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1 Diskussion Seite Diskussion Das Urothelkarzinom der Harnblase ist der häufigste maligne Tumor des Harntraktes. Die zurzeit zur Verfügung stehenden Prognoseparameter konzentrieren sich im Wesentlichen auf den histologischen Typ, den Differenzierungsgrad und das Tumorstadium (108). Mit zunehmender Infiltrationstiefe nimmt die Wahrscheinlichkeit von Metastasierung und Progression zu. Ist die Lamina propria überwunden, nimmt die mittlere Überlebenszeit deutlich ab (16). Die häufig eingesetzte TNM-Klassifikation kann jedoch zu Fehlinterpretationen führen. Patienten mit oberflächlichen Tumoren z. B. weisen oft eine hohe Rezidiv- und Progressionsrate auf. 60 bis 80 % der Patienten mit oberflächlichem Harnblasenkarzinom entwickeln trotz TUR innerhalb von vier Jahren Tumorrezidive. Da man nicht genau weiß, welche oberflächlichen Tumoren eine Progression aufweisen werden, lässt sich nur schwer eine Aussage zur Prognose treffen. Ein weiteres Beispiel der Unzuverlässigkeit gebräuchlicher Klassifikationen bezüglich der Prognose führten Jordan et al. (53) an. Bei den muskelinvasiven Karzinomen hat sich die prognostische Beschreibung mit Hilfe des Gradings als wenig signifikant bezüglich Rezidivvorhersage und Progressionswahrscheinlichkeit herausgestellt. Jordan und Mitarbeiter sehen die Ursache darin, dass die meisten dieser muskelinvasiven Karzinome in die Gruppe der entdifferenzierten Karzinome einzuordnen sind. Gerade bei den invasiven Karzinomen wäre es aber wichtig, eine Aussage zur Metastasierungswarscheinlichkeit treffen zu können. Dies macht deutlich, dass das Blasenkarzinom einen sehr variablen klinischen Verlauf zeigt. Einige Blasenkarzinome zeigen nur selten Invasivität und sind somit prognostisch günstiger einzustufen. Andere dagegen wachsen schnell invasiv und metastasieren früh. Die Vermutung, dass durchaus auch lokalisierte, oberflächliche Tumoren aggressives Verhalten an den Tag legen können, äußern auch Sier et al. (119). Bei ihrer Untersuchung der MMP-9 Aktivität im Urin zeigten einige pt a - und pt 1 -Tumoren eine hohe Aktivität an MMP-9, ein möglicher Hinweis auf das aggressive Potential des

2 Diskussion Seite -74- Tumors (119). Moses et al. konnten diese Vermutung erhärten und den Nachweis von MMP-9 im Urin als unabhängigen signifikanten Parameter der Metastasierungswahrscheinlichkeit bestätigen (89). Ein Nachteil dieser Methode ist die ebenfalls erhöhte Ausscheidung von MMP-9 bei Patienten mit einer Zystitis. Zuletzt muss man noch darauf hinweisen, dass das TNM-Stadium ja anhand des durch die transurethrale Elektroresektion gewonnenen Gewebematerials bestimmt wird. Bei der TUR besteht aber immer die Gefahr, dass das gewonnene Präparat nicht die tatsächliche Tumorausdehnung widerspiegelt und es so zu einem Over- oder Understaging kommmt (139). Bei den invasiven Tumoren, die sich häufig schon bei der Erstdiagnose manifestieren, ist das weitere therapeutische Vorgehen meist eindeutig. Die Entscheidung bei den oberflächlichen Blasenkarzinomen gestaltet sich dagegen schwieriger. Gerade das unterschiedliche Verhalten der oberflächlichen Tumoren, das von einem relativ gutartigen Verlauf bis zu einem äußerst aggressiven Verlauf reichen kann, bleibt bei der therapeutischen Entscheidung zwischen radikaler Cystektomie oder blasenerhaltender transurethraler Resektion anhand der TNM-Klassifikation unberücksichtigt (46). Wie wichtig es ist, vorhersagen zu können, welcher Tumor invasives Verhalten zeigen wird, macht folgender Vergleich deutlich: Muskelinvasives Verhalten hat bei Verzicht auf eine radikale Therapie eine 5-JÜR von 20 bis 40 %. Die 5-JÜR nach radikaler Zystektomie sind vom Tumorstadium abhängig und liegen für pt 2 -Tumoren bei ca %, für pt 3a -Tumoren bei %, für pt 3b - Tumoren bei % und bei pt 4 -Tumoren bei % (5, 32). Es wäre somit wünschenswert, weitere Faktoren zur Verfügung zu haben, die eine Aussage direkt zur Prognose bei einem bestimmten Patienten erlaubten. So ließe sich auf der einen Seite eine Heilung im Frühstadium ermöglichen, auf der anderen Seite könnten unnötige Operationen, Chemotherapien und BCG-Instillationstherapien vermieden werden. Der Nutzen einer neoadjuvanten Chemotherapie könnte nach ganz neuen Kriterien erwogen werden. Auch könnte man den zeitlichen Abstand der Kontrollzystoskopien mit Hilfe von Prognosemarkern entsprechend variieren.

3 Diskussion Seite -75- Die hohe Rezidivrate und die relevante Progressionsrate bei oberflächlichen Tumoren nach transurethraler Resektion macht besonders deutlich, dass die bisher verwendeten Parameter (TNM-Klassifikation und WHO-Grading) bezüglich der Prognosefindung nur begrenzt aussagefähig sind. Der Wunsch, vorhersagen zu können, welcher oberflächliche Tumor rezidivieren oder einen Progress aufweisen bzw. welcher invasive Tumor metastasieren wird, hat zu der Etablierung bzw. Untersuchung verschiedener möglicher prognostischer Marker geführt. TNM-Klassifikation und Differenzierungsgrad: Die wichtigsten Prognoseparameter für das klinische Verhalten des Harnblasentumors sind das Tumorstadium und der Differenzierungsgrad. Die Infiltrationstiefe korreliert mit der Wahrscheinlichkeit zur Rezidiventstehung und Progression (16). Smits et al. (122) fanden eine signifikante Abhängigkeit der Progression vom Tumorstadium. Darüber hinaus konnten Angulo et al. (2) eine Abhängigkeit der tumorspezifischen Überlebensrate vom Tumorstadium nachweisen (131). Die Nachteile dieser Methode zur Beurteilung des zukünftigen klinischen Verlaufes wurden weiter oben bereits ausführlich diskutiert. DNA-Analyse : Der DNA-Gehalt von Tumorzellen kann auf verschiedene Weise untersucht werden. Häufig verwendete Methoden sind die Durchflusszytometrie und die Image-Zytometrie. Es gibt viele Arbeiten, welche die prognostische Relevanz der DNA-Ploidität bestätigen. Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die Image-Zytometrie werden häufig bezüglich Prognosestellung zitiert (8, 75, 80, 114). Nur wenige Autoren fanden Differenzen in DNA-Gehalt und Malignitätsgrad (65) sowie fehlende Korrelation zum Tumorstadium und zur Prognose. Somit ist er allerdings kein unabhängiger Marker und findet deshalb keine allgemeine Akzeptanz. Ein entscheidender Nachteil der Durchflusszytometrie sind zudem der große Zeitaufwand und die relativ hohen Kosten.

4 Diskussion Seite -76- Blutgruppenantigene: 85 % der Bevölkerung sind so genannte Ausscheider. Von diesen Personen werden in der Mukosa der Urothelschleimhaut die Blutgruppenantigene (ABH-Antigen und Lewis-Antigen) exprimiert. Es ist beschrieben, dass ein Verlust der ABH-Antigene mit erhöhter Invasivität korreliert und somit mit einer schlechteren Prognose verbunden ist (76). Jüngste Daten zeigen, dass aus der Gruppe der Blutgruppenantigene das Lewis-X-Antigen als einziges einen potentiellen Prognosefaktor darstellt. Im Gegensatz zum normalen Urothel exprimieren 90 % des Tumors dieses Antigen (22). Sheinfeld et al. berichten über eine Sensitivität von 93 % einen Harnblasentumor nachzuweisen, wenn man eine diesbezügliche positive Zytologie und den positiven immunhistochemischen Nachweis des Lewis-X-Antigens miteinander kombiniert (117). Ein entscheidender Nachteil der Blutgruppenantigene als Prognosefaktor ist die fehlende Anwendbarkeit bei Nicht- Ausscheidern. Humanes Chorion Gonadotropin (HCG): Die Produktion des Glykoproteins HCG konnte bei einer großen Anzahl von Neoplasien verschiedenen Ursprungs nachgewiesen werden. Ein erhöhter Serumspiegel bei Harnblasenkarzinompatienten ergab Hinweise auf das Vorhandensein von Metastasen (49, 50). In einer weiteren Arbeit von Iles et al. konnte dargelegt werden, dass eine erhöhte Urinkonzentration vor Zystektomie mit einer kurzfristigen Progression der Erkrankung einhergeht (51). Eine immunhistochemische Arbeit von Seidal konnte einen signifikanten Zusammenhang zwischen Tumordiffenrenzierungsgrad und HCG-Expression zeigen (116). Mitoserate:

5 Diskussion Seite -77- Die Bestimmung der Mitoserate ist die älteste und schnellste Methode, um eine prognostische Aussage bezüglich eines Tumors zu treffen. Nachteile waren bisher das Fehlen standardisierter Regeln und die oft mangelnde Reproduzierbarkeit. Haapasalo et al. haben eine Methode entwickelt, mit der ein standardisiertes und somit vergleichbares Zählen ermöglicht wird (42). Dieser volumenkorrigierte Mitoseindex hat sich bei verschiedenen Neoplasien als prognostische Bewertung mit guter Reproduzierbarkeit bewährt (43). In Arbeiten an Blasenkarzinomen zeigte sich sogar eine Überlegenheit gegenüber dem Malignitätsgrad (69, 72, 75). Tumorassoziierte Antigene: Aus der Vielzahl von tumorassoziierten Antigenen sind M344 und 19A211 von besonderem Interesse. Antikörper gegen M344- und 19A211-Antigen zeigen nur in oberflächlichen Blasentumoren eine positive Reaktion und bleiben negativ in normalem Urothel. Mit zunehmendem Tumorgrad allerdings nimmt die Expression dieser Antigene und somit ihre Nachweisbarkeit bei invasiven Tumoren ab (35). Ebenso scheint T138 ein vielversprechender klinischer Marker zu sein. Die Expression von T138 nimmt mit Tumorstadium und Tumorgrad zu. Zwei Studien konnten eine Korrelation mit der Metastasierungswahrscheinlichkeit zeigen (13). Proliferationsantigene: Diese Antigene sind wichtig, um das tumorbiologische Potential einer Neoplasie zu erfassen. Die zwei meist untersuchten immunhistochemisch nachweisbaren Proliferationsmarker sind der murine monoklonale Antikörper Ki-67 und das Proliferating-cell-nuclear-Antigen. Steigender Expressionsgrad von Ki-67 weist auf eine erhöhte proliferatorische Aktivität hin und zeigt somit Progression und Metastasierungspotential an. Ebenso gibt es eine Beziehung zur Rezidivrate beim Harnblasenkarzinom (17, 33, 57). Der genaue Mechanismus, in den Ki-67 eingebunden ist, ist noch nicht bekannt. Man geht aber davon aus, dass das Kernantigen ein Protein erkennt, welches im DNA-Replikationszyklus involviert ist (77). Für vergleichende Analysen fehlt aber noch ein standardisiertes Untersuchungsverfahren.

6 Diskussion Seite -78- Cohen et al. fanden eine Korrelation zwischen dem Proliferating-cell-nuclear- Antigen und der Stadieneinteilung sowie dem Malignitätsgrad beim Transitionalzellkarzinom der Harnblase(21). Insgesamt lässt sich festhalten, dass zur Bestätigung der Resultate dieser Arbeiten weitere Studien mit einem größeren Patientenkollektiv nötig sind. Außerdem erfüllt dieser Marker nicht das Kriterium der vom TNM-System unabhängigen Aussagekraft. Onkogene: Onkogene sind zelluläre Gene, welche bei Veränderung durch Mutation ihre natürliche Regelfunktion bei der Kontrolle des Wachstumsprozesses einer Zelle verlieren. Ras-Proteine sind an der Signaltransduktion von Proliferations- und Differenzierungssignalen beteiligt. Entsteht eine Mutation in der GTP-Bindungseigenschaft, so kommt es zu einer Daueraktivierung des Proteins (4). Fontana et al. (34) sowie Ghoneim et al. (39) konnten die Korrelation zwischen dem c-h-ras-onkogen und frühen Rezidiven bei Patienten mit oberflächlichen Blasentumoren aufzeigen. Der große Nachteil ist der hohe Aufwand und die deshalb kaum mögliche klinische Anwendung. C-myc ist ebenfalls ein wichtiger Faktor in der Proliferation. Mutationen in diesem Gen können zur Translokation sowie Genamplifikation führen. Auch wenn der Mechanismus der Überexpression noch nicht genau bekannt ist, so konnten zumindest Kotake et al. (60) zeigen, dass die Überexpression von c-myc mit dem Malignitätsgrad des Harnblasentumors korreliert. Zurzeit lassen sich aber keine allgemeingültigen Aussagen über die prognostische Relevanz dieses Faktors treffen, da die Literatur noch eindeutige Ergebnisse vermissen lässt bzw. sehr kontrovers diskutiert. Lipponen et al. (71) konnten in ihren Untersuchungen c-myc keinen prognostischen Wert zusprechen. C-erbB-2 (HER-2/neu) ist ein Protoonkogen, das ein transmembranes Glykoprotein kodiert, welches dem EGF-R ähnlich ist. Man vermutet, dass c-erbb-2 ein epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor ist, mit der Fähigkeit, das zelluläre Wachstum zu forcieren. Sowohl c-erbb-2 als auch EGF-R gehören zu der Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen. Zu c-erbb-2 finden sich ver-

7 Diskussion Seite -79- schiedene Studienergebnisse bezüglich der Signifikanz von Progression, Metastasierung sowie Gesamtüberlebenszeit bei verschiedenen Tumoren wie Mammakarzinom, Prostatakarzinom und Harnblasenkarzinom (40, 70, 74, 83, 85, 88, 112, 127). Das Zellkernprotein mdm2 inaktiviert das p53-protein, indem es dieses bindet (86). Auf diesem Weg kommt es zu einer indirekten Beeinflussung der Zellproliferation, indem die zellregulatorische Fähigkeit des p53 unterdrückt wird. Die Überexpression des mdm2-gens wird in Bezug auf das Harnblasenkarzinom nur vereinzelt nachgewiesen. Zwar wird eine Überexpression in 20 bis 30 % der Neoplasien der Harnblase beschrieben (67), ein Zusammenhang zum Tumorstadium oder Malignitätsgrad konnte aber nicht gefunden werden (118). Epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren: EGF-R ist ein transmembranes Glykoprotein, das durch das c-erb-1-gen kodiert wird und somit zu den Onkogenen gezählt wird. In normalem Urothel bleibt der EGF-R auf die basalen Schichten des Übergangsepithels begrenzt. Nicht so beim Transitionialzellkarzinom. Dieses Phänomen kann sogar in der normalen Schleimhaut von Blasentumorpatienten gefunden werden und könnte somit als eine prämaligne Läsion gewertet werden. EGF-R ist ein Faktor, der unter Umständen eingesetzt werden könnte, die frühe Tumorgenese zu erkennen. In immunhistochemischen Arbeiten hat sich die Expression von EGF-R als prognostischer Marker für das Übergangsepithelkarzinom bewährt. Es besteht eine hohe Korrelation zwischen der Überexpression und der tumorspezifischen Überlebenszeit, dem rezidivfreien Intervall und der Progressionszeit bei oberflächlichen Blasentumoren (84, 93). Peptid-Wachstumsfaktoren: Peptid-Wachstumsfaktoren wie EGF, FGF und TGF sind parakrine Mediatoren, die an der Kommunikation zwischen Zellen beteiligt sind. Sie üben einen großen Einfluss auf das Wachstum, die Differenzierung und Apoptose von Zellen aus.

8 Diskussion Seite -80- Die Ergebnisse von EGF-Studien sind bezüglich ihrer Aussage zur Prognose von Tumorpatienten bisher eher widersprüchlich. Matilla et al. konnten keinen Unterschied in der EGF-Konzentration im Urin bei Gesunden und Tumorerkrankten feststellen (81). Kristensen et al. hingegen wiesen eine signifikant niedrigere Konzentration an EGF im Urin von Erkrankten gegenüber der Kontrollgruppe nach (61). Eine mögliche Erklärung hierfür sei die vermehrte Bindung an dem abnorm exprimierten EGF-Rezeptor. Fuse et al. konnten eine Korrelation der EGF-Konzentration mit Tumorstadium, Differenzierungsgrad und Überlebensrate zeigen (37). FGF, ein Angiogenesefaktor, zeigte zwar in mehreren Versuchen eine Korrelation zum metastatischen Potential von Harnblasenkarzinomzellen, und die Urinzytologie hinsichtlich FGF war in mehreren Studien bei Blasentumorpatienten positiv; es konnte jedoch keine Unterscheidung zwischen hochmalignen und niedrigmalignen Tumoren getroffen werden. Eine Arbeit von Cairns (18) ergab eine Assoziation zur benignen Prostatahyperplasie. Dies ist als ein entscheidender Nachteil für FGF in der Tumormarkersuche des Harnblasenkarzinoms zu werten, da so eine Unterscheidung zwischen benignem und malignem Gewebe unmöglich wird. Für die Transforming Growth Factoren (TGF-α, TGF-β) lässt sich zusammenfassend sagen, dass diese Faktoren zurzeit noch keine Bewertung ihrer Aussagekraft zur Prognose oder Überlebenszeit zulassen. Zelluläre Adhäsionsmoleküle: Diese Gruppe von Molekülen spielt eine bedeutende Rolle bei der Interaktion von Zellen. Sie sind unter anderem beteiligt an Signaltransduktion, Zellkommunikation und Apoptose. Sie sind wichtig bei dem Metastasierungsprozess von Karzinomzellen. Um in das Kreislaufsystem oder in den Lymphabflussweg zu gelangen, müssen die zellulären Kontaktgrenzen überwunden werden. E-Cadherin ist ein häufig untersuchtes Molekül mit vielversprechenden Ergebnissen. In mehreren Arbeiten konnte ein Zusammenhang zum Tumorstadium, Malignitätsgrad und der Prognose beim Harnblasenkarzinom

9 Diskussion Seite -81- hergestellt werden. Mit abnehmender Expression von E-Cadherin steigt der Malignitätsgrad. Lipponen und Eskelinen erzielten in einer Studie an 122 Patienten signifikante Ergebnisse bezüglich der rezidivfreien Zeit (73). Auch eine Korrelation zur Gesamtüberlebensrate ist in der Literatur beschrieben (14, 99, 110). Sowohl immunhistochemische Arbeiten, als auch Serum- und Urinkonzentrationen konnten diese prognostische Relevanz des E-Cadherinmoleküls bestätigen. Gerade auch die nichtinvasiven Untersuchungsmethoden wie Immunblotting-Verfahren zum Nachweis von E-Cadherin im Urin machen dieses Molekül so interessant und vielver-sprechend. Angiogenese: Tumorwachstum und Tumormetastasierung sind eng mit der Neovaskularisation verbunden. Die Tumorangiogenese wird reguliert von Faktoren wie z. B. FGF, ebenso sind Inhibitoren wie Thrombospondin-1 und Angiostatin beteiligt. Eine Hypothese lässt vermuten, dass diese Faktoren durch den Tumor selbst, die umgebende Matrix oder inflammatorische Zellen sezerniert werden. Mehrere Arbeiten konnten einen Zusammenhang zwischen einer vermehrten Kapillarisierung und der Tumorprogression sowie dem Gesamtüberleben herstellen (123, 133, 134). Bochner et al. konnten mittels immunhistochemischem Nachweis der micro vessel density (MVD) die Angiogenese sogar als unabhängigen Prognosefaktor für Progression und Gesamtüberleben postulieren (10). Kontrovers dazu steht eine Arbeit von Hawke et al., bei welcher die Tumorgefäßdichte und die Anzahl der Gefäße in keiner Relation zur Tumorprogression stehen. Hawke et al. wiesen in einer multivarianten Analyse nach, dass die micro vessel density (MVD) kein unabhängiger Faktor ist. Ein weiterer in dieser Studie aufgedeckter Nachteil der MVD besteht darin, dass die im Biopsiematerial ermittelte MVD nur selten der im Zystektomiepräparat gefundenen MVD entsprach (44). Für den Angiogeneseinhibitor Thrombospondin-1 konnte eine antiproportionale Beziehung hinsichtlich der Rezidivrate und dem Gesamtüberleben bei invasiven Blasentumoren festgestellt werden (23).

10 Diskussion Seite -82- Regulatorproteine des Zellzyklus (Tumorsuppressor-Gene): In einem normalen Zellproliferationszyklus sorgen Kinasen durch Phosphorylierung von Regulatorproteinen für einen geordneten Ablauf. Verlust dieses Kontrollmechanismus kann der erste Schritt in der Karzinogenese sein. Das Retinoblastom-Gen (Rb) ist nicht nur an der Entstehung von Retinoblastomen beteiligt, sondern wurde auch bei anderen malignen Erkrankungen vorgefunden. Es inhibiert die Progression im Zellzyklus am G1-S Checkpunkt. Veränderungen des Gens oder des Genproduktes gehen mit einem erhöhten Tumorstadium und einem erniedrigten Differenzierungsgrad der Harnblasenkarzinome einher. Cordon-Cardo et al. konnten zwischen dem Verlust der Expression von Rb in muskelinvasiven Blasentumoren und der 5-JÜR einen Zusammenhang zeigen. Mutationen im p53-gen, einem Tumorsuppressorgen, sind die häufigsten genetischen Defekte in menschlichen Tumoren. Dieses Gen kodiert für ein 53 kd Protein. Die normale Funktion des Proteins sorgt bei DNA-Defekten für eine Unterbrechung des Zellzyklus, um den Reparatursystemen die Möglichkeit zur Behebung des Defektes zu geben. Kommt es zu nicht-reparablen Schäden der DNA der Zelle, wird die Apoptose eingeleitet. Bei Mutationen in diesem Gen kommt es zur nukleären Akkumulation des Genprodukts, welche mit Hilfe der Immunhistochemie nachgewiesen werden kann. Der Defekt korreliert mit der Progression, dem Gesamtüberleben, der tumorspezifischen Überlebenszeit und der rezidivfreien Zeit des organbegrenzten muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms (31), unabhängig vom Malignitätsgrad und dem Tumorstadium. Verschiedene Studien konnten p53 als verlässlichen und konstanten prognostischen Marker für die Progression in Harnblasenkarzinomen bestätigen (124). Cote et al. gingen sogar noch einen Schritt weiter und untersuchten in einer randomisierten prospektiven Studie die Relation p53 und adjuvanter Chemotherapieerfolg. In einer Gruppe von 88 muskelinvasiven Tumorpatienten wurde die p53-expression in der Gruppe unter Chemotherapiebehandlung mit der Kontrollgruppe ohne Therapie verglichen. Die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass nur die Patienten mit Tumoren, in denen p53 verändert war, von einer Chemotherapie eindeutig profitierten.

11 Diskussion Seite -83- Das Rezidivrisiko dieser Patienten nach Chemotherapie war auf ein Drittel erniedrigt und die Überlebensrate 2,6-fach erhöht gegenüber der Kontrollgruppe. Eine mögliche Ursache könnte sein, dass ein beeinträchtigtes p53- Protein die Apoptose der Tumorzelle bei der Chemotherapie eher zulässt als ein normal funktionierendes Protein (24). Untersuchungen von van Ahlen et al. betrachten p53 eher kritisch im Hinblick auf die diagnostische und prognostische Aussagekraft. Weder für das Tumorstadium oder den Differenzierungsgrad noch für die Metastasierungswahrscheinlichkeit, die Progressionszeit oder Gesamtüberlebenszeit zeigten sich signifikante Unterschiede im p53-status von 100 Patienten mit muskelinvasivem Harnblasenkarzinom. Van Ahlen et al. führten verschiedene Arbeitsgruppen an, die zu ähnlichen Ergebnissen gekommen sind (92, 130, 141). Sie vermuten, dass zwei oder mehrere Tumorentitäten existieren, die von verschiedenen anderen Parametern beeinflusst werden (129). Auch bei Vorreuther et al. zeigte sich eine schlechte Korrelation von p53 mit dem Rezidivrisiko (132). Diese Arbeitsgruppe beschäftigte sich ausschließlich mit oberflächlichen Tumoren. Zlotta sieht die Erklärung für die umstrittenen Ergebnisse vor allem in der unterschiedlichen Untersuchungstechnik, den verschiedenen Antikörpern und Cut-off-Werten (144). Die zum Teil stark divergierenden Ergebnisse und Kriterien lassen zurzeit noch keinen klinischen Einsatz dieses Markers zu. Das biologische Verhalten eines Tumors bestimmt ganz entscheidend die Prognose des jeweiligen Patienten und definiert sich unter anderem über das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Neoplasien haben eine Reihe von Mechanismen entwickelt, derer sie sich bei ihrer Ausbreitung bedienen. Der Tumor braucht allerdings Wegbereiter für die Expansion. Bei der Suche nach geeigneten Prognoseparametern haben wir deshalb bewusst einen Faktor ausgewählt, der an der Wachstumsregulation von Tumorzellen beteiligt ist. Eine Gruppe von Enzymen ist in letzter Zeit mehr und mehr zum Gegenstand des Interesses geworden, nämlich die so genannten Matrixmetalloproteina-

12 Diskussion Seite -84- sen (MMP). Sie sind Teil des Interaktionssystems zwischen Tumor und umliegendem Gewebe. Matrixmetalloproteinasen destruieren die Basalmembran und ermöglichen dem Tumor sich auszudehnen, invasiv zu werden und Anschluss an Metastasierungswege zu finden. Gerade die Fähigkeit, die Basalmembran-Komponenten anzugreifen, zeichnet die Metalloproteinasen gegenüber anderen interstitiellen Proteasen aus (113). Wie kürzlich festgestellt, spielt die Destruktion der Basalmembran und der Matrix aber auch eine Rolle bei der Freilegung von Komponenten, deren Interaktion mit dem Tumor die Apoptose von Tumorzellen verhindern kann (87). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen gehen weit über die bisherige Annahme hinaus, dass die Basalmembran dem Tumor nur als Barriere dient, deren Destruktion eine räumliche Ausdehnung ermöglicht. Was die MMPs so interessant macht ist, dass sie schon zu Beginn des Tumordaseins, also bei den ersten Zellmigrationsschritten, beteiligt sind. Sier et al. (119) fanden heraus, dass 50 % der NED-Patienten (non evidence of disease) erhöhte MMP-9-Aktivität hatten. Diese Tatsache erklären sie mit der Annahme, dass die Krankheit zwar schon vorhanden, mit den herkömmlichen Methoden, wie Histologie und Zystoskopie, aber noch nicht nachweisbar ist (119). Des Weiteren scheinen die MMPs gerade in epithelialen Karzinomen bei der Invasion des Tumors eine Schlüsselrolle zu spielen (100). Von besonderem Interesse sind die Matrixmetalloproteinasen 2 und 9, da sie in der Lage sind, Basalmembran-Typ-IV-Kollagen zu hydrolysieren. Wie Sugiura et al. in einem Review schreiben, sind im letzten Jahrzehnt eine große Anzahl von Veröffentlichungen erschienen, die einen Zusammenhang der Metalloproteinasen zu Tumorinvasion und Metastasierung herstellen (125). Liotta und Duffy (28) gehörten zu den Ersten, die einen Zusammenhang zwischen der MMP-Expression und der Invasion eines Tumors herstellten. Daidone et al. fanden einen Zusammenhang zwischen der MMP-Expression und dem klinischen Outcome der Patienten mit lymphknotennegativem Mammakarzinom (27). Seitdem sind einige Studien erschienen, die die Korrelation zwischen MMP- Expression und Krankheitsverlauf von Tumorpatienten belegen (9, 15, 66,

13 Diskussion Seite ). Es wurden verschiedene Karzinome untersucht (58), unter anderem Karzinome der Lunge (56, 126), das Prostatakarzinom (140), das Mammakarzinom (107) und das Kolonkarzinom (94). Bis vor kurzem wurde aufgrund der Beobachtung, dass eine Korrelation zwischen Proteolyseenzymexpression und invasivem Verhalten von Tumoren besteht, davon ausgegangen, dass der Tumor wegen seiner Fähigkeit zur Produktion matrixdestruierender Proteasen invasives Verhalten an den Tag legen kann. Diese Hypothese musste in den letzten Jahren revidiert werden. Es gibt einige immunhistochemische und in-situ-hybridisationsarbeiten, die die Lokalisation der MMP- Produktion im Stromabereich und nicht in den Tumorzellen selbst ansiedeln (4, 45, 95, 97). Das erste Experiment, das der Frage nachging, ob nur der Tumor selbst Produzent der Metalloproteinasen ist, wurde von Basset et al. (4) durchgeführt. Diese Autoren demonstrierten, dass Stromalysin-3-mRNA vom Stroma des Mammakarzinoms, nicht aber von den Tumorzellen selbst produziert wurde (4). Auch Sugiura et al. konnten die MMP-9-Expression beim Neuroblastom im Bereich der tumorumgebenden Stromazellen nachweisen, nicht jedoch in den Tumorzellen selbst (125). DeClerck cokultivierte Neuroblastomzellen mit Fibroblasten und demonstrierte die Stimulation der MMP-Expression in den Fibroblasten durch die Neuroblastomzellen (26). Mittlerweile gibt es viele Zytokine, die nachweislich die MMP-Expression induzieren bzw. forcieren, und viele von ihnen werden im Tumorgewebe gebildet. Tumorzellen epithelialen Ursprungs sind in ihren expressiven Möglichkeiten begrenzt. Tumoren, bei denen sich während ihrer Progression ein morphologischer Wandel von epithelial zu mesenchymal vollzieht (wie zum Beispiel für das Melanom beschrieben (82, 141)), sind plötzlich in der Lage, Stromalysin-1,3 und interstitielle Kollagenase-mRNA zu produzieren. Es stellt sich die Frage, ob Tumoren, die nicht in der Lage sind, MMP zu produzieren, diese Aufgabe an das Stroma delegieren. Interessanterweise sind 95 % der Harnblasentumoren urothelialen Ursprungs. Unter der zuvor geäußerten Annahme könnte man die Arbeitshypothese aufstellen, dass Harnblasenkarzinome aufgrund ihrer epithelialen Ausprägung nicht in der Lage sind,

14 Diskussion Seite -86- MMP-9 selbst zu exprimieren und sich über sezernierte Zytokine des umliegenden Stromas zur Proteasenproduktion bedienen. Gerade das Tumorwachstum kann von im Stroma produzierten MMPs forciert werden, sei es durch Raumbeschaffung, oder einfach nur durch Aktivierung von Wachstumsfaktoren, wie von McDougall et al. postuliert (82). Ein interessantes Experiment stellten Schnaper et al. vor (115). Sie studierten das Verhalten von Endothelzellen, abgeleitet von menschlichen Nabelschnurvenen auf Matrigel, einem Basalmembranextrakt. Schnaper et al. untersuchten das Vorkommen von 72-kD- und 92-kD- Gelatinase-Aktivität und konnten durch Variation der Versuchsanordnung darstellen, dass die gesamte 92-kD-Aktivität von dem Matrigel ausgeht. Dies spricht ebenfalls für eine Kommunikation zwischen Endothelzellen und dem Matrigel bzw. für eine Induktion der MMP-9- Expression im Matrigel, getriggert durch die Endothelzellen (115). Pyke et al. vermuteten schon 1993, dass im kolorektalen Karzinom die MMP-9-mRNA von Makrophagen sezerniert wird (105). Zeng und Guillem gingen der Frage nach, welche Zellen der Ursprung der MMP-9-mRNA- Produktion sind (143). Die in-situ-hybridisierung zeigte runde Zellen im Stroma von kolorektalen Karzinomen als Quelle der MMP-9-mRNA-Produktion an. Mittels eines Anti-Makrophagenantikörpers KP-1 konnten diese Zellen als Makrophagen identifiziert werden. Zeng und Guillem beschreiben ausserdem die Variabilität bezüglich der MMP-9-positiven Verteilung innerhalb des Tumors. Ebenso stellen sie fest, dass nicht alle Makrophagen eine positive MMP-9-mRNA-Expression aufweisen (143). In der vorliegenden Arbeit zeigte sich ebenfalls eine starke Schwankung in der Verteilung der MMP-9-positiven Makrophagen, und nicht alle Makrophagen zeigten eine immunhistochemische Färbung. Nielsen et al. nahmen sich zur Aufgabe, die Lokalisation der MMP-9- Produktion anhand des Adenokarzinoms des Kolons zu bestimmen (52). Sie untersuchten 19 Adenokarzinome und 2 Biopsien von angrenzendem normalen Tumorgewebe. Das Ergebnis war eine immunhistochemische Anfärbung ausschließlich der Makrophagen und neutrophilen Granulozyten.

15 Diskussion Seite -87- Im normalen Kolongewebe konnten vereinzelte immunhistochemisch angefärbte neutrophile Granulozyten innerhalb von Blutgefäßen und Makrophagen innerhalb des mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebes (Peyersche Plaques) identifiziert werden. Die MMP-Lokalisation wurde mittels in-situ-hybridisierung bestätigt (95). Aber auch bezüglich des Kolonkarzinoms liegen divergente Ergebnisse vor. Jeziorska et al. wiesen zusätzlich zur Aktivität in neutrophilen Granulozyten und Makrophagen auch in den Tumorzellen selbst eine immunhistochemische Reaktion nach, die Nielsen et al. ausdrücklich verneinten (52). Die MMP-9-mRNA-Expression in makrophagenähnlichen Zellen wurde bei einer Reihe von Karzinomen entdeckt, z.b. von Davies et al. im Mammakarzinom und Harnblasenkarzinom, von Pyke et al. im Basalzellkarzinom der Haut und von Canete-Soler et al. im Plattenepithelkarzinom der Lunge (19, 25, 95, 105). Daneben existieren einige Arbeiten zu MMP-9, die nicht nur eine Assoziation zu den inflammatorischen Zellen im Tumor, sondern auch zu den Tumorzellen selbst aufzeigen (19, 59, 105). Beim Harnblasenkarzinom wurden ebenfalls erhöhte MMP-9-Expressionsraten gefunden. Der Nachweis der Gelatinase wurde dabei sowohl im Serum und Urin, als auch im Gewebe selbst erbracht. Bei Grignon et al. zeigte sich eine immunhistochemische Färbung besonders in den Karzinomzellen des Harnblasentumors in unterschiedlicher Ausprägung (41). Eine Korrelation mit dem Überleben oder dem Tumorstadium bzw. Tumorgrad konnte aber nicht nachgewiesen werden. Grignon et. al. verzeichneten jedoch auch vereinzelte MMP-9-positive Makrophagen, und es bestand eine schwache statistische Assoziation zwischen der Stromaanfärbung mit dem MMP-9-Antikörper und dem tumorspezifischen Überleben (41). Oezdemir et al. dagegen fanden eine positive MMP-9-Expression in den Tumorzellen des Urothelkarzinoms und sogar eine starke Expression in intravaskulären und gewebeinfiltrierenden Leukozyten. Es bestand eine Korrelation zum Tumorstadium und Tumorgrad, und zwar stärker als für

16 Diskussion Seite -88- MMP-1 und MMP-2. Des Weiteren wurde auch der Urin untersucht. MMP-9 fand sich im Urin aller Blasenkarzinompatienten in unterschiedlicher Konzentration. In der freiwilligen Kontrollgruppe blieb die MMP-9- Konzentration unter der Nachweisgrenze. Ein statistischer Zusammenhang zwischen der Urinkonzentration und dem Tumorgrad oder dem Tumorstadium konnte nicht aufgedeckt werden (100). Papathoma et al. konnten keinen statistisch relevanten Zusammenhang zwischen MMP-9-Konzentration und der Rezidivrate sowie Progression der Blasenkarzinome feststellen (103). Es fiel aber auf, dass zwei oberflächliche Tumoren mit niedrigem Differenzierungsgrad MMP-9 stark exprimierten und innerhalb von zwei Monaten rezidivierten. Papathoma et al. gehen davon aus, dass MMP-9 eine prognostische Rolle innerhalb der oberflächlichen Tumorgruppe spielen könnte. Ihre Fallzahlen waren aber zu gering, um eine Aussage treffen zu können. Die MMP-9- Expression lokalisierte sich im Zytoplasma des Tumors und vereinzelt in Fibroblasten und Endothelzellen (103). Slaton et al. zeigten in einer multivarianten Analyse, dass bei einem Verhältnis von MMP-9 : E-Cadherin von mehr als 1,8 : 1 eine unabhängige Aussage zur Progression des Krankheitsverlaufes bei Blasentumorpatienten gemacht werden kann (121). Des Weiteren war bei der Untersuchung von Slaton et al. eine hohe MMP-9-Expression mit einem frühzeitigem Auftreten von Rezidiven und verminderter Überlebenszeit assoziiert (121). Davies et al. wiesen in ihrer Studie mittels quantitativer Zymographie eine deutliche Beziehung zwischen MMP-Expression und Tumorgrad, sowie der Invasivität nach (25). Leider konnte keine Aussage zur Überlebenszeit oder zum Metastasierungsrisiko gemacht werden, da die Datenlage hierzu nicht ausreichend war. Ihre in-situ-hybridisationsversuche zur Quellenlokalisation der MMP-Produktion konnten Stromaelemente ausmachen, eine genaue Zelltypisierung war Davies und seinen Mitarbeitern noch nicht möglich. Sie beschrieben die Zellen aber als Makrophagen/Fibroblasten-ähnlich. Davies et al. zitieren in-vitro Studien, in denen die Hauptproduzenten der Metalloproteinase-9 der mononukleären Phagozytenlinie angehören (47, 136). Einige

17 Diskussion Seite -89- wenige Biopsien enthielten auch MMP-9-positive Tumorzellen. Davies fiel auf, dass die Enzymexpression häufig um Tumorgefäße angeordnet war, was sie zur Vermutung einer enzyminduzierten Angiogenese veranlasste (25). Auch in der vorliegenden Arbeit fanden sich in einem Teil der Präparate der überwiegende Teil der angefärbten Makrophagen um die Kapillaren herum. Dies war mit einem deutlich schlechteren Outcome verbunden, was mit der Hypothese von Davies et al. vereinbar ist. In der vorliegenden Studie zeigten sich die myeloischen Entzündungszellen als Hautproduzenten der Metalloproteinase-9, und bei nur wenigen Präparaten konnten MMP-9 immunhistochemisch in den Tumorzellen nachgewiesen werden. Da die Harnblasenkarzinome epithelialen bzw. urothelialen Ursprungs sind, unterstützt diese Arbeit die Hypothese von McDougall, dass nur mesenchymale Tumoren in der Lage sind, MMP-9 selbst zu produzieren. Interessant wäre es sicherlich, mit Hilfe der mrna-lokalisation den genauen Produktionsort der Metalloproteinase auszumachen und für die wenigen MMP-9-positiven Tumoren einen möglichen Uptake-Mechanismus nachzuweisen (s.u.). In der vorliegenden Arbeit konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der MMP-9-Expression und dem Gesamtüberleben, dem turmorspezifischen Überleben und der Progressionszeit gezeigt werden. Es wurden zwei Auswertungssysteme mit Hilfe der Makrophagen erstellt. Zum einen wurde der Tumoranteil mit MMP-9-positiven infiltrierenden myeloischen Entzündungszellen, zum anderen die Lage der MMP-9-positiven myeloischen Entzündungszellen in Bezug auf Kapillaren bewertet. Für letzteres konnte ein deutlicher statistischer Zusammenhang mit der Prognose dargestellt werden: Je mehr positive Entzündungszellen extrakapillär lagen, desto schlechter zeigte sich die Gesamtüberlebensrate, tumorspezifische Überlebensrate und die Progressionsrate mit einer deutlichen Signifikanz in der Kaplan-Meier- Überlebensanalyse. Dieser Zusammenhang war auch innerhalb der Gruppen oberflächlicher und invasiver Karzinome signifikant. Das könnte als Hinweis auf MMP-9 als Wegbereiter weiteren invasiven Wachstums bzw. der Metastasierung des Tumors beurteilt werden.

18 Diskussion Seite -90- Dass über die rezidivfreie Zeit keine Aussage getroffen werden kann, ist kein deutlicher Nachteil von MMP-9. In der vorliegenden Studie ist die 5-JÜR der oberflächlichen Tumoren ca. 80 %, die der invasiven ca. 39 %. Trotzdem zeigen die oberflächlichen Tumoren eine hohe Rezidivneigung. Ein Parameter, welcher die Rezidivwahrscheinlichkeit des Harnblasentumors anzeigt, erlaubt noch keine Aussage über die Gesamtprognose des Patienten. Eine mögliche Erklärung für den unterschiedlichen Ort der Expression von MMP-9, d.h. Tumor vs. Stroma, bietet vielleicht die elektronenmikroskopische Arbeit von Ohtani et al (96). Sie stellten die Hypothese auf, dass Tumorfibroblasten MMP-2 produzieren, sezernieren und die Tumorzellen das Enzym durch einen Uptake-Mechanismus aufnehmen (36, 96). Übertragen auf MMP-9, hätte man einen Erklärungsansatz für die anscheinend widersprüchlichen Ergebnisse hinsichtlich der Lokalisation. Trotzdem bliebe auch hier offen, warum ein Teil der Tumoren die Gelatinase aufnimmt, während andere dies nicht tun. Aber auch die verwendeten unterschiedlichen Versuchsansätze und Antikörper machen es schwer, die Studien wirklich miteinander zu vergleichen. Einige Autoren sehen gerade dort das Problem. Solange nicht weitere Untersuchungen zur oben genannten Hypothese von Ohtani et al. (96) existieren, bleibt der Erklärungsansatz der divergenten Versuchsansätze noch der wahrscheinlichste. Umso wichtiger ist die Forderung nach standardisierten Immunhistochemieprotokollen.

19 Diskussion Seite -91- Aus der vorliegenden Arbeit ergeben sich weitere Fragestellungen: So könnte eine Untersuchung des genauen Mechanismus, mit dem die in stromalen bzw. inflammatorischen Zellen gebildeten Metalloproteinasen zu Tumorwachstum, Tumorprogression und Metastasierung beitragen, wertvolle Informationen liefern. In der vorliegenden Untersuchung blieb unberücksichtigt, ob die Matrixmetalloproteinase in aktiver oder inaktiver, der sog. (prommp-9) Form, vorlag. Es wäre interessant, auch dies weiter zu untersuchen. Allerdings konnten Sier et al. (119) bei ihrer Untersuchung von MMP-9 im Urin zeigen, dass eine hohe Korrelation zwischen aktiver MMP-9 und Gesamt-MMP-9-Aktivität besteht und es somit unerheblich scheint, ob die Gesamtaktivität oder die aktive Form der Metalloproteinase herangezogen wird. Für die klinische Einführung der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Versuchsanordnung mit der teilweise sehr aufwändigen Zählung der Entzündungszellen sollte eine Verbesserung und untersucherunabhängige Standardisierung des Auszählsystems weiterentwickelt werden. Ebenso ist eine standardisierte, d.h. laborunabhängige automatisierte Immunhistochemie zu fordern. Interessant könnte auch das Ergebnis einer quantitativen Messung der MMP-Produktion sein, da Makrophagen physiologischerweise ebenfalls einen gewissen Anteil an MMP-9 sezernieren. Interessant wäre zudem, den genauen Mechanismus der MMP-9 Produktion im Stroma bzw. in den myeloischen Entzündungszellen zu kennen. Sezerniert der Tumor Faktoren, ist der direkte Tumorkontakt mit Stroma entscheidend oder ist es das Resultat einer inflammatorischen Reaktion, die den Tumor oft begleitet? Stünde die inflammatorische Reaktion im Vordergund, so könnte man mit dem Wissen, dass die Makrophagen Produzenten der MMPs sind, neue therapeutische Ansätze überlegen. Eine mögliche Therapie könnte dann eine Unterdrückung der inflammatorischen Reaktion beinhalten. Die entzündungshemmende Therapie ist ja schon Gegenstand mehrer Forschungsgebiete, wie z.b. bei allen auto-

20 Diskussion Seite -92- immunen Prozessen, so dass auf ein bereits vorhandenes Therapiekonzept zurückgegriffen werden könnte. Je besser man die Tumorkinetik verstehen wird, umso mehr Ansätze zur Prognosefindung und Therapieoptimierung werden sich ergeben. Der Trend wird sicherlich dahin gehen, nicht nach einem einzigen Prognoseparameter zu suchen, sondern Kombinationssysteme zu entwickeln (101).