homo sapiens Fliege Drosophila melanogaster I am the enemy you killed, my friend. I knew you in this dark: for so you frowned Yesterday through me as you jabbed and killed. I parried; but my hands were loath and cold. Let us sleep now...' Wilfred Owen (Strange Meeting 1917)

42 Enthalten nur BH3 Domäne = pro-apo Enthalten BH1-BH4 Domäne = anti-apo Apoptose Proteasen aktivierender Faktor Proteasen (Caspasen) Apoptose inhibierende Faktoren (AIF) AIF-inhibierende Proteine

43 Apoptose ein energieverbrauchender, sehr fein regulierter Prozess 1. Initiierungsphase 2. Exekutionsphase 3. Zellbeseitigung Intrinsische und extrinsische Induktion p53, Todes rezeptoren und bcl-2 Proteinfamilie Caspasen Chromatinkondensation, DNA-ladder, Cell shrinkage, Membranintegrität, Phagozytose

44 Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik - Universität Rostock AG Molekulare Strahlenbiologie: Ralf Kriehhuber Berit Gniech Katrin Kadenbach Birgit Wobith Marcus Unverricht Ines Mundt Manuela Riedling René Warnke