Hendrik A. Wolff, Can M. Sag, Kay Neumann, Marie-Kristin Opiela, Margret Rave-Fränk, Clemens F. Hess, Lars S. Maier, Hans Christiansen

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1 Ionisierende Strahlung (IR) führt über Reactive Oxygen Species (ROS) und aktivierte CaMKinase II zu akuten Veränderungen im kardialen Calciumstoffwechsel und zu akuter Schädigung isolierter Kardiomyocyten in vitro Hendrik A. Wolff, Can M. Sag, Kay Neumann, Marie-Kristin Opiela, Margret Rave-Fränk, Clemens F. Hess, Lars S. Maier, Hans Christiansen Abteilung Strahlentherapie und Radioonkologie Abteilung für Kardiologie und Pneumologie Universitätsmedizin Göttingen Robert-Koch-Str Göttingen "Akute Effekte von RT auf Kardiomyozyten" - Dr. HA Wolff, Göttingen 1

2 Hintergrund und Ziele Radiotherapie im Thoraxbereich ist integraler Bestandteil von multimodalen Therapiekonzepten bei verschiedenen Tumorerkrankungen. Die Gabe von kardiotoxischen Medikamenten nimmt stark zu. Insgesamt ist derzeit ein deutlicher Anstieg bestrahlungsinduzierter Kardiotoxizität als Spätfolge zu verzeichnen. Deshalb nimmt die Relevanz im klinischen Alltag mit der Diskussion über die Einführung der Fachdisziplin Kardioonkologie / Onkokardiologie weiter zu. Die Pathomechanismen des kardiovaskulären und kardiozelllulären Schadens nach Bestrahlung (RT) sind bislang wenig untersucht und verstanden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es deshalb zunächst akute Effekte nach Bestrahlung in isolierten Kardiomyocyten zu untersuchen. Der Calcium-Stoffwechsel steht dabei als grundlegender Apparat kardialer Steuerungsfunktionen im Mittelpunkt der Experimente. Die beobachteten Effekte sollen durch Untersuchung von - radikalabhängigen Pathways - oder Inhibition spezifischer Steuerungs-Kinasen näher beschrieben werden. Diskussion: Können die gezeigten akuten Stressreaktionen unmittelbar nach RT einen Trigger für chronische Spätfolgen wie kardiale Insuffizienz und/oder Rhythmusstörungen darstellen? "Akute Effekte von RT auf Kardiomyozyten" - Dr. HA Wolff, Göttingen 2

3 Versuchsaufbau Bestrahlung isolierter Kardiomyocyten mit 0, 4 oder 20Gy und direkt anschließender Messung des akuten Stressniveaus durch Epifluoreszenz Mikroskopie (Fura-2) - mit Bestimmung von: - Diastolischer Calcium-Konzentration, - Calcium - Transienten Amplitude - Relaxation s Parametern Wiederholung aller Versuche unter Zugabe von Melatonin vor RT als ROS-Scavenger zum Beweis eines radikal-abhängigen Effektes Im Fokus der weiteren Versuche steht die Ca 2+ - Calmodulin - abhängigen Proteinkinase II (CaMKII) die im Zytoplasma / Zellkern von Kardiomyocyten vorkommt und nach Aktivierung für die Steuerung von zentralen kardialen Calcium-Homöostase-Parametern durch Phosphorylierung von diversen intrazellulären Proteinen und Kanalöffnungen zuständig ist. Als verstärkenden Hinweis konnte für die CaMKII bei langfristiger Hochregulation bereits ein spezifischer Einfluss auf chronische Herzerkrankungen wie Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen bewiesen werden. Zum Nachweis einer Beteiligung der CaMKII an den gezeigten akuten Effekten erfolgte deshalb eine Wiederholung der Versuche unter Zugabe des hochspezifischen CaMKII Inhibitors AIP (Autocamid-2 Related Inhibitory Peptide) vor RT (Schlagender Kardiomyozyt mit Färbung der Ca-Transienten zur Durchführung von Epifluoreszenz - Messungen) "Akute Effekte von RT auf Kardiomyozyten" - Dr. HA Wolff, Göttingen 3

4 Ergebnisse I: Ca fluorescence signal (F380/F340) Gy 4 Gy 20 Gy 500 ms 500 ms 500 ms Obere Abb.: Calcium-Transienten isolierter Kardiomyocyten nach RT mit 0, 4 oder 20Gy Durch die RT steigt das diastolische Grundniveau dosisabhängig an. Zusätzlich kommt es mit steigender Dosis zu einer signifikanten Amplitudenvergrößerung (Aufstrich) und verkürzter Relaxationszeit (Abstrich bis zum Grundniveau). Alle Effekte spiegeln ein durch RT signifikant erhöhtes Stressniveau der Kardiomyocyten wider. Untere Abb.: Graphische Darstellung der zuvor gezeigten Calcium-Transienten (weiß, grau, schwarz) mit signifikanten Anstieg des diastolischen Calcium-Niveaus (p<0.05). Durch die Zugabe von Melatonin vor der RT (gelb) wird der zuvor gezeigte Effekt aufgehoben. Es ist kein Anstieg des diastolischen Calciums im Vergleich zur Kontrolle mehr nachweisbar. Die durch RT verursachten Stressreaktionen können also durch das Abfangen der ROS durch einen Scavenger verhindert werden. Demnach wird ein ROS-abhängiger Effekt postuliert. Diastolic Calcium (F340/F380) Gy 4 Gy 4 Gy + Mel 20 Gy 20 Gy + Mel "Akute Effekte von RT auf Kardiomyozyten" - Dr. HA Wolff, Göttingen 4

5 Ergebnisse II: Ca transient amplitudes Diastolic Ca H Two way ANOVA P<0.05 N= 98 N=26 Two way ANOVA P<0.05 N=94 * N=89 $ N=36 N=31 Ctrl 4 Gy 20 Gy N= 98 N=26 N=94 * N=38 Ctrl 4 Gy 20 Gy N=89 $ - AIP + AIP * - AIP N=31 + AIP Linke Abb.: Wiederholung der Versuche unter Zugabe von AIP als spezifischen CaMKII-Inhibitor vor RT Sowohl bei den gemessenen Ca-Transienten-Amplituden als auch bei den diastolischen Ca-Parametern kommt es nach Inhibition der CaMKII zu keinem Anstieg der gemessenen Werte mit steigender Dosis von 4 bzw. 20Gy. Im Vergleich zur Kontrolle ohne AIP-Zugabe ergibt sich nun ein signifikanter Unterschied. Somit kann eine Beteiligung der CaMKII an den durch RT ausgelösten Effekten postuliert werden. Rechte Abb.: Darstellung der CaMKII-Phosphorylierung / Aktivierung nach RT Es zeigt sich ein Zunahme der A Phosphorylierung/Aktivierung mit pcamkii steigender Dosis (obere Abb.). Durch Zugabe von AIP als GAPDH spezifischen CaMKII-Inhibitor ist kein Unterschied zur Kontrolle C mehr nachweisbar (untere Abb.). pcamkii + AIP Somit ist eine Inhibition der CaMKII durch AIP auf GAPDH Proteinebene nachgewiesen. 0 Gy 0 Gy 4 Gy 4 Gy 20 Gy 20 Gy "Akute Effekte von RT auf Kardiomyozyten" - Dr. HA Wolff, Göttingen 5

6 Diskussion / Fazit: RT von isolierten Kardiomyozyten ruftakute Stress-Reaktionen hervor: Es kommt zu einem signifikanten Anstieg von diastolischen Calcium-Parametern Calcium Transientenamplituden und einer Verkürzung der Relaxationszeit. Eine ROS-abhängige Induktion dieser Effekte wurde nachgewiesen (Scavenger- Effekt durch Melatonin). Beteiligung der spezifischen Steuerungskinase CaMKII kann postuliert werden (Nachweis durch spezifische Inhibition mittels AIP erfolgreich). Link zur Klinik: Multimodale onkologische Therapie inkl. RT führt als Spätfolge im Bereich des Herzens nicht nur zu Gefäßschäden, sondern auch zu Schädigung der Myozyten mit den möglichen Folgen einer chronischen Herzinsuffizienz und/oder Herzrhythmusstörungen. Hier nachgewieseneakute Mechanismen sind dabei möglicherweise erste frühe Schritte in der Pathogenese fürlangfristige Störungen in der Calcium-Homöostase, die bei vielen Herzerkrankungen diagnostiziert werden können. Möglicherweise lassen sich derartige Veränderungen in der Zukunft durch spezifische Blockade zentraler Steuerungskinasen während der RT verhindern. "Akute Effekte von RT auf Kardiomyozyten" - Dr. HA Wolff, Göttingen 6

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