Identifizierung Interferon-regulierter Gene beim Haushuhn

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1 Aus dem Veterinärwissenschaftlichen Department der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Angefertigt unter der Leitung von Univ.- Prof. Dr. Bernd Kaspers Identifizierung Interferon-regulierter Gene beim Haushuhn Inaugural-Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München von Susanne Hildegard Röll aus Freiburg im Breisgau München 2013

2 Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Dekan: Univ.-Prof. Dr. Joachim Braun Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Bernd Kaspers Korreferent: Univ.-Prof. Dr. Rüdiger Korbel Tag der Promotion: 20. Juli 2013

3 Für Mama, Papa und Katharina

4 Inhaltsverzeichnis IV INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG LITERATURÜBERSICHT Das Interferon System Interferone beim Säugetier Charakterisierung von Interferonen Typ I Interferone Typ II Interferon Typ III Interferone Induktion einer Interferon Antwort Pathogen-assoziierte molekulare Muster Mustererkennungsrezeptoren Die Interferon vermittelten Signalkaskaden Interferon-regulierte Gene Interferone beim Huhn ZIELSETZUNG MATERIAL UND METHODEN Tiere und Tierhaltung Gewinnung von Proben Gewinnung von Organen Gewinnung von Plasma Zellkultur Medien und Zusätze Verwendete Zelllinien Kultivierung von Zellen Einfrieren von Zellen Auftauen von Zellen CEC-32#511 Interferon-α Reporterassay Nachweistest für ChIl Herstellung von rekombinantem ChIFN-α Endotoxin Messung mit dem Limulus Amebocyte Lysate Biotest RNA-Präparation RNA-Isolation Reinheitsbestimmung der RNA im NanoDrop Bestimmung der RNA Integrität im Agilent 2100 Bioanalyzer TM cdna Synthese DNase Verdau cdna Synthese... 47

5 Inhaltsverzeichnis V 4.8. Quantitative Real Time Polymerase Kettenreaktion (qrt-pcr) Mikroarray crna Synthese Fragmentierung der crna Hybridisierung des Mikroarrays Waschen und Scan des Mikroarrays Auswertung des Mikroarrays Agilent Feature Extraction Software Version Bioconductor R Version Significance Analysis of Microarrays Version 3.08 (SAM) Berechnung der Expressionsänderung (fold change) Microsoft Office Access Datenbanksystem Pathway Express Multi Experiment Viewer Version Ingenuity PANTHER-Gene List Analysis INTERFEROME Datenbank und ISG-Database Durchflusszytometrische Untersuchungen Färbung mit direkt Fluorochrom-markierten Antikörpern Indirekte Färbungen Lebend/Tot-Färbung mit 7-AAD Histologie Vorbereitung der Gewebeproben für die Histologie Anfertigung von Gewebeschnitten Vorbereitung der Schnitte für die Färbung Histologische Färbung mit Hämatoxylin-Eosin Lösung Immunhistochemische Färbung Statistische Auswertung ERGEBNISSE Datenbank Analysen zur Identifizierung von Interferon-regulierten Genen im Hühnergenom Halbwertszeit von ChIFN Vergleich der Bioverfügbarkeit nach intravenöser und intramuskulärer Injektion von ChIFN Ausschluss von Lipopolysaccharid Kontamination Limulus Amebocyte Lysate Biotest Analyse der LPS-Auswirkungen auf die Gen- und Proteinexpression Identifizierung IFN-regulierter Gene im Huhn mittels Mikroarray Behandlung mit ChIFN Mikroarray Experiment Heat Map Gruppenanalyse nach IFN Behandlung... 73

6 Inhaltsverzeichnis VI Identifizierung signifikant regulierter Gene nach IFN-Behandlung Vergleich von IRGs beim Huhn und Säugetier Weitere funktionelle Analysen der Gengruppen nach IFN Behandlung Eingehende Betrachtung von Zytokinen und Chemokinen Verifizierung ausgewählter Gene in der qrt-pcr Messung von Interleukin-6 Protein im Plasma Behandlung mit Newcastle Disease Virus NDV Infektion Makroskopische Veränderungen der Lunge nach NDV Infektion Charakterisierung der nach NDV Infektion makroskopisch veränderten Lungen Histologische Charakterisierung der Lungen Durchflusszytometrische Charakterisierung der Lungen Mikroarray Experiment nach Infektion mit NDV Heat Map Gruppenanalyse nach Infektion mit NDV Identifizierung signifikant regulierter Gene nach NDV Infektion Verifizierung ausgewählter Gene in der qrt-pcr Vergleichende Betrachtung der signifikant regulierten Gene nach... NDV Infektion Funktionelle Analysen nach NDV Infektion Zytokine und Chemokine Identifizierung von IRGs nach Infektion mit NDV Funktionelle Analysen nach NDV Infektion regulierten IRGs und weiterer Gene DISKUSSION Datenbank-Analyse zur Identifizierung von IRGs im Huhn IFN-Injektion zur Identifizierung von IRGs im Huhn NDV Infektion zur Bestätigung der IRGs im Huhn Genauere Betrachtung der Gewebespezifität von IRGs Zytokine und Chemokine Genauere Betrachtung ausgewählter IRGs ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG TABELLARISCHER ANHANG DANKSAGUNG

7 Abbildungsverzeichnis VII Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Schematischer Überblick über eine Auswahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) Abbildung 2 Schematische Darstellung der Virus induzierten Toll-Like Receptor (TLR) Signalkaskade Abbildung 3 Die klassische durch Interferone induzierte Jak-Stat Signalkaskade Abbildung 4 Probenentnahme aus der Lunge Abbildung 5 Bioverfügbarkeit nach intravenöser Injektion von rek ChIFN-α Abbildung 6 Vergleich der IFN Bioverfügbarkeit nach intravenöser und intramuskulärer Injektion von rek ChIFN-α Abbildung 7 Il-6 und K203 Gen Expression in Milz und Lunge nach LPS Injektion Abbildung 8 Il-6 Protein im Plasma nach LPS Injektion Abbildung 9 Behandlungsschema mit rek ChIFN Abbildung 10 Typ I IFN Plasmaspiegel vor und nach IFN Injektion Abbildung 11 Vergleich der Mikroarrays von Milz und Lunge nach IFN Injektion Abbildung 12 Gesamtanalyse der Mikroarrays von Milz und Lunge nach IFN Injektion.. 74 Abbildung 13 Abgleich durch IFN Injektion im Huhn regulierter Gene mit IRGs des Säugetiers Abbildung 14 Schema einer Mikroarray Analyse Abbildung 15 Ausgewählte funktionellen Untergruppen nach IFN Injektion Abbildung 16 Expressionsprofile nach IFN Injektion Abbildung 17 Netzwerkanalyse von PTX Abbildung 18 Netzwerkanalyse von SFTPA Abbildung 19 Netzwerkanalyse von Interleukin Abbildung 20 Netzwerkanalyse von Albumin Abbildung 21 Expressionsprofile der Zytokine und Chemokine nach IFN Injektion Abbildung 22 Validierung ausgewählter Gene mit qrt-pcr Abbildung 23 Interleukin-6 Protein im Plasma nach IFN Injektion Abbildung 24 Typ I IFN Plasmaspiegel 16h p.i. nach NDV Infektion Abbildung 25 Makroskopische Veränderungen der Lungen nach NDV Infektion Abbildung 26 Probenentnahme für die RNA Isolation nach NDV Infektion Abbildung 27 HE-Färbung der Lunge nach NDV Infektion Abbildung 28 Immunhistologische Charakterisierung der Lungen nach NDV Infektion 122

8 Abbildungsverzeichnis VIII Abbildung 29 Durchflusszytometrische Charakterisierung der Lungen nach... NDV Infektion Abbildung 30 Heat Map Darstellung von Milz und Lunge nach NDV Infektion Abbildung 31 qrt-pcr Validierung ausgewählter Gene nach NDV Infektion Abbildung 32 Genexpression in der Lunge nach NDV Infektion Abbildung 33 Vergleich der Gewebeexpression nach NDV Infektion und... IFN Behandlung Abbildung 34 Funktionelle Gruppen nach NDV Infektion Abbildung 35 IRGs nach NDV Infektion und IFN Injektion Abbildung 36 Gene Ontology der IRGs und weiterer Gene nach NDV Infektion Beiliegende CD: Abbildung 37 Netzwerkanalyse von Interleukin-6

9 Tabellenverzeichnis IX Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Übersicht über die Interferone... 2 Tabelle 2 Humane Toll-Like Rezeptoren und ihre Liganden Tabelle 3 TLR und RLR des Huhnes Tabelle 4 Verwendete qrt-pcr Primer Tabelle 5 In der Durchflusszytometrie eingesetzte Antikörper Tabelle 6 Verwendete Primärantikörper für die Immunfluoreszenzfärbung Tabelle 7 Ermittlung der biologischen Halbwertszeit von rek ChIFN-α Tabelle 8 Signifikant regulierte Gene in Milz und Lunge nach IFN Injektion Tabelle 9 Anzahl signifikant regulierter IRGs nach IFN Injektion Tabelle 10 Gene in den Expressionsprofilen nach IFN Injektion Tabelle 11 Biologisch relevante Signalwege nach IFN Injektion Tabelle 12 Signifikante biologische Funktionen nach IFN Injektion Tabelle 13 Anzahl an Zytokinen und Chemokinen in den Expressionsprofilen Tabelle 14 Signifikant regulierte Gene in Milz und Lunge nach NDV Infektion Tabelle 15 Funktionelle Gruppen nach NDV Infektion Tabelle 16 Biologisch relevante Signalwege nach NDV Infektion Tabelle 17 Durch IRGs und weitere Gene nach NDV Infektion beeinflusste Signalwege Tabelle 18 Höchst signifikant regulierte Gene 3 Stunden nach IFN Injektion Tabelle 19 Gene Ontology Analyse nach IFN Injektion Tabelle 20 Ausgewählte funktionelle Untergruppen nach IFN Injektion Tabelle 21 Upstream Regulators nach IFN Injektion Tabelle 22 Zytokine und Chemokine nach IFN Injektion Tabelle 23 Höchst signifikant regulierte Gene nach NDV Infektion Tabelle 24 Signifikant regulierte Gene im unveränderten Lungengewebe nach NDV Infektion Tabelle 25 Zytokine und Chemokine nach NDV Infektion Tabelle 26 Gene Ontology Analyse der IRGs und weiterer Gene nach NDV Infektion. 227

10 Tabellenverzeichnis X Tabellenverzeichnis der beiliegenden CD Mappe 1 Tabelle 27 Tabelle 28 Tabelle 29 Tabelle 30 Tabelle 31 Tabelle 32 Tabelle 33 Tabelle 34 Tabelle 35 Tabelle 36 Tabelle 37 Tabelle 38 Tabelle 39 Tabelle 40 Tabelle 41 Übersicht Annotation Allgemeine IRGs aus Datenbank Analyse Signifikant regulierte Gene nach IFN Injektion Allgemeine und neu identifizierte IRGs nach IFN Injektion Signifikant regulierte Gene sechs und neun Stunden nach IFN Injektion Gene Ontology der allgemeinen IRGs in Milz und Lunge Gene Ontology der allgemeinen IRGs in der Milz Gene Ontology der allgemeinen IRGs in der Lunge Gene Ontology der neu identifizierten IRGs in Milz und Lunge Gene Ontology der neu identifizierten IRGs in der Milz Gene Ontology der neu identifizierten IRGs in der Lunge Gene Ontology ausgewählter funktioneller Untergruppen der allgemeinen IRGs in Milz und Lunge Gene Ontology ausgewählter funktioneller Untergruppen der allgemeinen IRGs in der Milz Gene Ontology ausgewählter funktioneller Untergruppen der allgemeinen IRGs in der Lunge Tabelle 42 Gene Ontology ausgewählter funktioneller Untergruppen der neu identifizierten IRGs in Milz und Lunge Tabelle 43 Gene Ontology ausgewählter funktioneller Untergruppen der neu identifizierten IRGs in der Milz Tabelle 44 Gene Ontology ausgewählter funktioneller Untergruppen der neu identifizierten IRGs in der Lunge Tabelle 45 Tabelle 46 Tabelle 47 Tabelle 48 Tabelle 49 Tabelle 50 MEV der allgemeinen IRGs in Milz und Lunge MEV der allgemeinen IRGs in der Milz MEV der allgemeinen IRGs in der Lunge MEV der neu identifizierten IRGs in Milz und Lunge MEV der neu identifizierten IRGs in der Milz MEV der neu identifizierten IRGs in der Lunge

11 Tabellenverzeichnis XI Tabelle 51 Tabelle 52 Tabelle 53 Tabelle 54 Tabelle 55 Tabelle 56 Pathway Express nach IFN Injektion Biologische Funktionen nach IFN Injektion Biologische Funktionen in der Milz nach IFN Injektion Biologische Funktionen in der Lunge nach IFN Injektion Apoptose und Nekrose nach IFN Injektion Netzwerkanalyse von Interleukin-6 Mappe 2 Tabelle 57 Tabelle 58 Tabelle 59 Tabelle 60 Tabelle 61 Tabelle 62 Tabelle 63 Tabelle 64 Tabelle 65 Tabelle 66 Tabelle 67 Tabelle 68 Tabelle 69 Tabelle 70 Tabelle 71 Tabelle 72 Signifikant regulierte Gene nach NDV Infektion Genüberschneidungen in der Lunge nach NDV Infektion Genüberschneidungen in Milz und Lunge nach NDV Infektion Genexpression in der Milz nach NDV Infektion Gewebeexpressionsvergleich der Milz nach NDV Infektion und IFN Injektion Genexpression im unveränderten Lungengewebe Gewebeexpressionsvergleich des unveränderten Lungengewebes nach NDV Infektion und IFN Injektion Stark exprimierte Gene in NDV (A) vs K und NDV (A) vs NDV (U) Genexpression im veränderten Lungengewebe im Vergleich zur Kontrolle Genexpressionsvergleich des veränderten Lungengewebe nach NDV Infektion und IFN Injektion Gewebeexpressionsvergleich des veränderten Lungengewebes nach NDV Infektion und IFN Injektion Funktionelle Gruppen in Milz und Lunge nach NDV Infektion Pathway Express der Milz nach NDV Infektion Pathway Express der Lunge nach NDV Infektion IRGs nach NDV Infektion und IFN Injektion Pathway Express von IRGs und weiterer Gene nach NDV Infektion

12 Abkürzungsverzeichnis XII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 2 5 -OAS 2 5 -Oligoadenylatsynthetase ADAR Adenosin Deaminase AP Apurin-Apyrimidin Endonuklease AP-1 Aktivator Protein -1 APC Antigen präsentierende Zelle APOBEC3G Apolipoprotein B mrna editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G Aqua bidest. Bidestilliertes Wasser Aqua dest. Destilliertes Wasser ATP Adenosintriphosphat AUC Area under the curve Bak Bax BCL-2 BSA BSL bzw. BCL-2 antagonist/killer BCL-2 asoziiertes X Protein B cell leukemia/lymphoma-2 Bovines Serum Albumin Biosicherheitslevel Beziehungsweise CARD Caspase Aktivierungs und Rekrutierungsdomäne CCL CC-Chemokin Ligand CCR CC-Chemokin-Rezeptor cdc Konventionelle dendritische Zellen CDK-2 Cyclin abhängige Kinase 2 cdna Copy Desoxyribonukleinsäure Ch Chicken (Huhn) ChIFN- Hühner Interferon alpha ChIFN- ChIFN- ChIFN- CKI Cl CL C max CML CMV CpG CR CRF2 CRNA CT CV Cy3 Hühner Interferon beta Hühner Interferon gamma Hühner Interferon lambda CDK Hemmer Clearance C Chemokin Ligand Maximale Konzentration chronische myeloische Leukämie Zytomegalieviren Cytosin Phosphatidyl Guanin C-Chemokin Rezeptor Klasse II Zyotkin Rezeptor Familie Copy Ribonukleinsäure Cycle Threshold Variationskoeffizient Cyanine3 DAI DAP DDT DMSO DNA-PK DNS/DNA dsrns DNS-abhänige Aktivator des IRF Death associated Protein Dichlordiphenyltrichlorethan Dimethylsulfoxid DNS abhängigen Protein Kinase Desoxyribonukleinsäure Doppelstrang Ribonukleinsäure EBV Epstein Barr Viren EDTA Ethylendiamintetraacetat eif-2 eukaryotic translation initiation factors-2 EMCV Enzephalomyokarditits Virus ERK 2 extrazelluläre Signal regulierte Kinase 2 et al. Und andere (et alii)

13 Abkürzungsverzeichnis XIII F FADD FBS FBS FC FDR FITC fmlp -R GBP GDP GTP GTPase HA HBV HCl HCMV HCV HEF HIN-200 HIV HPAIV HPSE HS HSV-1 HWT Bioverfügbarkeit Fas-associated via death domain Fetal bovine serum Fetales Bovines Serum Fold Change False Discovery Rate Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat fmet-leu-phe-(fmlp)-rezeptor Guanylat bindende Proteine Guanosidipohosphat Guanosintriphosphat Guanosintriphosphatase Hämagglutinin Hepatitis B Virus Chlorwasserstoff humane Zytomegalie Virus Hepatitis C Virus Hühnerembryofibroblasten hematopoietic IFN-inducible nuclear protein with the 200-amino-acid repeat Humanes Immundefizienz Virus Hoch pathogene aviäre Influenza Viren Heparanase Heparan Sulfat Herpes-simplex Viren-1 Halbwertszeit i.m. Intra muskulär i.v. Intra venös IF16 IFN- induzierbares Protein 16 IFI44L IFN induziertes ähnliches Protein 44 IFIT IFN induzierten Proteine mit tetratricopeptid Wiederholungen IFITM-3 IFN induziertes transmembran Protein-3 IFN Interferon IFN- Interferon alpha IFN- Interferon beta IFN- Interferon omega IFN- Interferon kappa IFN- Interferon lambda IFN- Interferon epsilon IFN- Interferon delta IFN- Interferon ny IFN- Limitin IFN- Interferon tau IFN- IFN-gamma IFN R1, IL-28R Interferon lambda Rezeptor 1 IFNAR Interferon alpha Rezeptor IFNGR Interferon gamma Rezeptor Ig Immunglobulin IgG2a Immunglobulin G 2a IKK, NEMO NF- B essentiellen Modulator Il-xy Interleukin-xy inos induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase IRAK- Interleukin-1Rezeptor assoziierte Kinase IRF-1, -3, -5, -7 Interferon regulierender Faktor-1, -3, -5, -7 IRG Interferon-reguliertes Gen ISG Interferon stimulierte Gene ISG-15 IFN-stimuliertes Gen-15 ISG-20 IFN stimulierten Gen-20 ISGF-3 Interferon stimulierter Gen Faktor 3 IVPI intravenösen Pathogenitätsindex

14 Abkürzungsverzeichnis XIV Jak Janus Protein Tyrosin Kinase K203 Chicken Chemokine C-Cmotif Ligand Inflammatory 3 kda Kilo-Dalton KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LAL LGP-2 LPAIVΔNS1 LPS LPS LSL Ly49 LY6E Limulus Amebocyte Lysate laboratory of genetics and physiology-2 Low pathogenic avian invluenza virus delete NS1 Lipopolysaccharide Lipopolysaccharid Lohmann s Selected Leghorn Killer cell lectin like receptor Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Lokus E MAF Makrophagen aktivierende Faktor MAPK Mitogen aktivierende Protein Kinase MAVS, VISA, IPS-1, CARDIF mitochondriales antivirales Signal Protein MCOLN2 Mucolipin 2 MDA-5 Melanoma Differenzierungs assoziierten Gen-5 MDT Mittlere Todeszeit MEF mouse embryonic fibroblasts MEV Multi Experiment Viewer Min Minuten MNDA myeloid cell nuclear differentiation antigen mrna Messenger Ribonukleinsärue MS Multiple Sklerose MW Mittelwert Mx myxovirus resistance Gen MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 NA Neuraminidase NaCl Natriumchlorid NaOH Natrium Hydrogencarbonat NDV Newcastle Disease Virus NF- B nuclear factor kappa B NKT-Zelle Natürlichen Killer T-Lymphozyten NK-Zelle Natürliche Killerzelle NLR Nukleotid Oligomerisierungs Domäne ähnlicher Rezeptor NO Stickstoffmonoxid NOD1 Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1 OD PACT PAMP PAMP PBMC PBS PCR pdc PKC PKR PLSCR-1 PML pna PRR qrt-pcr Optische Dichte Protein Aktivator fort PKR pathogen-assoziierte molekulare Muster Pathogen associated molecular Pattern Periphere einkernige Blutzellen Phosphatgepufferte Salzlösung Polymerase Kettenreaktion Plasmazytoide dendritische Zelle Protein Kinase C Protein Kinase R Phopholipid Scramblase Promyelozytischen Leukämie Gen p-nitroanilin Mustererkennungsrezeptoren Quantitative Real Time Polymerase Kettenreaktion

15 Abkürzungsverzeichnis XV Rb RD rek RID RIG-I RIN RIP-1 RLR RNS/RNA rrna RSV RT SAM SDS Sek SFV sirna SOTA ssrns STAT SV TAB TAK-1 TBK-1 TGF- TH TIR TIRAP TLR TNF TRADD TRAF-3 TRAF-6 TRAIL TRAM TRIF TRIM-5 V Viperin VSV WNV Retinoblastoma Gen Produkt Unterdrücker Domäne Rekombinant Regulatoren des IFN vermittelten Todes Retinolsäure induzierbaren Gen RNA Integrity Number Rezeptor interagierenden Protein-1 Retinolsäure induzierbares Gen I ähnlicher Rezeptor Ribonukleinsäure Ribosomale Ribonukleinsäure Respiratorisches Synzytial Virus Raumtemperatur Significance Analysis of Microarrays Natrium Dodecylsulfat Sekunden Semliki Forest Virus Short interfering RNA Self organising tree algorithm Einzelstrang Ribonukleinsäure Signal transducer and activator of transcription Sendai Virus TAK-1 bindendes Protein TGF- aktivierten Kinase-1 TANK bindenden Kinase-1 transforming growth factor T-Helferzelle Toll/Interleukin-1 Rezeptor Toll/Interleukin-1 Rezeptor domain-containing adaptor protein Toll- ähnlicher Rezeptor Tumor Nekrose Faktor alpha Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain Protein TNF Rezeptor assoziierten Faktor- TNF Rezeptor assoziierten Faktor-6 Tumor Nekrose Faktor verwandte Apoptose induzierende Ligand Toll/Interleukin-1 Rezeptor domain-containg adaptor inducing IFN- -related adaptor molecule Toll/Interleukin-1 Rezeptor domain-containg adaptor inducing IFN- tripartite motif containing-5 Verteilungsvolumen Virus-inhibitory protein, endoplasmic reticulum associated, interferon inducible Vesikulo Stomatitis Virus West Nile Virus XAF-1 X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor 1 z.b. ZAP zum Beispiel Zink Finger antivirales Protein

16 Einleitung 1 1. EINLEITUNG Interferone stellen bei Säugern und Vögeln einen unverzichtbaren Teil der angeborenen Immunantwort dar. Intensive Forschung seit über 55 Jahren auf diesem Gebiet hat gezeigt, dass sie Schutz gegen viele Pathogene vermitteln und zudem immunmodulatorische Aktivität besitzen. Beim Säugetier kennt man drei Typen von Interferonen: Typ I, Typ II und Typ III Interferone und versteht mittlerweile die Mechanismen ihrer Induktion, die durch sie induzierten intrazellulären Signalkaskaden, durch sie induzierte weiterführende Abwehrstrategien des Organismus und wie es Viren gelingt, die Interferonantwort zu umgehen oder sie für ihre Zwecke zu nutzen. Von Zellen gebildetes Interferon löst die Induktion so genannter Interferon-regulierter Gene (IRGs) aus. Diese vermitteln die mannigfaltigen Aufgaben von Interferonen. Im Säugetier sind zahlreiche IRGs charakterisiert und in ihren Funktionsweisen erforscht. Auch wenn Typ I Interferon initial im Huhn entdeckt wurde, gibt es im Huhn noch viele Wissenslücken im Interferonsystem. Seuchenausbrüche beim Geflügel mit pandemischem Potential, wie beispielsweise Influenza, verdeutlichen die Notwendigkeit das Abwehrsystem des Vogels zu verstehen, um Mensch und Tier vor gefährlichen Krankheiten zu schützen. Insbesondere auf dem Gebiet der IRGs im Huhn ist noch viel Forschungsbedarf. Nur einzelne IRGs, wie PKR (Protein Kinase R), 2 5 OASL (2 5 -Oligoadenylat Synthetase Like) und Mx-1 (Myxovirus-Resistance Protein-1) sind näher charakterisiert [1, 2]. Mx-1 ist bei der Maus als der essentielle Faktor bei der Bekämpfung einer Influenza A Virus Infektion bekannt [3]. Die Frage, ob Mx-1 auch im Huhn eine wesentliche Rolle in der Abwehr einer Influenza Virus Infektion spielt, wird nach wie vor kontrovers diskutiert. Jedoch zeigen jüngste Arbeiten, dass Mx-1 im Huhn keine antivirale Aktivität gegen Influenzaviren besitzt [4]. Demnach scheint es Unterschiede in den Wirkmechanismen von bestimmten IRGs beim Säugetier und im Huhn zu geben, wobei nach wie vor die Frage ungeklärt ist, welche von ihnen im Huhn wesentliche Aufgaben bei der Abwehr einer Virusinfektion spielen. Im Gegensatz zu Vertretern der Säugetiere, für die diverse Datenbanken mit IRGs zur Verfügung stehen, die einen Überblick über zahlreiche durch Interferon induzierte Gene liefern, fehlen im Huhn bisher umfassende Übersichtsarbeiten über IRGs. Im Rahmen dieser Dissertation wurden daher mittels Datenbankrecherchen und verschiedener in vivo Ansätze die IRGs des Huhnes näher untersucht. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage im Huhn potentielle antiviral wirksame IRGs auszuwählen und sie funktionell näher zu charakterisieren.

17 Literaturübersicht 2 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1. Das Interferon System Interferone (IFNs) bilden einen unverzichtbaren Teil der angeborenen Immunantwort und sind essentiell bei der Bekämpfung vieler Infektionen. Im Säugetier spielen sie beispielsweise eine Schlüsselrolle bei der Abwehr von Influenzavirusinfektionen. Bereits 1957 entdeckten Isaacs und Lindemann IFN im Huhn [5]. Dabei identifizierten sie einen löslichen Faktor, der Hühnerallantoismembranen vor einer Infektion mit hoch pathogenen Influenzaviren (HPAIV) schützte. Weitere Untersuchungen zeigten, dass dieser Faktor auch eine wesentliche Rolle in der Abwehr vieler anderer Viren spielt, beispielsweise gegen Sendai Viren (SV), Vaccinia Viren und Newcastle Disease Virus (NDV) [6]. Da dieser lösliche Faktor mit der Virusreplikation interferierte, nannte man ihn Interferon (IFN). In den darauf folgenden Jahren wurden IFNs bei vielen Vertretern der Wirbeltiere entdeckt [7]. Komponenten der durch IFNs ausgelösten Signalkaskaden, wie beispielsweise Stat (Signal transducer and activator of transcription), sind auch in Intervertebraten zu finden. Dennoch wurde bisher kein IFN in diesen Organismen gefunden [8], obwohl es auch in diesen Tieren Hinweise auf ein Abwehrsystem, welches dem IFN System der Vertebraten ähnelt, gibt [9]. Die Forschung fokussierte sich hauptsächlich auf die Entschlüsselung der IFN vermittelten Mechanismen im Säugetier. Mittlerweile kennt man drei Klassen von IFNs: Typ I, Typ II und Typ III IFN. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Struktur, ihrer genomischen Sequenz, ihrer Rezeptor Spezifität und ihren biochemischen und biologischen Eigenschaften (siehe Tabelle 1). Tabelle 1 Übersicht über die Interferone Dargestellt sind die verschiedenen Typen von IFN beim Menschen und deren Unterschiede. Typ I Typ II Typ III Mitglieder IFN-α (alpha) IFN-β (beta) IFN-ω (omega) IFN-κ (kappa) IFN-ε (epsilon) IFN-δ (limitin) IFN-τ (tau) IFN-δ (delta) IFN-ν (ny) IFN-γ (gamma) IFN-λ1 (Il-29) IFN-λ2 (Il-28a) IFN-λ3 (il-28b) Sequenz unterschiedliche Sequenzen Struktur keine Introns Introns Introns Genomische Lokalisation Chromosom 9 Chromosom 12 Chromosom 19 Produziert von meisten Zellen Leukozyten meisten Zellen Rezeptor Spezifität IFNAR1/IFNAR2 IFNGR1/IFNGR2 IFN-λR1/Il-10R2 Besondere biologische Eigenschaften Vor allem antiviral Vor allem Immunmodulation Vor allem antiviral

18 Literaturübersicht 3 Alle IFNs gehören zu der großen Familie der Klasse II Zytokine. Zu dieser gehören neben den IFNs selbst, auch Il-10 (Interleukin-10), Il-19 (Interleukin-19), Il-20 (Interleukin-20), Il-22 (Interleukin-22), Il-24 (Interleukin-24), Il-26 (Interleukin-26) und einige weitere Il-10 verwandte Zytokine [10]. Ihre Gemeinsamkeit ist, dass sie an Rezeptoren binden, die gemeinsame Motive in ihrer extrazellulären Domäne besitzen. Diese Klasse von Rezeptoren nennt man auch CRF2 (Class II Cytokine receptor family). Ihren antiviralen, antibakteriellen und antiparasitären Schutz vermitteln Interferone durch die Beeinflussung von Zellwachstum und Zelldifferenzierung. Außerdem können sie die Apoptose von Zellen auslösen [11, 12]. Es scheint, als ob manche Viren alleine durch eine Typ I IFN-Antwort eliminiert werden können (Beispielsweise Semliki Forest Virus (SFV) und Vesikulo Stomatitis Virus (VSV)), während andere Viren sowohl eine Typ I IFN-, als auch eine Typ II IFN-Antwort benötigen um effizient eliminiert werden zu können (Vaccinia Virus, Theilier s murine Encephalomyelitis Virus und Lymphocytic Choriomeningitis Virus) [13]. In den ersten Jahren der IFN-Forschung glaubte man, dass Typ I IFNs die primär antiviral wirksamen IFNs sind und Typ II IFN das primär immunmodulatorisch wirksame IFN [14]. Mittlerweile weiß man, dass beide sowohl antiviral als auch immunmodulatorisch wirken [15]. Vielmehr scheint Ihre sich ergänzende antivirale Aktivität im frühen Stadium der Infektion bedeutend zu sein, während ihre immunmodulatorische Funktion in einem späteren Stadium der Infektion zum Tragen kommt - wenn die erworbene Immunantwort einsetzt [13]. Insgesamt spielen IFNs eine große Rolle bei Infektionen, Entzündungsgeschehen, Autoimmunität und Krebserkrankungen [16]. Aus diesem Grund werden sie inzwischen auch bei der Therapie von Infektionen mit Hepatitis C Virus (HCV), Hepatitis B Virus (HBV), Humanem Immundefizienz Virus (HIV), Hämatologischen Krebsarten, soliden Tumoren und Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose eingesetzt (MS) [17]. Initial im Huhn entdeckt, erlangte die Erforschung des Hühnerinterferons neue Bedeutung als es im Jahre 1994 gelang, Hühnerinterferon zu klonieren [18].

19 Literaturübersicht Interferone beim Säugetier Charakterisierung von Interferonen Bisher konnten bei Vertretern der Säugetiere drei Typen von IFNs identifiziert werden: Typ I, Typ II und Typ III IFNs. Im Folgenden werden die drei Typen von IFNs näher erläutert Typ I Interferone Beim Mensch sind bisher neun Mitglieder der Typ I IFN Familie bekannt (siehe Tabelle 1). Dabei sind IFN- und IFN- die am besten erforschten IFNs. Viele Mitglieder der Typ I IFN Familie kommen bei den meisten Säugetieren vor. Dazu zählen IFN-, IFN-, IFN- und IFN-. Einige Familienmitglieder konnten bisher nur in bestimmten Tierarten gefunden werden: IFN- findet man insbesondere im Genom von Primaten aber auch bei einigen anderen Säugetieren. IFN- findet man nur bei Nagetieren und IFN- bei Katzen [19, 20]. IFN- und IFN- spielen in der Reproduktion eine bedeutende Rolle und sind bisher nur bei behuften Wiederkäuern und Schweinen beschrieben [21-23]. Mit Bekanntwerden der Genomsequenzen wurde Chromosom neun des Menschen als humaner Typ I IFN Gen Cluster identifiziert [24]. Auf diesem werden 13 nicht alellische IFN- Gene, mindesten fünf Pseudogene und jeweils ein einziges funktionelles IFN-, IFN-, IFN- und IFN- Gen codiert. Den humanen Typ I IFNs fehlen Introns (mit einer Ausnahme: IFN-, welches ein Intron besitzt), eine Besonderheit, die sie mit den Genen für Histone und G-Protein gekoppelten Rezeptoren gemeinsam haben [25]. Auf Proteinebene codieren die 13 beschriebenen IFN- Gene 12 IFN- Proteine, da IFNA1 und IFNA13 für das gleiche Protein codieren [26]. Der murine Typ I IFN Cluster befindet sich auf Chromosom vier. Diese Region enthält mindestens drei Pseudogene, 14 funktionelle IFN- Gene und jeweils ein einziges Gen für IFN-, IFN- und IFN-. Die genaue Anzahl an IFN- Genen wird noch kontrovers diskutiert. Hardy et al. beschreiben mindestens zwei IFN- Gene, wobei van Pesch et al. von 16 IFN-z Genen sprechen [27, 28]. Fast alle kernhaltigen Zellen des Körpers können Typ I IFN bilden. Es gibt Zellen die im Vergleich zu anderen Zellen äußerst viel Typ I IFN bilden und ausschütten. So konnten im Säugetier pdcs (plasmazytoide dendritische Zellen) als besonders starke Typ I IFN Produzenten identifiziert werden. Diese Zellen können bis zu 1000 mal mehr Typ I IFN

20 Literaturübersicht 5 produzieren, wenn sie mit einem geeigneten IFN-Induktor stimuliert werden [29]. Mikroorganismen stellen einen Stimulus für Typ I IFN Produktion dar. Hierzu zählen Viren, Bakterien, Mykoplasmen, Protozoen und deren Produkte wie virale Glykoproteine, bakterielle Lipopolysaccharide, CpG DNS und ss und ds RNS (Einzelstrang und Doppelstrang RNS). Außerdem können auch wirtseigene Faktoren eine Typ I IFN-Antwort auslösen, wie Mitogene und eine Vielzahl an Zytokinen. Die gebildeten Typ I IFNs können auto- und parakrin wirken. Dafür binden sie an einen Rezeptor, der von fast allen Körperzellen exprimiert wird (zusammengefasst von [30]) und der aus zwei Untereinheiten besteht: IFNAR1 und IFNAR2c [31]. Beide Moleküle gehören zur Klasse II der Zytokin Rezeptor Superfamilie. IFNAR1 ist alleine nicht in der Lage Typ I IFN zu binden. Im Komplex mit IFNAR2 wird allerdings eine hochaffine Bindung geschaffen, was eine effiziente Signaltransduktion ermöglicht [32]. Die Bindung von Typ I IFN an seinen Rezeptorkomplex löst eine Signalkaskade aus. Diese ist in Kapitel genauer beschrieben. Am Ende der durch Typ I IFNs ausgelösten Signalkaskade steht die Transkription von IFNregulierten Genen (IRGs). IRGs sind für die Vermittlung und Ausführung der Aufgaben von Typ I IFN verantwortlich (siehe Kapitel 2.2.4). Dabei sind sie fähig in vielen verschiedenen Zellarten eine wirksame antivirale Aktivität zu induzieren. IFN- wird insbesondere nach Virusinfektionen rasch gebildet und sezerniert [33]. IFN- hingegen wird nach einer Infektion mit gram negativen Bakterien schnell gebildet. Außerdem wird IFN- daneben eine bedeutende Rolle bei der Zelldifferenzierung myeloider Zellen zugesprochen. Des Weiteren wirken Typ I IFN regulierte IRGs antiproliferativ und können bei Virus infizierten Zellen Apoptose auslösen. IFN-, welches bisher nur im Nagetier beschrieben ist, hat sogar im Vergleich zu anderen Typ I IFNs eine sehr hohe antivirale, immunmodulatorische und Tumor unterdrückende Wirkung. Dabei verursacht es weder Myelosuppression noch Fieber - Nebeneffekte, die andere Typ I IFNs stets hervorrufen. Diese Entdeckungen haben dazu geführt, dass IFN- als hoffnungsvoller neuer Kandidat für eine nebenwirkungsarme IFN-Therapie in Betracht gezogen wird (zusammengefasst von [30]) Typ II Interferon IFN- (IFN-gamma) stellt den einzigen Vertreter der Typ II IFNs dar. Es wurde im Jahre 1965 von E.F. Wheelock zum ersten Mal beschrieben [34]. Schon bald sprach man IFN- antivirale und vor allem immunmodulatorische Eigenschaften zu. Der endgültige Name IFN- wurde im Jahre 1980 festgelegt. Das für IFN- codierende Gen wurde bisher in vielen Säugetieren, in

21 Literaturübersicht 6 Vögeln und sogar im Knochenfisch und Fugu Fisch beschrieben. Niedrigere Eukaryoten scheinen kein IFN- ähnliches Gen zu besitzen (zusammengefasst von [35]). Die Expression von IFN- wird durch vielerlei extrazelluläre Signale ausgelöst. Zu den IFN- Induktoren zählen lösliche Mediatoren wie TNF (Tumor Nekrose Faktor alpha), Il-2 (Interleukin-2), Il-12 (Interleukin-12), Il-15 (Interleukin-15) und Il-18 (Interleukin-18) und die Vernetzung verschiedener Oberflächen Rezeptoren, wie CD3, CD16 und Ly49 (zusammengefasst von [30]). Diese Faktoren werden insbesondere von APCs (Antigen präsentierenden Zellen) nach Pathogen Erkennung ausgeschüttet [36-42]. Durch Ausschüttung von Zytokinen wie Il-12 und Il-18, rekrutieren APCs IFN- produzierende Zellen zum Entzündungsherd [43, 44]. Treffen mehrere induzierende Signale zusammen, kann eine verstärkte IFN- Induktion beobachtet werden. Es gibt auch Regulatoren, die hemmend auf eine IFN- Bildung wirken. Zu diesen zählen Il-4 (Interleukin-4), Il-10, TGF- (transforming growth factor ) und Glukokortikoide [45, 46]. IFN- wird insbesondere von folgenden Zellen gebildet: CD4 positiven und CD8 positiven T- Lymphozyten, NK-Zellen (Natürlichen Killerzellen) und NKT-Zellen (Natürlichen Killer T- Lymphozyten). Aber auch Makrophagen, B-Lymphozyten und Neutrophile Granulozyten produzieren IFN- (zusammengefasst von [30]). Das humane Gen, welches für IFN- codiert, befindet sich auf Chromosom 12. Das murine IFN- Gen auf Chromosom 10. Die Genstruktur ist speziesübergreifend hoch konserviert und besteht aus vier Exons und drei Introns. Die Gensequenz jedoch weist nur 40% Homologie zwischen Mensch, Maus und Ratte auf [47]. IFN- weist folgende Struktur auf: Das IFN- Monomer besteht aus sechs - Helices und C- Terminal einer ausgesetzten ungefalteten Sequenz. Um biologische Aktivität zu erhalten verbinden sich zwei Monomere antiparallel zum Dimer. Im Gegensatz zu Typ I IFNs ist IFN- säurelabil [48, 49]. Um eine zelluläre Antwort auszulösen, bindet auch IFN- an einen Rezeptor, der - ähnlich dem Rezeptor der Typ I IFNs - aus zwei Untereinheiten besteht: IFNGR1 und IFNGR2. Ein funktioneller IFN- Rezeptor ist ein Tetramer und besteht aus zwei IFNGR1 Untereinheiten und zwei IFNGR2 Untereinheiten [50, 51]. Bindung von IFN- an seinen Rezeptorkomplex löst die Jak-Stat Signalkaskade aus. Diese wird im Kapitel besprochen. Außerdem kann IFN- an das Glykosaminoglykan HS (Heperan

22 Literaturübersicht 7 Sulfat) auf Zelloberflächen binden. Eine Bindung an HS führt zur Hemmung seiner biologischen Aktivität [52]. Analog zu Typ I IFNs mündet ein durch IFN- aktivierter Signalweg in der Transkription von IRGs, die auch für die Vermittlung und Ausführung der Aufgaben von Typ II IFN verantwortlich sind. Insgesamt kann man sagen, dass IFN- und durch IFN- induzierte IRGs immunmodulatorische und antivirale Aufgaben erfüllen. Da es neben den durch die von IFN- regulierten IRGs ausgeübten Eigenschaften auch als Botenstoff des Immunsystems arbeitet, gehört IFN- in gewisser Weise auch zu den Interleukinen. Zu den immunmodulatorischen Aufgaben von IFN- zählt die Tatsache, dass IFN- die Ausbildung einer adaptiven Immunantwort unterstützt. Dies gelingt durch Förderung der T H 1-Zell-Antwort, Vermittlung des B-Lymphozyten Isotypen Klassenwechsels zu IgG2a [53-55] und der Regulation lokaler Entzündungsreaktionen durch Rekrutierung von Leukozyten zum Entzündungsherd. Außerdem regelt es Wachstum, Reifung und Differenzierung vieler Zellarten [35, 56, 57]. Zusätzlich fördert es die Hochregulierung von MHC Klasse I Molekülen auf der Zelloberfläche. Dies führt dazu, dass zytotoxische T- Lymphozyten besser in der Lage sind Fremdantigen zu erkennen [58-64]. Zudem ist allein IFN- in der Lage MHC Klasse II Moleküle auf der Zelloberfläche hochzuregulieren. Dies vermag es sowohl bei Zellen die konstitutiv MHC Klasse II Moleküle exprimieren, wie APC, als auch bei Zellen die MHC Klasse II Moleküle nicht konstitutiv exprimieren. So konnte bei Mensch und Maus gezeigt werden, dass dadurch vermehrt antigenspezifische CD4 positive T- Lymphozyten aktiviert werden [57, 65, 66]. Dennoch ist die durch IFN- ausgelöste T-Zell Antwort vor allem eine T H 1-Zell-Antwort. Dies wird durch Förderung spezifischer T H 1 Effektor Mechanismen erreicht: NK-Zell Effektor Funktionen werden gefördert, zytotoxische Immunität wird unterstützt und Makrophagen und Neutrophile Granulozyten werden aktiviert [57]. Zytotoxische Immunität wird dadurch erreicht, dass das Wachstum von T H 2-Lymphozyten gehemmt wird und Antigen Verarbeitung, Präsentation und Expression kostimulatorischer Moleküle gefördert werden. Außerdem treibt IFN- sich entwickelnde CD4 positive T- Lymphozyten in Richtung einer T H 1-Zell-Antwort, zum einen durch die Anwesenheit von IFN- selbst, zum anderen durch die geförderte Produktion von Il-12, während die Il-4 Produktion unterdrückt wird [67, 68]. Seine antiviralen Fähigkeiten vermittelt IFN- durch die Induktion spezifisch antiviral wirksamer Enzyme, wie PKR (Protein Kinase R) [69-74], ADAR (RNA specific Adenosin Deaminase) [75] und GBP1 und GBP2 (Guanylat bindende Proteine 1 und 2) [76-78]. Darüber hinaus greift IFN- auch in den Zellzyklus vieler Zellen ein, indem es den

23 Literaturübersicht 8 Zellzyklus von Makrophagen arretiert [79]. Andererseits kann IFN- aber auch die Apoptose von bestimmten Zellen fördern, in dem es proapoptotische Moleküle induziert [80, 81]. Beispiele hierfür sind PKR, DAP (Death Associated protein), Cathepsin D, Fas und der TNF Rezeptor [82-92]. Durch welche Mechanismen IFN- induzierte IRGs diese Aufgaben erfüllen wird genauer in Kapitel erläutert Typ III Interferone Im Jahr 2003 wurde ein dritter Vertreter der Interferone beschrieben: Typ III IFN, auch IFN- (IFN lambda) genannt [93-95]. Beim Menschen hat die IFN- Familie drei Mitglieder: IFN- 1, - 2 und - 3. IFN- 1 wird auch als Il-29 (Interleukin-29) bezeichnet, IFN- 2 als Il-28a (Interleukin-28a) und IFN- 3 als Il-28b (Interleukin-28b). Diese werden von drei funktionellen Genen auf dem humanen Chromosom 19 codiert, welches außerdem ein Pseudogen enthält: IFN- 4. Jedes der humanen Gene besteht aus fünf Exons und vier Introns [96]. Mäuse besitzen nur funktionelle Gene für IFN- 2 und - 3, die auf Chromosom 7 codiert sind. Murines IFN- 1 und IFN- 4 sind Pseudogene. Von den beim Menschen beschriebenen fünf Exons fehlt den Mäusen das komplette Exon zwei [97]. Da die Promotor Regionen von IFN- 1 und - 2 einander sehr ähnlich sind und viele gemeinsame Elemente mit der Promotor Region von IFN- 3 besitzen, geht man davon aus, dass ihre Expression auf die gleiche Weise induziert wird [98-100]. Des Weiteren konnten Bindungsstellen für dieselben Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die auch an den Typ I IFN Promotor binden können (AP-1, NF- B (Nuclear Factor kappa B) und VRE (Virus Response Elements) für IRF (IFN regulierende Faktor) Proteine) [ ]. Auch konnte allgemein gezeigt werden, dass Typ I und Typ III IFNs durch sehr viele gemeinsame Stimuli (Viren und andere TLR Agonisten) induziert werden [105, 106]. IFN- s ähneln in Struktur und Sequenz Mitgliedern der Il-10 Familie. Auf Grund der großen Ähnlichkeit zu Typ I IFNs hinsichtlich Induktion und Wirkungsweise werden sie aber zu den Interferonen gezählt [93, 94]. Vergleicht man die Aminosäuresequenzen von Typ III IFN mit anderen IFNs und Il-10 verwandten Zytokinen, so besteht zu beiden nur eine sehr geringe Homologie von 10-18% [107]. Typ III IFNs binden an einen Rezeptorkomplex bestehend aus dem für IFN- spezifischen IFN R1 (IFN- Rezeptor 1 oder IL-28R ) und einer Kette des Rezeptors der Il-10 Familie: Il-

24 Literaturübersicht 9 10R2 [93, 94, 108]. Neben IFN- nutzen diesen auch Il-10, Il-22 und Il-26 [109]. Während der Il-10R2 von fast allen Körperzellen exprimiert wird, wird IFN R1 nur auf bestimmten Zelllinien gefunden. Epithelzellen sprechen außerordentlich gut auf eine Behandlung mit Typ III IFNs an und scheinen die Zielzellen für Typ III IFNs zu sein. Bezüglich anderer Zellarten kann bisher mit Sicherheit gesagt werden, dass primäre Fibroblasten, HUVEC (Humane Nabelvenen Endothelzellen) und murine Milzzellen keinen IFN R1 auf ihrer Oberfläche tragen [97, 110]. PBMCs (Periphere einkernige Blutzellen) und Knochenmarks- Zellen reagieren nur mit schwacher Aktivierung auf eine Behandlung mit Typ III IFNs [97]. Auch scheinen die meisten Leukozyten keinen IFN R1 auf ihrer Oberfläche zu tragen [111]. Erwähnenswert erscheint in diesem Zusammenhang, dass der IFN R1 zusammen mit dem IL- 22R1 (Il-22 Rezeptor 1) auf dem humanen Chromosom 1 codiert wird, was die Möglichkeit nahelegt, dass die Expression beider Rezeptoren durch dieselben Stimuli reguliert wird [107, 109]. Bindet ein Vertreter der IFN- Familie an seinen Rezeptorkomplex löst dies wiederum die Aktivierung der Jak-Stat Signalkaskade aus. Um eine hochaffine Bindung zu erhalten, benötigt IFN- die Anwesenheit beider Rezeptor Untereinheiten. IFN- bindet zuerst an die IFN R1 Untereinheit. Dies führt zu einer Konformationsänderung, wodurch der Il-10R2 rekrutiert werden kann [94]. Schließlich steht auch bei Typ III IFNs am Ende der Signalkaskade die Transkription von IRGs, die für die Vermittlung und Ausführung der Aufgaben von Typ III IFNs verantwortlich sind. Bis heute sind allerdings noch keine spezifischen Typ III IRGs beschrieben. Doch konnte für zahlreiche IRGs gezeigt werden, dass sie auch durch Typ III IFNs reguliert werden [112, 113]. Daher ist es nicht überraschend, dass die Aufgaben von Typ III IFNs sich mit denen von Typ I IFNs (und auch Typ II IFN) oftmals überschneiden. Ebenso wie Typ I IFNs wirken sie antiviral und fördern die MHC Klasse I Expression. Die durch IRGs vermittelten Aufgaben werden in Kapitel noch genauer beschrieben.

25 Literaturübersicht Induktion einer Interferon Antwort In den Körper eingedrungene Pathogene haben typische, konservierte Erkennungsmerkmale, was es Körperzellen ermöglicht, Pathogene als fremd zu erkennen und eine Immunantwort auszulösen. Diese Erkennungsmerkmale werden pathogen-assoziierte molekulare Muster (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) genannt und binden an so genannte Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRRs), die viele Körperzellen besitzen oder sogar frei löslich im Blutplasma vorkommen. Erkennen PRRs in den Körper eingedrungene Pathogene über deren PAMPs, werden Signalkaskaden in Gang gesetzt. Dadurch werden Interferone und andere Zytokine gebildet. Dies ermöglicht eine rasche Immunantwort, die das Ausbreiten des Pathogens verhindert und dieses schließlich beseitigt oder bis zur Ausbildung einer adaptiven Immunantwort in Schach hält [ ] Pathogen-assoziierte molekulare Muster Meist sind PAMPs sich wiederholende molekulare Strukturen auf der Pathogen Oberfläche. Im Falle von Bakterien sind dies beispielsweise Lipopolysaccharide (LPS) der äußeren Membran von gram negativen Bakterien oder Lipoteichonsäure von gram positiven Bakterien. Ein weiteres Erkennungsmerkmal von Bakterien sind nichtmethylierte CpG Motive. Erkennungsmerkmale von Viren sind ss (Einzelstrang) RNS oder ds (Doppelstrang) RNS, welche von diesen in der Regel im Laufe ihres Vermehrungszyklus, nicht aber von eukaryotischen Zellen exprimiert werden (zusammengefasst von [117]) Mustererkennungsrezeptoren Es gibt unterschiedliche Gruppen von PRRs, die bestimmte PAMPs erkennen. Zu den PRRs gehören die TLRs (Toll-Like Receptors), die RLRs (Retinoic Acid-inducible Gene I-Like Receptors) und DNS und RNS Sensoren des Zytosols (zusammengefasst von [116]). Diese drei großen Gruppen spielen insbesondere bei der durch Viren ausgelösten IFN Induktion eine bedeutende Rolle und sind in Abbildung 1 nochmals schematisch dargestellt. Die NLRs (Nucleotide Oligomerization Domain-Like Receptors, auch NACHT, LRR und PYD Domäne Proteine genannt) sind essentiell für die Aktivierung anderer wichtiger Zytokine wie Il-1 und Il-18 [118].

26 Literaturübersicht 11 Abbildung 1 (PRRs) Schematischer Überblick über eine Auswahl von Mustererkennungsrezeptoren Zu den PRRs zählen die endosomal lokalisierten TLR (Toll-Like Receptors) 3, 7, 8 und 9, die zur Familie der RLR (Retinoic Acid-inducible Gene I-Like Receptors) gehörenden RIG-I (Retinoic acid-inducible Gene) und MDA-5 (Melanoma Differentiation-Associated Gene 5) und die PKR (Proteinkinase R). Binden diese Rezeptoren ihren Liganden, kommt es zur Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren und schließlich zur Transkription von Interferonen. Toll- Like Rezeptoren TLRs spielen insbesondere bei der Erkennung einer viralen oder bakteriellen Infektion eine bedeutende Rolle. Ursprünglich wurden sie bei der Taufliege Drosophila melanogaster entdeckt. Mittlerweile weiß man, dass sie bei der Bekämpfung von Infektionen in Pflanzen, adulten Insekten und Vertebraten eine große Rolle spielen. Fast alle Vertebraten haben mindestens einen Vertreter jeder Gruppe [119]. Die TLRs sind vermutlich die am intensivsten erforschten PRRs. Sie gehören zu den Typ 1 Transmembran Proteinen und befinden sich auf der Zelloberfläche oder in der Membran von Endosomen. TLRs, die sich an der Zelloberfläche befinden, erkennen PAMPs aus hydrophoben Lipiden und Proteinen, während intrazellulär lokalisierte TLRs vor allem Nukleinsäuren

27 Literaturübersicht 12 erkennen. Einerseits ist es ihnen dadurch möglich, Pathogene anhand deren Hüllproteine bereits im extrazellulären Raum zu erkennen, andererseits haben Pathogene Mechanismen entwickelt, der Erkennung durch Zellen des angeborenen Immunsystems zu entgehen und diese zu infizieren. Durch die intrazellulär lokalisierten TLRs können Viren schließlich doch noch erkannt werden. Für die TLR Familie des Menschen sind 10 für die Maus 13 Rezeptoren beschrieben. TLR 1-9 kommen in beiden Spezies vor. Dabei befinden sich TLR1, 2, 4, 5 und 6 auf der Plasmamembran und TLR3, 7, 8 und 9 sind endosomal lokalisiert [120]. Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über die beim Menschen vorkommenden TLR, ihre Liganden und welche Mikroorgansimen diesen Liganden besitzen. Tabelle 2 Humane Toll-Like Rezeptoren und ihre Liganden TLR können in endosomalen Membranen (rot) oder Zelloberflächenmembranen (schwarz) lokalisiert sein, Tabelle modifiziert nach [30]. Rezeptor Ligand Ursprung des Liganden TLR1 Triacyl Lipopeptide Lösliche Faktoren TLR2 Hitze Schock Protein 70 Peptidoglycan Lipoprotein/Lipopeptide HCV core und nicht strukturelles Protein 3 TLR3 dsrns Viren TLR4 Lipopolysaccharide Taxol TLR5 Flagellin Bakterien TLR6 TLR7 TLR8 Zymosan Lipoteichonsäure Diacyl Lipopeptide ssrns Imidazoquinoline ssrns Imidazoquinoline Bakterien und Mykobakterien Neisseria meningitidis Wirt Gram positive Bakterien Verschiedene Pathogene Hepatitis C Virus Gram negative Bakterien Pflanzen Pilze Gram positive Bakterien Mykoplasmen Viren Synthetische Stoffe Viren Synthetische Stoffe TLR9 CpG enthaltende DNS Bakterien und Viren TLR11 Profilin ähnliche Moleküle Toxoplasma gondii Alle TLRs haben den gleichen Aufbau. Sie gehören zu den Typ I Transmembranproteinen und bestehen aus extrazellulären gelegenen Leucin Rich Repeats und einer intrazellulären TIR (Toll/Interleukin-1 Receptor) Domäne [121]. Diese Rezeptoren dimerisieren und rekrutieren verschiedene Adapter Proteine. Hierzu gehören TIRAP (TIR-Domain-Containing Adaptor Protein), MyD88 (Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88), TRIF (TIR-Domain-

28 Literaturübersicht 13 Containg Adaptor Inducing IFN- ) und TRAM (TRIF-Related Adaptor Molecule) [ ]. Diese Adapter Proteine aktivieren NF- B (Nuclear Factor 'kappa-light-chain-enhancer' of Activated B-cells), die MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) und IRF-1, -3, -5 und -7 (IFN-Regulating Factors-1, -3, -5, und -7). Diese Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von IFNs, anderen Zytokinen und Chemokinen und beeinflussen die Zellreifung und das Überleben von Zellen [127]. Die nach viraler Infektion ausgelöste TLR-Signalkaskade ist in Abbildung 2 schematisch dargestellt. Abbildung 2 Schematische Darstellung der Virus induzierten Toll-Like Receptor (TLR) Signalkaskade Nach viraler Infektion der Zelle finden sich im Zytoplasma virale ssrns, dsrns und virale CpG- Motive. Diese binden an endosomal lokalisierte TLRs. Im Fall von TLR7, 8 und 9 kommt es zur Rekrutierung von MyD88 (Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88) und IRF (Interferon-Regulatig Factors), die letztendlich in den Zellkern translozieren und die Transkription von Interferonen veranlassen [122, 123, 125, 128]. Bindet ssrns an TLR3 kommt es zur Rekrutierung von TRIF (TIR-Domain-Containg Adaptor Inducing IFN- ), RIP-1 (Receptor Interacting Protein-1) und TRAF-3 (TNF Receptor Associated Factor-3). TRIF und RIP-1 Rekrutierung mündet ebenfalls in der Aktivierung von NF B (Nuclear Factor 'kappa-light-chain-enhancer' of Activated B-Cells) [123, 124, 129]. Rekrutierung von TRAF-3 führt zur Aktivierung von IRF-3 und IRF-7, die ihrerseits die Transkription von Interferonen veranlassen [104, ]. (Modifiziert nach [134] und zusammengefasst von [135])

29 Literaturübersicht 14 Retinoic acid-inducible gene I-Like Rezeptoren RLRs sind wichtige intrazytoplasmatische, virale Sensoren, die in vielen Zellarten vorkommen. Zu diesen zählen Fibroblasten, Lymphozyten, Epithelzellen und cdcs (konventionelle dendritische Zellen) [ ]. Die RLR Familie besteht aus drei DExD/H box RNS Helikasen: RIG-I (Retinoic acid-inducible Gene), MDA-5 (Melanoma Differentiation-Associated Gene 5) und LGP-2 (Laboratory of Genetics and Physiology-2) [139]. RIG-I und MDA-5 erkennen dsrns. MDA-5 erkennt außerdem noch poly I:C, RIG-I hingegen zusätzlich noch ssrns [ ]. Dem dritten Familienmitglied LGP-2 fehlen für die Aktivierung essentielle Bestandteile, die RIG-I und MDA-5 besitzen [ ]. Daher wird vermutet, dass LPG-2 regulierend auf RIG-I und MDA-5 wirkt, aber auch dsrna erkennen kann [149]. Hinweise für eine regulatorische Funktion liefern einerseits, dass sich eine Überexpression von LGP-2 negativ auf eine New Castle Disease Virus (NDV) und Sendai Virus (SV) induzierte IFN Produktion auswirkt. Ein weiterer Hinweis hierfür ist, dass mit poly I:C stimulierte Mäuse ohne LGP-2 eine verstärkte IFN-Antwort zeigen [144, 145, 148]. Andererseits wurde auch gezeigt, dass LGP-2 die RLR-spezifische antivirale Funktion fördert [150]. Aktivierung von RIG-I und MDA-5 führt zur Transkription von Typ I IFNs [139, 151]. Zyotosolische DNS und RNS Sensoren Die Vermutung, dass es neben TLRs und RLRs weitere zyotosolische DNS Sensoren geben muss, kam auf, als TLR9 -/- MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts), die nicht auf CpG DNS reagierten, auf Transfektion mit synthetischer b-form dsdns oder genomischer DNS aus Bakterien, Viren oder Säugetierzellen mit massiver IFN Expression reagierten [152]. Die durch zytosolische DNS Sensoren aktivierten Signalkaskaden münden ebenfalls in der Aktivierung von TBK-1 und IRF und letztendlich in der Expression von Typ I IFNs [ ]. Zu den zytosolischen DNS Sensoren gehören DAI (DNA-Dependent Activator of IFN-Regulatory Factors) [156, 157], IFI16 (IFN-Inducible Protein 16) [158], die RNA Polymerase III [159, 160], LRRFIP1 (Leucine-Rich Repeat (LRR)-Containing Protein) [161], Ku70 [162] und DHX9 bzw. DHX36 (DEAD/H-box Helicases 9 bzw. 36) [163]. Als zytosolischer RNS Sensor arbeitet die ubiquitär vorkommende Serin/Threonin Protein Kinase PKR. Sie wird durch dsrns im Zytoplasma aktiviert, aber auch durch eine Vielzahl weiterer Signale wie Zytokine (darunter IFN selbst), Wachstumsfaktoren und zellulären Stress. Die Aktivierung von PKR führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF B und dadurch wiederum zur Transkription von IFNs [164]. Da PKR selbst zu den antiviral wirksamen IRGs zählt, wird in Kapitel noch einmal näher auf PKR und seine Funktionen eingegangen.

30 Literaturübersicht Die Interferon vermittelten Signalkaskaden Sobald Interferone durch diverse Stimuli induziert werden, werden sie ausgeschüttet und binden an ihre Rezeptoren auf der Zelloberfläche bestimmter Zellen. Diese Bindung löst die Aktivierung diverser Signalkaskaden, insbesondere der Jak-Stat Signalkaskade aus [165]. An dieser Signalkaskade sind zwei Janus Protein Tyrosin Kinases (Jak1 und 2) beteiligt, die verschiedenen Stats (Signal Transducer and Activator of Transcription) phosphorylieren und aktivieren, die wiederum als Transkriptionsfaktoren wirken [166]. Die Jak-Stat Signalkaskade wird von über 50 Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Hormonen zur Signaltransduktion genutzt [167]. Üblicherweise unterscheiden sich die durch Typ I /Typ III und die durch Typ II IFNs aktivierten Jak-Stat Signalkaskaden. Der Rezeptor der Typ I IFNs IFNAR1 ist mit der Janus Kinase TYK2 und IFNAR2 mit JAK1 assoziiert. Ligandenbindung führt zur Phosphorylierung des Rezeptorkomplexes. Dieser bindet nun die SH2 Untereinheiten von Stat 1 und 2. Dadurch werden bestimmte Tyrosine von Stat1 und 2 phosphoryliert. Stat1 und 2 können nun mit IRF-9 assoziieren und bilden den Transkriptionsfaktor ISGF3 (IFN-Stimulated Gene Factor 3) [168, 169]. ISGF3 transloziert in den Nukleus, wo es an ISRE (IFN-Stimulated Response Elements) bindet [170, 171]. Diese befinden sich in den Promoter Region von IRGs und bestehen aus einer definierten Nukleotid Sequenz (AGTTTN3TTC). Durch Bindung von ISGF3 an ISRE wird die Expression von IRGs entweder veranlasst oder aber gehemmt. Für Typ I IFNs konnte nachgewiesen werden, dass sie neben ISGF3 auch andere Stats zur Signaltransduktion benutzen. Dies konnte für Komplexe aus Stat1/Stat1, Stat3/Stat3 und Stat5/Stat5 Homodimeren und für Stat3/Stat1 und Stat2/Stat1 Heterodimere gezeigt werden. Auch sie binden im Nukleus an bestimmte Promotor Regionen - jedoch nicht an ISRE. Diese Promotor Regionen enthalten die Nukleotid Sequenz (TTCN(2-4)GAA), auch GAS (Gamma Activated Sequence) genannt, welche wie ISRE, Bestandteil von Promotor Regionen vieler IRGs ist [ ]. Des weiteren nutzten Typ I IFNs auch einen Komplex aus Stat5/CrkL zur Signaltransduktion [176]. CrkL (v-crk Sarcoma Virus CT10 Oncogene Homolog (Avian)-Like) ist Teil der dreiköpfigen CrK Protein Familie. Diese sind zelluläre Homologe des v-crk Protoonkogens. Stat5 interagiert konstitutiv mit TYK2. In Anwesenheit von IFN wird Stat5 phosphoryliert. Daraufhin bindet CrkL an die SH2 Domäne von Stat5. Dieser Komplex aus Stat5 und CrkL transloziert in den Nukleus und bindet ebenfalls an GAS-Elemente [176].

31 Literaturübersicht 16 In reifen B-Lymphozyten kann IFN auch einen ISGF3 ähnlichen Komplex aus Stat2/6 und IRF- 9 zur Signaltransduktion nutzen [177]. Im Fall von IFN- ist der Rezeptorkomplex mit den Janus Kinasen Jak1 und Jak2 assoziiert. Ligandenbindung an den Rezeptor führt zur Autophosphorylierung von Jak2 und dessen Aktivierung. Dadurch wird Jak1 transphosphoryliert [178]. Das aktivierte Jak1 phosphoryliert Tyrosine der IFNGR1 Untereinheiten. Dadurch können sich SH2 Domänen von Stat1 mit der IFNGR1 Untereinheit verknüpfen [179]. Stat1 löst sich als Homodimer von dem Rezeptor. Diesen Homodimer nennt man auch GAF (Gamma IFN Activating Factor) [180]. GAF transloziert in den Zellkern und bindet GAS [175]. Durch diese Bindung wird die Transkription von IRGs gefördert oder gehemmt [181]. Die erste Welle an IFN- induzierter Gen Expression erfolgt innerhalb Minuten nach IFN- Behandlung [182]. Viele der induzierten Gene sind wiederum Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise IRF-1, welche die nächste Welle der IFN- Antwort aufrechterhalten sollen. Bindet ein Vertreter der Typ III IFN Familie an seinen Rezeptorkomplex löst auch dies die Aktivierung der Jak-Stat Signalkaskade aus. Bisher ist noch nicht sicher bekannt, welche Janus Kinasen durch Ligandenbindung phosphoryliert werden. Kotenko et al. konnten aber 1997 zeigen, dass TYK2 mit Il-10R2 interagieren kann [183]. Die weiterfolgende Signalkaskade ist mit der durch Typ I IFNs ausgelösten vergleichbar. Es kommt zur Bildung des Transkriptionsfaktors ISGF3. ISGF3 transloziert in den Zellkern und bindet an ISRE. Dadurch kommt es zur Transkription von IRGs. Bis heute sind noch keine spezifischen Typ III IFN regulierten Gene beschrieben, doch konnte für zahlreiche IRGs gezeigt werden, dass sie auch durch Typ III IFNs reguliert werden. Inzwischen konnte nachgewiesen werden, dass sich die durch Typ I/III IFNs und Typ II IFN ausgelösten Signalkaskaden überschneiden. Früher glaubte man, dass ISGF3 der für Typ I IFN spezifische Transkriptionsfaktor ist und GAF der für Typ II IFN spezifische Transkriptionsfaktor. Mittlerweile weiß man aber, dass auch Typ I IFNs GAF als Transkriptionsfaktor gebraucht und Typ II IFN ISGF3 [184]. Diese Überschneidungen ermöglichen es, dass sich die, durch die verschiedenen Typen ausgelösten IFN-Antworten gegenseitig unterstützen oder sich gegebenenfalls gegenseitig aufheben. Durch die Überschneidungen lassen sich auch die ähnlichen Wirkungsweisen der Interferone erklären. Dies stützt außerdem die Theorie, dass nicht ein einziges Zytokin eine antivirale Antwort auslöst, sondern dass dies vielmehr durch einen ganzen Zytokincocktail vermittelt wird, der viele interagierende Signalkaskaden aktiviert.

32 Literaturübersicht 17 In Abbildung 3 ist die klassische durch alle drei Typen von Interferonen induzierte Jak-Stat Signalkaskade schematisch dargestellt. Abbildung 3 Die klassische durch Interferone induzierte Jak-Stat Signalkaskade. IFNs binden an ihre jeweilige Rezeptoren, die mit Janus Kinasen assoziiert sind und Stats rekrutieren und aktivieren. Alle drei Typen von IFNs können den Transkriptionsfaktor ISGF3 (Interferon Stimulating Gene Factor 3), bestehend aus Stat1/Stat2/IRF-9, aktivieren. Dieser transloziert in den Nukleus und bindet an ISRE (IFN- Stimulated Response Elements) in den Promotor Regionen von bestimmten IRGs (IFN-Regulated Genes). Typ I und Typ II IFNs könne außerdem GAF (Gamma Activating Factor), bestehend aus einem Stat1/Stat1 Homodimer aktivieren. GAF transloziert in den Nukleus und bindet an GAS (Gamma Activating Sequences) Elemente, die ebenfalls in den Promotor Regionen bestimmter IRGs zu finden sind. Schon lange gibt es Hinweise, dass eine IFN-Antwort nicht alleine durch die Jak-Stat Signalkaskade vermittelt wird. Im Gegenteil - je mehr über IFNs und über die durch IFNs ausgelösten Signalkaskaden bekannt wird, desto deutlicher wird, wie komplex eine IFN- Antwort ist. Im Folgenden sind einige Signalwege aufgeführt, die neben der Jak-Stat Signalkaskade zu der durch IFNs induzierten biologischen Antwort beitragen. Eine Beteiligung an einer IFN-Antwort konnte für Mitglieder der IRS-1 und -2 (Insulin

33 Literaturübersicht 18 Receptor Substrate-1 und -2) gezeigt werden [185, 186]. Mögliche Folge dieser Aktivierung ist eine PI3K (Phospatidylinositol-3-Kinase) vermittelte Aktivierung der Serin/Threonin Protein Kinase mtor (mammalian Target Of Rapamycin) [187]. So trägt auch die mtor Signalkaskade zur Expression Typ I induzierter IRGs bei. Auch konnten für die MAPK, ERK2 (Extrazellular Signal Regulating Kinase 2) und p38 gezeigt werden, dass sie eine Rolle in der Typ I IFN Vermittlung spielen [188]. Die MAPK Signalkaskade mündet sowohl in ISRE, als auch in GAS vermittelter Genexpression von IRGs [189]. Eine gewisse Bedeutung bei der Aktivierung einer IFN-Antwort scheint auch das Vav Protoonkogen zu haben. Vav ist ein Guanin austauschender Faktor in der Rho/Rac Familie der GTPasen (Guanosintriphosphatases) und viele unterschiedliche Stimuli können eine Thyrosinphosphorylierung von Vav auslösen, zu denen auch IFN zählt. Dabei assoziiert Vav sowohl mit IFNAR1 als auch mit IFNAR2 und bildet einen Komplex mit den Tyk2 und Ku80 Untereinheiten der DNA-PK (DNA dependent Protein Kinase). Zwar ist die Rolle von Ku80 bei einer IFN-Antwort noch nicht erforscht, es könnte aber die Genexpression beeinflussen. Es wird außerdem angenommen, dass die IFN induzierte Phosphorylierung von Vav die GDP/GTP (Guanosindiphosphat/Guanosintriphosphat) Austauschaktivität von Rac-1 (RAS-related C3 Botulinum Substrate 1) fördert, was wiederum die MAPK Signalkaskade aktiviert [190, 191]. Zuletzt ist zu erwähnen, dass auch Mitglieder der PKC (Protein Kinase C) Familie durch Typ I IFNs aktiviert werden. So aktiviert IFN PKC-, welche wiederum die Phosphorylierung von Stat1 reguliert. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung von PKC- sowohl die GAS- und ISRE- vermittelte Gen Transkription, als auch die Aktivierung des MAPK Signalweges behindert [192] Interferon-regulierte Gene Die vielfältigen Funktionen von IFNs werden durch IRGs (IFN-Regulated Genes) vermittelt. Das bedeutet, dass durch IFNs die Expression von Genen induziert wird, die antivirale, antibakterielle, antiparasitäre, immunmodulatorische und apoptotische Eigenschaften haben und außerdem den Zellzyklus, die Zellproliferation und die Zelldifferenzierung beeinflussen. Die ersten IRGs wurden vor über 30 Jahren beschrieben [193] und in den darauf folgenden Jahren konnten zahlreiche durch IFNs induzierte Gene identifiziert werden. Einige wenige wurden auch hinsichtlich ihrer Funktion eingehend untersucht. Dazu gehören antiviral, apoptotisch und immunmodulatorisch wirkenden IRGs, von denen in den folgenden Absätzen

34 Literaturübersicht 19 einige eingehender besprochen und ihre Funktionsmechanismen näher erläutert werden. Antiviral wirksame IRGs können fast jeden Schritt eines viralen Lebenszyklus beeinflussen. Manche induzieren weitere IRGs und IFNs um den Effekt noch zu verstärken. Zu den antiviral wirkende IRGs deren Mechanismen eingehend untersucht wurden gehören PKR, 2-5- OAS/RNase L und das Mx (Myxovirus Resistance) Protein (zusammengefasst von [30]). Antivirale Eigenschaften wurden außerdem der ADAR-1 (Adenosin Deaminase 1), den IFITs (Familiy of IFN-induced Protein with Tetratricopeptide Repeats), Viperin (Virus-Inhibitory Protein, Endoplasmatic Reticulum associated, Interferon inducible), PLSCR-1 (Phopholipid Scramblase) und ISG-20 (IFN Stimulated Gene-20) zugesprochen [ ]. Seit einiger Zeit werden auch antiviral wirksame IRGs APOBEC3G (Apolipoprotein B mrna Editing Enzyme, Catalytic Polypeptide-Like 3G), TRIM-5 (Tripartite Motif Containing-5), ZAP (Zinc Finger Antiviral Protein), ISG-15 (IFN-Stimulated Gene-15) und BST-2 (Tetherin) intensiv erforscht, in der Hoffnung insbesondere im Kampf gegen HIV neue Therapieansätze zu finden [198, 199]. Mx zählt wohl zu den am intensivsten erforschten IRGs. Schon 1962 konnte dieser antivirale Effekt von Mx bei der Maus festgestellt werden, als Mäuse des Inzuchtstammes A2G die intrazerebrale Infektion mit einem an die Maus adaptierten neurotropen Influenza A Virusstamm überlebten [200]. Staeheli et al. konnten schließlich in MEFs von Mäusen dieses Inzuchtstammes zeigen, dass die antivirale Wirkung von Mx durch Typ I IFNs ausgelöst wird [201]. Insgesamt konnte für Mx eine antivirale Aktivität gegen eine Vielzahl von Viren gezeigt werden. Sowohl gegen negativ orientierte ss RNS Viren wie Influenza Viren, Masern Viren, Thogoto Viren, Vesikulo Stomatitis Viren und Bunyaviren, als auch gegen positiv orientierte RNS Viren wie Semliki Forest Viren und Coxsackie B Viren [ ]. Mx Proteine gehören zur Familie der großen GTPasen. Teil dieser Familie sind auch Dynamine und die IFN regulierten Guanylat bindenden Proteine. Für die meisten Vertebraten ist mindestens eine Isoform von Mx beschrieben. Mx ist entweder im Zellkern oder im Zytoplasma lokalisiert [209]. Die Maus besitzt zwei Mx Isoformen: Mx1 und Mx2. Für beide konnte eine antivirale Aktivität gezeigt werden. Mx1 befindet sich im Zellkern und ist ein entscheidender antiviraler Faktor bei Infektionen mit Influenzaviren und Togaviren, die beide im Nukleus replizieren. Mx2 ist intrazytoplasmatisch lokalisiert und ist antiviral gegen die intrazytoplasmatisch replizierenden Bunyaviren wirksam. Der Mensch besitzt zwei Mx Isoformen die im Zytoplasma lokalisiert sind: MxA und MxB, wobei bislang lediglich für MxA eine antivirale Wirksamkeit gegen viele Viren gezeigt werden konnte [210]. Seine antivirale Aktivität vermittelt Mx über die Bindung von GTP und die dadurch veranlasste Hydrolyse [211]. Einerseits unterbricht Mx die Polymerase Aktivität von Viren und blockiert so deren Replikation. Andererseits kann Mx

35 Literaturübersicht 20 Ribonukleoproteine binden und dadurch die virale RNS Transkription verhindern. Des Weiteren verhindert Mx den Transport von viraler mrns und Nuklokapsiden und damit den Zusammenbau von Viruspartikeln. PKR zählt zu den Serin/Threonin Kinasen. Den viralen Replikationszyklus unterbricht PKR indem es nach Bindung von viraler dsrns eine Konformationsänderung erfährt. Hierdurch kann es die alpha Untereinheit des eif-2 (Eukaryotic Translation Initiation Factor-2) phosphorylieren. Dadurch wird verhindert, dass Initiatoren von Translationfaktoren wiederverwendet werden, und schränkt die de novo Proteinsynthese ein [212]. Die antivirale Eigenschaft von PKR ist Virus spezifisch. So konnte eine antivirale Wirksamkeit gegen Vesikulo Stomatitis Virus (VSV) und Influenza Viren nachgewiesen werden, jedoch nur eine eingeschränkte antivirale Wirksamkeit gegen Enzephalomyokarditis Virus (EMCV) oder Vaccinia Viren [ ]. Dabei starben PKR -/- Mäuse an einer im Wildtyp klinisch inapparent verlaufenden intranasalen Infektion mit VSV und zeigten verstärkte Empfänglichkeit für eine Infektion mit Influenza Viren (A/WSN/33 Influenza Virus Stamm) [213]. Virale dsrns induziert auch die Expression von 2-5 -OAS [217]. OAS sind Enzyme die die Polymerisation von Adenosintriphosphat (ATP) in verknüpfte Oligoadenylate katalysieren. Diese Oligoadenylatfragmente aktivieren konstitutiv vorhandene RNase L, welche einzelsträngige zelluläre und virale RNS spalten kann und damit die virale Proteinsynthese inhibiert. Außerdem inhibiert RNase L den Proteinbaukasten der Zelle, indem es 28s ribosomale RNS spaltet und dadurch Ribosomen inaktiviert [218]. Eine besonders effektive OAS/RNase L vermittelte antivirale Aktivität konnte gegen Picoranvirusinfektionen, wie zum Beispiel EMCV gezeigt werden [219]. Wurden murine Zellen, die eine stabile, trunkierte Form dieses RNS Degradierung Systems (2-5 A RNase) exprimierten, mit EMCV infiziert, zeigten diese Zellen keine antivirale Antwort gegen die Infektion [218]. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass RNase L für die Aktivierung der JNK (C-Jun-NH2-Terminal Kinase) Signalkaskade als Teil der MAPK Signalkaskade essentiell ist, da RNase L -/- MEFs nach EMCV Infektion im Vergleich zu Wildtyp Zellen nur eingeschränkt in Apoptose gingen und JNK Aktivierung aufwiesen, was den Schluss nahe legte, dass die RNase L vermittelte JNK Aktivierung eine bedeutende Komponente der Interferon vermittelten Apoptose ist [220]. IFITs werden sowohl nach viraler Infektion, als auch nach IFN Applikation induziert [197]. Beim Menschen gibt es vier Mitglieder der IFIT Familie: IFIT-1 (auch ISG56), IFIT-2 (ISG54), IFIT-4 (ISG60) und IFIT-5 (ISG58). Bei Mäusen wurden bisher drei Mitglieder der IFIT Familie beschrieben: IFIT-1, MuP54 und MuP49. Vermutlich vermitteln IFITs ihre antivirale Aktivität indem sie die Translation einschränken [221]. Bisher konnte gegen Sendai Viren (SV),

36 Literaturübersicht 21 Respiratorisches Synzytial Viren (RSV), Vesikulo Stomatitis Viren (VSV), West Nile Viren, Lymphozytäre Choriomeningitits Viren (LCMV), Influenza Viren, Reoviren, Herpes simplex Viren, Zytomegalieviren und Adeneoviren ein Geninduktion von Mitgliedern der IFIT Familie nachgewiesen werden [ ]. Viperin wirkt antiviral gegen humane Zytomegalieviren (HCMV), indem es die Expression viraler, essentieller Proteine einschränkt. Dies konnten Chin et al. feststellen, als sie Fibroblasten, die mit einem Retrovirus, welches für Viperin codierte oder einem Kontrollvirus transduzierten, die Fibroblasten mit HMCV infizierten und sieben Tage später mit Hilfe eines Plaque Assays bei den Viperin transduzierten Zellen eine Verminderung der viralen Replikation um 90% im Vergleich zu den Kontrollen feststellen konnten [195]. PLSCR-1 ist ein Kalzium bindendes Plasmamembran Protein und vermag selber die Expression von einigen IRGs zu stimulieren, darunter ISG-15, IFIT-2 und IFIT-1 [231]. Die antivirale Wirkung von PLSCR-1 konnte gezeigt werden, indem Hey1B Zellen (eine humane Ovarialtumor Zelllinie), die vermindert PLSCR-1 exprimierten und PLSCR-1 -/- MEFs nach Vesikulo Stomatits Virus Infektion oder Enzephalomyokarditis Virus Infektion erhöhte Virustiter aufwiesen [231]. ISG-20 ist eine IFN induzierte 2-5 -Exoribonuklease. Es hat antivirale Effekte gegen RNS Viren, wie Vesikulo Stomatitis Viren, Enzephalomyokarditis Viren und Influenza Viren, indem es ihre mrns Synthese und Peptid Produktion hemmt, zeigt jedoch keinen antiviralen Effekt gegen das DNS Adenovirus [232]. Dies konnten Espert et al. zeigen, indem sie nachwiesen, dass VSV, Influenza Viren und EMCV infizierte ISG-20 überexprimierende HeLa Zellen resistent gegen eine Infektion mit den genannten Viren sind, jedoch nicht gegen eine Infektion mit Adenoviren [232]. APOBEC3G gehört zu der Familie der Cytidin Deaminasen. Man hat festgestellt, dass APOBEC3G von Virionen des Humanen Immunodefizienz-Viruses (HIV) aufgenommen wird, wo es Cytosin zu Uracil deaminiert und damit die virale RNS angreifbar für Spaltung durch die Uracil DNS Glykosylase und Apurin-Apyrimidin (AP) Endonuklease macht [233]. Neben antiviral wirksamer IRGs werden auch IRGs induziert, die das Zellwachstum einschränken und gezielt Apoptose auslösen. Dies kann auf mehreren Wegen geschehen. Zum einen, indem Signalkaskaden eingeleitet werden, die zur Apoptose oder Wachstumshemmung bestimmter Zellen führen. Zum anderen können gezielt Effektormoleküle induziert werden, die den Zellzyklus kontrollieren. Zuletzt können proapoptotisch wirkende IRGs induziert werden, die gezielt Zellen in Apoptose führen.

37 Literaturübersicht 22 Durch IRGs induzierte Signalkaskaden, die zur Apoptose und Wachstumshemmung bestimmter Zellen führen, sind die CrkL und MAPK Signalkaskade und die Vav Protoonkogene. So nimmt die CrkL Signalkaskade Einfluss auf das Zellwachstum haematopoetischer Vorläuferzellen [234]. Werden Zellen von Patienten mit CML (Chronischer Myeloischer Leukämie) mit IFN behandelt, kommt es zur Komplexbildung von CrkL und STAT5. Diese binden Promotor Sequenzen von einigen IRGs, die wachstumshemmend wirken, wie zum Beispiel PML (Promyelocytic Leukemia Gene Product), welches für ein Tumor unterdrückendes Protein codiert. Auch TRAIL, wird so induziert und führt zur Wachstumshemmung und Apoptose. Es gehört zur TNF Ligand Superfamilie und wird unter anderem von NK-Zellen nach IFN- Stimulation ausgeschüttet um an seine Rezeptoren (TNFRSF10A und TNFRSF10B) zu binden und dadurch Apoptose auszulösen [235]. Für TRAIL konnte ein antiviraler Effekt nach Enzephalomyokarditis Virus (EMCV) Infektion in vitro und in vivo gezeigt werden [194]. MEFs wurden mit EMCV infiziert und anschließend mit einer TRAIL überexprimierenden Mäusezellinie behandelt. Nach acht Stunden wurde die TRAIL induzierte Apoptose gemessen. Es konnte festgestellt werden, dass, im Gegensatz zu nicht infizierten MEFs, die infizierten MEFs apoptotisch waren. Behandlung mit einem anti-trail Antikörper verhinderte die Apoptose der infizierten MEFs. Ähnliches konnte in vivo festgestellt werden, als Mäuse, die EMCV infiziert wurden signifikant länger lebten als Mäuse die vor EMCV Infektion den neutralisierenden anti-trail Antikörper erhielten [194]. Einige IRGs inhibieren das Zellwachstum direkt, indem sie die Expression von bestimmten Effektormolekülen, die den Zellzyklus kontrollieren, beeinflussen. Auf diese Weise wirken die IRGs Rb (Retinoblastoma Gene Product), Cyclin A, CDK-2 (Cyclin Dependent Kinase-2), E2F, c-myc und CKI (CDK Inhibitors) [ ]. Weitere wachstumshemmende IRG sind die HIN- 200 Familie (Family of Hematopoietic IFN-inducible Nuclear Protein with the 200-Amino-Acid Repeats). Mitglieder dieser Familie sind P202, P203, P204 und P205 (Murine Myeloide Cell Nuclear Differentiation Antigens) und ihre humanen Vertreter MNDA (Myeloid Cell Nuclear Differentiation Antigen), AIM-2 (Absent In Melanoma-2) und IFI16 [239]. Die genannten Faktoren ermöglichen es, den Zellzyklus in jeder Phase zu beeinflussen. Um die Apoptose einzelner Zellen auszulösen, werden einige proapoptotisch wirkenden IRGs induziert. Zu diesen zählen Fas, Kaspasen, TRAIL, der XAF-1 (X-Linked Inhibitor of Apoptosis-associated Factor-1), die BCL-2 (B-Cell Leukemia/Lymphoma-2) verwandten Proteine Bak (BCL-2 Antagonist/Killer) und Bax (BCL-2 associated-x Protein) und die Gruppe der RIDs (Regulators of IFN-Induced Death) [240, 241]. Des Weiteren zählen Mitglieder der IRF-Familie wie IRF-1, -3 und -5 zur Gruppe der proapoptotisch wirkenden IRGs, indem sie

38 Literaturübersicht 23 die Transkription weitere proapoptotischer IRGs veranlassen [242]. Die genauen Mechanismen der IFN induzierten Apoptose sind noch unklar, jedoch weiß man, dass Kaspasen, Cytochrom C Freisetzung und FADD (Fas-Associated via Death Domain) und damit der extrinsische und intrinsische Weg der Apoptose daran beteiligt sind [243]. Darüber hinaus wirken IRGs immunmodulierend. So spielen IFNs in der Entwicklung des Immunsystems und in der Hämatopoese eine entscheidende Rolle [244, 245]. Abwesenheit von IFNs - und damit von IRGs - während der Entwicklung des Immunsystems hat Auswirkungen auf fast alle Zellpopulationen, insbesondere Makrophagen, B-Lymphozyten und Granulozyten. Auch im ausgereiften Immunsystem spielen IRGs eine Rolle: In einem Infektionsgeschehen beeinflussen sie direkt die Antwort der T-Lymphozyten und der B-Lymphozyten. Sie vermitteln das Wachstum von T-Gedächtnis Zellen und unterstützen die Entwicklung einer T- H 1 Immunantwort. IRGs, wie beispielsweise IRF-1, vermitteln die Hochregulierung von MHC Klasse I Molekülen und die Entwicklung einer CD8 T-Zell-Antwort. IRGs, wie CCL5 (Chemokin (C-C Motiv) Ligand 5), CCL3 (Chemokin (C-C Motiv) Ligand 3; auch Mip-1 genannt) und IP-10 (IFN- induced Protein-10) wirken selber chemotaktisch auf T- Lymphozyten oder regulieren die Expression von weiteren Zytokinen und Chemokinen, die chemotaktisch auf T-Lymphozyten wirken [15, 246]. Sie aktivieren Makrophagen und NK- Zellen und regulieren die Reifung und Ausdifferenzierung von Dendritischen Zellen [247, 248]. Des Weiteren helfen IRGs von einer angeborenen Immunantwort in eine adaptive Immunantwort überzuleiten [249].. In den letzten Jahren haben verschiedene Forschergruppen viel Arbeit in die Katalogisierung von IRGs investiert [ ]. Der Fortschritt in der Methodik und die Kenntnis von Genomsequenzen ermöglichte eine umfassende Identifizierung von IRGs innerhalb einer Spezies. So ermöglicht die im Jahre 1994 auf dem Markt erschienene Mikroarray Technologie die Identifizierung tausender IRGs innerhalb eines Experiments. Dieser Methodik bedienten sich zahlreiche Gruppen zur Identifizierung vieler IRGs, indem sie verschiedene Zellarten oder Gewebe mit unterschiedlichen Typen von IFNs oder Viren stimulierten (zusammengefasst in [252]) und die RNS dieser Proben mit Hilfe von Mikroarrays analysierten. Samarajiawa et al. fassten 2008 die Ergebnisse von 28 Publikationen in einer Datenbank namens INTERFEROME zusammen [252]. Diese Datenbank enthält einerseits eine umfangreiche Liste an IRGs aus zahlreichen Experimenten (über 1900 IRGs bei Maus und Mensch). Andererseits gibt sie auch einen Überblick darüber, welche Gene durch welche Typen von IFNs reguliert werden. So scheint es Gene zu geben, die ausschließlich durch Typ I IFNs

39 Literaturübersicht 24 reguliert werden und Gene die ausschließlich durch Typ II IFN reguliert werden. Es scheint auch viele IRGs zu geben, die durch Typ I und Typ II oder durch Typ I und Typ III IFNs reguliert werden. Ein großer Teil der IRGs wird aber durch alle drei Arten von IFNs reguliert. Bisher konnten keine Typ III spezifischen IRGs identifiziert werden. Mehrere Gruppen konnten jedoch zeigen, dass Typ III IFNs ähnliche Gene wie Typ I IFNs regulieren [113, 254]. Dennoch konnten Unterschiede zwischen Typ I und Typ III IFNs hinsichtlich Geschwindigkeit und Dauer der Induktion festgestellt werden [112]. Interessanterweise gibt es einige IRGs, die beim Menschen und bei der Maus durch unterschiedliche Typen von IFNs induziert werden. Die Identifizierung von zahlreichen IRGs auf Transkriptomebene beim Säugetier ermöglicht es, sich gezielt interessante Kandidaten auszusuchen und sie hinsichtlich ihrer Wirkungsweise näher zu charakterisieren. Einige dieser IRGs sind bezüglich ihrer biologischen Funktion schon eingehend untersucht worden. Dies kann man individuell für einzelne Kandidaten machen, oder aber in einem umfassenden Ansatz wie bei Schoggins et al. [253]. Deren Ziel war es, gezielt antiviral wirksame IRGs zu identifizieren. Dafür haben sie IRGs aus publizierten Mikroarray Datensätzen auf ihre antivirale Wirkung nach Infektion mit unterschiedlichen Viren analysiert [253]. Ihr methodischer Ansatz hierfür war, diese IRGs mit Hilfe eines bicitronischen lentiviralen Vektors der zusätzlich ein rot fluoreszierendes Protein codiert, in Zellen zu transduzieren, diese mit verschiedenen, grün fluoreszierenden Viren zu infizieren und nach bestimmten Zeiträumen die Replikation der Viren in den rot fluoreszierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie zu messen. Bei einigen IRGs gelang zwar die lentivirale Transfektion nicht - darunter PKR und APOBEC3G, für zahlreiche IRGs zeigte dieser Ansatz aber höchst interessante Ergebnisse: So gelang es insgesamt für 25 IRGs eine antivirale Wirkung nachzuweisen von denen etwa die Hälfte bis dahin noch nicht als antiviral wirksam beschrieben war. Es gelang generell antiviral wirksame IRGs zu identifizieren (IRF-1, C6orf150, HPSE (Heparanase), RIG-I, MDA-5 und IFITM-3 (IFN-Induced Transmembrane Protein-3), aber auch IRGs die spezifisch auf bestimmte Viren antiviral wirken. Viele IRGs vermochten die Virusreplikation entweder besonders stark zu hemmen (über 80%) wie IRF-1, IRF-7, MDA-5 oder RIG-I oder um weniger als 20% wie IRF-3, Map3K14 (Mitogen Activating Protein Kinase Kinase Kinase 14), IFI44L (IFN-Induced Protein 44-Like) und andere. Nur ein IRG hemmte intermediär: 2 5 -OAS. Interessanterweise konnten auch einige IRGs gefunden werden, welche die Replikation von Viren erhöhten: ADAR, FAM46C, LY6E (Lymphocyten Antigen 6 Complex, Locus E) und MCOLN2 (Mucolipin 2). Dies könnte einerseits ein Zeichen für eine komplexe IFN-Funktion sein, andererseits könnte es auch bedeuten, dass Viren Mechanismen entwickelt haben, Effektorfunktionen von IFNs zu

40 Literaturübersicht 25 ihrem Zweck zu nutzen. Schon längere Zeit gibt es Hinweise, dass mehrere Faktoren gleichzeitig vorhanden sein müssen, um einen vollständigen antiviralen Schutz zu erhalten. So zeigen Mäuse deren IRGs Mx-1, 2 5 -OAS und PKR ausgeschalten wurden, noch immer antivirale Aktivität [216]. Um die Hypothese zu stützen, dass eine schützende IFN-Antwort die Kombination aus mehreren IRGs braucht, testeten Schoggins et al. das kombinatorische Verhalten mehrerer IRGs auf bestimmte Viren. Hierbei sahen sie, dass die Effekte von IRGs durchaus additiv wirken. Die Replikation der Viren konnte dadurch um bis zu 90% gesenkt werden. Bei näherer Betrachtung der antiviralen Mechanismen von IRGs fanden Schoggins et al. heraus, dass eines der Hauptziele von antiviral wirksamen IRGs eine frühe Hemmung der viralen Replikation und Translation ist [253]. Weitere wichtige Punkte, an denen antivirale IRGs ansetzten sind der Virus Zusammenbau und die Virus Freisetzung, was beispielsweise Tetherin und Viperin vermögen [255]. Zu den interessanten neueren Erkenntnissen im Feld der IRGs gehört auch die Tatsache, dass einige IRGs ihrerseits IFNs induzieren können - oder aber selber weitere IRGs induzieren können, ohne IFNs zu induzieren. Diese IRGs wirken einerseits antiviral, andererseits verstärken sie die IFN Signalkaskade. Dies konnte bisher unter anderem für IRF-1, IRF-7, ZAP, Viperin und PKR [251, 256, 257] gezeigt werden Interferone beim Huhn Säugetiere und Vögel gehören unterschiedlichen Klassen der Wirbeltiere an. Diese haben sich vor Millionen von Jahren aufgetrennt und seitdem weiterdifferenziert. Daher ist es nicht erstaunlich, dass sich auch die Bestandteile des Immunsystems weiterentwickelt haben, und das Immunsystem von Säugern und Vögeln sowohl gemeinsame Bestandteile besitzen, die sich vor Trennung der Klassen entwickelt haben, als auch unterschiedliche Bestandteile des Immunsystems, die sich nach Trennung der beiden Klassen entwickelt haben. Einen evolutionär alten Anteil des Immunsystems stellt das IFN-System dar, welches bei vielen Wirbeltieren vorkommt. Im Zusammenhang mit Zoonosen und Pandemien ist es wichtig, die Unterschiede zwischen dem Immunsystem des Vogels und des Säugetiers zu kennen. Am besten erforscht ist hierbei das IFN-System des Huhnes (gallus gallus). Jedoch konnten auch bei anderen Mitgliedern der Klasse der Vögel, wie beispielsweise der Ente und der Pute Typ I und Typ II IFNs bereits kloniert werden [ ]. Vögel sind äußerst empfänglich für Infektionen des Respirationstraktes, bedingt durch eine besondere Anatomie und den fehlenden Alveolarmakrophagen [262, 263]. Bisher ist jedoch

41 Literaturübersicht 26 wenig über die molekularen Mechanismen einer Wirt-Pathogen Interaktion nach viraler Infektion beim Huhn bekannt. Obwohl IFN initial im Huhn entdeckt wurde trat die Forschung hinsichtlich IFNs im Huhn lange Jahre in den Hintergrund [5]. Dies lag wohl mitunter daran, dass die Sequenzhomologie zwischen Säugertieren und anderen Vertebraten nur sehr gering ist. Doch haben Seuchen, wie die Influenza Ausbrüche und deren pandemisches Potential, eingehende Erforschung der Abwehrmechanismen von Geflügel umso dringlicher gemacht. Die Erforschung des Hühner IFNs bekam neuen Schwung, als Pusztai et al einen löslichen antiviralen Faktor nach der Stimulation von Hühnerleukozyten entdeckten [264]. Im Jahr darauf identifizierten Weiler et al. eine säurestabile und säurelabile Form von antiviral wirksamen IFNs im Huhn nach Stimulation von Milzzellen [265]. Die erste Klonierung eines Hühner IFNs, gelang 1994 aus der cdns Virus infizierter Hühner Embryonen [18]. Hühner IFN konnte aus befruchteten Hühnereiern und embryonalen Hühnerzellen aufgereinigt werden [ ]. Dabei handelte es sich um ein glykosiliertes Protein von 20-30kDa Größe, welches die gleiche Hitze- und Säurestabilität wie Typ I IFN von Säugetieren aufwies [269]. Jedoch zeigte es nur 20-25% Homologie zum Säuger Typ I IFN [7]. Aber auch dieses im Huhn gefundene IFN hatte ein konserviertes Cysteinmuster und fünf alpha Helices, eine typische Eigenschaft von Typ I IFN. Die endgültige Bestätigung, dass es sich um Typ I IFN handelte, brachte die stark antivirale Aktivität von rekombinant in Escheria Coli hergestelltem IFN gegen Vesikulo Stomatitis Virus (VSV) [270]. Sick et al. gingen der Frage nach, ob im Huhn (wie bei Vertretern der Säugetiere) mehrere Mitglieder der Typ I IFN Familie zu finden sind und identifizierten Typ I IFN Gene. Von diesen konnten drei sehr ähnliche intronlose Gene (IFN- 1-3) sequenziert werden, deren Proteine 24% Homologie zu humanem IFN-, 20% Homologie zu humanem IFN- und 3% Homologie zu humanen IFN- hatten. Diese drei Gene der Typ I IFN Familie nannte man ChIFN1 [271]. Zusätzlich konnte ein weiteres intronloses Gen sequenziert werden, dessen Protein 57% Homologie zu ChFIN1 hatte. Dieses nannte man ChIFN2. Nach wie vor wird kontrovers diskutiert, ob ChIFN1 dem Säugetier IFN- und ChIFN2 dem Säugetier IFN- entspricht. Es wird postuliert, dass sich Vögel und Säugetiere vor der Entwicklung von ChIFN1 und ChIFN2 getrennt haben und sich die verschiedenen Arten von Typ I IFN bei Säugetier und Vogel unabhängig voneinander entwickelt haben [272, 273]. Phylogenenetische Erforschung des Säugetier Typ I IFN zeigt jedoch, dass sich die Vervielfältigung von IFN Genen vor der Trennung von Säugetier und Vogel vollzogen hat [274]. Auch spricht die Tatsache, dass es

42 Literaturübersicht 27 mehrere ChIFN1 Gene und nur ein singulares ChIFN2 Gen gibt, für die These, dass ChIFN1 ein Homolog zu IFN- und ChIFN2 ein Homolog zu IFN- ist. Außerdem ähneln sich die Struktur ihrer jeweiligen Promotor Regionen und ihre Reaktion auf entsprechende Induktoren [275]. Also entschied man sich, die für das Säugetier verwendete Nomenklatur zu übernehmen und ChIFN1 als IFN- und ChIFN2 als IFN- anzusprechen [276, 277]. Im Gegensatz zu Säugetieren, deren IFN Gene autosomal codiert sind, finden sich Hühner Gene für Typ I IFNs auf dem Geschlechts Chromosom Z [278]. Wie die Typ I IFNs des Säugetiers, vermittelt ChIFN- starke antivirale Aktivität [270]. Einen Hinweis auf die Existenz weiterer IFNs lieferte die Tatsache, dass ChIFN- die Fähigkeit fehlte, Makrophagen zu aktivieren [279]. Interessanterweise scheint ChIFN- eine 10fach höhere antivirale Aktivität als ChIFN- zu besitzen. Allerdings aktivierten beide Typ I IFNs des Huhns in einem biologischen Testverfahren den Mx-Promotor gleichermaßen [280]. Karpala et al. lieferten kürzlich Hinweise, dass auch IFN-κ im Huhn zu finden ist, allerdings wurde dies bisher noch nicht publiziert und bisher ist diesbezüglich nur ein Datenbankeintrag darüber zu finden (GenBank: ADU ). Im Jahre 1995 konnten Digby und Lowenthal auch Typ II IFN (ChIFN- ) im Huhn nachweisen und klonieren [281, 282]. Das ChIFN- befindet sich auf Chromosom 1 und besitzt mit 30-35% Homologie zum IFN- Protein des Säugetiers besitzt eine beträchtliche Ähnlichkeit zu diesem. ChIFN- zeigt Makrophagen aktivierende Faktor (MAF) Aktivität und hat antivirale Eigenschaften gegen Semliki Forest Virus und Vesikulo Stomatitis Virus [281, 282]. Daneben konnte gezeigt werden, dass ChIFN- MHC Klasse II Moleküle auf Hühner Makrophagen, GBP und NOS2 (Nitric Oxide Synthase 2, inducible, auch inos) hochreguliert [283]. Neben der Induktion durch die Jak-Stat Signalkaskade konnte für ChIFN- auch gezeigt werden, dass es durch Il-18 induziert wird [284]. Als Vertreter der Typ III IFNs konnte ChIFN-, welches dem humanen IFN- 2 entspricht, nachgewiesen und kloniert werden. ChIFN- ist auf Chromosom 7 lokalisiert [285] und scheint auch antivirale Aktivität zu besitzen. Bisher konnte dies für das Semliki Forest Virus und das Influenza Virus gezeigt werden, wenn auch weniger stark als ChIFN- [285]. Analog zum IFN- des Säugetiers konnte für chifn- gezeigt werden, dass es bekannte Typ I IRGs wie OAS und Mx-1 auch im Huhn induziert [93, 286]. Insgesamt scheinen IFNs im Huhn aber hinsichtlich ihrer Funktionsweise denen von Säugetieren weitgehend zu entsprechen [282, 285]. So ähneln bei der Aktivierung einer IFN- Antwort die im Vogel beschriebenen Mechanismen denen des Säugetiers. Ebenso wie

43 Literaturübersicht 28 Säugetiere besitzen Hühner PRRs, die durch PAMPs aktiviert werden. Jedoch ist nur wenig über die beim Huhn vorkommenden PRR bekannt. Man weiß jedoch, dass das Huhn Vertreter der TLRs, der NLRs und RLRs besitzt. Wie beim Säugetier gibt es auch im Huhn TLRs auf der Zelloberfläche und auf endosomalen Membranen. Dabei findet man im Huhn Orthologe zu einigen TLRs des Säugetiers, jedoch auch einige Hühner spezifische TLRs (siehe Tabelle 3). Die TLRs des Huhns werden auch durch dem Säugetier entsprechenden PAMPs aktiviert [ ]. Orthologe zum Säugetier konnten für TLR4 und TLR5 gefunden werden. Sie befinden sich auch beim Huhn auf der Zelloberfläche [294, 295]. Statt des humanen TLR Komplexes bestehen aus TLR1/6/10 besitzt das Huhn zwei Gene TLR1A und TLR1B [289, 296, 297]. Auch hat das Huhn statt einem TLR2 Gen zwei TLR2 Gene: TLR2A und TLR2B [289, 297], die funktionelle Heterodimere mit TLR1 eingehen können [298, 299]. Intrazellulär besitzt das Huhn Orthologe zu TLR3 und TLR7. Diese können, wie beim Säugetier, Nukleinsäure erkennen [291, 296]. TLR8 ist ein Pseudogen [291]. Das Huhn besitzt kein TLR9, jedoch wird dessen Aufgabe im Säugetier (CpG Motive zu erkennen) von einem Hühner spezifischen TLR21 übernommen [300]. Ein weiterer hühnerspezifischer TLR ist TLR15. Er ist auf der Zelloberfläche lokalisiert. Sein Ligand ist derzeit noch unbekannt, es gibt allerdings Hinweise, dass TLR15 durch Bestandteile von Hefen aktiviert wird [301, 302]. NOD1 (Nucleotide-binding Oligomerization Domain-containing Protein 1) konnte als Vertreter der NLRs im Hühnergenom gefunden werden. Von den RLRs scheint es beim Huhn MDA-5 und LGP-2 zu geben. Dabei konnte für MDA-5 in Hühner DF-1 (Fibroblasten) und HD11 Zellen (Hühner Makrophagen) gezeigt werden, dass es nach dsrns Stimulus oder Infektion mit einer LPAIVΔNS1 Mutante zur Bildung von biologisch aktivem Typ I IFN führt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass LGP-2 die Typ I IFN Sekretion nach Infektion mit der LPAIVΔNS1 Mutante fördert [303, 304]. RIG-I gibt es im Huhn nicht, es wurde jedoch bei der Ente beschrieben [305]. Dies bietet Anlass zur Spekulation, ob das Fehlen von RIG-I im Huhn im Zusammenhang mit der hohen Empfindlichkeit gegenüber Infektionen mit HPAIV steht - vor denen die Ente geschützt ist. In diesem Fall müsste das Huhn jedoch für eine Vielzahl von Viren empfänglicher sein als die Ente. Daher kann das Fehlen von RIG-I zumindest nicht die einzige Ursache für die hohe Empfindlichkeit gegenüber HPAIV sein.

44 Literaturübersicht 29 Tabelle 3 TLR und RLR des Huhnes PRR Lokalisation Mensch Huhn Ligand TLRs Zelloberfläche TLR1/6/10 TLR1A undtlr1b Diacyl und Tricacyl Peptide Lokus TLR2 TLR2A und TLR2B Lipoteichonsäure TTricacylTiacyTriacylPeptide TLR4 Vorhanden Lipopolysaccharide TLR5 Vorhanden Flagellin TLR11 Nicht vorhanden TLR15 Unbekannt (Motive aus Hefen) Endosomal TLR3 Vorhanden ds RNS TLR7 Vorhanden ssrns TLR8 TLR9 Pseudogen Nicht vorhanden TLR21 CpG Motive RLRs intrazytoplasmatisch RIG-I Nicht vorhanden MDA-5 (vorhanden Vorhanden n der dsrns LGP-2 Ente) Vorhanden Wenn PRRs passende PAMPs erkennen und binden, führt dies auch beim Huhn zur Aktivierung verschiedener Signalkaskaden und zur Bildung von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen und IFNs. Zahlreiche Mitglieder dieser Signalkaskaden konnten auch im Huhn identifiziert werden. Des Weiteren spricht die Tatsache, dass viele der Produkte dieser Signalkaskaden auch im Huhn im Rahmen einer Immunantwort zu finden sind, dafür, dass die durch PRRs aktivierten Signalkaskaden im Huhn weitgehend denen des Säugetiers entsprechen [291, ]. Der Hühner IFN/Il-10 Rezeptor Cluster wurde bereits identifiziert, kloniert und charakterisiert [309]. Hier finden sich beide Ketten des IFNAR, eine Kette des IFNGR (IFNGR-2) und IL- 10R2, als eine Kette des Rezeptors für IFN-. Damit ähnelt seine Struktur dem humanen IFN/Il-10 Rezeptor Cluster auf Chromosom 21, wobei der entsprechende Cluster des Huhnes dreimal kleiner ist als der des Menschen, was aber in Übereinstimmung mit den Größenverhältnissen zwischen Humanen- und Hühnergenom ist [310]. Die zweite Kette des IFNGR (IFNGR-1) befindet sich auf Chromosom 3, auf welchem sich auch TLR15 befindet [301] und ist damit nicht Teil des IFN/Il-10 Rezeptor Clusters. Die Mechanismen der durch IFNs ausgelösten Signalkaskaden scheinen sich mit denen von Säugetieren weitgehend zu überschneiden und so gibt es Hinweise auf eine funktionelle Jak-

45 Literaturübersicht 30 Stat Signalkaskade, die auch im Huhn zur Aktivierung von ISRE und GAS Elemente in den Promotor Regionen von IRGs führt und dadurch deren Gen Expression veranlasst [311, 312]. Größtenteils unbeantwortet ist nach wie vor die Frage, welche IRGs beim Huhn vorkommen und wie diese wirken. Zu den bereits identifizierten IRGs gehören PKR, 2 5-OAS und Mx-1. Die antivirale Rolle von Mx-1 beim Huhn wird seit Jahren kontrovers diskutiert. Da Mx-1 bei der Maus einen potenten Schutz gegen hoch pathogene aviäre Influenza Viren (HPAIV) vermittelt [3], lag die Vermutung nahe, dass Mx beim Huhn ebenfalls antiviral gegen HPAIV wirkt. Nach viraler Infektion oder Typ I IFN Stimulation wird Mx Protein auch im Huhn induziert. Doch wirkt das gebildet Mx im Huhn nicht antiviral gegen HPAIV, Vesikulo Stomatitis Viren und Thogoto Viren [1, 4, 313]. Vermutungen, dass dies einerseits mit der zytoplasmatischen Lokalisation von Mx-1 beim Huhn und andererseits mit einem Aminosäurepolymorphismus an Position 631 zusammenhängt konnten nicht bestätigt werden [ ]. Kürzlich konnte außerdem gezeigt werden, dass das Hühner Mx-1 keine GTPase Aktivität besitzt - eine essentielle Eigenschaft für die antivirale Aktivität des Mx des Säugetiers [4]. Für PKR konnte im Huhn eine antivirale Wirksamkeit gegen Vesikulo Stomatitis Virus gezeigt werden [1, 319]. Die 2 5 -OAS wird im Huhn durch zwei Gene codiert. OAS A und OAS B. Dabei scheinen einige Hühnerlinien beide Varianten zu tragen, andere jedoch nur OAS A. [320, 321]. Antivirale Aktivität von ChOASL konnte in vitro gegen West Nile Virus gezeigt werden [2]. Innerhalb von Transkriptomstudien nach viraler Infektion von Hühnern oder Hühnerzelllinien konnten auch viele aus dem Säugetier bekannte IRGs gefunden werden [263, ]. Reemers et al. zeigten, dass nach Infektion mit aviärem Influenzavirus, Subtyp H9N2 via Aerosol in der Lunge zahlreiche Gene exprimiert wurden, darunter zahlreiche Zytokine, Chemokine und Apoptose assoziierte Gene und Transkriptionsfaktoren, die sie in Zusammenhang mit der Anatomie der Lunge brachten [263]. In einem weiteren Experiment zeigten sie wiederum, dass viele immunrelevante Gene nach H9N2 Infektion in der Trachea und Lunge, in Abhängigkeit vom Alter des Tieres exprimiert wurden [328]. Andere Gruppen analysierten CEF Zellen nach Infektion mit LPAIV-Stämmen und konnten beispielsweise die Expression von IFN-β, IFN-γ, CCL20, K203 (Chicken Chemokine (C-C motif) inflammatory Ligand 3), Il-6 und Il-8 zeigen, aber auch von OAS, Mx-1, ISG12-2 und IFIT-5 [327]. Lee et al. sahen, nachdem sie Hühnerembryo Lungenzellen mit Laryngotracheitits Virus

46 Literaturübersicht 31 infizierten, wiederum zahlreiche Zytokine, Chemokine, MHC-assoziierte Gene und Signaltransduktoren differentiell exprimiert [326], ebenso wie Dar et al., die Hühnerembryonen mit Infektiösem Bronchitis Virus infizierten und anschließend deren Lungentranskriptom untersuchten [324]. Nach Infektion von Hühnerembryozellen mit velogenem NDV konnten erst nach 24 Stunden die ersten Interferon- regulierten Gene gefunden werden [323]. All diese Experimente zeigten, dass nach viraler Infektion, aus dem Säugetier bekannte IRGs auch im Huhn reguliert werden. Jedoch lässt sich aus diesen Experimenten nicht klar erkennen, ob die Transkription dieser Gene viral bedingt oder IFN vermittelt ist. Eine umfassende Übersicht, welche IRGs im Huhn alleine durch IFN induziert werden, steht daher bisher nicht zur Verfügung.

47 Zielsetzung ZIELSETZUNG Ziel dieser Arbeit war es, eine umfassende Zusammenstellung Interferon-regulierter Gene (IRGs) im Huhn zu erstellen, da bisher nur einzelne IRGs im Huhn näher charakterisiert sind. Das Wissen über das antivirale Abwehrsystem im Huhn wird aber in Zeiten von drohenden Pandemien umso dringlicher. Um IRGs im Huhn zu identifizieren, sollte zunächst in Datenbanken und Publikationen nach IRGs von Maus und Menschen gesucht werden, um die gefundenen IRGs mit dem Hühnergenom abzugleichen. Anschließend sollte Hühnern rekombinantes Hühner Interferon alpha (rek ChIFN-α) intravenös injiziert werden, um die induzierten Gene mittels Transkriptomanalyse von Milz und Lunge mit zu analysieren. Um die Interferon Antwort in einem natürlichen Infektionsmodel zu überprüfen, sollte ein weiteres Mikroarray Experiment mit Milz und Lunge von intratracheal mit lentogenem Newcastle Disease Virus infizierten Hühnern durchgeführt werden. Die auf diese Weise identifizierten Gene sollten hinsichtlich ihrer Einteilung in funktionelle Gengruppen, biologisch relevante Signalkaskaden und Netzwerke und Expression in bestimmten Expressionsprofilen näher charakterisiert werden. Die derart identifizierten IRGs im Huhn sollen einen umfassenden Überblick geben, welche Typ I IFN induzierten IRGs im Huhn vorkommen und in Zukunft die genaue Charakterisierung potentiell antiviral wirksame Kandidatengene erleichtern.

48 Material und Methoden MATERIAL UND METHODEN 4.1. Tiere und Tierhaltung Befruchtete Hühnereier der Hühnerlinie LSL (Lohmann s Selected Leghorn) stammten von der LSL-Rhein-Main-Geflügelvermehrung GmbH, Dieburg. Befruchtete Hühnereier der Hühnerlinie M11(B 2/2 -Haplotyp) stammten vom Institut für Tierzucht in Mariensee. Brut und Schlupf erfolgten am Lehrstuhl für Tierphysiologie, München. Die Hühnereier wurden bei 37,8 C und 55% Luftfeuchtigkeit bebrütet und viermal täglich gewendet. Für den in vivo Tierversuch zur Bestimmung der Lipopolysaccharid (LPS) Auswirkungen auf den Plasmagehalt an biologisch aktivem Typ I IFN und auf die Genexpression in Lunge und Milz wurden Hühner der Linie LSL im Alter von fünf Wochen von Gut Heinrichsruh, Berglern geliefert und für eine Woche bis zum Versuchsbeginn am Lehrstuhl für Tierphysiologie, München aufgestallt. Zu Versuchsbeginn hatten die Tiere folgendes Alter: Ermittlung der Halbwertszeit von rek ChIFN-α: 10 Wochen, LPS-Injektion: 6 Wochen, Vergleich der Bioverfügbarkeit nach i.m./i.v. Injektion von rek ChIFN-α: 4 Wochen, i.v. Injektion von rek ChIFN-α zur Mikroarray Analyse: 7 Wochen, NDV Infektion: 13 Wochen. Die in vivo Tierversuche wurden von der Regierung von Oberbayern unter der Tierversuchsnummer genehmigt. Die Hühnerhaltung erfolgte in Kleingruppen in Volieren oder auf Gitterrostkäfigen. Die Tiere wurden mit handelsüblichem Alleinfuttermittel gefüttert und hatten Wasser ad libitum zur Verfügung Gewinnung von Proben Gewinnung von Organen Material: Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), ph 7,2 8,00g Natriumchlorid 1 1,45g Di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat 1 0,2g Kaliumchlorid 1 0,2g Kaliumhydrogenphosphat 1 ad 1000ml Aqua dest. Einstellen des ph mit HCl und NaOH auf 7,2 Zum Arbeiten mit sterilem PBS wurde die Lösung autoklaviert RNAlater 9 Skalpellklingen 24 Steriles Besteck

49 Material und Methoden 34 Durchführung: Die Hühner wurden betäubt und durch Blutentzug getötet. Anschließend wurden die Organe unter Verwendung von sterilem Besteck entnommen und entsprechend der weiteren Analyse in geeignete Medien überführt. Für die RNA-Isolation wurden die Organe in eisgekühltem RNAlater aufgenommen, für 12 Stunden bei 4 C gekühlt und anschließend bis zur Weiterverarbeitung bei -20 C gelagert. RNAlater verhindert die Destabilisierung der RNA durch zelleigene RNAsen. Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden die Organe in eisgekühltem PBS aufgenommen. Für die histologischen Untersuchungen wurden die Lungen wie in Kapitel 4.12 beschrieben behandelt und weiterverarbeitet. Für alle durchgeführten Analysen der Lungen wurden stets die vorletzten Lungenscheiben (Tori intercostales) mit scharfen Skalpellklingen von den benachbarten Lungenscheiben getrennt. Für die Genexpressionsanalysen und die durchflusszytometrischen Analysen der Lunge wurden ausschließlich die Anteile der vorletzten Lungenscheibe verwendet, die sich dorsal und ventral des Primärbronchus befinden. Damit sollte verhindert werden, dass konstitutiv um Primärbronchus gelegenes Bronchial Assoziiertes Lymphatisches Gewebe (BALT) mit analysiert wird [329, 330]. Die Hühnerlunge und die zur Analyse entnommenen Anteile sind in Abbildung 4 zu sehen. A B Abbildung 4 Probenentnahme aus der Lunge Abbildung (A) zeigt eine Hühnerlunge von dorsal. Die Trachea teilt sich in die zwei Hauptbronchien (Bronchi primarii). Des Weiteren sind die linke und die rechte Lunge zu sehen. Jede Lungenseite ist in vier Lungenscheiben (Tori intercostales) aufgeteilt, die durch Rinnen (Sulci costales) jeweils voneinander getrennt sind. Die für die Analysen verwendete vorletzte Lungenscheibe der linken Lunge ist durch eine grüne Umrandung hervorgehoben. In Abbildung (B) ist die vorletzte Lungenscheibe der linken Lunge im Transversalschnitt dargestellt. Der Kreis kennzeichnet die Lage des Primärbronchus. Für die Genexpressionsanalysen und die durchflusszytometrische Analyse wurden die durch die grüne Umrandung hervorgehobenen ventral und dorsal des Primärbronchus gelegenen Anteile der vorletzten Lungenscheibe entnommen.

50 Material und Methoden Gewinnung von Plasma Material: Heparinlösung (500 U/ml) 5 ml Heparin-Natrium (25.000IU/5ml) 3 45 ml RPMI 1640 with Glutamax 4 Spritzen die Lösung wurde aliquotiert und bei 4 C gelagert. Kanülen der Größe 0,4x19mm Probengefäß 1,3ml Lithium zur Plasmagewinnung 26 Durchführung: Zur Gewinnung von Hühnerplasma wurden Spritzen mit Heparinlösung beschichtet. Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena jugularis dextra oder der Vena ulnaris. Das Blut wurde sofort in Probengefäße zur Plasmagewinnung überführt und bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gekühlt. Um Plasma zu erhalten wurden die Blutproben für 10 Minuten bei 4 C mit 300xg zentrifugiert Zellkultur Medien und Zusätze CEC32#511-Medium: Medium: Basal ISCOVE 4 40ml fetales Rinderserum (fetal bovine serum, FBS) 2 10ml Hühnerserum 4 7TD1-Medium: Medium: RMPI 1640 with Glutamax 4 10ml FBS Rekombinantes ChIl-6 (1ng/ml); Referenz: [331] G418-Gebrauchslösung 250mg G418-Stammlösung (50mg/ml) 2 ad 5ml PBS Lagerung bei 4 C Standard Einfriermedium 45ml FBS 2 5ml Dimethylsulfoxid (DMSO) 1 Lagerung bei -20 C Trypsin-EDTA 2 PBS

51 Material und Methoden Verwendete Zelllinien CEC32#511 Zellart: Wachtelfibroblasten Spezies: Wachtel Medium: CEC32#511 Medium Zusatz: nach jedem dritten Teilen 250µg/ml G418 Gebrauchslösung zugesetzt Referenz: [312, 332] 7TD1 Zellart: Hybridom Spezies: Maus Medium: 7TD1 Medium Referenz: [333] Kultivierung von Zellen Zur Teilung der adhärent wachsenden CEC32#511 Zellen wurde das Medium vollständig abgenommen. Der Zell-Monolayer wurde zur Entfernung von FBS Resten einmal mit 37 C warmen PBS gewaschen und anschließend mit 37 C warmer 1xTrypsin Lösung bedeckt und 10 Minuten bei 37 C inkubiert. Danach wurden die abgelösten Zellen mit PBS gewaschen. Die gewünschte Zelldichte wurde in Medium aufgenommen und in Zellkulturflaschen 6 bei 37 C kultiviert. Die 7TD1 Zellen wurden zur Teilung durch abklopfen gelöst und dann in der gewünschten Zelldichte in frischem Medium aufgenommen und ebenfalls bei 37 C kultiviert Einfrieren von Zellen Die Zellen wurden gewaschen und pelletiert und in einer Dichte von 5x10 6-1x10 7 Zellen/ml in kaltem Einfriermedium aufgenommen. Es wurden 1,8 ml Zellsuspension pro Gefrierröhrchen 6 in eine isopropanolhaltige 7 Einfrierbox überführt und diese bei -80 C eingefroren. Diese ermöglicht eine Abkühlung um 1 C pro Minute. 24 Stunden später wurden die Gefrierröhrchen zur langfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff 8 überführt Auftauen von Zellen Die Zellen wurden in dem Gefrierröhrchen 6 möglichst rasch in 37 C warmem Wasserbad aufgetaut und zügig in ein 50 ml Probenröhrchen 26 überführt. Anschließend wurde sehr langsam und unter dauerndem Schwenken des Röhrchens eiskaltes RPMI 1640 zugegeben. Dies ermöglicht ein langsames Auswaschen des zelltoxischen DMSOs. Die Zellen wurden pelletiert um anschließend nochmals mit PBS gewaschen zu werden. Anschließend wurden sie in Medium aufgenommen und bei 37 C kultiviert.

52 Material und Methoden CEC-32#511 Interferon-α Reporterassay CEC-32#511-Zellen sind stabil mit einem Plasmid transfiziert, welches für Luciferase codiert. Die Transkription von Luciferase steht unter einem Mx-Promotor. Bindet IFN an den IFN- Rezeptor wird der Mx-Promotor aktiviert und das Luciferase-Gen transkribiert. Das Ausmaß an Luciferaseaktivität kann luminometrisch quantifiziert werden und dadurch der Gehalt an biologisch aktivem Typ I IFN in den gemessenen Proben bestimmt werden. Material: Proben CEC-32#511 CEC.32#511 Medium IFN-α Standard 1000 Units/ml hergestellt aus rek ChIFN-α (E.coli) (Herstellung siehe Kapitel 4.4) verdünnt in RMPI 1640 with Glutamax 4 mit 10% FBS 2 Lagerung bei -20 C Luciferase Assay Reagent 3 Lagerung bei -80 C Cell culture lysis reagent 5x 3 Lagerung bei -20 C vor Gebrauch auf RT erwärmen mit Aqua bidest. auf 1x verdünnen Gerät: GloMax 96 Microplate Luminometer 3 Referenz: [332] Durchführung: Am Vorabend der Messung wurden die CEC-32#511 in einer Zelldichte von 1x10 5 Zellen pro Kavität auf einer sterilen 96-Loch Flachbodenplatte 6 ausgesät und Stunden bei 37 C kultiviert. Anschließend wurde das Medium abgenommen und die Proben in Duplikaten in den gewünschten Verdünnungen aufgetragen. Zur Erstellung einer Standardkurve wurde IFN-α Standard in einer log-2 Titration von 6 Units/ml bis 0,1875 Units/ml in Duplikaten aufgetragen. Als Negativkontrolle diente reines Medium. Nach Zugabe der Proben wurde die Platte für 6 Stunden bei 37 C inkubiert. Dann wurden die Überstände entfernt, die Platte mit warmen PBS gewaschen und 1xCell culture lysis reagent aufgetragen. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben aufsuspendiert und in eine 96-Loch Rundbodenplatte 6 überführt. Um Luftblasen zu entfernen wurde die Platte kurz abzentrifugiert. Anschließend wurden jeweils 10µl der zu testenden Proben auf eine 96-Loch-Lumitrac200- Messplatte 27 überführt und im GloMax - Luminometer 3 nach Zugabe von Luciferase Reagenz die Emission der Lichtquanten pro Probe gemessen. In Relation zu den Lichtquanten im Standard mit bekannter IFN-Konzentration konnte nun der Gehalt der Proben an biologisch

53 Material und Methoden 38 aktivem Typ I IFN bestimmt werden Nachweistest für ChIl-6 In Anwesenheit von Il-6 proliferieren die streng Il-6 abhängigen murinen Hybridomzellen 7TD1. Diese dosisabhängige Proliferation der 7TD1 Zellen lässt sich mittels des Tetrazoliumsalzes XTT quantifizieren, da mitochondriale Succiant-Dehydrogenasen das gelbe XTT in ein orange-rotes Formazan Produkt umwandeln. Die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450nm wird mit dem ELISA-Reader 33 gemessen. Somit lässt sich in den gemessenen Proben der Gehalt an ChIl-6 bestimmen. Material: Proben 7TD1 Zellen 7TD1 Medium Rekombinantes ChIl-6 (1ng/ml) XTT-Lösung 9 PMSG-Lösung 9 (5mM) Durchführung: Die zu testenden Proben wurden auf einer sterilen 96-Loch Flachbodenplatte 6 in einer log2 Titration austitriert. Als Positivkontrolle diente rekombinantes ChIl-6 in einer Konzentration von 1ng/ml, als Negativkontrolle Il-6 freies 7TD1 Medium. Die 7TD1Zellsuspension wurde aus den Zellkulturflaschen 6 in ein 50 ml Probenröhrchen 26 überführt. Die Zellsuspension wurde dreimal mit sterilem PBS gewaschen um sämtliches Il-6 aus der Zellsuspension zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in einer Zelldichte von 5x10 5 Zellen pro Kavität auf die zu testenden Proben aufgetragen. Nach 96-stündiger Inkubation bei 37 C wurde eine 0,025 mm XTT-Gebrauchslösung angesetzt und dieser pro ml XTT-Lösung 5µl PMS-Lösung zugesetzt. Von dieser Gebrauchslösung wurden 50µl auf jede Kavität der 96-Loch-Flachbodenplatte gegeben. Danach wurde diese 4 Stunden bei 37 C inkubiert. Nun wurde die 96-Loch-Flachbodenplatte noch eine Minute auf einen Schüttler gestellt, um die Formazansalze in Lösung zu bringen und anschließend die Extinktion der zu testenden Proben bei einer Wellenlänge von 450nm im Plattenphotometer 33 gemessen.

54 Material und Methoden Herstellung von rekombinantem ChIFN-α Material: Verwendetes Konstrukt: Vektor: Insert: pet-3a ChIFNα-His Dieser Vektor wurde freundlicherweise von Prof. Dr. Peter Staeheli, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum zur Verfügung gestellt. Das Konstrukt wurde in den chemisch kompetenten Bakterienstamm BL21-DE3 transformiert und als Glycerolstock bei -80 C gelagert. Proteinexpression: Ampicillin 400mg Ampicillin ad 4ml Aqua dest. Lagerung bei -20 C LB-Medium Vor Gebrauch autoklaviert Lagerung bei 4 C Expressionsbakterium BL21-DE3 Tris-HCl Lösung (1M), ph 7,5 1,21g Tris 1 in 5ml Aqua dest. lösen ph 7,5 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) ad 10 ml Aqua dest. Lagerung bei RT Glucose (1M) 9,91g D(+)-Glucose-Monohydrat 1 ad 50 ml Aqua dest. Immer frisch ansetzten IPTG- Lösung (1M) 0,48g IPTG 1 ad 2ml Aqua dest. Lagerung bei -20 C Ultraschall Puffer, ph 7,8 0,53g Natriumchlorid 1 (300mM) 0,21g Di-Natriumhydogenphosphat 1 (50mM) ad 30 ml Aqua dest. ph 7,8 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Vor Gebrauch DDT (1M) 1 zugeben Puffer A, ph 8,0 114,64g Guanidin-Hydrochlorid 1 (6M) 3,12g Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 1 (100mM) 2ml 1M Tris HCl(10mM) ad 200 ml Aqua dest. ph 8,0 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Vor Gebrauch DDT (1M) 1 zugeben

55 Material und Methoden 40 Puffer B1, ph 8,0 24,02g Harnstoff 1 (8M) 0,78g Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 1 (100mM) 0,5 1M Tris HCl (10mM) ad 50ml Aqua dest. ph 8,0 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Vor Gebrauch DDT 1 (1M) zugeben Puffer B2, ph 8,0 30,03g Harnstoff 1 (2M) 14,61 Natriumchlorid 1 (1M) 3,9g Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 1 (100mM) 2,5g 1M Tris HCl (10mM) ad 250ml Aqua dest. ph 8,0 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei RT Vor Gebrauch DDT 1 (1M) zugeben Puffer E1, ph 6,5 0,21g Natriumacetat 1 (50mM) 2,92g Natriumchlorid 1 (1M) 6,01g Harnstoff 1 (2M) 0,5ml 1M Tris-HCl (10mM) ad 50ml Aqua dest. ph 6,5 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Vor Gebrauch DDT 1 (1M) zugeben Puffer E2, ph 3,6 0,21g Natriumacetat 1 (50mM) 2,92g Natriumchlorid 1 (1M) 6,01g Harnstoff 1 (2M) ad 50ml Aqua dest. ph 3,6 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Vor Gebrauch DDT 1 (1M) zugeben Ni-NTA Agarose 28 Lagerung bei 4 C Econo-Pac 10DG Columns 5 Dreiwegehahn Dialyse Schlauch ZelluTrans 3,5 19mm 17 Dialysepuffer, ph 3,6 14,61g Natriumchlorid 1 (50mM) 20,51g Natriumacetat 1 (50mM) 6,01g Harnstoff 1 (2M) ad 5000ml Aqua dest. ph 3,6 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Spritzenfilter Filtropur S 0,2µm 26

56 Material und Methoden 41 Gel-Elektrophorese: 5x Elektrophoresepuffer, ph 8,3 15g Tris 1 72g Glycin 1 5g SDS 1 (Natriumdodecylsulfat) ad 1000ml Aqua dest. Die Stammlösung wird zur Elektrophorese 1:5 mit Aqua dest. verdünnt Lagerung bei RT Gelpuffer, ph 8,8 91g Tris 1 (1,5M) 2g SDS 1 ad 500ml Aqua dest. ph 8,8 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C Sammelgelpuffer, ph 6,8 6,05g Tris 1 (0,5M) 0,4 g SDS ad 100ml Aqua dest. ph 6,8 einstellen (mit NaOH 1 (1M) bzw. HCl 1 (1M)) Lagerung bei 4 C TEMED 1 (N`,N`,N`,N`-Tetramethyläthylendiamin) Lagerung bei 4 C Gebrauchslösung in dunklem Cup 10%ige APS-Lösung (Ammoniumperoxodisulfat) 0,5 g Ammoniumpersulfat 1 ad 5 ml Aqua bidest. Lagerung bei -20 C Acrylamid-Lösung 1 30% Lagerung bei RT Probenpuffer Lämmli 6x reduzierend 0,93mg DTT 1 (0,6 M) 10 ml 6x Lämmli Lagerung bei -20 C Unstained Protein Molekulargewichtsmarker, kd Lagerung bei 4 C Coomassie Färbung Coomassie Färbelösung 450ml Ethanol 1 99% vergällt 100ml Essigsäure 1 100% 2,5g Coomassie Brilliant Blue R ad 1000ml Aqua bidest. Lagerung bei RT unter dem Abzug Entfärbelösung 250ml Ethanol 1 99% vergällt 100ml Essigsäure 1 100% ad 1000ml Aqua dest. Lagerung bei RT unter dem Abzug

57 Material und Methoden 42 Durchführung: Von dem angefertigten Glycerolstock des Expressionsbakteriums wurden einige Kristalle in 20ml mit 20µl Ampicillin versetztes LB-Medium überführt und über Nacht bei 37 C und 200rpm hochgeschüttelt. Am nächsten Tag wurde diese Bakteriensuspension auf weitere vier Kolben mit jeweils 0,5l LB-Medium, die zuvor mit 0,5ml Ampicillin und 10ml 1M Glukose versetzt wurden, aufgeteilt und bis zu einer optischen Dichte (OD) 600 zwischen 0,3 und 0,5 bei 37 C und 200rpm inkubiert. Zur Induktion der Proteinexpression wurde pro Kolben 250µl einer 1M IPTG-Lösung zugegeben und weitere 2 Stunden bei 37 C und 200rpm inkubiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension 30 Minuten bei 4 C mit 2400xg zentrifugiert und die Pellets in 20ml Ultraschall Puffer resuspendiert. Diese Suspension wurde 7x30 Sekunden mit Ultraschallwellen auf Eiswasser behandelt, um die Bakterienzellwände zu zerstören. Anschließend wurde die Suspension 25 Minuten bei 4 C mit xg zentrifugiert und die Pellets in 20ml Puffer A resuspendiert. Danach wurde die Suspension zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend nochmals 30 Minuten bei 4 C mit xg zentrifugiert. Das Bakterienlysat wurde mit gereinigter Ni-NTA Agarose über Nacht bei 4 C gemischt und nacheinander mit Puffer A, Puffer B1, Puffer B2 und Puffer E1 über eine Biorad-Säule aufgereinigt. Puffer E2 wurde als letztes für die Elution des Proteins zugegeben. Die ersten 15ml wurden als Fraktion 1, die folgenden 10ml wurden einzeln in 1ml Fraktionen als Fraktionen 2-11 und die darauffolgenden 15ml wurden als Fraktion 12 in mehreren Röhrchen aufgefangen. Mit Hilfe eines 12%igen SDS-Gels, welches mit Coomassie gefärbt und über Nacht entfärbt wurde, wurde der Proteingehalt abgeschätzt. Die Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, wurden gepoolt und in einen Dialyseschlauch überführt und über Nacht gegen 5l Dialysepuffer umgepuffert. Anschließend wurde der Inhalt des Dialyseschlauchs durch einen Spritzenfilter Filtropur S mit einer Porengröße von 0,2µm filtriert und anschließend der Proteingehalt im NanoDrop und der Gehalt an biologisch aktivem Typ I IFN im CEC-32#511 IFN-α Reporterassay bestimmt Endotoxin Messung mit dem Limulus Amebocyte Lysate Biotest Der Limulus amebocyte lysate (LAL) Biotest dient der quantitativen Bestimmung von Endotoxin gram negativer Bakterien. Der Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus besitzt ein Gerinnungsprotein, welches im Beisein von Endotoxin enzymatisch aktiviert wird. Im LAL Biotest katalysiert dieses aktive Gerinnungsenzym die Spaltung von einem farblosem Substrat zu gelbem p-nitroanilin (pna). Die Menge an gespaltenem pna kann bei einer Wellenlänge

58 Material und Methoden 43 von nm photometrisch gemessen werden. Sie ist proportional zur Menge an enthaltenem Endotoxin. Material: Limulus amebocyte lysate Kit QCL Endotoxin freie Plastikwaren Endotoxin freies H 2 O Durchführung: Bei diesem Test ist unbedingt darauf zu achten, dass endotoxinfreie Materialien verwendet werden und möglichst Endotoxin kontaminationsfrei gearbeitet wird. Der ph-wert der zu messenden Proben sollte zwischen 6 und 8 liegen. Nötigenfalls war der ph-wert mit Endotoxin freien Substanzen anzugleichen. Als Positivkontrolle diente ein standardisiertes Escherichia coli Endotoxin, welches in vier Verdünnungsstufen getestet wurde. Als Negativkontrolle diente endotoxinfreies Wasser. Die zu testenden Proben und die Kontrollen wurden nach Herstellerangaben mit LAL gemischt und für 10 Minuten bei 37 C inkubiert. Anschließend wurde ein farbloses chromogenisches Substrat hinzugefügt und die Mischung für 6 Minuten bei 37 C inkubiert. Nun wurde ein Stop-Reagenz hinzugefügt. Die Menge an enthaltendem Endotoxin wurde mit dem ELISA Reader 33 bei einer Wellenlänge von nm photometrisch bestimmt und mit Hilfe der Standardkurve der Positivkontrolle in EU/ml berechnet RNA-Präparation RNA-Isolation Alle RNA Isolationen wurden mit einer Guanidinisothiocyanant-Phenol-Chloroform Extraktion durchgeführt. Material: TpeqGold Trifast 10 Lagerung bei 4 C Chloroform ad analysis 1 Lagerung bei RT unter dem Abzug Aqua bidest. (nukleasefrei) Lagerung bei -20 C Isopropanol 1 Lagerung bei RT unter dem Abzug 70% Ethanol

59 Material und Methoden 44 70ml Ethanol absolut 1 Lagerung bei RT unter dem Abzug 30ml Aqua bidest. (nukleasefrei) 10%ige SDS-Lösung 1 Lagerung bei RT Durchführung: Für sämtliche Arbeiten wurde RNAse freies Einwegmaterial und Handschuhe verwendet. Vor Arbeitsbeginn wurden Arbeitsflächen und Arbeitsgeräte mit 10% SDS-Lösung behandelt. Bis zu 100mg Organgewebe wurde in 1ml gekühltem Trizol aufgenommen. Das Gewebe wurde mit einem PreCellys Homogenisator 10 aufgeschlossen. Dafür wurden die Proben 10 Sekunden bei 5.000rpm homogenisiert. Sofern das Gewebe durch einmalige Homogenisierung nicht ausreichend aufgeschlossen werden konnte, wurde nach einer zweiminütigen Pause, in der die Probe gekühlt wurde, ein weiteres Homogenisierungsintervall durchgeführt. Anschließend wurden jeder Probe 200µl Chloroform zugegeben und die Mischung 30 Sekunden stark geschüttelt. Anschließend wurde die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im folgenden Zentrifugationsschritt (12.000xg bei 6 C für 15 Minuten) trennte sich die Suspension in drei Phasen: eine milchig-rosa Phase mit organischem Material, eine weiße Interphase mit DNA und eine wässrige Phase mit RNA. Die wässrige Phase wurde vorsichtig abgenommen und in ein 500µl Isopropanol enthaltendes Eppendorf-Cup überführt und durch Schwenken gemischt. Die Probe wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit kam es zur Ausfällung der RNA. Anschließend wurde die Probe 10 Minuten bei 6 C mit 12000xg zentrifugiert. Es bildete sich ein RNA-Pellet am Boden. Von diesem RNA-Pellet wurde der Überstand vorsichtig abgenommen. Nun wurde das Pellet in 70%igem Ethanol gewaschen und erneut fünf Minuten bei 6 C mit 7.600xg zentrifugiert. Erneut wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und das RNA-Pellet maximal 30 Minuten bei Raumtemperatur unter der PCR-Arbeitstation 10 getrocknet, bevor es in 100µl nukleasefreiem Aqua bidest. gelöst, wobei es sich 10 Minuten bei Raumtemperatur und 10 Minuten bei 58 C und 300rpm lösen konnte. Anschließend wurde die RNA-Konzentration und Reinheit mit einem NanoDrop 10 bestimmt und die Konzentration der RNA auf ng/ml mit nukleasefreiem Aqua bidest. eingestellt. Die RNA wurde kurzfristig auf -20 C und langfristig auf -80 C gelagert.

60 Material und Methoden Reinheitsbestimmung der RNA im NanoDrop Die Konzentration und Reinheit der RNA wurde mit einem NanoDrop 10 bestimmt. Kontaminationen können durch Phenol oder durch in Trizol enthaltene chaotrope Salze verursacht werden, was zu einer Hemmung der c-dna Synthese oder der Bindungskapazität eines Fluoreszensfarbstoffes führen kann. Im NanoDrop wurde die Absorption der RNA bei 230nm bis 280nm gemessen. Reine RNA absorbiert maximal bei 260nm, während mit Guanidinisothiocyanat verunreinigte RNA bei 230nm und mit Phenol verunreinigte RNA bei 270nm absorbiert. Mit Hilfe des NanoDrops werden die Absorptionsverhältnisse von 260nm zu 230nm (260/230) und von 260nm zu 280nm(260/280) bestimmt. Für die weiter verarbeitete RNA wurden Grenzwerte von mindestens 1,9 im 260/280 Verhältnis und von mindestens 2,0 im 260/230 Verhältnis vorausgesetzt Bestimmung der RNA Integrität im Agilent 2100 Bioanalyzer TM Material: RNA 6000 Nano-Kit Durchführung: Um die Qualität der isolierten RNA zu bestimmen wurde diese im Agilent 2100 Bioanalyzer 30 analysiert. Der Agilent 2100 Bioanalyzer 30 ermöglicht es, die Intaktheit der RNA zu bestimmen und Schädigungen der RNA durch Nukleasen, Scherkräfte, Hitze und Verunreinigungen mit DNA zu ermitteln. Hierfür bedient er sich einer chip-basierten Kapillar- Gelelektrophorese. Dabei werden die RNA-Moleküle ihrer Größe nach aufgetrennt und in einem Elektroferogramm dargestellt. Aus den analysierten Werten, wie dem Verhältnis des 18s zum 28s rrna Peaks, der 5s rrna und der Grundlinie des Elektroferogramms, errechnet die Software des Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent 2100 Expert die Integrität der RNA (RIN). Diese reicht von 1, was einer vollständig degradierten RNA entspricht, bis 10, was einer vollständig intakten RNA entspricht. Die Proben der isolierten RNA wurden nach Herstellerangaben aufgetragen und analysiert. Für weiter verarbeitete RNA wurde eine RIN von mindestens 7,6 vorausgesetzt cdna Synthese Die isolierte RNA wurde in eine komplementäre copy DNA (cdna) umgeschrieben. Dafür wurde Reverse Transkriptase und Random Hexamer Primer verwendet. Random Hexamer Primer bestehen aus einer Mischung aus allen möglichen Kombinationen von Adenin,

61 Material und Methoden 46 Thymin, Guanin und Cytosin. Vor der c-dna Synthese wurde ein DNase Verdau durchgeführt, der Verunreinigungen mit genomischer DNA vernichtet. Alle Arbeitsflächen und Arbeitsgeräte wurden vor Beginn der Arbeit mit 10%iger SDS Lösung gereinigt. Die Arbeit wurde unter einer PCR Arbeitsstation 10 durchgeführt, die zuvor durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht dekontaminiert wurde. Je Probe wurde 400ng Gesamt-RNA streng nach Herstellerangaben in cdna umgeschrieben. Die umgeschriebene cdna konnte als Matritze in der qrt-pcr eingesetzt werden. Nach dem Verdau der genomischen DNA wurde die verbleibende RNA dazu genutzt von einer einzelsträngigen RNA einen RNA-DNA-Hybridstrang mittels einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase zu synthetisieren DNase Verdau Material: RNA Proben Lagerung bei -80 C DNase I, RNase free 12 (1U/µl) Lagerung bei -20 C 10x Reaktionspuffer mit MgCl 12 Lagerung bei -20 C Aqua bidest. (nukleasefrei) Lagerung bei -20 C 25mM EDTA Lösung 12 Lagerung bei -20 C Durchführung: Ansatz für einen DNase Verdau RNA 10x Reaktionspuffer mit MgCl DNase Aqua bidest. (nukleasefrei) 1μg 1μl 1μl (1U/μl) ad 10μl 30 Minuten Inkubation bei 37 C 25mM EDTA 1µl 10 Minuten Inkubation bei 65 C

62 Material und Methoden cdna Synthese Material: DNase verdaute RNA GoScript TM Reverse Transciption System 3 Lagerung bei -20 C Aqua bidest. (nukleasefrei) Lagerung bei -20 C Durchführung: DNase verdaute RNA 4,4µl Random Hexamer Primer (100pmol) 1µl Aqua bidest. (nukleasefrei) 4,6µl 5 Minuten Inkubation bei 70 C 5 Minuten Inkubation auf Eis Aqua bidest. (nukleasefrei) 1,5µl GOScript 5x Reaktionspuffer 4µl MgCl (25mM) 2µl PCR Nukleotid Mix (0,5mM) 1µl RNasin Ribonuklease Hemmer 0,5µl GOScript Reverse Transkriptase 1µl 5 Minuten Inkubation bei 25 C, 60 Minuten Inkubation bei 42 C und 15 Minuten Inkubation bei 70 C Im Anschluss wurden die Proben bis zur Verwendung bei -20 C gelagert Quantitative Real Time Polymerase Kettenreaktion (qrt- PCR) Die qrt-pcr dient dazu, die Menge RNA eines bestimmten Gens in einer Ausgangsprobe quantitativ zu bestimmen. Sie beruht auf dem Prinzip der konventionellen Polymerase Kettenreaktion. Dabei wird ein fluoreszierender Farbstoff (SYBR Green) in die DNA-Stränge eingebaut. Die Fluoreszenz Intensität wird nach jedem PCR-Zyklus ermittelt und nimmt

63 Material und Methoden 48 proportional mit der Menge an PCR-Produkt zu, so dass anhand der Stärke der Fluoreszenz die relative Menge an DNA eines bestimmten Gens in der Probe ermittelt werden kann. Material: GoTaq q-pcr Mater Mix 3 Lagerung bei -20 C Aqua bidest. (nukleasefrei) Lagerung bei -20 C qpcr Primer (5pmol/µl) 14 Lagerung bei -20 C Verwendete Primer: Die in der qrt-pcr eingesetzten Primer wurden nach einer einheitlichen Anealing- Temperatur von 59 C und einer Amplikongröße von 80 bis 150 Nukleotiden gewählt. Sie weisen eine Länge von etwa 20 Nukleotiden auf und bilden weder Selbst- noch Kreuz-Dimere und keine Sekundärstrukturen. Für jedes Primerpaar wurde die Bindungseffizienz in einer Standardkurve bestimmt. Die Synthese der Primer erfolgte durch die Firma MWG, Ebersberg. Die Spezifität der Primerpaare wurde durch Sequenzierung des Amplifikats überprüft (Firma GATC, Konstanz). Tabelle 4 Verwendete qrt-pcr Primer Primer Primersequenz sense Primersequenz antisense 18s rrna CATGTCTAAGTACACACGGGCGGTA GGCGCTCGTCGGCATGTATTA CD40 CACCTTCTCCAATGTATCTTCCAA TCCCTTTCACCTTCACCACAA IL6 GCTTCGACGAGGAGAAATGC GCCAGGTGCTTTGTGCTGTA Mx GCGGACAAGCCATAGAACAAG GGCACCCCAAAAACTCCTACA PKR GGAAGTAGACATTTATGCGCTGG CATCCTGCCATACCTTGTTTTTCT TFRC GGCGGGCCTTCAGTCAA ATCGGCTCGACGCTGAAC TLR5 ACTGCTGGAGGATTTGTTCTTGTT GGTCCAAGACACGAAGATTTGG TLR21 GACCGACCTCTATCACAACTCCTT AGGACGGAGACACGGTTGTT Durchführung qrt-pcr: Alle Arbeitsflächen und Arbeitsgeräte wurden vor Beginn der Arbeit mit 10%iger SDS Lösung gereinigt. Die Arbeit wurde unter einer PCR Arbeitsstation 10 durchgeführt, die zuvor durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht dekontaminiert wurde. Jeder Ansatz wurde als echtes Duplikat pipettiert.

64 Material und Methoden 49 Aus den folgenden Reagenzien wurde ein Mastermix pipettiert: Primer sense Primer antisense Aqua bidest. (nukleasefrei) GoTaq Mastermix 100xCXR Reference Dye 1,5µl 1,5µl 8,25µl 12,5µl 0,25µl Von diesem Mastermix wurden 24µl in eine 96-Loch-PCR-Platte 26 pipettiert und jeweils 1µl cdna zugegeben. Die PCR-Ansätze wurden vorsichtig gemischt und mit einer durchsichtigen, selbstklebenden Folie abgedichtet. Die Platte wurde kurz zentrifugiert um Luftblasen zu entfernen. Die qrt-pcr wurde nach folgendem Temperaturprotokoll durchgeführt: Phase Funktion Temperatur Wiederholungen Zeit Initiale 95 C 1 mal 2 Minuten Aktivierungsphase Denaturierung 95 C 15 Sekunden Amplifikationsphase Annealing 59 C 40 mal 30 Sekunden Extension 72 C 30 Sekunden 95 C 15 Sekunden Schmelzkurve 57 C 1 mal 30 Sekunden 95 C 15 Sekunden Auswertung: Um das Ergebnis einer qrt-pcr vergleichbar zu machen, wurde der CT-Wert (threshold cycle) in der exponentiellen Phase ermittelt. Da die Proben in Duplikaten aufgetragen wurden, wurde ein Mittelwert der CT-Werte errechnet und auf den Mittelwert des CT-Wertes des Housekeeping-Gens (18s rrna) normalisiert. Durch Subtraktion des CT-Wertes der 18s rrna von dem CT-Wert der Probe ergab sich der ΔCT. Nun wurde der ΔCT von der maximalen Anzahl der Amplifikationszyklen abgezogen, 40-ΔCT, um einen zur Expression direkt proportionalen Wert zu erhalten. Um mehrere Gruppen, beispielsweise die Gruppen Kontrolle und Infiziert miteinander vergleichen, wurde der ΔCT einer Gruppe vom ΔCT einer anderen Gruppe abgezogen. Dies ergab den ΔΔCT-Wert. Dadurch erhielt man die relative Expressionsänderung zwischen Kontrolle und Infiziert. Um die n-fache Expression E eines Gens der Gruppe Infiziert im Vergleich zu der Gruppe Kontrolle zu ermitteln, wurde die Formel E=2 -Δ ΔCT verwendet.

65 Material und Methoden Mikroarray Durch die Mikroarray Technologie ist es möglich, mehrere tausend Gene gleichzeitig zu untersuchen. Es gibt zwei Arten der DNA Mikroarrays: spotted Microarrays und Olignucleotide Microarrays. Der Unterschied liegt darin, dass sich beim spotted Micorarray cdna oder PCR Produkte als Sonden auf der Trägerplatte befinden, während beim Oligonucleotide Microarray synthetisch hergestellte Oligonukleotide als Sonden dienen. In beiden Arten dienen die Sonden als komplementäres Gegenstück für bestimmte fluoreszierende crna in zu untersuchenden Proben. Für die in dieser Dissertation beschriebene Mikroarray Analysen wurde der Agilent Oligonukleotid Mikroarray: Agilent 4x44K chicken-genom Katalog- Mikroarray verwendet. Dieser ermöglicht die gleichzeitige Analyse von vier Mikroarrays auf einem Glasträger mit jeweils Spots. Jeder Spot besteht aus 60 Nukleotiden mit bestimmter Sequenz. Auf dem Agilent 4x44K chicken-genom Katalog- Mikroarray ist ein Querschnitt aller bekannten Hühnergene zu finden. Zusätzlich bietet Agilent die Möglichkeit weitere Gene auf dem Mikroarray analysieren zu lassen. Deren Sequenz kann man über ein Internetprogramm earray in eine passende, für das gewünschte Gen spezifische, Oligonukleotidsequenz umrechnen lassen. Dadurch konnten im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Mikroarrays zusätzlich zu den bereits von Agilent gespotteten Genen weitere Gene analysiert werden, die speziell Funktionen im Bereich des Immunsystems erfüllen. Mängel in der Annotation wurden im Rahmen von früheren Dissertationen über eine eigens für das Projekt AvImmun entwickelte Software AvI-Blast und über im Internet verfügbare ID-Converter wie DAVID, Babelomics und g:profiler stark verbessert. Durch diese Arbeiten konnten den Spots auf dem Mikroarray Proben zugeordnet werden. Da einige Gene wiederholt als Spots auf den Mikroarry geladen wurden, entspricht dies Genen, die über den Mikroarray angesprochen werden können. Eine Liste mit den annotierten Genen ist auf der beiliegenden CD in Mappe 1, Tabelle 28 zu finden crna Synthese Material: One-Color Spike-In-Kit 11 Quick Amp Labeling Kit, one color 11 RNeasy Mini Kit 11

66 Material und Methoden 51 Durchführung: Den RNA-Proben wurden sogenannte Spike-In-RNAs zugesetzt. Diese ermöglichen die Postitivkontrolle des gesamten Arbeitsablaufs. Spike-In-RNAs bestehen aus zehn definierten Transkripten, die nur minimal selbst- und kreuzhybridisieren. Bei der Hybridisierung binden die Spike-In-RNAs an Spike-In-Proben. Diese Spike-In-Proben weisen keine komplementäre Sequenz zu biologischen Replikaten auf. Bei der cdna Synthese wurden 500ng RNS streng nach Herstellerangaben mit einer rekombinanten Reversen Transkriptase 1:1 in cdna umgeschrieben. Die eingesetzten T7- Promotor-Primer banden an poly-adenosin RNA Abschnitte. Dadurch wurde nur der mrna- Anteil in cdna umgeschrieben. Außerdem enthielten diese Primer auch eine Promotorsequenz für die T7-RNA Polymerase, die in der nachfolgenden crna-synthese eingesetzt wurde. Die Silikatmembran basierte Aufreinigung der crna wurde nach Herstellerangaben durchgeführt, um Rückstände aus den bisher durchgeführten Reaktionen aus den Proben zu entfernen. Die Proben wurden im NanoDrop 10 gemessen um die Gesamt-cRNA Ausbeute und die spezifische Cy3-Aktivität zu bestimmen. Dafür wurde das Verhältnis der Cy3 Konzentration (pmol/µl) zur Menge der Gesamt crna (µg) berechnet. Für die weitere Verwendung musste eine crna Gesamtmenge von mindestens 1,65µg und eine spezifische Cy3 Aktivität von mehr als 9,0pmol Cy3 pro µg RNA vorliegen Fragmentierung der crna Material: Gene Expression Hybridisation Kit 11 Durchführung: Um die Hybridisierungskinetik zu optimieren, mussten die crna Stränge fragmentiert werden. Dafür wurde zu 1,65µg crna 2,2µl 25xFraktionspuffer zugegeben. Diese Mischung wurde exakt 30 Minuten bei 60 C inkubiert. Dann wurde Hybridisierungspuffer zugefügt und dadurch die Fragmentation gestoppt. Anschließend wurden die Proben in ein spezielles Medium für die Hybridisierung überführt.

67 Material und Methoden Hybridisierung des Mikroarrays Material: Gasketslides 11 Durchführung: Bei der Hybridisierung des Mikroarrays musste streng auf Sauberkeit geachtet werden, da die Mikroarrays äußerst empfindlich sind. Sie durften nur mit puderfreien Handschuhen seitlich berührt werden und die Luftexposition des Mikroarrays musste auf ein Minimum reduziert werden. Gleichzeitig musste rasch und präzise gearbeitet werden. Durch das gewählte Mikroarrayformat 4x44K konnten vier Mikroarrays auf ein Gasketslide aufgetragen werden. Dafür wurden pro Mikroarray 100µl Hybridisierungsflüssigkeit auf einen mit einem Gummiring abgedichteten Teil des Gasketslides aufgetragen. Dadurch entstand der so genannte Mikroarray-Gasketslide Sandwich. Dabei durfte die Flüssigkeit keinen Kontakt zu dem Gummiring haben. Nachdem dies für alle vier Mikroarrays auf dem Gasketslide durchgeführt wurde, wurde das Microarrayslide so aufgelegt, dass zwischen den beiden Glasplatten vier durch die Gummiringe abgedichtete Räume entstanden. Jede Mikroarrayfläche musste vollkommen mit Flüssigkeit benetzt sein und eine mobile Luftblase musste in dem abgedichteten Raum zu sehen sein. Die Mikroarrays wurden für 17 Stunden bei 65 C und 10rpm in einem Hybridisierungsofen inkubiert. Die einzelne mobile Luftblase ermöglichte eine kontinuierliche Durchmischung der Hybridisierungsflüssigkeit und sorgte dafür, dass jeder Teil des Mikroarrays immer wieder mit der Flüssigkeit in Kontakt kam Waschen und Scan des Mikroarrays Material: Gene Expression Wash Buffer 1 11 Gene Expression Wash Buffer 2 11 Triton X Durchführung: Nach der Hybridisierung wurden die Mikroarray-Gasketslide-Sandwiches in einem Bad mit 500ml Waschpuffer 1 gewaschen und dabei wurde der Mikroarray vom Gasketslide mit Hilfe einer Pinzette getrennt. Anschließend wurden die Mikroarrays erneut in ein Bad mit Waschpuffer 1 gestellt und dort gesammelt, bis alle bearbeiteten Microarrayslides in Waschpuffer 1 standen. Daraufhin kamen die Microarrayslides für 1 Minute in Waschpuffer 2 (31 C) und wurden langsam herausgezogen, damit die Flüssigkeit gleichmäßig abfließen

68 Material und Methoden 53 konnte. Diese Waschschritte dienten der Entfernung nicht gebundener crna Fragmente. Schließlich wurden die Mikroarray in einem Agilent G2505C Scanner 11 bei einer Auflösung von 3µm gescannt Auswertung des Mikroarrays Agilent Feature Extraction Software Version Die Agilent Feature Extraction Software diente zum Bearbeiten der Bilddatei des Scans. Dadurch konnten die Daten weiter analysiert werden. Jedem Feature bzw. Spot auf dem Mikroarray wurde über ein ausgelegtes Raster eine Probe-ID zugeordnet. Außerdem rechnete die Software die Signalintensität jedes Features in einen Zahlenwert um. Zeigte ein Feature Abnormitäten wurde es von der Software erkannt und entfernt. Ein Qualitätsreport wurde anhand der mitanalysierten Spike-In-Proben erstellt. Außerdem wurde von der Software über die Spike-In-Proben der lineare Bereich der Quantifikation, die Nachweisgrenze und der Punkt der Sättigung bestimmt Bioconductor R Version Mit dem Programm R wurden die Mikroarraydaten normalisiert und statistisch ausgewertet. Erweiterungswerkzeuge ermöglichten die spezifische Analyse von Daten aus Mikroarray Experimenten. Analysiert wurden die Fluoreszenz Intensitäts-Werte (gprocesssignal) aller Mikroarrays. Diese wurden als tabstop getrennte Textdatei dem Programm zur Analyse zur Verfügung gestellt. Die Normalisierung wurde als VSN (Variance Stabilization and Normalization) durchgeführt. Dabei wurden die Daten derart transformiert, dass die Varianz der Stärke der Signalintensität der Mikroarraydaten möglichst konstant war. Der natürliche Logarithmus der Mikroarraydaten wurde durch VSN errechnet. Das Geneplotter Paket reduzierte die normalisierten Arraydaten zur graphischen Darstellung in einer Heat Map Significance Analysis of Microarrays Version 3.08 (SAM) SAM dient der statistischen Analyse von Mikroarrayexperimenten. Mit SAM können signifikant regulierte Gene aus der Masse von Mikroarraydatensätzen identifiziert werden. Dafür erstellt SAM wiederholt Permutationen der Mikroarraydaten und identifiziert Spots die in einer Gruppe im Vergleich zu einer anderen Gruppe signifikant reguliert sind. Für die Analyse muss ein Exceltabellenblatt erstellt werden. Auf diesem sollte die Probe-ID der einzelnen Spots und die zugehörigen normalisierten gprocesssignal Werte der einzelnen Mikroarrayexperimente gelistet sein. Um ausschließlich signifikant regulierte Gene zu untersuchen, wurde die False Discovery Rate (FDR) auf 5% festgelegt. Für die statistische

69 Material und Methoden 54 Analyse in der vorliegenden Arbeit wurden zwei Analysemethoden durchgeführt: Two class, unpaird und Multiclass. Bei den Arbeiten mit Newcastle Disease Virus wurde die Analysemethode Two class, unpaired angewandt. Dabei wurden zwei Gruppen miteinander verglichen ( Two class ), die jeweils mehrere biologische Replikate umfassten ( unpaired ). Diese Analyse wurde im Lungengewebe für die Gruppen infiziert verändert und nicht infiziert, infiziert verändert und infiziert unverändert, infiziert unverändert und nicht infiziert durchgeführt und im Milzgewebe für die Gruppen infiziert und nicht infiziert. Bei dem Mikroarray Experiment nach Typ I IFN Injektion wurde die Multiclass Analyse angewandt. Dabei werden signifikant regulierte Proben in mehreren Gruppen gesucht. In dem erwähnten Experiment war dies der Gruppenvergleich zwischen Kontrolle und den drei Injektionszeitpunkten IFN(3h), IFN(6h) und IFN(9h) Berechnung der Expressionsänderung (fold change) Mit dem fold change (FC) können Expressionsänderungen zwischen zwei Gruppen errechnet werden. Dafür wurden in einer Excel Tabelle die Probe-IDs der einzelnen Spots und die zugehörigen normalisierten gprocesssignal Werte der einzelnen Mikroarrayexperiment gelistet. Der FC wurde mit der Formel FC=EXP(Mittelwert(Gruppe2)-Mittelwert(Gruppe1)) errechnet. Werte über 1 bedeuten, dass ein Spot in Gruppe 2 eine höhere Expression als in Gruppe 1 hat. Werte zwischen 0 und 1 bedeuten, dass ein Spot in Gruppe 2 eine weniger starke Expression als in Gruppe 1 hat. Ein Wert von 1 bedeutet, dass es keinen Expressionsunterschied zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 gibt. Zur vereinfachten Darstellung und besseren Interpretationsmöglichkeit der herunterregulierten FC-Werte wurden diese in negative Zahlenwerte umgerechnet. Dafür wurde folgende Excel Funktion durchgeführt: =WENN(FC<1;-1/FC;FC). So ergab sich aus einem FC von 0,5 vor der Umrechnung ein Wert von -2, also eine 2fache Herunter-Regulation des Spots Microsoft Office Access Datenbanksystem Um Daten aus unterschiedlichen Analysen miteinander zu vergleichen wurden Microsoft Access Analysen verwendet. Dafür wurde die Versionen Microsoft Office Access 2003 und Microsoft Office Access 2010 verwendet Pathway Express Die Datensätze mit signifikant regulierten Spots aus den Mikroarray Experimenten wurden mit dem online Programm Pathway Express (Intelligent Systems and Bioinformatic Laboratory) analysiert. Mit diesem Programm können für die Analyse biologisch relevante Signalwege identifiziert werden. Dabei bedient sich das Programm der KEGG Datenbank (Kyoto

70 Material und Methoden 55 Encyclopedia of Genes and Genomes). Für die Analyse mit Pathway Express müssen eine Eingabedatei und eine Referenzdatei als Textdateien erstellt werden. Die Eingabedatei enthält die Gensymbole der signifikant regulierten Spots und die entsprechenden FCs. Die Referenzdatei enthält alle orthologen Gensymbole, die auf dem Mikroarray zu finden sind. Als Ergebnis der Analyse erhält man ein Datenblatt mit den identifizierten Signalwegen und einigen weiteren Parametern. Außerdem erhält man eine Graphikdatei mit dem entsprechenden Signalweg. Zu den Parametern gehört der Impact Faktor, der p-value des Signalwegs und der corrected gamma p-value. Der Impact Faktor repräsentiert die Eindeutigkeit der enthaltenen Gene und deren Lage im Signalweg. Der p-value die Signifikanz des Signalwerts. Der corrected gamma p-value wird aus dem Impact Faktor, dem FC und dem p-value errechnet. Er spiegelt die biologische Relevanz des Signalwegs wider. Als Grenzwert für die biologische Relevanz des Signalwegs wurde ein corrected gamma p-value von kleiner als 0,5 festgelegt Multi Experiment Viewer Version Mit der Software MEV kann man mehr als zwei Gruppen eines Experiments gleichzeitig auswerten. Dadurch kann man beispielsweise das Expressionsverhalten eines bestimmten Genes über verschiedene Analysezeitpunkte darstellen. Es besteht die Möglichkeit, alle signifikant regulierte Spots mit den entsprechenden FC zu analysieren, einzelne interessante Gruppen oder sogar einzelne Gene. Dafür wurden die gewünschten Probe-IDs und die entsprechenden normalisierten gprocesssignal Werte in eine Exceltabelle übertragen. In MeV kann man die hochgeladenen Datensätze auf unterschiedliche Weise analysieren. Zum einen kann man eine hierarchische Cluster-Analyse (Hierachical Clustering HCL, sample tree) durchführen. Darin sieht man, wie ähnlich die analysierten Gruppen untereinander sind. Durch die baumähnliche Darstellung wird die Beziehung der unterschiedlichen Gruppen widergespiegelt. Die Self Organizing Tree Algorithm (SOTA) Analyse teilt Gene hinsichtlich ihres Expressionsverhaltens in den analysierten Gruppen ein. Für alle Analysen wurde die Metrik: Pearson correlation und Iteration: 100 angewandt. # Ingenuity Ingenuity ( ist ein kommerzielles Internet Programm mit dem man hochgeladene Datensätze auf unterschiedlichste Weise analysieren kann. Die Eingabedatei sollte Gensymbol oder Probe-IDs und die entsprechenden FCs der zu analysierenden Experimente beinhalten. Ingenuity analysiert nun den Datensatz hinsichtlich der in der Analyse relevanten biologischen Funktionen, Signalwege, beteiligter Transkriptionsfaktoren und Netzwerke. Außerdem stellt Ingenuity die genannten Analysen graphisch dar. Für die Analysen greift Ingenuity auf zahlreiche Datenbanken und Veröffentlichungen zurück. Deren

71 Material und Methoden 56 Ergebnisse analysiert Ingenuity und setzt sie in Verhältnisse zueinander, um biologisch relevante Zusammenhänge zu verdeutlichen PANTHER-Gene List Analysis PANTHER ist ein im Internet frei verfügbares Programm ( Es analysiert hochgeladene Listen von Gensymbolen hinsichtlich genontologischer Kriterien. Die Ergebnisse sind als Kreisdiagramm oder Balkendiagramm darstellbar und beinhalten die prozentuale Aufteilung der beteiligten genontologischen Gruppen der hochgeladenen Genliste. Des Weiteren erhält man Listen, mit Informationen über die ontologischen Gruppen, in die die hochgeladenen Gene eingeteilt werden INTERFEROME Datenbank und ISG-Database Die INTERFEROME Datenbank und die ISG-Database sind im Internet frei verfügbare Datenbanken zur Identifizierung von IRGs. Die INTERFEROME Datenbank umfasst eine umfangreiche Liste von über IRGs aus zahlreichen Mikroarray Experimenten, in welchen das Transkriptom von Gewebe oder Zelllinien aus Maus oder Menschen nach IFN- Applikation untersucht wurde. Des Weiteren gibt INTERFEROME einen Überblick darüber, durch welche IFNs die Transkription bestimmter Gene ausgelöst wird. Um zu untersuchen ob in einem Datensatz in INTERFEROME gelistete IRGs enthalten sind, mussten die entsprechenden Gensymbole in humane oder murine Ensembl Identitäten umgeformt werden. Hierfür bot INTERFEROME eine spezielle Funktion. Mit dieser Funktion wurden im Rahmen dieser Dissertation, die auf dem Mikroarray annotierten Gensymbole in humane bzw. murine Ensembl Identitäten umgeformt und diese dann in INTERFEROME zur Analyse hineingeladen. Die ISG-Database umfasst über 300 IFN-stimulierte Gene (ISGs). ISG-Database teilt ISGs hinsichtlich ihrer Funktion in zahlreiche Gruppen, wie beispielsweise Adhäsion, Immunmodulation, Chemokine und antivirale ISGs. Diese Gruppen wurden aufgerufen und die enthaltenen Gene mit den auf dem Mikroarray annotierten Gensymbolen abgeglichen. Neben anderen Publikationen über IRGs wurden diese beiden Datenbanken zur Identifizierung von möglichen IRGs im Hühnergenom verwendet.

72 Material und Methoden Durchflusszytometrische Untersuchungen Material: Collagenase Verdau: PBS ph 7,2 Liberase TM 36 5mg Gelöst in 13ml Aqua bidest. Im Kühlschrank für 30 Minuten stehen lassen In 100µl Aliquots bei -20 C einfrieren (0,2 Wünsch Units) Puffer für die Enzymreaktion 0,0203g MgCl 2 1 (1mM) 0,0011g CaCl 2 1 (0,1mM) ad 100ml PBS bei RT lagern PBS ph 7,2 mit 1% BSA 9 (bovines Serum Albumin) Biocoll Separating Solution 2 Zellen als klumpenfreie Einzelzellsuspension Primäre und sekundäre Antikörper verdünnt in Fluo-Puffer Fluo-Puffer 5g BSA 9 (bovines Serum Albumin) 50mg Natrium-Azid (NaN 3 ) 1 Ad 500ml PBS ph7,2; Lagerung bei 4 C Ethylendiamintetraacetat 1 (EDTA) 7-Actinomycin-D (7-AAD) 9 1mg 7-AAD in 50µl Methanol 1 lösen, ad 5ml PBS ph7,2; Lagerung in 1ml-Aliquots bei - 20 C Zell-Sieb (Cell Strainer) 100µm, gelb 38 Durchführung: Die Lunge wurde mit der Schere in 6ml PBS und 1ml Puffer für die Enzymreaktion in einem 50ml Probenröhrchen möglichst stark zerkleinert und nach Zugabe von 600µl Liberase TM 36 30Minuten bei 37 C in ein Schüttelinkubator 37 gestellt. Anschließend wurde das Präparat durch ein Sieb in ein 50ml Probenröhrchen homogenisiert, dieses auf 50ml mit PBS aufgefüllt um das Homogenat für 10Minuten auf Eis sedimentieren zu lassen. Der Überstand (etwa 45ml) wurde abgenommen, in ein weiteres 50ml Probenröhrchen überführt 26, und abzentrifugiert (10Minuten bei 4 C und 225xg). Das Zellpellet in 10ml PBS mit 1% BSA 9 resuspendiert und auf 10ml einer Biocoll-Separations-Lösung geschichtet. Nach 12 Minuten Dichtezentrifugation bei RT mit 650xg wurde die Interphase mit einer Pipette abgenommen und mit PBS gewaschen und zentrifugiert (10Minuten bei 4 C und 350xg). Anschließend wurde das Zellpellet in 10ml Fluopuffer mit 0,1% EDTA 1 und über einen 100µm Falcon-Aufsatz filtriert. Die Zellen wurden gezählt und pro Färbung wurden 1x10 6 Zellen eingesetzt. Diese wurden in Rundlochplatten mittels Zentrifugation in 96-Rundloch-

73 Material und Methoden 58 Platten pelletiert. Nach Resuspendieren in den jeweiligen Antikörper-Lösungen wurden die Zellen für je 20 Minuten lichtgeschützt auf Eis inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wurden 200µl Fluo-Puffer zugegeben, die 96-Lochplatten dann für 1 Minute bei 700xg und 4 C zentrifugiert und abschließend der Überstand durch rasches Abkippen gründlich vom Zellpellet entfernt (im Folgenden als Waschen bezeichnet). Am Ende einer Färbung wurden die Zellen in 200µl Fluo-Puffer resuspendiert und diese 200µl Zellsuspension in ein Messröhrchen überführt, in das zuvor 200µl Fluopuffer vorgelegt wurden. Die Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen erfolgte mithilfe der Programme BD FACS-DIVA Version 3.0 und FlowJo Eine Auflistung der eingesetzten Primär- und Sekundärantikörper ist Tabelle 5 zu entnehmen. Tabelle 5 In der Durchflusszytometrie eingesetzte Antikörper Gelistet sind die verwendeten Primärantikörper (A) und Sekundärantikörper (B) A Antigen Klon Isotyp Fluorochrom Konzentration/ Hersteller/ Verdünnung Referenz chcd IgG2a P FITC 1:50 39 chcd IgG2a P APC 1:1000 selbst chb6 (Bu1) AV20 IgG1 P APC 1: chb6 (Bu1) AV20 IgG1 P RPE 1: chcd3 CT3 igg1 P FITC 1:50 34 chcd4 CT4 IgG1 P RPE 1: chcd8a CT8 IgG1 P RPE 1: chmhcii anti-chia (CIa) IgM k P RPE 1: chtcrγδ TCR1 IgG1 P FITC 1: chtcrαβ-1 TCR2 IgG1 P FITC 1: chtcrαβ-2 TCR3 IgG1 P FITC 1: chmz, chmq KUL01 IgG1 P RPE 1: evtl. Integrin CD11C 8F2 IgG1 A APC 1:500 selbst Granulozyten GRL1 IgG3 Z 1:10 32 Granulozyten GRL2 IgG1 Z 1:20 32 chcd45 LT40 IgM P 5µg/ml [334] CD56 4B5 IgG1 1:3 [335] Thrombozyten, Makrophagen K1 IgG2a Z 1:3 [336] Z = Zellkulturüberstand; P = gereinigter Antikörper B Antigen Klon Fluorochrom Konzentration Hersteller muigg3 Ziege-anti-Maus-IgG3 FITC 1: muigg1 Ziege-anti-Maus-IgG1 RPE 1:30 34 muigg2a Ziege-anti-Maud-IgG2a Alexa Fluor 647 1: muigm Ziege-anti-Maus-IgM FITC 1:200 34

74 Material und Methoden Färbung mit direkt Fluorochrom-markierten Antikörpern Bei Färbungen mit Direktkonjugaten wurden die Zellen in 40µl der Antikörper-Lösungen inkubiert, danach 1x gewaschen. Wurden Mehrfachfärbungen durchgeführt, so wurden die Antikörper gemeinsam in ihrer Endkonzentration angesetzt und 40µl der Mixtur zum Färben verwendet Indirekte Färbungen Hierbei wurden nicht markierte Primärantikörper und nach einmaligem Waschen der Zellen Fluorochrom-markierte Sekundärantikörper eingesetzt. Von den Primärantikörpern wurden pro Färbung 40µl der Antikörper-Lösung eingesetzt. Verwendete man bei Mehrfachfärbungen gereinigte Primärantikörper, so wurden diese gemeinsam in Fluo-Puffer verdünnt. Bei Einsatz von zwei oder mehr Zellkulturüberständen wurden in Mehrfachfärbungen bei purem Einsatz jeweils 40µl von jedem Zellkulturüberstand zu den Zellen gegeben. Wurden Mehrfachfärbungen gleichzeitig sowohl mit aufgereinigten Primärantikörpern als auch Zellkulturüberständen durchgeführt, so wurden die gereinigten Primärantikörper in den Zellkulturüberständen verdünnt. Von den Enverdünnungen der isotypspezifischen Sekundärantikörper wurden jeweils 40µl eingesetzt. Bei Mehrfachfärbungen wurden die benötigten Sekundärantikörper in einem einzigen Endverdünnungs-Ansatz in Fluo-Puffer angemischt. Wurden bei Mehrfachfärbungen Direktkonjugate und unkonjugierte Antikörper eingesetzt, so wurden die Direktkonjugate stets mit den Sekundärantikörpern zugegeben Lebend/Tot-Färbung mit 7-AAD Für eine Diskriminierung zwischen toten und lebenden Zellen wurde direkt vor der Messung 10µl 7-AAD-Lösung zu den im FACS-Röhrchen befindlichen 400µl Zellsuspension gegeben.

75 Material und Methoden Histologie Vorbereitung der Gewebeproben für die Histologie Material 1,5%ige LowMelt Agarose 17 Knopfkanüle Faden 50ml Spritzen Einbettkassetten für Paraffinhistologie 15 10% Neutral gepufferte Formalinlösung (NBF) Aufsteigende Alkoholreihe und Paraffinreihe 2x Ethanol 40% je 12 Stunden 2x Ethanol 50% je 12 Stunden 2x Ethanol 60% je 12 Stunden 2x Ethanol 70% je 12 Stunden 2x Ethanol % je 12 Stunden 2x Isopropanol 16 je 12 Stunden 2x Xylol 16 je 24 Stunden Einmalige Verwendung bei RT 1er Paraffin 17 für 24 Stunden 3er Paraffin 17 für 24 Stunden 6er Paraffin 17 für 24 Stunden 9er Paraffin 17 für 24 Stunden Anwendung und Lagerung bei 65 C im Wärmeschrank Tissue Tek 18 Lagerung bei RT Peel-Off-Einbettkassetten für Kryohistologie 19 Flüssiger Stickstoff 8 Aluminiumfolie 20 SuperFrost Plus Objektträger 18 Aceton 1 Lagerung bei RT, Verwendungstemperatur 4 C Absteigende Alkoholreihe Xylol 16 1 Xylol 16 2 Isopropanol 16 1 Isopropanol 16 2 Ethanol % Ethanol 16 70% Lagerung bei RT für 10 Minuten für 10 Minuten 20 mal getaucht 20 mal getaucht 20 mal getaucht 20 mal getaucht PBS Lagerung bei RT

76 Material und Methoden 61 Durchführung: Für die Kryohistologie der Lungen wurden die Tiere getötet und die Organe mit Ausnahme der Atmungsorgane entfernt. Die Trachea wurde frei präpariert und eröffnet. Eine Knopfkanüle wurde eingeführt und mit einem Bindfaden befestigt. Die Tiere wurden an den Ständern aufgehängt und die erwärmte 1,5%ige LowMeltAgarose mit einer 50ml Spritze über die Knopfkanüle in die Lunge injiziert. Sobald man den Flüssigkeitsspiegel in den Luftsäcken ansteigen sah, wurde die Trachea mit einem Faden verschlossen und die Knopfkanüle entfernt. Zum Druckausgleich wurden die abdominalen Luftsäcke eröffnet und die Tiere für etwa 2 Stunden in einen 4 C kalten Raum oder Kühlschrank gehängt. In dieser Zeit härtete die Agarose aus. Sobald die Agarose vollständig ausgehärtet war, wurden die Lungen herauspräppariert und die vorletzten und letzten Lungenscheiben der linken Lungen in Tissue Tek eingebettet. Anschließend wurden die Proben vorsichtig in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 C mit Alufolie umwickelt gelagert. Für die Paraffinhistologie wurden die vorletzte Lungenscheibe der rechten Lungen in Einbettkassetten für Paraffinhistologie gelegt und für 12 Stunden in NBF fixiert. Anschließend wurden die fixierten Präparate zweimal für 12 Stunden in PBS gewaschen und in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert. Danach kamen die Proben für jeweils 24 Stunden in vier verschiedene Paraffine und wurden schließlich an einer Ausgießstation in Paraffinblöcke eingebettet. Diese wurden bei Raumtemperatur gelagert Anfertigung von Gewebeschnitten Für die Kryohistologie wurden mit einem Kryotom (Kryostat HM500 OM 31 ) 8µm dicke Gefrierschnitte von den Präparaten angefertigt. Für die Paraffinhistologie wurden mit einem Rotationsmikrotom 31 5µm dicke Paraffinschnitte angefertigt. Anschließend wurden die Schnitte auf Superfrost Plus Objektträger aufgetragen und entsprechend den Anforderungen (Kryohistologie bei Raumtemperatur für 1 Stunde; Paraffinhistologie bei 37 C für 48 Stunden) getrocknet Vorbereitung der Schnitte für die Färbung Zum Fixieren der Gefrierschnitte wurden diese vor Beginn der Färbung für 2 Minuten mit eiskaltem Aceton behandelt, anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und zuletzt mit PBS für 15 Minuten gewässert. Zum Fixieren der Paraffinschnitte wurden diese vor Beginn der Färbung mit der absteigenden Reihe der Alkohole entparaffiniert und zuletzt mit PBS für 15 Minuten gewässert.

77 Material und Methoden Histologische Färbung mit Hämatoxylin-Eosin Lösung Material: Eosin-Lösung 15 Lagerung bei Raumtemperatur Mayer s Hämatoxylin-Lösung 15 Lagerung bei Raumtemperatur Aufsteigende Alkoholreihe Ethanol 70% Ethanol % Isopropanol 16 1 Isopropanol 16 2 Xylol 16 1 Xylol 16 2 Lagerung bei RT Deckgläser 15 Eukitt Eindeckelmedium 15 Lagerung bei RT Durchführung: Entparaffinierte gewässerte Paraffinschnitte wurden für fünf Minuten in Mayer s Hämatoxylin-Lösung gelegt. Anschließend wurden sie für fünf Minuten unter fließendem Wasser abgespült. Nun wurden sie zwei Minuten in Eosin gefärbt. Es folgte die Behandlung der Schnitte mit der aufsteigenden Reihe der Alkohole. Zuletzt wurden die Schnitte mit Eukitt Eindeckelmedium und Deckgläsern versehen Immunhistochemische Färbung Material: Feuchte Kammer Parafilm 20 PBS 30% H 2 O 2 1 Lagerung bei RT Methanol 16 40% Lagerung bei RT Bovines Serumalbumin 9 (BSA) Magermilchpulver 1 Pferdeserum 21 Lagerung bei -20 C

78 Material und Methoden 63 Vectastain ABC-Kit -PK Vector DAB-Kit 21 Aqua dest. Mayer s Hämatoxylin-Lösung 15 Aufsteigende Alkoholreihe Eukitt Eindeckelmedium 15 Deckgläser 15 Tabelle 6 Verwendete Primärantikörper für die Immunfluoreszenzfärbung Antikörper (Klonname) Antigen Zelltyp Verdünnung Referenz α-bu1 a+b chb6.1, chb6.2 Hühner B-Lymphozyten 1:100 selbst α-cd4 (2-6) chcd4 Hühner T-Helfer Lymphozyten 1:2 selbst α-cd8 (3-298) chcd8 Zytotoxische Hühner T-Lymphozyten 1:50 selbst α-cd45 (16-6) chcd45 Leukozyten 1:400 selbst GRL1 unbekannt Granulozyten, aktivierte Thrombozyten 1: Kul01 unbekannt myeloide Zellen 1:500 selbst TCR1 chtcrγδ γδ-t-lymphozyten 1:20 selbst Durchführung: Für alle Inkubationsschritte wurde eine mit Aqua dest. befeuchtete Inkubationskammer verwendet. Gewässerte Gefrierschnitte wurden mit 0,3% Wasserstoffperoxid in 40%igem Methanol für 30 Minuten behandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blocken. Nun wurden die Schnitte drei Minuten unter fließendes Wasser gehalten. Anschließend wurden die Schnitte dreimal fünf Minuten mit PBS gewaschen. Danach wurden sie für eine Stunde mit Pferdeserum 1:40 in PBS mit 1% BSA verdünnt inkubiert. Dadurch wurden unspezifische Bindungen blockiert. Nach dieser Zeit wurde die Flüssigkeit abgekippt und der gewünschte Primärantikörper aufgetragen. Die verwendeten Primärantikörper sind in Tabelle 4 aufgelistet. Sie wurden zuvor im dort beschriebenen Verhältnis mit PBS verdünnt. Als Kontrollfärbung wurde auf einen Schnitt pro Gruppe nur PBS aufgetragen. Die Schnitte wurden mit dem gewünschten Antikörper oder PBS über Nacht bei 4 C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen. Der gebundene Antikörper wurde mit Peroxidase markiert. Dafür wurde das Vectastain ABC-Kit nach Anleitung des Herstellers verwendet. Zum Nachweis der Peroxidase Aktivität wurde das Vector DAB-Kit verwendet. Anschließend folgte eine Zellkernfärbung. Dafür wurden die Schnitte kurz in Aqua dest. getaucht, anschließend für 35 Sekunden in Mayer s Hämatoxilin-Lösung gegeben und danach für fünf Minuten unter fließendes Wasser gehalten. Es folgte die Dehydratation der Schnitte über die aufsteigende Reihe der Alkohole. Die Objektträger wurden mit Eukitt Eindeckelmedium und Deckgläsern eingedeckelt.

79 Material und Methoden Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Ergebnisse aus den biologischen Testverfahren und der q-rt PCR erfolgte mit Microsoft Excel 2010 für Windows. Die statistische Auswertung der Microarray Experimente erfolgte mit den Programmen Bioconductor R Version und Significance Analysis of Microarrays Version 3.08 (SAM). Grafiken wurden mit GraphPad Prism von GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA oder mittels Microsoft Power Point 2010 angefertigt.

80 Ergebnisse ERGEBNISSE 5.1. Datenbank Analysen zur Identifizierung von Interferonregulierten Genen im Hühnergenom Im Rahmen dieser Dissertation soll die Typ I IFN-Antwort des Haushuhnes untersucht werden. Der erste Schritt um IRGs (IFN-regulierte Gene) im Haushuhn zu identifizieren, war der Abgleich von Genen des Haushuhns mit bekannten IRGs des Säugetiers (vergleiche Kapitel 4.9.5). Bekannte IRGs des Säugetiers wurden aus folgenden Quellen verwendet: Im Internet verfügbare Datenbanken wie die INTERFEROME Datenbank und die ISG-Database [250, 252], in denen aus zahlreichen Mikroarray Experimenten mit humanen und murinen Zelllinien und Geweben IRGs dieser Spezies zusammengetragen wurden. Dabei enthält die INTERFEROME Datenbank außerdem Informationen, welche Gene durch welche Typen von IFN induziert werden. Des Weiteren wurden einige IRGs in der KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; Internet Adresse: und der Reactome Datenbank (Internet Adresse: gefunden. Außerdem wurden einige im Säugetier bekannte IRGs aus Publikationen herausgesucht [253, 337]. All diese IRGs des Säugetiers wurden in einer Liste zusammengefasst und mit den annotierten Genen auf dem für die im Rahmen dieser Dissertation verwendeten Mikroarray abgestimmt. Dabei handelte es sich um den Agilent Oligonukleotid Mikroarray: Agilent 4x44K chicken-genom Katalog- Mikroarray. Mit diesem Mikroarray war es möglich Gene anzusprechen. Nachdem die auf dem Mikroarray annotierten Gene überarbeitet und verifiziert worden sind, wurde die Liste der IRGs des Säugers mit den auf dem Mikroarray annotierten Genen abgeglichen. Auf diese Weise konnten Gene identifiziert werden, die im Säugetier als IRGs bekannt und gleichzeitig im Hühnergenom zu finden sind. Der Einfachheit halber werden diese Gene im Folgenden allgemeine IRGs genannt. Eine Liste dieser Gene mit Gen Beschreibung, den zughörigen Ensemble Nummern und Accession Nummern und den Gensequenzen ist auf der beiliegenden CD in Mappe 1, Tabelle 29 zu finden Halbwertszeit von ChIFN- Um die biologische Halbwertszeit von rek ChIFN- im Huhn zu ermitteln, wurde drei Hühnern rek ChIFN- intravenös verabreicht und vor Injektion und zu den Zeitpunkten 5, 10, 15, 30

81 ChIFN- [Units/ml] Ergebnisse 66 Minuten, 1, 2, 4, 6 und 8 Stunden Blut zur Plasmagewinnung entnommen. Zuvor wurden die Tiere gewogen. Dem schwersten Tier wurde eine Dosis von 1x10 7 Units rek ChIFN- verabreicht, den anderen Tieren eine ihrem Gewicht entsprechende Dosis (siehe Tabelle 7). Der Gehalt an biologisch aktivem Typ I IFN wurde mit Hilfe des Interferon Reporterassays bestimmt. Wie Tabelle 7 und Abbildung 5 zeigen, wurde die maximale Konzentration C max 5 Minuten nach Injektion gemessen, die dann bis etwa 60 Minuten nach Injektion exponentiell sank, um anschließend in eine Gerade überzugehen. Bei etwa 15 Units/ml nach 240 Minuten war das Detektionsminimum des Assays erreicht. Cl (Clearance) gibt die Effizienz der Ausscheidung von rek ChIFN-α aus dem Organismus an, V das Verteilungsvolumen in der terminalen Phase. Die Werte sind bei allen Tieren sehr ähnlich und bedeuten letztendlich, dass rek ChIFN-α schnell aus dem Plasma diffundiert. Die Berechnung des Mittelwerts, der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten (CV) zeigten mit Werten unter 12% einen vernünftigen Schwankungsbereich. Mit Hilfe der AUC (Area under the curve) ließ sich eine durchschnittliche terminale Halbwertszeit von rek ChIFN- im Plasma der Tiere von 36 Minuten berechnen Zeit [Minuten] Tier 1 Tier 2 Tier 3 Abbildung 5 Bioverfügbarkeit nach intravenöser Injektion von rek ChIFN-α Drei Tiere wurden mit den in Tabelle 7 beschriebenen Mengen rek ChIFN-α i.v. behandelt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde den Tieren Blut zur Plasmagewinnung entnommen und der Gehalt an biologisch aktivem Typ I IFN im IFN Reporterassay bestimmt. Tabelle 7 Ermittlung der biologischen Halbwertszeit von rek ChIFN-α Dargestellt sind die aufgrund des Gewichts errechneten verabreichten Mengen an rek ChIFN-α und die Messergebnisse von jedem Tier, sowie der Mittelwert, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient (CV) der errechneten Werte. Gewicht [kg] IFN-α [U] Dosis [U/kg] C max [U/ml] T max [min] Cl [ml/(hxkg)] V [l/kg] terminale T1/2 [min] Tier ,83x10 7 1,34x Tier ,93x10 7 1,35x Tier x10 7 1,34x Mittelwert SD CV [%]

82 ChIFN- [Units/ml] Ergebnisse Vergleich der Bioverfügbarkeit nach intravenöser und intramuskulärer Injektion von ChIFN- Um Aussagen über die Bioverfügbarkeit von intravenös verabreichtem rek ChIFN- im Vergleich zu intramuskulär verabreichtem rek ChIFN- treffen zu können, erhielt ein Huhn intravenös eine Dosis von 4x10 6 Units rek ChIFN-. Drei weiteren Hühnern wurde intramuskulär die gleiche Dosis verabreicht. Nach Injektion wurde den Tieren nach 5, 15, 30 Minuten, 1, 2, 4 und 8 Stunden Blut zur Plasmagewinnung entnommen. Der Gehalt an biologisch aktivem Typ I IFN wurde mit Hilfe des Interferon Reporterassays bestimmt (siehe Abbildung 6) Tier 1:i.v. Tier 2:i.m. Tier 3:i.m. Tier 4:i.m. Abbildung 6 Vergleich der IFN Bioverfügbarkeit nach intravenöser und intramuskulärer Injektion von rek ChIFN-α Vier Tiere wurden mit 4x10 6 Units rek ChIFNα behandelt. Tier 1 erhielt das rek ChIFN-α intravenös, Tier 2, 3 und 4 intramuskulär. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde den Tieren Blut zur Plasmagewinnung entnommen und der Gehalt an biologisch aktivem Typ I IFN im IFN Reporterassay bestimmt. Zeit [Minuten] Wie zu erwarten, zeigte sich bei Tier 1 eine typische i.v. Kinetik mit einem Maximalwert nach 5 Minuten und einer raschen Abnahme der IFN-Konzentration. Bei allen drei Hühnern, die intramuskulär mit rek ChIFN-α behandelt wurden, waren bereits nach 5 Minuten über 100 Units Typ I IFN pro ml Plasma messbar. Nach 15 Minuten war bei Tier 4 ein Höchstwert von 3750 Units/ml Typ I IFN messbar, der dann über die weiteren Messzeitpunkte abfiel. Möglicherweise wurde bei diesem Tier, welches deutlich höhere Plasmawerte an Typ I IFN zeigte, versehentlich bei der Injektion rek ChIFN-α in ein Blutgefäß verabreicht. Bei den anderen beiden Tieren war der Gehalt an Typ I IFN im Plasma über den gesamten Messzeitraum sehr ähnlich. Die maximale Konzentration (C max ) war bei Tier 2 mit 632 Units/ml Typ I IFN nach 60 Minuten erreicht und bei Tier 3 mit 674 Units/ml Typ I IFN nach 2 Stunden. Insgesamt zeigte sich bei Tier 2 und Tier 3 nach Minuten eine Art Plateau, das bis 4 Stunden nach Injektion anhielt und dann wieder absank. Nach 8 Stunden war bei allen Tieren noch etwa 60 Units/ml Typ I IFN im Plasma zu messen.

83 Ergebnisse 68 Folglich stieg und sank der Gehalt an Typ I IFN im Plasma nach intramuskulärer Injektion später als nach intravenöser Applikation. Außerdem war nach intramuskulärer Injektion nur ein Bruchteil der maximalen Konzentration (C max ) der nach intravenöser Injektion nachweisbaren Menge an Typ I IFN messbar. Um die Bioverfügbarkeit von rek ChIFN-α nach intramuskulärer Injektion zu bestimmen, wurden die AUC (Area under the Curve) Werte aus den Daten von Tier 1 und den gemittelten Daten von Tier 3 und 4 bestimmt. Dadurch ließ sich bei einer Dosis von 4x10 6 Units rek ChIFN-α nach intramuskulärer Injektion im Vergleich zur intravenösen Injektion eine Bioverfügbarkeit (F) von 84% ermitteln Ausschluss von Lipopolysaccharid Kontamination Kontaminationen von Proben durch Lipopolysaccharid (LPS) stellen ein bekanntes Problem bei der Laborarbeit dar. Da LPS als Bestandteil der Zellwand von gram negativen Bakterien PRRs binden und aktvieren kann, vermag es seinerseits eine Interferon-Antwort auszulösen und die Ergebnisse der durchgeführten Experimente nachhaltig zu beeinflussen Limulus Amebocyte Lysate Biotest Um auszuschließen, dass die durch Interferon Injektion vermittelte Geninduktion auf einer Kontamination mit LPS beruhte, wurde das aus E.Coli hergestellte rek ChIFN-α und der lentogene NDV Impfstoff La Sota mit dem Limulus Amöbozyten Lysat Biotest auf Kontamination mit LPS geprüft. Die Endotoxin Toleranzgrenze beträgt laut der Methodenvalidierung der U.S. Pharmacopeia für parenteral verabreichte Medikamente beim Menschen 20 EU/Dosis (U.S.Pharmacopeil Convention, Kapitel 161 und 85, 2005). Die Messung ergab, dass in einer Dosis rek ChIFN-α 19,33 EU enthalten waren und in einer Dosis NDV Impfstoff 4,98 EU. Damit enthielten die applizierten Substanzen weniger LPS, als von USPC für parenteral verabreichte Substanzen vorgegeben Analyse der LPS-Auswirkungen auf die Gen- und Proteinexpression Um zu prüfen, ob die in den applizierten Substanzen enthaltenen geringen Mengen LPS einen Einfluss auf die Genexpression hatten, wurde Hühnern vergleichbare Mengen LPS intravenös injiziert und Il-6 Protein im Plasma und auf Genexpressionsebene bestimmt. Il-6 wurde gewählt, da es zu den klassischen proinflammatorischen Zytokinen zählt, die rasch und in großer Menge nach LPS Behandlung gebildet werden [338]. Des Weiteren wurde das Gen K203 (Chicken Chemokine (C-C motif) Ligand inflammatory 3) auf Genexpressionsebene gemessen, da in einer weiteren Dissertation in der AG Kaspers die LPS induzierte

84 fold change fold change Ergebnisse 69 Genexpression von K203 in Hühnermakrophagen festgestellt wurde (persönliches Gespräch mit Melanie Reger). Im Rahmen dieses Experiments wurden zwei von drei Hühnergruppen mit jeweils fünf Tieren verschiedene Mengen an LPS intravenös injiziert: Gruppe 1 erhielt 10µg/kg LPS, Gruppe 2 erhielt 6ng/kg LPS und Gruppe 3 erhielt sterile isotone NaCl Lösung. Die gewählten Konzentrationen ergaben sich aus Beobachtungen, dass nach intravenöser Injektion von 10µg/kg eine deutliche Fieberinduktion feststellbar ist (persönliches Gespräch mit Bernd Kaspers) und dass laut Food and Drug Administration (FDA) je nach Art des Endotoxins 1EU zwischen 0,1 und 0,2 ng Endotoxin enthält. Daher erhielt in den durchgeführten Experimenten mit rek ChIFN-α und lentogenem NDV Impfstoff La Sota, ein Huhn mit einem Gewicht von 500g zwischen 1 und 3 ng LPS (zwischen 2 und 6 ng/kg). Um ein mit dem IFN-Versuch vergleichbares Ergebnis zu erhalten, wurden die Tiere nach drei Stunden getötet und die Organe Milz und Lunge zur Genexpressionsanalyse entnommen (siehe Abbildung 7). Außerdem wurde vor LPS Injektion und zum Zeitpunkt der Organentnahme Blut zur Plasmagewinnung entnommen, und der Il-6 Proteinspiegel im Plasma bestimmt (siehe Abbildung 8) A B Milz Lunge ng/kg 10µg/kg 0-3 6ng/kg 10µg/kg Abbildung 7 Il-6 und K203 Gen Expression in Milz und Lunge nach LPS Injektion Expression von Il-6 (A) und K203 (B) nach Injektion von LPS im Vergleich zur Kontrolle gemessen in der qrt- PCR. (n=5) Im Vergleich zur Kontrolle waren in der Tiergruppe die 6ng/kg LPS erhalten hatte nur äußerst geringe Expressionsunterschiede im Bereich von -1,5-1,2 (FC) zu finden. Bei der Tiergruppe, die 10µg/kg LPS erhalten hatte war Il-6 im Vergleich zur Kontrolle in der Milz 327fach und in der Lunge 6fach hochreguliert. K203 war im Vergleich zur Kontrolle in der Milz 128fach und in der Lunge 3fach hoch reguliert.

85 Il-6 [ng/ml] Ergebnisse Abbildung 8 Il-6 Protein im Plasma nach LPS Injektion Dargestellt sind die im 7TD1 Biotest gemessenen Plasmawerte an Il-6 Protein und deren Standardabweichung in den verschiedenen Behandlungsgruppen. (n=5) 50 0 Kontrolle LPS 6ng/kg LPS 10µg/kg Die Messung von Il-6 Protein im Plasma ergab, dass drei Stunden nach Injektion von 10µg/kg LPS im Mittel 115 ng/ml Il-6 Protein im Plasma und nach Applikation von 6ng/kg LPS ein Mittelwert von 12 ng/ml Il-6 Protein im Plasma zu messen war und damit ungefähr die gleiche Menge wie im Plasma der Kontrollgruppe (11ng/ml). Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Injektion von LPS Mengen die zu einer Fieberinduktion führen, zu einem massiven Anstieg der Genexpression von Il-6 und K203 in Milz und Lunge führten und hohe Mengen an Il-6 Protein im Plasma nachweisbar waren. Injizierte man Mengen an LPS die mit den im Rahmen dieser Dissertation applizierten Substanzen rek ChIFN-α und NDV Impfstoff enthaltenen LPS Mengen vergleichbar waren, hatte dies keinen Einfluss auf die Genexpression von Il-6 und K203 in Milz und Lunge und den Il-6 Protein Gehalt im Plasma. Da Il-6 und K203 sehr sensitiv auf LPS reagieren, sollte dieses Ergebnis repräsentativ für die gesamte Gen Expression in Milz und Lunge sein Identifizierung IFN-regulierter Gene im Huhn mittels Mikroarray Behandlung mit ChIFN- Die frühe IFN-Antwort des Huhnes sollte auf Transkriptomebene untersucht werden. Hierfür wurde Hühnern rek ChIFN-α i.v. appliziert. Um eine über die Zeit anhaltende konstante IFN Konzentration zu erreichen, wurde aus den Daten über die Halbwertszeit und Bioverfügbarkeit von ChIFN-α das in Abbildung 9 gezeigte Behandlungsschema abgeleitet. Insgesamt 24 Hühner der Hühnerlinie LSL wurden in vier Gruppen mit jeweils sechs Tieren eingeteilt. Diese vier Tiergruppen setzten sich aus der Kontrollgruppe (K) und drei Tiergruppen zusammen, die rek ChIFN- über die verschiedenen Zeiträume drei (IFN(3h)), sechs (IFN(6h)) und neun Stunden (IFN(9h)) i.v. erhielten. Eine Dosis rek ChIFN- enthielt 1x10 7 Units biologisch

86 Ergebnisse 71 aktives Typ I IFN. Um einen konstanten IFN Level zu erhalten, wurde bei den Tieren aus den Gruppen IFN(6h) und IFN(9h) alle drei Stunden eine weitere Dosis rek ChIFN- appliziert. Nach diesen Zeiträumen wurden die Tiere getötet und die Organe Milz und Lunge für die Analysen entnommen. Bei der Entnahme des Lungengewebes wurden wie in Abbildung 4 beschrieben, nur die dorsal und ventral des Primärbronchus gelegenen Anteile entnommen, um eine Beeinflussung der Ergebnisse durch konstitutiv exprimiertes BALT zu verhindern. Außerdem wurde vor Injektion und vor Tötung Blut zur Plasmagewinnung entnommen. Die Kontrollgruppe wurde nach sechs Stunden getötet. Abbildung 9 Behandlungsschema mit rek ChIFN- Das gewählte Behandlungsschema sollte die Möglichkeit bieten, den Genexpressionsverlauf in einer IFN-Antwort über den Zeitraum von neun Stunden zu beobachten und Gene zu identifizieren, die rasch nach IFN-Injektion exprimiert werden oder aber erst später. Vor und nach Behandlung mit rek ChIFN-α wurde der Gehalt an Typ I IFN im Plasma mit dem IFN Reporterassay bestimmt (siehe Abbildung 10).

87 ChIFN- [Units/ml] ChIFN- [Units/ml] Ergebnisse 72 A B K IFN (3h) IFN (6h) IFN (9h) 0 K IFN (3h) IFN (6h) IFN (9h) Tiergruppen Tiergruppen Abbildung 10 Typ I IFN Plasmaspiegel vor und nach IFN Injektion Vier Tiergruppen (n = 6) wurde vor (A) und nach (B) der in Abbildung 9 dargestellten Behandlung mit rek ChIFN-α Blut zur Plasmagewinnung entnommen und der Gehalt an Typ I IFN im IFN Reporterassay gemessen. Dargestellt sind die Werte der Einzeltiere, sowie die Mittelwerte der jeweiligen Gruppe. Bei keinem der Tiere wurden vor der IFN Applikation relevante Mengen Typ I IFN im Plasma gemessen (siehe Abbildung 10 A). In den Plasmaproben, die nach Behandlung mit rek ChIFNα gewonnen wurden, war Typ I IFN nachweisbar. Im Plasma der Tiergruppe IFN(3h) war nach drei Stunden ein Mittelwert von ca. 150 Units/ml Typ I IFN im Plasma messbar (siehe Abbildung 10 B). Nach weiteren Dosen rek ChIFN-α war eine geringe Steigerung der Plasmakonzentrationen von Typ I IFN feststellbar. So konnte im Plasma der Tiergruppe IFN(6h) ein Mittelwert von ca. 175 Units/ml ChIFN-α und im Plasma der Tiergruppe IFN(9h) ein Mittelwert von annährend 200 Units/ml Typ I IFN gemessen werden, während im Plasma der Kontrollgruppe (K) weiterhin kein Typ I IFN messbar war. Folglich gelang es tatsächlich, durch das gewählte Behandlungsschema über den Zeitraum von neun Stunden einen relativ konstanten Plasma Spiegel an Typ I IFN zu erzielen Mikroarray Experiment Die unter beschriebenen Tiergruppen wurden nach drei, sechs und neun Stunden getötet und Milz und Lunge zur RNA-Isolation entnommen. Die Milz wurde dabei als wichtiges lymphatisches Organ ausgewählt, die Lunge als Organ, welches bei der angeborenen Immunantwort des Huhns eine bedeutende Rolle spielt und als Eintrittspforte für eine Vielzahl von für den Respirationstrakt relevanten Erregern in den Organismus dient. Aus den sechs Proben pro Gruppe wurden für das Mikroarray Experiment von Milz und Lunge anhand der RIN und der RNA-Reinheit jeweils vier Replikate pro Tiergruppe ausgewählt. Dabei lag die RIN bei mindestens 8,5 und die Parameter der RNA-Reinheit für den 260/280 Wert über 2,0

88 Ergebnisse 73 und für den 260/230 Wert über 1,9. Die Hybridisierung der RNA-Proben erfolgte auf dem customized chicken Agilent 4x44k Array Heat Map Gruppenanalyse nach IFN Behandlung Die Mikroarraydaten wurden mit dem Programm R (Version The R Foundation for Statistical Comuting) normalisiert und mit dem Bioconductor Paket Genplotter in einer Heat Map graphisch dargestellt. In dieser Heat Map wurden die Signalintensitäten der im Mikroarray analysierten Proben als zweidimensionale Matrix dargestellt. Dies ermöglicht eine Beurteilung der Homologie der Genexpression der verschiedenen Proben innerhalb einer Gruppe und der Gruppen zueinander. Dabei wird diese Homologie durch Farbstufen widergespiegelt, die von Rot über Zwischenstufen bis Blau reichen. Rot bedeutet, dass die Genexpression zweier Proben sehr ähnlich ist, blau hingegen weist auf eine geringe Homologie der Genexpression hin. Neben der Farbeinteilung verdeutlicht R die Homologien der analysierten Proben mit Hilfe eines Dendrogramms, das über einen distance plot erstellt wurde. Dabei kennt das Programm R die Gruppeneinteilung des Experiments nicht und ordnet die analysierten Datensätze ausschließlich nach ihrer Ähnlichkeit in der Genexpression. Das bedeutet, dass die Gruppierung der Heat Map alleine auf der Homologie der Signalintensitäten beruht. In Abbildung 11 ist eine Heat Map aller analysierten Proben von Milz und Lunge zu sehen. Abbildung 11 Vergleich der Mikroarrays von Milz und Lunge nach IFN Injektion Mittels R wurden die Signalintensitäten von Milz und Lunge verglichen und eine Heat Map erstellt. Wie der Farbverlauf der Heat Map zeigt, sind alle analysierten Proben von Milz und Lunge innerhalb eines Organs sehr homogen. Vergleicht man allerdings die Signalintensitäten beider Organe miteinander, sieht man, dass sich Milz und Lunge in ihrem Genexpressionsmuster deutlich voneinander unterschieden.

89 Ergebnisse 74 Um Genexpressionsmuster innerhalb der Organe genauer zu betrachten, wurden Milz und Lunge unabhängig voneinander mit dem Programm R analysiert (siehe Abbildung 12). A Milz B Lunge Abbildung 12 Gesamtanalyse der Mikroarrays von Milz und Lunge nach IFN Injektion Mittels R wurden die Signalintensitäten der einzelnen Mikroarrays von Milz (A) und Lunge (B) verglichen und eine Heat Map erstellt. Die Proben sind nach Gruppenzugehörigkeit benannt gefolgt von der jeweiligen Tiernummer (T1-6). Auffällig eingeordnete Datensätze wurden mit einem Pfeil markiert. Dabei zeigte sich, dass fast alle Proben in die richtigen Gruppen eingeteilt werden. Da R die Proben alleine hinsichtlich ihrer Signalintensität einteilt, ist die korrekte Einteilung der Proben entscheidend bei dieser Analyse. In der Milz und in der Lunge sind die Genexpressionsmuster der einzelnen Proben innerhalb der verschiedenen Tiergruppen nach Behandlung mit rek ChIFN-α sehr homogen. In der Milz weisen die Tiergruppen IFN(3h) und Kontrolle(K) innerhalb ihrer Gruppen sehr ähnliche Genexpressionsmuster auf, sind aber gegeneinander deutlich voneinander abgrenzbar wie das Dendrogramm belegt. Bei den Tiergruppen IFN(6h) und IFN(9h) weisen jeweils drei der vier Proben innerhalb einer Tiergruppe sehr ähnliche Genexpressionsmuster auf. Doch zeigt jeweils eine Probe dieser beiden Tiergruppen ein divergierendes Genexpressionsmuster: IFN(6h)T2 und IFN(9h)T3 (siehe Abbildung 12 A, Pfeilmarkierung). Das Dendrogramm zeigt, dass diese beiden Proben einander sehr ähnlich sind, sich aber von den anderen Mitgliedern ihrer jeweiligen Tiergruppe unterscheiden. Dennoch besteht eine größere Ähnlichkeit zu den anderen Mitgliedern der Gruppen IFN(6h) und IFN(9h). Interessanterweise scheint das Genexpressionsmuster der Kontrolle(K) dem der Tiergruppen IFN(6h) und IFN(9h) ähnlicher zu sein, als das der Tiergruppe IFN(3h). Die Genexpression nach drei Stunden weist im Vergleich zu allen anderen Gruppen auch zur

90 Ergebnisse 75 unbehandelten Kontrollgruppe die größten Unterschiede auf. Wie in der Milz zeigen auch in der Lunge die Kontrolle(K) und IFN(3h) innerhalb ihrer Tiergruppen ein sehr homogenes Genexpressionsmuster, sind aber gegeneinander deutlich abgrenzbar. Ebenso wie in der Milz gibt es innerhalb der Tiergruppen IFN(6h) und IFN(9h) zwei Ausreißer: IFN(6h)T1 und IFN(9h)T4 (siehe Abbildung 12 B, Pfeilmarkierung). Dabei scheint IFN(6h)T1 ein ähnliches Genexpressionsmuster aufzuzeigen wie die restlichen Mitglieder der Tiergruppe IFN(9h). Das Genexpressionsmuster von IFN(9h)T4 scheint den Genexpressionsmustern der weiteren Proben nach drei Stunden und sechs Stunden noch ähnlicher zu sein, als den anderen neun Stunden Proben. Jedoch zeigt das Dendrogramm, dass IFN(9h)T4 geringere Ähnlichkeit zu den weiteren Mitgliedern der Tiergruppen IFN(6h) und IFN(9h) hat, als diese untereinander haben. Im Gegensatz zur Milz ist die Kontrollgruppe in der Lunge von allen Behandlungsgruppen deutlich abgegrenzt. Insgesamt konnte mit dieser Analyse festgestellt werden, dass die Genexpressionsmuster der Gruppen IFN(3h) und (K) jeweils in der Milz und in der Lunge innerhalb ihrer Gruppen sehr homogen sind, sich aber deutlich voneinander abgrenzen lassen, während die Genexpression der Gruppen IFN(6h) und IFN(9h) in beiden Organen gewisse Überschneidungen aufweist. Diese Ergebnisse ermöglichen weiterführende Analysen der Daten, wobei für die folgenden Untersuchungen die große Ähnlichkeit der Genexpressionsmuster der Tiergruppen IFN(6h) und IFN(9h) zueinander berücksichtigt werden muss Identifizierung signifikant regulierter Gene nach IFN-Behandlung Da in einem Mikroarray Experiment sehr viele Daten auf einmal analysiert werden, ist eine strenge statistische Auswertung dieser Daten zur Identifizierung signifikant regulierter Gene unerlässlich. Diese statistische Auswertung wurde mit dem Programm SAM (significance analysis of microarrays) durchgeführt. Als Maß für die Signifikanz dienten einerseits die FDR (False Discovery Rate) und andererseits der FC (fold change). Die FDR beurteilt die Wahrscheinlichkeit, ob ein Spot fälschlicherweise als signifikant reguliert beurteilt wurde (falsch positiv). Der FC gibt die Höhe der Expressionsänderung eines Spots zwischen zwei Tiergruppen an. Analysiert wurden alle Datensätze von Milz und Lunge mit Hilfe der SAM Multiclass Analyse. Der FC wurde jeweils aus den Expressionsunterschieden der drei mit rek ChIFN-α behandelten Tiergruppen zur Kontrollgruppe errechnet. Dabei wurden Spots mit einer FDR von kleiner als 5% und einer mindestens 2fachen Hoch- oder Herunter-Regulation als signifikant reguliert beurteilt. Da manche Gene wiederholt in mehreren Spots auf den Mikroarray geladen wurden, wurden aus der Anzahl der signifikant regulierten Spots die der

91 Ergebnisse 76 signifikant regulierten Gene ermittelt. Tabelle 8 zeigt die Anzahl der signifikant regulierten Gene nach Behandlung mit rek ChIFN-α in den Gruppen IFN(3h), IFN(6h) und IFN(9h) bezogen auf die Kontrollgruppe. Tabelle 8 Signifikant regulierte Gene in Milz und Lunge nach IFN Injektion Gelistet ist die Anzahl der signifikant regulierten Gene der unterschiedlichen Tiergruppen nach Behandlung mit rek ChIFN-α im Vergleich zur Kontrollgruppe in Milz und Lunge. Dabei sind die Gesamtzahl der signifikant regulierten Gene und die jeweilige Anzahl an hoch (schwarz) - und herunter (rot) regulierten Genen gezeigt. (FDR<5%; FC mindestens +/-2) Milz Lunge IFN(3h) IFN(6h) 852 IFN(9h) 665 IFN(3h) 947 IFN(6h) 435 IFN(9h) 611 Gene Eine Liste aller signifikant regulierten Gene ist auf der beiliegenden CD in Mappe 1, Tabelle 30 zu finden. Die Zahlen zeigen, dass drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α sowohl in der Milz als auch in der Lunge die Genexpression zwischen IFN behandelten Tieren und Kontrolltieren die größten Unterschiede aufweist, während nach sechs und neun Stunden in beiden Organen eine geringere Anzahl an Genen signifikant reguliert ist. Interessanterweise sind in der Milz ungefähr gleich viele herunter regulierte Gene zu finden wie hoch regulierte, während in der Lunge deutlich mehr hoch regulierte Gene identifiziert werden konnten. Wie auch die Heat Map zeigen diese Ergebnisse, dass sich in Milz und Lunge das Genexpressionsmuster der Gruppe IFN(3h) deutlich von den anderen Gruppen unterscheidet Vergleich von IRGs beim Huhn und Säugetier Da im Rahmen dieser Dissertation IRGs im Huhn identifiziert werden sollten, wurden die Ergebnisse aus dem Mikroarray Experiment drei Stunden nach Behandlung mit rek ChIFN-α

92 Ergebnisse 77 von Milz und Lunge mit der Liste der aus den Datenbank Analysen erhaltenen allgemeinen IRGs abgeglichen (siehe Abbildung 13). Dabei wurde zum Abgleich der Zeitpunkt drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN- gewählt um sicherzustellen, dass ausschließlich IRGs analysiert werden. Dies geschah aufgrund der Überlegung, dass sechs und neun Stunden nach IFN Injektion Gene durch andere Umstände als allein durch das injizierte rek ChIFN-α exprimiert werden könnten, wie zum Beispiel aufgrund zuvor induzierter IRGs. Außerdem zeigte bereits die Heat Map Darstellung, dass die Tiergruppen IFN(3h) und die Kontrollgruppe(K) am deutlichsten von den anderen Gruppen abgrenzbar sind, während Mitglieder der Tiergruppen IFN(6h) und IFN(9h) untereinander ein sehr ähnliches Expressionsprofil aufweisen. Abbildung 13 Abgleich durch IFN Injektion im Huhn regulierter Gene mit IRGs des Säugetiers In diesem Venn-Diagramm ist die Verteilung der signifikant regulierten Gene drei Stunden nach Behandlung mit rek ChIFN-α in Milz (rot) und Lunge (blau) dargestellt. Der dritte grüne Kreis entspricht den im Säugetier vorkommenden IRGs, die auch im Hühnergenom zu finden sind, hier allgemeine IRGs genannt. Die Zahlen geben die Anzahl von Genen innerhalb der Schnittmengen an.

93 Ergebnisse 78 Tabelle 9 Anzahl signifikant regulierter IRGs nach IFN Injektion Gelistet ist die Anzahl der signifikant regulierten Gene der verschiedenen Gruppen, die in Abbildung 13 dargestellt sind. Die Gruppen teilen sich in die Gesamtzahl der signifikant regulierten Gene und die jeweilige Anzahl an hoch (schwarz) und herunter (rot) regulierten Genen (FDR<5; FC mindestens +/-2) Milz und Lunge 146 Milz 166 Lunge 69 Allgemeine IRGs Neu identifizierte IRGs Milz +/ Lunge- 1 Milz +/ Lunge- 9 Milz -/ Lunge+ 1 Milz -/ Lunge Es zeigte sich, dass die signifikant regulierten Gene in Milz und Lunge drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α mit den allgemeinen IRGs mehrere verschiedene Schnittmengen bilden. Jedoch fallen Gene in der Milz und 363 Gene in der Lunge, sowie 369 Gene die sowohl in Milz als auch in der Lunge signifikant reguliert sind, nicht in die Gruppe der allgemeinen IRGs. Außerdem können durch dieses Experiment von der Liste der allgemeinen IRGs lediglich 381 Gene bestätigt werden. Dabei wurden von diesen 381 Genen 166 Gene in der Milz, 69 in der Lunge und 146 in beiden Organen gefunden. In Anlehnung an die Definition eines IRGs als ein durch IFN reguliertes Gen, werden Gene die drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α signifikant reguliert sind und nicht in die Gruppe der allgemeinen IRGs fallen, im Folgenden als neu identifizierte IRGs bezeichnet. Betrachtet man die Datensätze der Gruppen IFN(6h) und IFN(9h) sieht man, dass einige Gene die in der Gruppe IFN(3h) ausschließlich in Lunge oder Milz reguliert sind, in den Gruppen IFN(6h) und IFN(9h) auch im jeweilig anderen Organ oder in beiden Organen reguliert sind (siehe beiliegende CD Mappe 1, Tabelle 31) Dabei überwiegt in fast allen Gruppen der Anteil hoch regulierter Gene (siehe Tabelle 9). Lediglich in der Milz sind etwa doppelt so viele herunter regulierte neu identifizierten IRGs wie hoch regulierte zu finden, eine Tatsache die schon bei der ersten Gesamtanalyse der signifikant regulierten Gene aufgefallen ist. In der Gruppe der allgemeinen IRGs die sowohl in der Lunge als auch in der Milz signifikant reguliert sind, ist ein Gen, EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), welches in der Milz 2fach hoch und in der Lunge 2fach herunter reguliert ist und ein Gen HNMT (Histamin N-Methyltransferase), welches in der Milz herunter und in der Lunge hoch reguliert ist. Alle anderen Gene dieser Gruppe sind entweder in Lunge und Milz hoch reguliert oder in beiden Organen herunter reguliert. Ähnliches triff für die Gruppe neu identifizierte IRGs zu. Neben zahlreichen Genen die in beiden Organen entweder hoch oder herunter reguliert sind, gibt es neun Gene (SNAI2

94 Ergebnisse 79 (Snail Homolog 2), DUSP14 (Dual Specificity Phosphatase 14), CRISPLD1 (Cysteine-Rich Secretory Protein LCCL Domain Containing 1), TMEM215 (Transmembrane Protein 215), DKK1 (Dickkopf Homolog 1), ARHGAP22 (Rho GTPase Activating Protein 22), VASH2 (Vasohibin 2), GJC1 (Gap Junction Protein, Gamma 1) und RGS4 (Regulator of G-Protein Signaling 4)), die in der Milz hoch reguliert sind und in der Lunge herunter reguliert sind und zwei Gene (ST3GAL5 (ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialyltransferase 5), C1QB (Complement Component 1, Q Subcomponent, B Chain)), die in der Milz herunter reguliert sind und in der Lunge hoch reguliert sind. Zu den Genen, die drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α reguliert sind und zu den allgemeinen IRGs zählen, gehören Gene die durch alle drei Typen von IFN induziert werden, wie ein Abgleich mit der INTERFEROME Datenbank zeigt. Allerdings überwiegt der Anteil an Typ I IFN induzierten Genen (siehe beiliegende CD Mappe 1, Tabelle 31). Typ I IFN selbst ist nicht reguliert (siehe beiliegende CD, Mappe 1, Tabelle 30). Allerdings ist einer der Rezeptoren des Typ I IFN Rezeptorkomplexes, IFNAR1, sowohl in der Milz als auch in der Lunge nach drei Stunden 2fach hoch reguliert, jedoch nicht mehr nach sechs und neun Stunden. IFN- ist in beiden Organen signifikant hoch reguliert. So findet sich in der Milz nach drei Stunden eine 10fache und nach sechs und neun Stunden noch eine 2fach Hoch- Regulierung. In der Lunge zeigt IFN- über die Behandlungszeiträume steigende Expressionswerte: IFN- ist hier 2fach nach drei Stunden, 3fach nach sechs Stunden und 9fach nach neun Stunden hoch reguliert. Einer der Rezeptoren des IFN- Rezeptorkomplexes, IFNGR1, ist in der Milz in drei Stunden nach IFN Injektion 2fach hoch reguliert. In den anderen Gruppen ist IFNGR1 nicht signifikant reguliert, ebenso wenig wie in allen Gruppen der Lunge. Typ III IFN ist nicht reguliert. Jedoch wird die Expression der Anteile aus denen sich der passende Rezeptorkomplex für Typ III IFN (Il-28R1 und IL-10R2) bildet, gegenläufig reguliert. Die für IFN- spezifische Kette Il-28R1 ist in der Milz nach drei Stunden 2fach herunter reguliert, während Il-10R2 sowohl in der Milz als auch in der Lunge nach drei Stunden 2fach hoch reguliert ist. Es wurden 386 Gene gefunden, die ausschließlich nach sechs und/oder neun Stunden reguliert wurden. Unter ihnen finden sich 46 allgemeine IRGs. Diese Gene sind auf beiliegender CD, Mappe 1, Tabelle 32 zu finden. Um die Gruppen der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs in Milz und Lunge näher zu charakterisieren, wurden zunächst die 15 am stärksten hoch und herunter regulierten Gene jeder Gruppe herausgesucht (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18). Dabei fiel auf, dass

95 Ergebnisse 80 innerhalb der 15 meist hoch regulierten allgemeinen IRGs in Milz und Lunge (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18 A) fast alle Gene nicht nur nach drei Stunden, sondern auch nach sechs und neun Stunden in Lunge und Milz hoch reguliert waren. Nur FKBP5 (FK 506 Binding Protein 5) war in beiden Organen ausschließlich nach drei Stunden hoch reguliert, SOCS3 (Suppressor of Cytokine Signaling 3) war zwar in der Lunge zu allen Zeitpunkten hoch reguliert, in der Milz jedoch nur nach drei Stunden. In der Lunge waren außerdem PTX3 (Pentraxin related Gene, rapidly induced by Il-1b) und DIO2 (Deodinase type II) nur nach drei Stunden hoch reguliert, in der Milz jedoch zu allen Zeitpunkten. Bei den herunter regulierten allgemeinen IRGs hingegen waren lediglich 5 der 15 Gene in der Milz zu allen Zeitpunkten reguliert (EVPL (Envoplakin), PCP4 (Purkinje Cell Protein 4), AHNAK2 (AHNAK Nucleoprotein 2), HNMT (Histamine N-Methyltransferase) und HSD11B1 (Hydroxysteroid Dehydrogenase 1)), ein weiteres Gen (HOXB7 (Homeobox B7)) nach drei und sechs Stunden und ein weiteres Gen (PROCR (Protein C Receptor, endothelial) nach drei und neun Stunden. In der Lunge waren sogar nur zwei der allgemeinen IRGs die in Milz und Lunge herunter reguliert waren auch nach neun Stunden herunter reguliert: MCM3 (Minichromosome Maintainance Complex Component3) und AHNAK2. Innerhalb der meist hoch regulierten allgemeinen IRGs die drei Stunden nach IFN Injektion ausschließlich in der Milz reguliert waren (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18 B) waren nur zwei Gene zu finden, die auch nach sechs Stunden in der Milz hoch reguliert waren: CD40 (TNF Superfamiliy Member 5) und KIF9 (Kinesin Family Member 9) und nur ein Gen, Il-22 (Interleukin-22), welches nach drei und nach neun Stunden reguliert war. Dafür waren sechs Gene zu späteren Zeitpunkten auch in der Lunge reguliert, wie Il-22, VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), NR1D2 (Nuclear Receptor Subfamily 1, Group D, Member 2), GOS2 (G0/G1 Switch 1), NOS2 (Nitric Oxide Synthase 2, inducible auch inos) und KIF9. Hingegen waren innerhalb der 15 meist herunter regulierten allgemeinen IRGs in der Milz acht Gene, die auch zu späteren Zeitpunkten in der Milz reguliert wurden: CYB1B1 (Cytochrom P 450, Family 1, Subfamily B, Polypeptide 1), ME1 (Malic Enzyme 1, NADP+ Dependent, Cytosolic), TSHB (Thyreoid Stimulating Hormone Beta), NFIL3 (Nuclear Factor, Interleukin-3 regulated) und SCRN1 (Secernin 1) waren auch nach sechs Stunden in der Milz reguliert, LCAT (Lecithin- Cholesterol Acyltransferase), FKBP1B (FK506 Binding Protein 1B) und SFTPA1 (Surfactant, Pulmonary Associated Protein A1) waren auch nach sechs und neun Stunden reguliert. Dabei waren LCAT und NFIL3 auch zu späteren Zeitpunkten in der Lunge reguliert - wobei LCAT in der Lunge hoch reguliert war. Außerdem fällt bei den herunter regulierten allgemeinen IRGs in der Milz auf, dass zu ihnen stärker herunter regulierte Gene zählen als zu den allgemeinen

96 Ergebnisse 81 IRGs die in Milz und Lunge reguliert waren, wie MEOX1 (Mesenchym Homobox 1), das nach drei Stunden 22fach herunter reguliert war und SFTPA1, das nach drei Stunden 66fach herunter reguliert war, wobei die Regulation von SFTPA1 über die Behandlungszeiträume weiter, bis auf eine 436fache Herunter-Regulation nach neun Stunden, sank. Ein ähnliches Regulationsmuster zeigt sich auch bei den allgemeinen IRGs die drei Stunden nach IFN Injektion ausschließlich in der Lunge reguliert waren (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18 C). Innerhalb der hoch und herunter regulierten Gene waren fünf Gene auch zu späteren Zeitpunkten in der Lunge hoch reguliert: LEPR (Leptin Receptor), FGG (Fibrinogen gamma Chain), MT3 (Metallothionein 3), ASPA (Asparoacylase) und CFI (Complement Factor 1) die auch nach sechs und neun Stunden hoch reguliert wurden und FABP1 (Fatty Acid Binding Protein 1, Liver) welches nach drei und neun Stunden hoch reguliert wurde. Dabei wurden zwei Gene auch in der Milz nach neun Stunden hoch reguliert: ASPA und LAPTM4B (Lysosomal Associated Protein Transmembrane 4 Beta). Die Gene SNAP25 (Synaptosomal Associatd Protein), WNT7A (Wingless Type MMTV Integration Site Family, Member 7A), EPB41 (Erythrocyte Membrane Protein Band 4.1) waren in der Lunge auch nach sechs und neun Stunden herunter reguliert, wobei WNT7A auch in der Milz nach sechs und neun Stunden herunter reguliert war. TLR5 war nach drei und sechs Stunden in der Lunge herunter reguliert und SH3PXD2A (SH3 and PX Domains 2A) war nach drei und neun Stunden in der Lunge herunter reguliert. Auch in der Lunge fiel auf, dass mit TLR5 und SNAP25 die am stärksten herunter regulierten allgemeinen IRGs ausschließlich in der Lunge zu finden waren. Interessanterweise zeigte sich ein sehr ähnliches Bild bei den meist regulierten der neu identifizierten IRGs, die drei Stunden nach IFN Injektion in Milz und Lunge hoch reguliert waren (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18 D). Hier waren mit einer Ausnahme in Milz und Lunge (TULP1 (Tubby Like Protein 1)) und einem weiteren Gen in der Milz (MSC (Musculin)) alle zu allen Zeitpunkten reguliert, während innerhalb der herunter regulierten Genen nur neun Gene in der Milz auch zu späteren Zeitpunkten reguliert wurden, was auch auf sechs dieser Gene in der Lunge zutraf. Dabei stach das Gen LOC (Similar to Cytochrome P450 2D20) dadurch heraus, dass es drei Stunden nach IFN Injektion in Milz und Lunge herunter reguliert war, nach sechs Stunden aber in beiden Organen hoch reguliert war. Im Gegensatz zu den allgemeinen IRGs, die drei Stunden nach IFN Injektion ausschließlich in der Milz reguliert waren, sind auch innerhalb der hoch regulierten, aber auch der herunter regulierten neu identifizierten IRGs die ausschließlich in der Milz reguliert waren (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18 E) die meisten Gene auch nach sechs und/oder neun Stunden reguliert. Ausnahme bildeten innerhalb der hoch regulierten Gene CSF3 (Granulozyte

97 Ergebnisse 82 Stiumlating Growth Factor 3), RHD10 (Retinol Dehydrogenase 10), CACNA1C (Calcium Channel, Voltage Dependent, L Type, Alpha 1C Subunit), GBX2 (Gastrulaiton Brain Homeobox 2) und PKP2 (Plakopholin). Innerhalb der herunter regulierten Gene waren TMEM121 (Transmembrane Protein 121) und KCNA1 (Potassium Voltage-Gated Channel, Shaker-Related Subfamily, Member 1) nur nach drei Stunden reguliert. Die in der Milz hoch regulierten Gene CSF3, LIP1 (Lipase Member 1) und RHD10 waren zu späteren Zeitpunkten auch in der Lunge hoch reguliert. Das in der Milz herunter regulierte Gen MMP-13 (Matrix Metalloproteinase 13), wurde in der Lunge nach neun Stunden 2fach hoch reguliert. Auch bei den meist herunter regulierten neu identifizierten IRGs in der Milz fiel auf, dass über die Hälfte der Gene stärker herunter reguliert wurden, als innerhalb der meist herunter regulierten neu identifizierten IRGs in Milz und Lunge. Innerhalb der 15 meist hoch und herunter regulierten neu identifizierten IRGs die ausschließlich in der Lunge reguliert wurden (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 18 F) waren alle hoch regulierten Gene auch zu späteren Zeitpunkten reguliert, außer die drei Gene UCP3 (Uncoupling Protein 3), B3GALT2 (UDP-Gal:betaGlcNAc b 1,3-Galactosyltransferase, Polypeptide 2) und LOC (Similar to Potassium Channel, Subfamily K, Member 16). Dabei waren zwei dieser Gene nach sechs Stunden auch in der Milz reguliert: B3GALT2 war dabei in der Milz 2fach herunter reguliert und LOC fach hoch reguliert. Das Gen DMBT1 (Deleted in Malignant Brain Tumors 1) war neben der über alle Zeitpunkte 5fachen Hoch-Regulation in der Lunge, in der Milz nach neun Stunden 2fach hoch reguliert. Bei den herunter regulierten Genen waren hingegen nur drei Gene auch zu späteren Zeitpunkten reguliert. Dabei war NES (Nestin) und LOC auch nach sechs Stunden herunter reguliert und LIMCH1 (LIM and Calponin Domain 1) auch nach sechs und neun Stunden herunter reguliert. TCF15 (Trancription Factor 15) war auch in der Milz sechs Stunden nach IFN Injektion reguliert. Mit dem 15fach herunter regulierten Gen LOC war eines der am stärksten herunter regulierten Gene in der Lunge in dieser Gruppe zu finden. Insgesamt war feststellbar, dass der überwiegende Anteil der hoch regulierten IRGs die in Milz und Lunge reguliert waren, auch nach sechs und/oder neun Stunden reguliert waren, der Anteil bei den herunter regulierten Genen in Milz und Lunge war geringer, unabhängig davon ob sie zu den allgemeinen IRGs oder neu identifizierten IRGs zählten. Bei den Genen die ausschließlich in Milz oder Lunge reguliert waren und zu den allgemeinen IRGs zählen, war der überwiegende Teil nur nach drei Stunden signifikant reguliert - jedoch waren einige dieser Gene im jeweils anderen Organ zu späteren Zeitpunkten reguliert. Anders sah es bei den neu identifizierten IRGs aus: Hier waren in der Milz sowohl unter den hoch regulierten als auch

98 Ergebnisse 83 unter den herunter regulierten Genen der überwiegende Teil auch zu späteren Zeitpunkten reguliert, ebenso wie bei den hoch regulierten neu identifizierten IRGs in der Lunge. Die herunter regulierten neu identifizierten IRGs in der Lunge waren hauptsächlich nur nach drei Stunden reguliert. Auch innerhalb der neu identifizierten IRGs die ausschließlich in der Milz oder in der Lunge reguliert waren, fanden sich zahlreiche Gene, die zu späteren Zeitpunkten auch im jeweilig anderen Organ reguliert wurden. Auffällig war zudem, dass bei den herunter regulierten allgemeinen IRGs die ausschließlich in Milz oder Lunge reguliert waren, die am stärksten herunter regulierten Gene zu finden waren. Die am stärksten hoch regulierten allgemeinen IRGs waren hingegen bei den in Milz und Lunge gemeinsam regulierten Genen zu finden. Auch unter den neu identifizierten IRGs in der Milz waren die am stärksten herunter regulierten Gene zu finden. Die am stärksten hoch und herunter regulierten neu identifizierten IRGs in der Lunge und die am stärksten hoch regulierten neu identifizierten IRGs in der Milz waren unter den Genen zu finden, die in Milz und Lunge reguliert waren Weitere funktionelle Analysen der Gengruppen nach IFN Behandlung Mit den folgenden Analysen sollten die allgemeinen IRGs und insbesondere auch die neu identifizierten IRGs näher charakterisiert werden. Bei der Analyse von Datensätzen aus Mikroarrays wird nach dem in Abbildung 14 dargestellten Schema vorgegangen. Die Daten werden in unterschiedlichste Richtungen analysiert und aus den einzelnen Analysen werden Folgerungen gezogen. Diese Folgerungen werden anschließend miteinander in Beziehung gesetzt, um die Frage zu beantworten welche biologische Prozesse, Signalkaskaden und Zellantworten in den Organen Milz und Lunge durch die IRGs beeinflusst werden und in welchem Zusammenhang diese Prozesse zueinander stehen.

99 Ergebnisse 84 Abbildung 14 Schema einer Mikroarray Analyse Funktionelle Gengruppen Analysen Mit der Panther Gene List Analysis wurden die verschiedenen Gruppen der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs in funktionelle Untergruppen eingeteilt, um herauszufinden, ob sich die Gene der einzelnen Datensätze hinsichtlich ihrer Funktionalität unterscheiden (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 19). Dabei gibt es drei große funktionelle Gruppen Molecular Function, Biological Process und Cellular Component, die sich wiederum in funktionelle Untergruppen aufteilen lassen. Die Analyse ergab folgende Ergebnisse. Zwischen 31 und 50% der signifikant regulierten Gene konnten mit Panther Gene Analysis eingeordnet werden. Das Gen der Gruppe allgemeine IRGs welches in der Milz hoch und in der Lunge herunter reguliert war (EGFR), konnte keiner funktionellen Gruppe zugeordnet werden, ebenso wenig wie HNMT, welches in der Milz herunter und in der Lunge hoch reguliert wurde. Die funktionellen Gruppen Molecular Function, Biological Process und Cellular Component konnten in allen außer einem Datensatz gefunden werden, da dem Gen aus der Gruppe der neu identifizierten IRGs welches in der Milz negativ und in der Lunge positiv reguliert war (ST3GAL5), keine funktionelle Untergruppe in Cellular Component zugeordnet werden konnte.

100 Ergebnisse 85 Betrachtet man die Untergruppen der funktionellen Gruppen genauer, stechen folgende Auffälligkeiten ins Auge: Innerhalb von Molecular Function findet man unter Receptor Activity in beiden Lungen Datensätzen prozentual mehr als doppelt so viele herunter regulierte wie hoch regulierte Gene. Dabei sind die Verhältnisse der anderen Datensätze annährend ausgeglichen. Enzym Regulator Activity enthält in den Datensätzen Milz und Lunge und Milz der allgemeinen IRGs nur hoch regulierte Gene, alle anderen Datensätze enthalten hoch und herunter regulierte Gene. Transcription Regulator Activity enthält in allen Datensätzen prozentual mindestens doppelt so viel hoch regulierte Gene, außer der Datensatz Milz der allgemeinen IRGs, der ausschließlich herunter regulierte Gene enthält. Ion Channel Activity wurde nur in den Datensätzen der neu identifizierten IRGs gefunden und die funktionelle Untergruppe Translation Regulator Activity und Motor Activity nur im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs. Innerhalb von Biological Process fällt bei näherer Betrachtung der funktionellen Untergruppe folgendes auf: Cell Communication enthält überall außer im Datensatz Milz und Lunge der allgemeine IRGs und Milz der neu identifizierte IRGs prozentual deutlich mehr herunter regulierte Gene, während im Datensatz Milz und Lunge der allgemeinen IRGs deutlich mehr hoch regulierte Gene sind und im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs das Verhältnis an hoch regulierten und herunter regulierten Genen annährend ausgeglichen ist. Ähnliches fällt für die funktionelle Untergruppe Cellular Process auf. Auch hier ist in allen Datensätzen ein höherer Anteil an herunter regulierten Genen zu finden, außer im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs, indem das Verhältnis ausgeglichen ist. Ebenso System Process. Auch hier ist ein doppelt so hoher Anteil an herunter regulierten Genen in allen Datensätzen, außer in den Datensätzen beider Milz Gruppen, in denen das Verhältnis an hoch und herunter regulierten Genen wiederum annährend ausgeglichen ist. Auch für Cell Adhesion fällt Ähnliches auf. Alle Datensätze der neu identifizierten IRGs und der Datensatz Lunge der allgemeinen IRGs enthalten prozentual deutlich mehr herunter regulierte Gene. Ausnahmen bilden der Datensatz Milz der allgemeinen IRGs, indem der Anteil an hoch und herunter regulierten Genen annährend ausgeglichen ist und der Datensatz Milz und Lunge der allgemeinen IRGs, indem nur hoch regulierte Gene zu finden sind. Die im Zusammenhang mit der Untersuchung der IFN-Antwort interessante funktionelle Untergruppe Response to Stimulus zeigt in fast allen Abfragen ausgewogene Anteile an hoch und herunter regulierten Genen. Gene der Datensätze Milz und Lunge fallen etwas aus dem Rahmen. In ihnen findet man deutlich mehr hoch regulierte Gene als herunter regulierte Gene und insgesamt höhere Anteile an Genen als in den anderen Datensätzen.

101 Ergebnisse 86 In der im oben genannten Zusammenhang interessanten funktionellen Untergruppe Immune System Process findet man in den Datensätzen Milz und Lunge und Milz der allgemeinen IRGs, sowie in Milz und Lunge und Lunge der neu identifizierten IRGs prozentual deutlich mehr positiv regulierte Gene, jedoch sind im Datensatz Lunge der allgemeinen IRGs prozentual deutlich mehr negativ regulierte Gene. Im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs ist das Verhältnis ausgeglichen. Regulation of biological Process beinhaltet nur Gene der Datensätze neu identifizierte IRGs von Milz und Lunge und Lunge. Generation of Precursor Metabolites and Energy und Localization findet man in allen Datensätzen der neu identifizierten IRGs und dem Datensatz Lunge der allgemeinen IRGs. Die meisten mittels Panther gefundenen Gene finden sich in Cell Communication und Cellular Process, die vor allem Zytokine und Chemokine enthalten, wieder. Innerhalb von Cellular Component sind in Protein Complex in den beiden Datensätzen Milz und Lunge der allgemeinen IRGs und dem Datensatz Milz und Lunge der neu identifizierten IRGs nur herunter regulierte Gene zu finden, in den Datensätzen Milz und Lunge der neu identifizierten IRGs jedoch nur hoch regulierte IRGs. Plasma Membrane beinhaltet im Datensatz Milz der allgemeinen IRGs und Milz und Lunge der neu identifizierten IRGs nur herunter regulierte Gene. Im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs sind nur hoch regulierte Gene innerhalb dieser funktionellen Gruppe zu finden. In Ribonucleoprotein Complex sind im Datensatz Lunge der allgemeine IRGs und im Datensatz Lunge und Milz der neu identifizierten IRGs nur hoch regulierte Gene zu finden, im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs nur herunter regulierte IRGs. Vergleicht man die Einteilung allgemeiner IRGs und neu identifizierter IRGs unabhängig von ihrer Organspezifität, fällt auf, dass insbesondere in Molecular Function neu identifizierte IRGs in mehr funktionelle Untergruppen eingeteilt werden konnten. Ion Channel Activity, Translation Regulator Activity und Motor Activity erscheinen nur in Datensätzen der neu identifizierten IRGs, während es unter den allgemeinen IRGs keine funktionelle Untergruppe gibt, die nicht bei den neu identifizierten IRGs vorkommt. Bei Biological Process sieht man diesbezüglich Ähnliches, da Regulation of biological Process, Generation of Precursor Metabolites and Energy und Localization innerhalb der allgemeinen IRGs jeweils nur in einem Datensatz reguliert sind, während sie innerhalb der neu identifizierten IRGs im Fall von Generation of Precursor Metabolites and Energy und Localization in allen drei Datensätzen erscheinen und im Fall von Regulation of biological Process in zwei der drei Datensätzen. Bei Cellular Component ist Ähnliches für Protein Complex, Plasma Membrane und Ribonucleoprotein Complex feststellbar, da diese

102 Ergebnisse 87 funktionellen Untergruppen in ein bis zwei (im Fall von Protein Complex ) Datensätzen der allgemeinen IRGs zu finden sind, während sie innerhalb der neu identifizierten IRGs in zwei (im Fall von Ribonucleoprotein Complex ) bzw. allen Datensätzen zu finden sind. Des Weiteren scheint innerhalb Molecular Function bei den allgemeinen IRGs der Anteil der Gene, die in Binding und Transcription Regulator Activity eingeteilt wurden, höher zu sein als bei den neu identifizierten IRGs, während umgekehrt bei den neu identifizierten IRGs ein höherer Anteil an Genen die in Transporter Activity eingeteilt wurden, vorzukommen scheint. Bei Biological Process scheint ein höherer Anteil an Genen in Apoptosis und Immune System Process den allgemeinen IRGs zugeordnet werden zu können als den neu identifizierten IRGs. Vergleicht man die Anteile der Gene die in Milz und Lunge bzw. ausschließlich in Milz oder Lunge reguliert wurden, unabhängig davon, ob sie zu den allgemeinen IRGs oder neu identifizierten IRGs zählen und ob sie hoch oder herunter reguliert sind, miteinander, fällt innerhalb von Biological Process auf, dass in der Lunge im Durchschnitt höhere Anteile in Cell Communication, Transport, System Process und Cell Adhesion zu finden sind, als in der Milz und in Milz und Lunge, während in Metabolic Process anteilsmäßig weniger Gene in der Lunge sind als in der Milz und in Milz und Lunge. Hingegen sind durchschnittlich in Response to Stimulus anteilsmäßig die meisten Gene in Milz und Lunge zu finden.. Da die funktionellen Untergruppen Cell Communication, Cellular Component, Immune System Process und Response to Stimulus aufgefallen sind, wurden diese Gruppen näher betrachtet (siehe Abbildung 15). Hierfür wurden von jedem Datensatz hoch und herunter regulierte Gene gemeinsam analysiert (siehe Abbildung 15 und Tabelle 20).Bei näherer Betrachtung von Cellular Process und Cellular Communication konnte man feststellen, dass sich Cellular Process in weitere Untergruppen unterteilen lässt, unter anderem auch in Cellular Communication, die sich wiederum in zwei Untergruppen unterteilen lässt. Insbesondere in Cell Communication und ihren Untergruppen finden sich zahlreiche Zytokine und Chemokine. Dabei liegt der Anteil an Cell Communication mit 39-52% der in Cellular Process relevanten Gene in allen Datensätzen recht hoch, wobei er mit 52% bei den allgemeinen IRGs in Milz und Lunge und den neu identifizierten IRGs in der Lunge am höchsten ist. Eine fokussierte Analyse der regulierten Chemokine und Zytokine wird in abgehandelt.

103 Ergebnisse 88 A B Abbildung 15 Ausgewählte funktionellen Untergruppen nach IFN Injektion Dargestellt sind die prozentualen Zusammensetzungen von (A) Cellular Process und Cell Communication und (B) Response to Stimulus, Immune System Process und Immune Response aller Gene der einzelnen Gruppen. (A) In jeder Gruppe entspricht das obere Kreisdiagramm Cellular Process und das untere Kreisdiagramm Cell Communication, welches einen Anteil von Cellular Process bildet. (B) In jeder Gruppe entspricht das linke obere Kreisdiagramm Response to Stimulus, das rechte obere Immune System Process. Einen Anteil dieser beider Kreisdiagramme bildet Immune Response, dargestellt als das untere Kreisdiagramm. Die entsprechenden Prozentangaben sind in Tabelle 20 verzeichnet.

104 Ergebnisse 89 Die nähere Betrachtung von Response to Stimulus und Immune System Process enthüllte, dass sich nach IFN Injektion Response to Stimulus in fünf bis sechs weitere Untergruppen unterteilen lässt und Immune System Process in zwei oder drei. Alle gefundenen Untergruppen sind relevant bei einer Immunantwort und bei Immune System Process scheinen neben Immune Response auch die Makrophagen Aktivierung von Bedeutung zu sein, da besonders in der Lunge ein großer Teil der Gene Makrophage Activation zugeordnet wird. Außerdem konnten unter den neu identifizierten IRGs auch Gene gefunden werden, die in Antigen Processing and Presentation eingeordnet werden - nicht aber bei den allgemeinen IRGs. Ein großer Anteil der Gene wird in allen analysierten Datensätzen Immune Response zugeordnet, die sowohl bei Response to Stimulus als auch bei Immune System Process eine Rolle spielt. Immune Response setzt sich nach IFN Injektion je nach Gewebe aus zwei bis vier Untergruppen zusammen. Dabei konnten in den Untergruppen teilweise nicht viele Gene gefunden werden und die Zusammensetzung ist sehr unterschiedlich. Während bei den allgemeinen IRGs in Milz und Lunge Natural Killer Cell Activation und Response to IFN Gamma im Vordergrund stehen, scheint unter den allgemeinen IRGs in der Milz Response to IFN Gamma besonders relevant, jedoch auch Natural Killer Cell Activation und B-Cell Mediated Immunity. Unter den neu identifizierten IRGs in Milz und Lunge werden die meisten der gefundenen Gene in B-Cell Mediated Activation und einige in Natural Killer Cell Activation und Response to IFN Gamma eingeteilt. Die neu identifizierten IRGs in der Milz hingegen werden vor allem in B-Cell Mediated Activation und Complement Activation eingeteilt, während von den neu identifizierten IRGs in der Lunge nur in ein Gen (C17orf60) in Natural Killer Cell Activation gefunden werden kann und der Hauptteil in B- Cell Mediated Activation (C17orf60, ALOX5AP und PHLDB1). Eine Liste der Gene die in die verschiedenen funktionellen Gruppen und ihren Untergruppen eingeteilt wurden, ist auf beiliegender CD, Mappe 1, Tabellen 33-44, Tabellenbeschriftung siehe Tabellenverzeichnis zu finden. Zusammenfassend fällt auf, dass der Datensatz Milz und Lunge der allgemeinen IRGs die geringste Vielfalt an funktionellen Untergruppen aufweist, während der entsprechende Datensatz der neu identifizierten IRGs wesentlich diverser ist und sich in ihm alle funktionellen Untergruppen finden. Einige funktionelle Untergruppen sind nur in bestimmten Datensätzen zu finden, andere zeigen Auffälligkeiten durch die Verteilung von hoch und herunter regulierten Genen in den verschiedenen Datensätzen. Besonders deutlich tritt hervor, dass die meisten von Panther gefunden Gene der Datensätze in Cellular Process und Cell Communication, die viele Zytokine und Chemokine enthalten, eingeteilt wurden. Ähnliches

105 Ergebnisse 90 fällt für die in Milz und Lunge positiv regulierten Gene bei Immune System Process und Response to Stimulus auf. Diese Auffälligkeiten müssen mit den Ergebnissen weiterer funktioneller Analysen in Zusammenhang gebracht werden, um genauer interpretiert werden zu können. Dynamische Gengruppen Analyse (MeV) Um die Expressionsprofile der drei Stunden nach IFN Injektion signifikant regulierten Gene über alle Behandlungszeiträume zu untersuchen, wurden die verschiedenen Datensätze der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs mit dem Multi Experiment Viewer (MeV) analysiert. Die von MeV identifizierten Expressionsprofil-Gruppen wurden miteinander verglichen und in ähnliche Expressionsmuster zusammengefasst. Dabei konnten die in Abbildung 16 anhand eines Beispiels dargestellten neun Gruppen von Expressionsprofilen identifiziert werden. Tabelle 10 enthält eine Übersicht über die Anzahl der Gene der einzelnen Datensätze, die in diesen Expressionsprofilen gefunden werden konnten. Abbildung 16 Expressionsprofile nach IFN Injektion Die verschiedenen Datensätze der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs wurden mit dem Programm MeV hinsichtlich ihrer Expressionsmuster über alle Behandlungszeiträume untersucht. Dargestellt ist exemplarisch ein Gen jedes gefundenen Expressionsprofils. Die y-achse zeigt die medianisierte Signalintensität jedes Gens, die von maximal -4 über 0 bis +4 reicht. Die x-achse zeigt die Tiergruppen.

106 Ergebnisse 91 Das Ergebnis der MeV Analyse zeigt, dass Gene aller Datensätze der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs die in Gruppe 1, 3, 4, 6 und 7 dargestellten Expressionsprofile aufwiesen. Dies bedeutet, dass Gene die in Milz und Lunge reguliert waren, sowie Gene die ausschließlich in der Lunge und in der Milz reguliert waren, nach drei Stunden einen deutlichen Expressionsunterschied zu allen anderen Tiergruppen zeigten (Gruppe 1 und Gruppe 6) und dass zudem in allen Datensätzen Gene vorkamen, deren Expressionsunterschied zur Kontrollgruppe sowohl bei den hoch regulierten Genen, als auch bei den herunter regulierten Genen über die Behandlungszeiträume ähnlich stark blieb (Gruppe 3 und 7). In allen Datensätzen konnten außerdem hoch regulierte Gene gefunden werden, die nach drei Stunden stark exprimiert wurden um dann im weiteren Zeitverlauf schwächer exprimiert zu werden (Gruppe 4), wobei dies bei den allgemeinen IRGs innerhalb der Gene die in Milz und Lunge reguliert wurden mit Ausnahme der Milz nur sehr wenige Gene waren. Bei den Genen, die in Milz und Lunge reguliert wurden, fiel insbesondere in der Lunge, aber auch für acht Gene in der Milz, ein weiteres Expressionsprofil auf: Die Gene, die das Expressionsprofil Gruppe 2 aufzeigten, zeigten drei und sechs Stunden nach Behandlung mit rek ChIFN-α einen mittleren Expressionsunterschied zur Kontrollgruppe, welcher neun Stunden nach Behandlung mit rek ChIFN-α noch weiter anstieg. Bei genauerer Betrachtung stellte man fest, dass bei den allgemeinen IRGs dabei sechs dieser Gene in der Milz den Expressionsprofilen 1 oder 4 zugeordnet wurden, also nach drei Stunden stark reguliert wurden und nach sechs und neun Stunden schwächer oder gar nicht mehr reguliert wurden. Nur das Expressionsprofil von LBA1 (Lupus Brain Antigen 1) blieb in der Milz auf einem andauernd ähnlichen Expressionsniveau. Bei den allgemeinen IRGs gehören zu den auf diese Weise exprimierten Genen unter anderem Il-1B, Il-6 und IFN-γ, die alle zu der Gruppe der Zytokine gehören und CCL4 und Il-8 welche zu der Gruppe der Chemokine gehören. Mit CXCL13L2 (Chemokine (C-X-C motif) Ligand 13), ah221, K60 (CXCLi1), K203 (Chicken CCLi3) und Il-13RA2 gehören auch einige Chemokine bzw. ein Zytokin Rezeptor zu dieser Gruppe. Bei den neu identifizierten IRGs, die in Milz und Lunge reguliert waren, wurden 6 der 24 Gene, die in der Lunge diesem Expressionsprofil 2 zugeordnet wurden, auch in der Milz auf ähnliche Weise exprimiert. Neun weitere Gene wurden in der Milz Gruppe 4 zugeordnet, zwei weitere Gruppe 1. Zudem wurden sieben dieser Gene in der Milz über den Behandlungszeitraum ähnlich stark exprimiert (Gruppe 3). Die zwei verbliebenen Gene, die in der Milz Gruppe 2 zugeordnet wurden, wurden in der Lunge Gruppe 3 zugeordnet (P20K (Quisence Specific Protein) und S100A9 (S100 Calcium binding Protein A9). Gruppe 5 stellte ein interessantes Expressionsprofil dar, welches in allen Datensätzen außer in der Milz innerhalb der allgemeinen IRGs die in Milz und Lunge zu finden waren, vorkam. Gruppe 5 enthielt hoch regulierte Gene, die nach drei Stunden und nach

107 Ergebnisse 92 neun Stunden verstärkt exprimiert wurden, nicht aber nach sechs Stunden, wie das Beispiel RPL37 (Ribosomal Protein L37) zeigt. Zwei weitere Expressionsprofile, die vor allem bei den herunter regulierten neu identifizierten IRGs in der Milz gefunden werden konnten, aber vereinzelt auch in anderen Datensätzen, stellen die Gruppen 8 und 9 dar. Dabei zählen zu Gruppe acht Gene, die über den Behandlungsverlauf immer stärker herunter reguliert wurden, wie SFTPA1, welches nach drei Stunden 66fach, nach sechs Stunden 130fach und nach neun Stunden 436fach herunter reguliert wurde. In Gruppe 9 fanden sich hingegen herunter regulierte Gene, deren Expression über die Behandlungszeit schwächer wurde, wie TLR5, das nach drei Stunden in der Lunge 18fach, nach sechs Stunden jedoch nur noch 4fach herunter reguliert wurde. Eine Übersicht der in den einzelnen Gruppen enthaltenen Gene ist auf beiliegender CD, Mappe 1, Tabellen zu finden, Tabellenbeschriftung siehe Tabellenverzeichnis. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die MeV Analyse neun klar definierte Expressionsprofile über die Behandlungszeiträume mit rek ChIFN-α zeigt, von denen fünf in allen Datensätzen gefunden werden konnten. Es scheint, als ob bestimmte Gengruppen wie die Zytokine und Chemokine verstärkt bestimmte Expressionsprofile aufweisen (Gruppe 1-4). Tabelle 10 Gene in den Expressionsprofilen nach IFN Injektion Übersicht über das Vorkommen von in Abbildung 15 dargestellten Expressionsprofilen in den verschiedenen Datensätzen der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs. Hinter der Gesamtzahl der Gene eines Profils ist ihr Anteil in Klammern in Prozent angegeben. Allgemeine IRGs Neu identifizierte IRGs Expressionsprofil Gesamtzahl Milz und Lunge Milz und Lunge Milz Lunge Milz Lunge Milz Lunge Milz Lunge Gruppe (32,5) Gruppe 2 39 (1,4) Gruppe (11,5) Gruppe (5,6) Gruppe 5 98 (3,5) Gruppe (28,9) Gruppe (14,4) Gruppe 8 20 (0,7) Gruppe 9 38 (1,4)

108 Ergebnisse 93 Pathway Express Durch das Programm Pathway Express ist es möglich, biologisch relevante Signalwege in einem Datensatz zu identifizieren. Die Datensätze der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α wurden mit Pathway Express analysiert, um zwischen den Gengruppen Unterschiede in der Signaltransduktion zu identifizieren. Insgesamt konnten 78 biologisch relevante Signalkaskaden gefunden werden. Sie sind auf beiliegender CD in Mappe 1, Tabelle 51 zu finden. Da die IFN-Antwort des Huhns untersucht werden sollte, wurden die im Immunsystem biologisch relevanten Signalkaskaden ausgewählt und in Tabelle 11 dargestellt. Die Analyse zeigte, dass die einzelnen Datensätze in unterschiedliche und gemeinsame biologisch relevante Signalkaskaden einteilbar waren. Dabei wurden manche Signalkaskaden exklusiv in einer Gruppe reguliert und andere in den unterschiedlichsten Zusammensetzungen gemeinsam reguliert. Mit Cytokine-cytokine receptor interaction, MAPK signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, Jak-STAT signaling pathway, TGF beta signaling pathway und Apoptosis zählen wichtige immunologisch relevante Signalkaskaden zu den meist biologisch relevanten Signalkaskaden. Es konnte keine Signalkaskade gefunden werden, die bei allen analysierten Datensätzen gemeinsam biologisch relevant reguliert wurde, aber Complement and Coagulation Cascade war bei allen Gruppen außer im Datensatz Milz der neu identifizierten IRGs reguliert. PPAR Signaling Cascade war ausschließlich bei beiden Datensätzen der Gruppe Milz reguliert. Auch konnte keine Signalkaskade gefunden werden, die ausschließlich bei allen drei Gruppen der neu identifizierten IRGs reguliert war. Allerdings wurde die Signalkaskade Calcium signaling pathway ausschließlich innerhalb zweier Gruppen der neu identifizierten IRGs gefunden: in den Gruppen Milz und Lunge und Lunge, wobei sie im Datensatz Milz und Lunge zu den biologisch relevantesten Signalwegen zählte.

109 Ergebnisse 94 Tabelle 11 Biologisch relevante Signalwege nach IFN Injektion Dargestellt sind die in immunologischen Prozessen biologisch relevanten Signalwege in den Datensätzen der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs und der entsprechende corrected gamma p-value. Als biologisch relevant wurde ein corrected gamma p-value von <0,5 angesehen. Je niedriger dieser ist, desto höher die biologische Relevanz des Signalwegs. Die corrected gamma p-values der drei Signalwege mit der höchsten biologischen Relevanz jedes Datensatzes sind rot geschrieben. Name des Signalwegs Milz und Lunge Allgemeine IRGs Milz Lunge Neu identifizierte IRGs Milz und Lunge Ubiquitin mediated proteolysis Regulation of autophagy Cell cycle Adherens junction Mismatch repair Homologous recombination DNA replication Antigen processing and presentation SNARE interactions in vesicular transport Nucleotide excision repair Tight junction Milz Lunge Phosphatidylinositol signaling system Hedgehog signaling pathway mtor signaling pathway Regulation of actin cytoskeleton 0,2824 0, p53 signaling pathway 0, Apoptosis 4x , Natural killer cell mediated cytotoxicity , Calcium signaling pathway T cell receptor signaling pathway , Cell adhesion molecules (CAMs) 0, , PPAR signaling pathway Gap junction - 0, B cell receptor signaling pathway ErbB signaling pathway 0, ,3916 Focal adhesion , Leukocyte transendothelial migration ,3165 0,4596 VEGF signaling pathway - 0, ,5058 0,4685 Wnt signaling pathway , Cytokine-cytokine receptor interaction - 6x ,0195 MAPK signaling pathway x ,3555 ECM-receptor interaction ,1679 Hematopoietic cell lineage , Toll-like receptor signaling pathway 4x10-8 1x , Jak-STAT signaling pathway 8x ,3005 0, TGF-beta signaling pathway 0,1419 0,0435 0, ,0515 Complement and coagulation cascades 0, ,1094 0,

110 Ergebnisse 95 Auffallend ist, dass die einzelnen Signalwege immer wieder ineinander greifen und zusammen ein Gesamtbild vermitteln. Dies gilt auch für die Signalwege, die unabhängig voneinander sowohl in der Milz als auch in der Lunge reguliert wurden. Angefangen beim Toll-like receptor signaling pathway zur Pathogen Erkennung und entsprechender Zellantwort, über klassische Signalwege wie Jak-STAT signaling pathway und MAPK signaling pathway, erschienen Signalwege wichtiger Immuneffektorzellen wie T cell receptor signaling pathway und Natural killer cell mediated cytotoxicity, aber auch Signalwege der Haematopoese wie Hematopoietic cell lineage. Des weiteren traten Signalwege der Effektormoleküle auf wie Cytokine-cytokine receptor interaction und Signalwege, die aufzeigen wie die Zellantworten vermittelt werden, wie Gap junction, Calcium signaling pathway, Focal adhesion und Cell adhesion molecules. Schließlich waren auch Signalwege biologisch relevant, die die Zellantworten aufzeigen wie Regulation of Autophagy, Apoptosis, VEGF signaling pathway und Ubiquitin mediated proteolysis. Alle Signalkaskaden, die ausschließlich in der Milz biologisch relevant reguliert wurden, spielen wichtige Rollen bei der Interaktion von Zellen. So beeinflusst Cell cycle den Zellzyklus und zeigt unter welchen Umständen eine Zelle in Apoptose geht, Proteine degradiert oder Genexpression veranlasst. Adherens junction und Tight junction sind wichtige Bestandteile bei der Zellkommunikation und PPAR signaling pathway ist am Lipidstoffwechsel beteiligt. Die Signalkaskaden, die ausschließlich in der Lunge biologisch relevant reguliert wurden spielen einerseits auf DNA-Ebene eine wichtige Rolle ( Mismatch repair, Homologous recombination, DNA replication und Nucleotide excision repair ), andererseits wurde hier auch ein Signalweg biologisch relevant reguliert, der die Antigen Prozessierung und Präsentation widerspiegelt und aufzeigt unter welchen Umständen naive T-Lymphozyten zu T- Effektorzellen werden. Des Weiteren waren in der Lunge auch Signalwege relevant, die wiederum in der Signaltransduktion und dem Zelltransport von Bedeutung sind ( Phosphatidylinositol signaling system, Hedgehog signaling pathway und mtor signaling pathway ). Zusammenfassend fällt auf, dass zahlreiche Signalkaskaden ausschließlich in einer der analysierten Gruppen biologisch relevant reguliert waren - jedoch keine Signalkaskade in allen analysierten Gruppen gemeinsam. Die Signalkaskaden, die in Milz und Lunge reguliert wurden, sind am gesamten Prozess einer Immunantwort beteiligt und greifen umfassend ineinander. Die Signalkaskaden, die exklusiv in der Milz reguliert waren, zählen hauptsächlich zu Signalkaskaden des Zellzyklus, der Zellkommunikation und des Zellstoffwechsels. Die

111 Ergebnisse 96 exklusiv in der Lunge regulierten Signalkaskaden spielen einerseits auf DNA-Ebene eine Rolle, andererseits sind in der Lunge wiederum Signalwege wichtiger Signaltransduktoren relevant. Insgesamt ergibt sich ein schlüssiges Bild einer Immunantwort mit Hinweisen auf eine fokussierte Regulation von Signalkaskaden die Zellkommunikation betreffend in der Milz und Signalkaskaden die DNA-Replikation betreffend in der Lunge. Biologische Funktionen Mit dem Programm Ingenuity können unter anderem relevante biologische Funktionen und Netzwerke innerhalb von Datensätzen identifiziert werden. Daher wurden die drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN- in der Milz und in der Lunge regulierten Gene mit diesem Programm analysiert. Hierzu wurden die Datensätze zunächst hinsichtlich der fünf meist signifikanten relevanten biologischen Funktionen untersucht. Für die biologische Relevanz wurde die Höhe des p-values herangezogen (siehe Tabelle 12). Die drei Stunden nach Behandlung mit rek ChIFN-α in der Milz regulierten Gene können in insgesamt 67, die in der Lunge regulierten Gene können in insgesamt 69 signifikant biologisch relevante Funktionen eingeteilt werden (siehe beiliegende CD, Mappe 1, Tabelle 52). Dabei überschneiden sich 61 biologische Funktionen. Die biologischen Funktionen Cell Signaling, Infectious Disease, Post Translational Modification, Vitamin and Mineral Metabolism, Metabolic Disease und Nucleic Acid Metabolism sind ausschließlich in der Milz relevant. Amino Acid Metabolism, Auditory and Vestibular System Development and Function, Cellular Compromise, Hair and Skin Development and Function, Hereditary Disorder, Hypersensitivity Response, Organismal Functions und Protein Trafficking kommen dagegen in der Lunge vor. Die biologischen Funktionen wurden in eine Vielzahl von Untergruppen unterteilt. In Tabelle 12 sind die fünf Hauptfunktionen mit der höchsten Signifikanz und die entsprechenden fünf meist signifikanten Untergruppen aufgelistet. Die Zahl der zugeordneten Gene beläuft sich auf 474 Gene in der Milz und 198 Gene in der Lunge.

112 Ergebnisse 97 Tabelle 12 Signifikante biologische Funktionen nach IFN Injektion Dargestellt sind in Spalte eins die fünf meist signifikant regulierten biologischen Funktionen in Milz (A) und Lunge (B). Spalte zwei zeigt die meist signifikanten funktionellen Untergruppen der biologischen Funktionen. In Spalte drei ist die entsprechende Anzahl signifikant regulierter Gene gelistet, in Spalte vier der jeweilige p-value. A Milz Kategorie Untergruppe # an Genen p-value Tissue Morphology Quantity of cells x10-30 Quantity of blood cells x10-24 Quantity of leukocytes 141 1x10-23 Quantity of lymphocytes 118 2x10-23 Quantity of mononuclear leukocytes 120 5x10-23 Cellular Movement Cell movement 247 8x10-28 Migration of cells 228 2x10-27 Leukocyte migration 121 1x10-16 Cell movement of mononuclear leukocytes 76 9x10-16 Cell movement of leukocytes 106 7x10-15 Cellular Development Differentiation of cells 230 2x10-22 Differentiation of leukocytes 100 1x10-17 Proliferation of blood cells 121 2x10-17 Differentiation of blood cells 110 5x10-17 Proliferation of mononuclear leukocytes 108 2x10-16 Cell Death and Survival Necrosis 276 1x10-20 Cell death 335 4x10-20 Apoptosis 276 8x10-18 Cell death of blood cells 101 3x10-15 Cell death of immune cells 98 4x10-15 Immune Cell Trafficking Leukocyte migration 121 1x10-16 Cell movement of mononuclear leukocytes 76 9x10-16 Cell movement of leukocytes 106 7x10-15 Migration of mononuclear leukocytes 62 1x10-14 Lymphocyte migration 56 2x10-13 B Lunge Kategorie Untergruppe # an Genen p-value Cellular Development Differentiation of cells 114 1x10-15 Differentiation of blood cells 52 8x10-10 Differentiation of connective tissue cells 39 7x10-9 Development of blood cells 44 1x10-8 Epithelial-mesenchymal transition 16 7x10-8 Cellular Movement Migration of cells 103 6x10-14 Cell movement 109 4x10-13 Invasion of cells 43 7x10-7 Cell movement of fibroblasts 16 2x10-6 Migration of vascular endothelial cells 14 5x10-6 Tissue Morphology Quantity of cells 100 2x10-13

113 Ergebnisse 98 Organismal Survival Organismal death 94 5x10-12 Cardiovascular System Development and Function Survival of organism 39 4x10-6 Morphology of cardiovascular system 49 1x10-11 Development of cardiovascular system 66 1x10-11 Development of blood vessel 51 4x10-9 Vasculogenesis 46 1x10-8 Abnormal morphology of artery 16 1x10-7 Es fällt auf, dass sich die Untergruppen Cellular Movement und Immune Cell Trafficking in der Milz teilweise überschneiden. Betrachtet man die enthaltenen Gene, fällt auf, dass 56 Gene in allen Untergruppen reguliert wurden. Die größte Gruppe stellt Cell movement mit 246 Genen dar. 227 dieser Gene wurden in Migration of cells reguliert. Gene, die Cell movement, aber nicht Migration of cells zugeordnet wurden sind beispielsweise ARHGAP22 (Rho GTPase activating protein 22), eine GTPase, die an der Zellmotilität beteiligt ist, HIPKK2 (Homeodomain-Interacting Protein Kinase 2), eine Serin/Threonin Protein Kinase, die unter anderem das Zellwachstum hemmt und PLA2G4A (Phospholipase A2, Group IVA (cytosolic, calcium-dependent)), eine Phospholipase, die die Hydrolyse von Membran Phospholipiden hydrolisiert und so in den Zellstoffwechsel eingreift. ARHGAP22 und HIPK2 wurden in der Milz drei Stunden nach IFN Injektion 3fach und PLA2G4A 5fach hoch reguliert. Leukocyte Migration aus Cellular Movement und Immune Cell Trafficking enthalten die gleichen 120 Gene. Unter den 120 Genen, die in Migration of cells enthalten sind, nicht aber in Leukocyte migration findet sich beispielsweise MSH2 (Homeobox Protein MSX-2) in der Milz 3fach hoch reguliert. In dieser Untergruppe ist im Gegensatz zu Cell movement of mononuclear leukocytes FLT4 (FMS-related Tyrosine Kinase 4) in der Milz 3fach hoch reguliert. FLT4 ist eine Tyrosin Kinase, die unter anderem an der Lymphangiogenese beteiligt ist. Cell movement of leukocytes und Cell movement of mononuclear leukocytes aus Cellular movement und Immune Cell Trafficking enthalten die gleichen Gene. Die Untergruppe von Immune Cell Trafficking Migration of mononuclear leukocytes enthält mit FLT1 (FMS-related tyrosine kinase 1), EFNB2 (Ephrin B2), MAPK14 (Mitogen Activated Protein Kinase 14), NINJ1 (Ninjruin 1) und PLA2G6 (Phospholipase A2, Group VI) fünf Gene mehr als Lymphocyte migration, welches mit 56 Genen, die auch in allen anderen erwähnten Untergruppen zu finden waren, die kleinste Untergruppe bildet. Auch in allen anderen in Tabelle 12 aufgeführten Gruppen, überschneiden sich in den jeweiligen Untergruppen zahlreiche Gene und Gene, die der jeweils größten Untergruppe zugewiesen werden, finden sich auch in kleineren Untergruppen dieser Gruppe. Ausnahmen bilden hierbei die Gruppen Organismal Survival und Cardiovascular System

114 Ergebnisse 99 Development and Function, wo in den Untergruppen Organismal death und Survival of organism bzw. in Morphology of cardiovascular system und development of cardiovascular system zwar zahlreiche Gene gemeinsam zugeordnet werden, aber einige Gene auch nur in einer der genannten Untergruppen erscheinen, wie beispielsweise FAT4 (FAT Tumor Supressor Homolog 4) und CCND1 (Cyclin D1), die in der Lunge 2fach herunter reguliert wurden, in Morphology of cardiovascular system und ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) und FGL2 (Fibrinogen-like 2) in Survival of organsim, die in der Lunge 2fach herunter bzw. 2fach hoch reguliert wurden. Betrachtet man das Gesamtbild dieser biologischen Funktionen scheint im Milzgewebe vermehrt mrna messbar zu sein, die Rückschlüsse auf die Zellzusammensetzung gibt. Wie Tissue Morphology zeigt, scheint sich die mrna Abundanz, die mit der Anzahl an Zellen in Verbindung gebracht wird, insbesondere bei den Leukozyten und Blutzellen zu verändern. Der Punkt Cellular Movement deutet darauf hin, dass im Milzgewebe mrna exprimiert wurde, die darauf hinweist, dass Leukozyten vermehrt einwandern und, wie Cellular Development zeigt, proliferieren und sich differenzieren. Cell death and survival zeigt, dass vermehrt mrna gefunden wurde, die für einen gesteigerten Zelltod spricht, da 335 Gene in Cell Death eingeordnet werden. Einerseits sind vermehrt Gene, die sich der Nekrose zuordnen lassen, andererseits auch vermehrt mit Apoptose verknüpfte Gene feststellbar. Sowohl Nekrose, als auch Apoptose wurden jeweils 276 Gene zugeordnet, von denen sich 233 Gene überschneiden und jeweils 43 Gene alleine Nekrose oder Apoptose zugeordnet werden (siehe beiliegende CD; Mappe 1, Tabelle 55). Zu den mit Apoptose assoziierten Genen gehören beispielsweise AQP1 (Aquaporin 1), welches für ein molekulares Wasserkanal Protein codiert. AQP1 wurde in der Milz drei Stunden nach IFN Injektion 4fach hoch reguliert. Ein weiteres Gen, das von Ingenuity nur mit Apoptose und nicht mit Nekrose assoziiert wird, ist CACNA1C (Calcium Channel, Voltage Dependent, L Type, Alpha 1C Subunit), das drei Stunden nach IFN Injektion in der Milz 13fach hoch reguliert wurde. Ein weiteres Beispiel ist Il-12B (Interleukin-12 Beta), als wichtiges Zytokin in der T H 1-Immunantwort. Mit Nekrose werden SQSTM1 (Sequestomsome 1) und STK25 (Serine/Threonine Kinase 25) in Verbindung gebracht, die in der Milz drei Stunden nach IFN Injektion 2fach bzw. 3fach hoch reguliert wurden. Auch in der Lunge spielt die biologische Funktion Cellular Development eine entscheidende Rolle. Allerdings werden mit Differentiation of connective tissue cells, Development of connective tissue cells und Epithelial-mesenchymal transition andere Untergruppen als relevant eingestuft. Auch die biologische Funktion Cellular Movement ist in der Lunge relevant. Hier jedoch konnten mehr Gene gefunden werden, die mit der Einwanderung von

115 Ergebnisse 100 Fibroblasten und Epithelzellen in Verbindung gebracht werden, als mit Leukozyten. Zudem wird Invasion of cells und Migration of vascular endothelial cells in der Lunge als biologisch relevant bewertet. Der Punkt Tissue Morphology enthält mit Quantity of cells nur eine einzige biologisch relevante Untergruppe. Der Punkt Organismal survival enthält die Untergruppen Organismal death und survival of organism. Außerdem kommen die biologischen Funktionen Cardiovascular System Development and Function vor, die mit den Untergruppen Morphology of cardiovascular system, Development of cardiovascular system, Development of blood vessel, Vasculogenesis und Abnormal morphology of artery auf Veränderungen der Genexpresssion, die mit biologisch relevanten Vorgängen im Gefäßsystem in Zusammenhang gebracht werden, hinweisen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN- insgesamt mit einigen Ausnahmen ähnliche biologische Funktionen in Milz und Lunge relevant sind. Allerdings unterscheiden sich diese hinsichtlich der Höhe der biologischen Relevanz. In beiden Organen konnten Gene gefunden werden, die mit Zellmigration und Zelldifferenzierung in Verbindung gebracht werden. Während in der Milz vor allem Gene exprimiert werden, die mit der Migration, Proliferation und Differenzierung von Leukozyten in Zusammenhang gebracht werden, scheinen in der Lunge vor allem Gene exprimiert zu werden, die mit einer Zunahme von Fibroblasten und Endothelzellen in Verbindung gebracht werden. Zudem konnten in der Lunge viele Gene gefunden werden, die darauf hindeuten, dass hier dem Gefäßsystem eine hohe biologische Relevanz zugeordnet werden kann. Netzwerke Um Zusammenhänge zwischen den regulierten Genen besser charakterisieren zu können, wurden PTX3 (Pentraxin Related Gene, rapidly induced by Il-1b), Il-6, Il-22, Alb (Albumin) und SFTPA1 (Surfactant, Pulmonary-associated Protein A1) mit Ingenuity analysiert. Mit der durchgeführten Analyse kann gezeigt werden, mit welchen Genen die ausgewählten Gene, in Ingenuity upstream regulator genannt, in direkter oder indirekter Beziehung stehen und Netzwerke bilden. Als Quelle dieser Zusammenhänge nutzt Ingenuity die Ingenuity Knowledge Base, welche aus zahlreiche Datenbanken und Veröffentlichungen zusammengetragen wurde und deren Ergebnisse Ingenuity analysiert und miteinander verknüpft, um Beziehungen zwischen Daten darzustellen. Aus diesem Grund kann nicht für jedes beliebige Gen eine Beziehung zu anderen Genen dargestellt werden. Die Gene wurden zum einen anhand ihrer Expressionsstärke, zum anderen aufgrund der Frage, ob für sie eine derartige Analyse durchführbar ist, ausgewählt. Mit PTX3 und SFTPA1 sind die über die Behandlungszeit am stärksten hoch und herunter regulierten Gene dieser Analyse unterzogen

116 Ergebnisse 101 worden. Il-6 sollte als wichtiges Zytokin und als das nach IFN Injektion am zweitstärksten hoch regulierte Gen umfassend untersucht werden. Ähnlich wie Il-22, das am zweitstärksten nach drei Stunden ausschließlich in der Milz hoch reguliert war und das stärkste Gen in der Milz war, für das diese Art der Analyse durchgeführt werden konnte. Albumin wurde gewählt, da es das am stärksten hoch regulierte Gen in der Lunge war, für das Beziehungen zu anderen Genen gefunden werden konnte. Die Ergebnisse dieser Analyse von PTX3 (Abbildung 17), SFTPA1 (Abbildung 18), Il-22 (Abbildung 19) und Albumin (Abbildung 20) wurden graphisch dargestellt. Da das Netzwerk um Il-6 zu umfangreich war, um es graphisch in dieser Monographie darzustellen, wurde es auf beiliegender CD unter Abbildung 37 und die Gene die Ingenuity mit Il-6 in Zusammenhang bringt in Mappe 1, Tabelle 56 gespeichert. Eine Liste mit den Genen, die mit den vier dargestellten upstream regulators in Zusammenhang gebracht werden, ist im tabellarischen Anhang Tabelle 21 zu finden. PTX3, auch Pentraxin related Gen, rapidly induced by Il-1beta (siehe Abbildung 17), gehört zu den allgemeinen IRGs. PTX3 war das am stärksten regulierte Gen überhaupt. In der Milz war es drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α 685fach hoch reguliert. Über den Behandlungsverlauf nahm die Regulation stark ab. In der Lunge war es ausschließlich in der Gruppe IFN(3h) 3fach hoch reguliert. Die Gene, die mit PTX3 in Zusammenhang gebracht werden können, sind in Tabelle 21 A näher erläutert. PTX3 kann direkt und indirekt Einfluss auf Gene nehmen, die zu den Zytokinen bzw. deren Rezeptoren, Wachstumsfaktoren, G- Protein gekoppelten Rezeptoren, Peptidasen, Transkriptionsfaktoren und Transmembran Rezeptoren zählen. Auffallend ist, dass zu diesen viele Chemokine und Zytokine sowie Chemokinrezeptoren, die ebenfalls stark hoch oder herunter reguliert waren, gehören : Il-1B (Interleukin-1 Beta), Il-6, CCL5 (Chemokine (C-C motif) Ligand 5), CCR2 (Chemokine (C-C motif) Receptor 2), CCR5 (Chemokine (C-C motif) Receptor 5), CX3CR1 (Chemokine (C-X3-C motif) Receptor 1) und zwei PRR (Toll-like Receptor 2 und 4). Außerdem kann PTX3 mit dem Wachstumsfaktor IGF1 (Insulin-like Growth Factor 1), den Transkriptionsfaktoren JUN (JUN Onkogene) und NFKB1 (Nuclear Factor of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer in B- Cells 1), der Peptidase MMP9 (Matirx Metallopeptidase 9) und TRAF3 (TNF Receptorassociated Factor 3) in Beziehung treten. Acht dieser Gene gehören zu den allgemeinen IRGs, fünf zu den neu identifizierten IRGs. Die Gene IGF1, IL-1B, Il-6, TLR2, TRAF3, CCL5 und CCR2 waren sowohl in der Milz als auch in der Lunge reguliert. Die Gene CXCR1, JUN, MMP9 und NFKB1 waren ausschließlich in der Milz reguliert. Die Gene TLR4 und CCR5 waren ausschließlich in der Lunge reguliert. Unter den Genen, auf die PTX3 Einfluss nimmt, sind Gene, die nach IFN-Injektion sowohl hoch als auch herunter reguliert wurden.

117 Ergebnisse 102 Abbildung 17 Netzwerkanalyse von PTX3 Dargestellt ist die Wechselwirkung von PTX3 (Pentraxinrelated Gene, rapidly induced by Il-1β) mit anderen signifikant regulierten Genen. Die kleinen Kästen neben den Genen zeigen das Expressionsprofil des Gens in der Reihenfolge Milz IFN(3h), Milz IFN(6h), Milz IFN(9h), Lunge IFN(3h), Lunge IFN(6h) und Lunge IFN(9h). Dabei steht ein roter Balken für eine Hoch-Regulation, ein grüner Balken für eine Herunter-Regulation. Die Pfeile zeigen die Natur der Beziehung. Gestrichelte Linien symbolisieren eine direkte oder indirekte Beziehung zwischen dem zentralen Gen und dem beeinflussten Gen, durchgehende Linien symbolisieren eine direkte Beziehung zwischen einem Gen und einem anderem.

118 Ergebnisse 103 SFTPA1, auch Surfactant Pulmonary-associated Protein A1 (siehe Abbildung 18) war das am stärksten herunter regulierte Gen überhaupt und wurde ausschließlich in der Milz reguliert. Über die Zeit der Behandlung sank die Expression von SFTPA1 in der Milz auf das über 460fache. SFTPA1 zählt zu den allgemeinen IRGs. Die Gene mit denen SFTPA1 laut Ingenuity in Beziehung treten kann, zählen zu den Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren (Il-10 (Interleukin-10), Il-1A (Interleukin-1 Alpha), Il-1B, IL-1RL1 (Interleukin-1 Receptor-like 1), Il-2 (Interleukin-2), Il-2RA (Interleukin-2 Receptor Alpha), Il-6, CXCL2 (Chemokine (C-X-C motif) Ligand 2), CXCL3 (Chemokine (C- X-C motif) Ligand 3), HBEGF (Heparin Binding EGF-like Growth Factor), NAMPT (Nicotinamid Phosphoribosyltransferase), PDK4 (Pyruvate Dehydrogenase Kinase, Isozyme 4) und CTGF (Connective Tissue Growth Factor)), den Enzymen (RASD 1 (RAS, Dexamethasoninduced 1), PMEL (Premelanosome Protein), ST3GAL1 (ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3- Sialyltransferase) und CYP1B1(Cytochrome P450, Family 1, Subfamily B, Polypeptide 1)), den G-Protein gekoppelten Rezeptoren (MRC1 (Mannose Recpetor, C Type 1), ADRB2 (Adrenergicc, Beta-2-, Receptor, Surface), FZD8 (Frizzled Homolog 8) und GPR68 (G- Protein-Coupled Receptor 68)), den Kinasen (ERN1 (Endoplasmic Reticulum to Nucleus Signaling 1)), den Peptidasen (ANPEP (Alanyl (Membrane) Aminopeptidase)) und den Transkriptionsfaktoren (RELA (V-rel Reticuloendotheliousis Viral Oncogene Homolog A (Avian)), MYC (V-MYC Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog (Avian)), KLF2 (Kruppel like Factor 2), FOS (V-FOS FBJ Murine Osteosarcoma Viral Oncogene Homolog), FOXP3 (Forkhead Box P3) und EGR1(Early Growth Response 1)). Von insgesamt 49 Genen waren 18 nicht auf dem Mikroarray annotiert (siehe Tabelle 21 B). Es sollte vermerkt werden, dass das Gen TNF (Tumor Nekrose Faktor), das mit SFTPA1 in Zusammenhang gebracht wird, vermutlich im Huhn nicht vorkommt, was die Datenbank Ingenuity jedoch nicht berücksichtigt. Nur etwa die Hälfte der auf dem Mikroarray annotierten Gene, die mit SFTPA1 in Beziehung treten können, wurde auch signifikant reguliert. Davon können 9 Gene den allgemeinen IRGs zugeordnet werden und 13 den neu identifizierten IRGs. Von den signifikant regulierten Genen wurden 10 sowohl in der Milz als auch in der Lunge reguliert. Fünf Gene wurden ausschließlich in der Lunge reguliert, sieben ausschließlich in der Milz. Von den 22 (inklusive TGFB2 und TGFB3) nach IFN Injektion regulierten Genen waren 5 Gene herunter reguliert und 17 hoch reguliert.

119 Ergebnisse 104 Abbildung 18 Netzwerkanalyse von SFTPA1 Dargestellt ist die Wechselwirkung von SFTPA1 (Surfactant Pulmonary-Associated Protein A1) mit anderen signifikant regulierten Genen bzw. mit Gengruppen zu denen signifikant regulierte Gene zählen und Genen die nicht signifikant reguliert sind. Die kleinen Kästen neben den Genen zeigen das Expressionsprofil des Gens in der Reihenfolge Milz IFN(3h), Milz IFN(6h), Milz IFN(9h), Lunge IFN(3h), Lunge IFN(6h) und Lunge IFN(9h). Dabei steht ein roter Balken für eine Hoch-Regulation, ein grüner Balken für eine Herunter-Regulation. Die Pfeile zeigen die Natur der Beziehung. Gestrichelte Linien symbolisieren eine direkte oder indirekte Beziehung zwischen dem zentralen Gen und dem beeinflussten Gen, durchgehende Linien symbolisieren eine direkte Beziehung zwischen einem Gen und einem anderem. Legende siehe Abbildung 17.

120 Ergebnisse 105 Il-6 (Interleukin-6) (siehe beiliegende CD, Abbildung 37 und Mappe 1, Tabelle 56) wurde als allgemeines IRG nach IFN Injektion in der Milz 186fach hoch reguliert, wobei die Expression rasch sank und schon nach sechs Stunden nur noch eine 10fache Hoch-Regulation messbar war. In der Lunge wurde Il-6 nach drei und sechs Stunden nur 7 bzw. 12fach hoch reguliert, um dann nach neun Stunden auf eine 67fache Hoch-Regulation anzusteigen. Il-6 kann von Ingenuity mit über Genen bzw. Molekülen in Zusammenhang gebracht werden. Von diesen waren mindestens 251 Gene auf dem Mikroarray annotiert und 85 nach IFN Injektion reguliert. Dabei zählen 30 dieser Gene zu den allgemeinen IRGs und 55 zu den neu identifizierten IRGs. Unter diesen Genen sind mit CX3CR1 (Chemokine (C-X3-C motif) Receptor 1), CCR6 (Chemokine (C-C motif) Receptor 6) und CCL17 (Chemokine (C-C motif) Ligand 17) zwei Chemokinrezeptoren und ein Chemokin und mit Il-1B (Interleukin-1 Beta), Il- 17F (Interleukin-17F), Il-7R (Interleukin-7 Receptor), Il-12RB2 (Interleukin-12 Receptor Beta 2), Il-1R1 (Interleukin-1 Receptor1), Il-1R2 (Interleukin-1 Receptor 2), IFNGR1 (IFN-gamma Receptor 1) und Il-23R (Interleukin-23 Receptor) zwei Zytokine und sechs Zytokinrezeptoren nach IFN Injektion reguliert. Außerdem können zahlreiche weitere Gene, die bereits in anderen durchgeführten Analysen aufgefallen sind, mit Il-6 in Zusammenhang gebracht werden, darunter PTX3, USP18 (Ubiquitin Specific Peptidase 18), AHNAK2 (AHNAK Nucleoprotein 2) und IFIH1 (Interferon Induced with Helicase C Domain 1). Von den 85 nach IFN Injektion regulierten Genen, die mit Il-6 in Verbindung gebracht werden können, wurden 25 in Milz und Lunge reguliert, davon wurden 22 Gene hoch reguliert, 2 Gene (AHNAK2 und EDN3 (Endothelin 3)) wurden in Milz und Lunge herunterreguliert und 1 Gen, NMU (Neuromedin U) wurde in der Milz herunter reguliert und in der Lunge hoch reguliert. Ausschließlich in der Lunge wurden 12 Gene reguliert, davon wurden 10 Gene hoch reguliert und 2 Gene (CRHR1 (Corticotropin Releasing Hormon Receptor 1) und ROR1 (Receptor Tyrosin Kinase-like Orphan Receptor 1)) herunter reguliert. Auffallend ist, dass von den 47 Genen die ausschließlich in der Milz reguliert wurden, 25 Gene herunter reguliert und nur 22 Gene hoch reguliert wurden.

121 Ergebnisse 106 Il-22 (Interleukin-22) (siehe Abbildung 19 und tabellarischer Anhang Tabelle 21 C) zählt zu den allgemeinen IRGs. Es wurde in der Milz drei und neun Stunden 34fach bzw. 3fach hoch reguliert, in der Lunge aber nur nach neun Stunden 3fach hoch reguliert. Damit war es nach ZPD (Zona Pellucida Protein D), welches drei Stunden nach IFN Injektion 38fach hoch reguliert war, das höchst regulierte Gen, das drei Stunden nach IFN Stimulation ausschließlich in der Milz vorkam. Auch Il-22 kann mit vielen Genen in Verbindung gebracht werden. Diese zählen zu den Zytokinen (IFN-γ (Interferon gamma), Il-10 (Interleukin-10), Il-13 (Interleukin- 13), Il-4 (Interleukin-4), Il-6, Il-8 (Interleukin-8) und Il-1 (Interleukin-1)), den Enzymen (HMOX1 (Heme Oxygenase 1), CD274 und NOS2 (Nitric Oxide Synthase 2, inducible), den Kinasen (AKT1 (V-AKT Murine Thymoma Viral Oncogen Homolog 1)), den Peptidasen (MMP3 (Matirx Metallopeptidase 3)) und den Transkriptionsfaktoren (MYC (V-MYC Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog (Avian))). Außerdem kann Il-22 mit dem antiapoptotischen BCL2 (B-Cell CLL/Lymphoma 2) in Zusammenhang gebracht werden. Von den durch Ingenuity identifizierten 34 Genen waren sechs Gene nicht auf dem Mikroarray annotiert. Von den 28 Genen die auf dem Mikroarray vorkamen wurden 22 signifikant reguliert. Davon zählen 14 Gene zu den allgemeinen IRGs und acht zu den neu identifizierten IRGs. Lediglich neun der Gene die mit Il-22 in Zusammenhang gebracht werden können, wurden sowohl in der Milz als auch in der Lunge reguliert. Von diesen wurden nur Il-18 und S100A9 über alle Behandlungszeiträume konstant exprimiert. Vier weitere Gene wurden in der Milz nur nach drei Stunden reguliert. Dies traf für MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) auch in der Lunge zu. NOS2 wurde erst neun Stunden nach IFN Injektion in der Lunge verstärkt exprimiert. SOCS3 und CD274 wurden bereits drei Stunden nach der Injektion in der Lunge reguliert. Beide wurden in der Lunge sechs Stunden nach IFN Injektion nicht oder vermindert exprimiert, um nach neun Stunden wieder stärker reguliert zu werden. Lediglich 5 der 22 Gene wurden herunter reguliert, die restlichen Gene wurden hoch reguliert. Auffallend ist, dass alle in der Lunge regulierten Gene, außer NOS2, bereits drei Stunden nach IFN Injektion exprimiert wurden, obwohl Il-22 erst neun Stunden nach IFN Injektion in der Lunge messbar war, was auf eine systemische Wirkung von Il-22 hinweisen könnte.

122 Ergebnisse 107 Abbildung 19 Netzwerkanalyse von Interleukin-22 Dargestellt ist die Wechselwirkung von Interleukin-22 mit anderen signifikant regulierten Genen bzw. mit Gengruppen zu denen signifikant regulierte Gene zählen und Genen die nicht signifikant reguliert sind. Die kleinen Kästen neben den Genen zeigen das Expressionsprofil des Gens in der Reihenfolge Milz IFN(3h), Milz IFN(6h), Milz IFN(9h), Lunge IFN(3h), Lunge IFN(6h) und Lunge IFN(9h). Dabei steht ein roter Balken für eine Hoch- Regulation, ein grüner Balken für eine Herunter-Regulation. Die Pfeile zeigen die Natur der Beziehung. Gestrichelte Linien symbolisieren eine direkte oder indirekte Beziehung zwischen dem zentralen Gen und dem beeinflussten Gen, durchgehende Linien symbolisieren eine direkte Beziehung zwischen einem Gen und einem anderem. Legende siehe Abbildung 17.

123 Ergebnisse 108 Der Transporter Albumin (siehe Abbildung 20 und tabellarischer Anhang Tabelle 21 D) zählt zu den neu identifizierten IRGs und wurde ausschließlich drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α in der Lunge 10fach hoch reguliert. Die Regulation von Albumin sank anschließend auf eine 3fache Expression. Laut Ingenuity steht Albumin in Beziehung zu Genen, die zu den Zytokinen und Wachstumsfaktoren bzw. deren Rezeptoren gehören (IL-12, Il-1B, Il-6, Il-8, EDN1 (Endothelin 1), Mitglieder der TNF (Tumor Necrosis Factor) Familie, AGT (Angiotensinogen), TGFB1 (Transforming Growth Factor Beta 1) CCL13 (Chemokine (C-C motif) Ligand 13), CCL2 (Chemokine (C-C motif) Ligand 2), CCL5 (Chemokine (C-C motif) Ligand 5) und CX3CL1 (Chemokine C-X3-C motif) Ligand 1)), Transkriptionsfaktoren (HNF1A (HNF1 Homeobox A)) und Enzyme (HPSE (Heparanase), CYBA (Cytochrome B- 245, Alpha Polypeptide) und PTGS2 (Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2)). Von 26 Genen die mit Albumin in Zusammenhang gebracht werden können waren 8 nicht auf dem Array annotiert. Von den annotierten 18 Genen wurden 14 signifikant reguliert. Dabei zählten acht dieser Gene zu den allgemeinen IRGs und sechs zu den neu identifizierten IRGs. Insgesamt wurden neun der Gene hoch reguliert und vier herunter reguliert. Il-12B wurde in der Milz negativ reguliert und in der Lunge positiv reguliert. Fünf Gene waren ausschließlich in der Milz reguliert, zwei ausschließlich in der Lunge. Weitere sieben Gene waren in Milz und Lunge reguliert. Zusammenfassend ist aus dieser Art der Netzwerkanalyse zu sagen, dass die mit Ingenuity analysierten Gene in Beziehung mit vielen weiteren signifikant regulierten Genen treten können. Ein großer Teil dieser Gene gehört zu den Zytokinen, Chemokinen und deren Rezeptoren. Auch viele Enzyme, Peptidasen, Pathogen Erkennungsrezeptoren und Transkriptionsfaktoren werden von den upstream regulators beeinflusst. Dabei gibt es zahlreiche Überschneidungen dieser Gene aus den unterschiedlichen Analysen, insbesondere bei den Zytokinen und Chemokinen. Des Weiteren scheinen auch Gene, die ausschließlich in einem der beiden Organe stark reguliert sind, Einfluss auf Gene im jeweilig anderen Organ zu nehmen. Das neu identifizierte IRG Albumin kann mit zahlreichen neu identifizierten IRGs aber auch mit vielen allgemeinen IRGs in Zusammenhang gebracht werden. Ebenso wie Beziehungen zwischen PTX3, SFTPA1, Il-6 und Il-22, die zu den allgemeinen IRGs zählen und vielen neu identifizierten IRGs und allgemeinen IRGs gefunden werden konnten. Insgesamt unterstützen die durchgeführten Netzwerkanalysen die Erkenntnisse aus den anderen Analysen. Ein komplexer Zusammenhang zwischen den signifikant regulierten Genen in allen analysierten Organen verdeutlicht sich.

124 Ergebnisse 109 Abbildung 20 Netzwerkanalyse von Albumin Dargestellt ist die Wechselwirkung von Albumin mit anderen signifikant regulierten Genen bzw. mit Gengruppen zu denen signifikant regulierte Gene zählen und Genen die nicht signifikant reguliert sind. Die kleinen Kästen neben den Genen zeigen das Expressionsprofil des Gens in der Reihenfolge Milz IFN(3h), Milz IFN(6h), Milz IFN(9h), Lunge IFN(3h), Lunge IFN(6h) und Lunge IFN(9h). Dabei steht ein roter Balken für eine Hoch-Regulation, ein grüner Balken für eine Herunter-Regulation. Die Pfeile zeigen die Natur der Beziehung. Gestrichelte Linien symbolisieren eine direkte oder indirekte Beziehung zwischen dem zentralen Gen und dem beeinflussten Gen, durchgehende Linien symbolisieren eine direkte Beziehung zwischen einem Gen und einem anderem. Legende siehe Abbildung 17.

125 Ergebnisse Eingehende Betrachtung von Zytokinen und Chemokinen In den bisher durchgeführten Analysen war aufgefallen, dass viele Vertreter der Gruppe der Zytokine und der Chemokine nach IFN Injektion immer wieder in Erscheinung treten. Daher wurden diese beiden Gengruppen detailliert betrachtet. Tabelle 22 listet die auf dem Mikroarray annotierten und signifikant regulierten Zytokine und Chemokine. Bereits die MeV Analyse der verschiedenen Datensätze der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs hat Hinweise geliefert, dass bei den Zytokinen und Chemokinen bestimmte Expressionsprofile überwiegen. Um diesem Verdacht nachzugehen, wurden die Datensätze der signifikant regulierten Zytokine und Chemokine in Milz und Lunge alleine mit MeV analysiert.

126 Ergebnisse 111 Abbildung 21 Expressionsprofile der Zytokine und Chemokine nach IFN Injektion Dargestellt ist exemplarisch ein Gen jedes von MeV gefundenen Expressionsprofils der Zytokine und Chemokine über den Behandlungszeitraum in Milz und Lunge nach Injektion von rek ChIFN-α. Die y-achse zeigt die medianisierten Signalintensität jedes Gens, die von maximal -2 über 0 bis +2 reicht. Die x-achse zeigt die Tiergruppen.

127 Ergebnisse 112 Es zeigte sich, dass Zytokine und Chemokine nach IFN Injektion in Milz und Lunge in sieben Expressionsprofile eingeteilt werden können (Abbildung 21 und Tabelle 22). Expressionsprofil 1 wurden 12 Zytokinen und 4 Chemokine zugeordnet. Gene dieser Gruppe wurden sowohl in der Milz als auch in der Lunge drei Stunden nach IFN Injektion stark exprimiert. Sechs und neun Stunden nach IFN Behandlung wurden diese Gene schwächer oder gar nicht exprimiert. Zu dieser Gruppe zählen viele stark exprimierte Zytokinrezeptoren wie Il-1R2 (Interleukin-1 Receptor 2), Il-20RA (Interleukin-20 Receptor Alpha), CSF2RB (Colony Stimulating Factor, Beta), IFNAR1 (IFN-α Receptor 1) und das Mitglied der TNF- Rezeptor Superfamilie FAS. Neben FAS wurden auch andere Rezeptoren der TNF-Familie auf diese Weise exprimiert, wie TNFRSF1B (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily 1 Beta) und TNFRSF11B (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily 11 Beta, auch Osteoprotegerin). Die einzigen Zytokine, die Expressionsprofil 4 zugeordnet wurden sind Il-2 (Interleukin-2) und TNFAIP3 (Tumor Necrosis Factor, Alpha-Induced Protein 3). Unter den Chemokinen wurden CX3CL1 (Chemokine (C-X3-C motif) Ligand 1, auch Fractalkine), CCL20 (Chemokine (C-C motif) Ligand 20; auch MIP-3α (Macrophage Inflammatory Protein-3 alpha)), CCL5 (Chemokine (C-C motif) Ligand 5, auch RANTES (Regulated upon Activation Normal T-Cell Express Sequence)) und CCL17 (Chemokine (C-C motif) Ligand 17 auch TARC (Thymus and Activation Regulated Chemokine)) Expressionsprofil 4 zugeordnet. Expressionsprofil 2 enthält Zytokine und Chemokine, die in der Milz drei Stunden nach IFN Injektion ein erhöhtes Expressionsprofil aufwiesen, nach sechs und neun Stunden jedoch kaum oder gar nicht exprimiert wurden. Gene dieses Expressionsprofils wurden in der Lunge nicht reguliert. Zu diesem Expressionsprofil zählen 15 Zytokine und 3 Chemokine. Damit stellt es das Expressionsprofil mit den meisten Mitgliedern dar. Auf diese Weise werden unter anderem der BAFF-Rezeptor (B-Cell Activating Factor belonging to the TNF Receptor Family, auch TNFRSF13C), CTLA8 (Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Antigen 8, auch Il- 17), TNFSF15 (auch Vascular Endothelial Cell Growth Inhibitor), das CD40 Molekül als Teil der TNF-Rezeptor Superfamilie und IFNGR1 (IFN-γ Receptor 1) exprimiert. Expressionsprofil 3 enthält acht Zytokine und drei Chemokine. Gene, die dieses Expressionsprofil aufwiesen wurden in der Milz drei Stunden nach IFN Injektion stark und nach sechs und neun Stunden nicht exprimiert oder zeigten über die Behandlungszeit abnehmende Expressionswerte. In der Lunge hingegen waren die Gene nach drei Stunden nicht oder nur gering exprimiert und die Expression stieg über die Behandlungszeit an. Zu dieser Gruppe zählen die am stärksten regulierten Zytokine wie Il-6, Il-22, Il-1B und IFN-γ als Mediatoren einer zellulären Entzündungsantwort und CSF3 (Colony Stimulating Growht

128 Ergebnisse 113 Factor 3), das die Produktion, Differenzierung und Funktion von Granulozyten kontrolliert. Auch CCL4 (Chemokine (C-C motif) Ligand 4, MIP-1β (Macrophage Inflammatory Protein-1 Beta)) und K203 (Chicken Chemokine (C-C motif) Ligand Inflammatory 3), die am stärksten regulierten Chemokine, zählen zu dieser Gruppe. Expressionsprofil 4 enthält einen Zytokinrezeptor, CSF2RA (Colony Stimulating Factor 2 Receptor, alpha) und zwei Chemokine, CCL19 (Chemokine (C-C motif) Ligand 19, auch MIP-3β (Macrophage Inflammatory Protein-3 beta) und CCR2 (Chemokine (C-C motif) Receptor 2), die in Milz und Lunge über die Behandlungszeit ein relativ konstantes Expressionsmuster zeigten. Zwei Chemokine, ah221(chicken Chemokine ah221) und CXCL13 (Chemokine (C-x-C motif) Ligand 13, auch BCA-1 (B-Cell Attractant Chemokine), zeigten sowohl in der Milz, als auch in der Lunge ein ansteigendes Expressionsprofil und wurden daher Gruppe 5 zugeordnet. Drei Zytokine und drei Chemokine wurden Expressionsprofil 6 zugeordnet. Diese Gene zeigten ausschließlich in der Lunge ein erhöhtes Expressionsprofil und wurden dabei in der Milz nicht, oder nur schwach vermindert oder nach sechs und neun Stunden schwach erhöht exprimiert. Hierzu zählen unter den Zytokinen TNFRSF1A (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily 1 Alpha, auch TNF Receptor Type I), BAFF (B-Cell Activating Factor belonging to the TNF Family, auch TNFSF13B (Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily 13B)) und Il-12B (Interleukin-12 Beta). Außerdem wurden die Chemokinrezeptoren Il-8RB (Interleukin- 8 Receptor Beta, auch CXCLi2 Receptor) und CCR7 (Chemokine (C-C motif) Receptor 7) Expressionsprofil 5 zugeordnet. Fünf Chemokine, XCL1 (Chemokine (C motif) Ligand 1, auch Lymphotactin), sein Rezeptor XCR1 (Chemokine (C motif) Receptor 1), CCR6 (Chemokine (C-C motif) Receptor 6), CXCL12 (Chemokine (C-X-X motif) Ligand 12, auch SDF-1 (Stromal Cell Derived Factor-1)) und CX3CR1 (Chemokine (C-X3-C motif) Receptor 1, auch Fractalkine Receptor), zwei Zytokine (Il-7 und TRAIL (TNF-Related Apoptosis Induced Ligand-like, auch TNFSF10) und drei Zytokinrezeptoren (Il-11RA (Interleukin-11 Receptor Alpha), Il-12RB (Interleukin-12 Receptor Beta) und Il-28RA (IFN-λ Receptor 1) wurden in der Milz drei Stunden nach IFN Behandlung herunter reguliert und in der Lunge zu keinem Zeitpunkt reguliert und wurden daher Expressionsprofil 7 zugeordnet. Zuletzt gab es unter den Zytokinen vier Gene, und unter den Chemokinen ein Gen, CCR5 (Chemokine (C-C motif) Receptor 5), die nicht drei Stunden nach IFN Injektion exprimiert wurden, jedoch nach sechs und/oder neun Stunden in Milz und/oder Lunge schwach

129 Ergebnisse 114 exprimiert wurden, zudem einen Chemokinrezeptor, CXCR7 (Chemokine (C-X-X motif) Receptor 7), der ausschließlich in der Lunge schwach herunter reguliert wurde und CCL21 (Chemokine (C-C motif)ligand 21, auch Exodus-2), das in der Lunge konstant exprimiert wurde und in der Milz nach sechs und neun Stunden schwach exprimiert wurde. Die Expressionswerte dieser Gene waren jedoch zu niedrig um von MeV ein eigenes Expressionsprofil zugewiesen zu bekommen. Zusammenfassend bestätigt sich bei näherer Betrachtung der in den anderen Analysen gewonnene Eindruck, dass viele Zytokine und Chemokine nach Injektion von rek ChIFN-α stark exprimiert wurden. Von 85 auf dem Mikroarray annotierten Zytokinen und Rezeptoren wurden nach Injektion von rek ChIFN-α 48 Gene signifikant reguliert. Der überwiegende Anteil der Zytokine wurde drei Stunden nach IFN Injektion hoch reguliert. Von den Chemokinen und deren Rezeptoren wurden von 30 auf dem Mikroarray annotierten Genen nach IFN Injektion 25 signifikant reguliert, davon 24 drei Stunden nach IFN Injektion. Von diesen 24 Chemokinen konnten 9 den allgemeinen IRGs zugeordnet werden und 15 den neu identifizierten IRGs. Wiederum wurde ein Großteil der Chemokine nach IFN Injektion hoch reguliert. Die Zytokin- und Chemokin Expression in Milz und Lunge nach Injektion von rek ChIFN-α zeigte sich über die Behandlungsdauer in 7 Expressionsprofilen. Dabei konnten mit 15 Zytokinen am meisten Zytokine in Expressionsprofil Gruppe 2 gefunden werden, gefolgt von Expressionsprofil Gruppe 1 mit 12 Zytokinen. Mit 5 Chemokinen konnten die meisten Chemokine in Expressionsprofil Gruppe 7 gefunden werden, wobei insgesamt alle Expressionsprofile der Chemokine eine ähnliche Anzahl an Mitgliedern aufwiesen. Tabelle 13 Anzahl an Zytokinen und Chemokinen in den Expressionsprofilen Expressionsprofil Gruppe Zytokine Chemokine

130 Ergebnisse Verifizierung ausgewählter Gene in der qrt-pcr Um zu überprüfen, ob die mit dem Mikroarray ermittelten Genexpressionsdaten korrekt sind, wurde von drei ausgewählten Genen die Genexpression mittels qrt-pcr bestimmt (siehe Abbildung 22). Abbildung 22 Validierung ausgewählter Gene mit qrt-pcr Dargestellt ist der Verlauf des Fold Change (FC) für die angegebenen Gene nach Mikroarray und qrt-pcr Analyse, errechnet aus den Expressionswerten der drei mit rek ChIFN-α behandelten Tiergruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigte sich, dass die FC-Werte der drei analysierten Gene nach Mikroarray Analyse und qrt-pcr Analyse einander sehr ähnlich waren. Il-6 wurde in der Milz drei Stunden nach IFN Injektion hoch exprimiert, nach sechs und neun Stunden jedoch nur vergleichsweise gering. In der Lunge hingegen war nach drei und sechs Stunden wenig Il-6 mrna zu finden, nach neun Stunden wurde es aber hoch exprimiert. Dies war sowohl nach Mikroarray Analyse, als auch nach qrt-pcr Analyse zu sehen. Auch bei dem Gen Mx-1 korrelierten die FC Werte nach Mikroarray Analyse und qrt-pcr Analyse sehr gut. In der Milz war Mx-1 drei Stunden nach IFN Injektion etwas höher exprimiert als nach sechs und neun Stunden. In der Lunge blieb die Mx-1 Expression in allen Gruppen auf einer ähnlichen Höhe. Ein ähnliches Ergebnis zeigte auch die Vergleichsmessung des Gens PKR.

131 Il-6 [ng/ml Plasma] Ergebnisse 116 Zusammenfassend kann vermerkt werden, dass die qrt-pcr Analyse die Mikroarray Daten absolut bestätigt hat und somit die im Mikroarray ermittelten Expressionsdaten zuverlässige Aussagen über den Genexpressionsverlauf zulassen Messung von Interleukin-6 Protein im Plasma Transkriptom Daten liefern nur Informationen über eine erhöhte oder reduzierte Menge von mrna, nicht aber über das Vorhandensein von funktionellem Protein. Dennoch ist das Wissen über Veränderungen im Transkriptom wichtige Grundlagenforschung und liefert Hinweise, welche Gene möglicherweise auch auf Protein Ebene eine wichtige Rolle spielen. Il-6 ist ein bekanntes IRG, welches durch alle drei Typen von IFNs induziert wird. Es scheint sehr interessant nach Behandlung mit rek ChIFN-α mehr über Il-6 auf Protein Ebene zu erfahren. Il-6 ist auf Genexpressionsebene in der Milz und in der Lunge nach Injektion von rek ChIFN-α stark hoch reguliert, wie Abbildung 22 zeigt. Durch die Verfügbarkeit eines Nachweistests konnte im Plasma der Gehalt von Il-6 Protein nach Behandlung mit rek ChIFN-α bestimmt werden (siehe Abbildung 23). 200 Abbildung 23 Interleukin-6 Protein im Plasma nach IFN Injektion Kontrolle IFN(3h) IFN(6h) IFN(9h) Dargestellt ist der Plasmagehalt an Il-6 Protein der verschiedenen Tiergruppen nach Behandlung mit rek ChIFN-α (n =6). Die Messung wurde mit dem 7TD1-Bioassy durchgeführt. Dargestellt sind die Werte der Einzeltiere sowie die Mittelwerte der jeweiligen Gruppe. Es konnte gezeigt werden, dass drei Stunden nach IFN Applikation durchschnittlich 144ng/ml im Plasma zu messen waren. Sechs Stunden nach IFN Applikation konnte im Mittel noch 9ng/ml im Plasma detektiert werden, während die Werte nach neun Stunden auf das Niveau der Kontrollgruppe abgefallen waren. Insgesamt ist zu sagen, dass nach Behandlung mit rek ChIFN-α neben der Geninduktion von Il-6 auch Il-6 Protein gebildet wird. Dabei korrelieren die Il-6 Proteinexpression im Plasma und die Il-6 Genexpression in der Milz sehr gut miteinander.

132 ChIFN- [Units/ml] Ergebnisse Behandlung mit Newcastle Disease Virus Um die IFN-Antwort des Haushuhns auch im Verlauf einer viralen Infektion zu analysieren wurden Hühner intratracheal mit NDV infiziert. Dabei wurde der lentogene Impfstamm NDV La Sota Avipro ND 131 gewählt, da er als potenter IFN Induktor bekannt ist NDV Infektion Vier Tiere erhielten intratracheal 1x10 8 EID NDV, vier Kontrolltiere erhielten PBS. Nach 16 Stunden wurde den Tieren Blut zur Plasmagewinnung, sowie Milz und Lunge für die Analysen entnommen. Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, da aufgrund von Vorversuchen [339] zu diesem Zeitpunkt eine zur Behandlung mit rek ChIFN-α vergleichbare IFN Konzentration im Plasma zu erwarten war. 200 Abbildung 24 Typ I IFN Plasmaspiegel 16h p.i. nach NDV Infektion NDV infizierten Tieren und einer Kontrollgruppe (n =4) wurde 16 Stunden nach NDV Infektion Blut zur Plasmagewinnung entnommen und der Gehalt an Typ I IFN im IFN Reporterassay gemessen. Dargestellt sind die Werte der Einzeltiere, sowie die Mittelwerte der jeweiligen Gruppe. 0 Kontrolle NDV Die Bestimmung des IFN Gehalts im Plasma (siehe Abbildung 24) ergab, dass im Plasma der NDV infizierten Tiere im Mittel 122 Units/ml Typ I IFN detektierbar waren, während das Plasma der Kontrollgruppe kein messbares Typ I IFN enthielt. Damit sind im Plasma der NDV infizierten Tiere vergleichbare Mengen an Typ I IFN messbar wie drei Stunden nach intravenöser Injektion von rek ChIFN-α (150 Units/ml) Makroskopische Veränderungen der Lunge nach NDV Infektion Nach intratrachealer Applikation von lentogenem NDV zeigten sich in der Lunge beidseitig kaudoventral makroskopisch veränderte Bereiche (Abbildung 25 B). Die Veränderungen äußerten sich in landkartenähnlich begrenzten, dunkelroten Herden. Der Primärbronchus der infizierten Tiere war in diesem Bereich verdickt und die Lungenränder waren kaudoventral abgerundet. Die gesamte Lunge erschien ödematös. Trotz dieser Veränderungen in der Lunge waren die Hühner klinisch unauffällig.

133 Ergebnisse 118 Abbildung 25 Makroskopische Veränderungen der Lungen nach NDV Infektion Gesunde Hühnerlunge (A) und nach intratrachealer Infektion mit NDV veränderte Hühnerlunge (B). Von links nach rechts sind jeweils eine Hühnerlunge von dorsal, die linke Lungenhälfte von lateral und die vorletzte Lungenscheibe (Torus intercostalis) der linken Lunge im Transversalschnitt dargestellt. Die abgegrenzten Veränderungen sind durch Pfeile gekennzeichnet. Aufgrund der kaudoventral lokalisierten Veränderungen wurden zur RNA Isolation aus der Lunge der infizierten Tiere jeweils zwei Lungenanteile, NDV (A), als verändertes, alteriertes Lungengewebe und NDV(U), als unverändertes Lungengewebe, aus der vorletzten Lungenscheibe (Torus intercostalis) entnommen und getrennt analysiert (siehe Abbildung 26). Abbildung 26 Probenentnahme für die RNA Isolation nach NDV Infektion Den infizierten Tieren wurde der rot umrandete, ventrale, alterierte Anteil (NDV(A)) und der blau umrandete, dorsomedial des Hauptbronchus gelegene, unveränderte Anteil (NDV(U)) für die RNA Isolation entnommen. Den Kontrolltieren wurde der grün markierte, ventral des Hauptbronchus gelegene Anteil entnommen.

134 Ergebnisse 119 Von den Kontrolltieren wurden auch die ventral des Hauptbronchus gelegenen Lungenanteile isoliert (K). Analog zur Probenentnahme nach Injektion von rek ChIFN-α wurde darauf geachtet, dass um den Primärbronchus gelegene BALT auszusparen, da dieses durch seine andere Zellzusammensetzung die Genexpression ungewollt beeinflussen könnte (siehe Abbildung 4) Charakterisierung der nach NDV Infektion makroskopisch veränderten Lungen Um die Zellzusammensetzung der makroskopisch veränderten Lungen nach NDV Infektion näher zu charakterisieren, wurden die Lungen NDV infizierter Tiere und Kontrolltiere histologisch und durchflusszytometrisch analysiert Histologische Charakterisierung der Lungen Für die histologische Untersuchung wurden Paraffin- und Gefrierschnitte der Lungen infizierter und nicht infizierter Tiere angefertigt. A B Abbildung 27 HE-Färbung der Lunge nach NDV Infektion Paraffinschnitte der Lungen nicht infizierter (A) und NDV infizierter Tiere (B) wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Der Pfeil weist auf ein Ödem des Bindegewebes der Sekundär- bzw. Parabronchien. (2,5fache Vergrößerung) Die HE Färbung der Paraffinschnitte zeigte, dass die makroskopisch sichtbaren Veränderungen nach NDV Infektion auch auf mikroskopischer Ebene deutlich sichtbar sind (siehe Abbildung 27). Die Lungen nicht infizierter Tiere wiesen viel belüftetes Lungengewebe auf, das umliegende Stroma erschien nicht verdichtet (Abbildung 27 A). Lungenstrukturen wie Primär-, Sekundär- und Parabronchien waren klar identifizierbar. In

135 Ergebnisse 120 den Lungengefäßen befanden sich kernhaltige Zellen, ein Artefakt, das auf der Tötung durch Blutentzug beruht. Das Lungengewebe infizierter Tiere hingegen zeigte sich stark verdichtet und um die Sekundärbronchien und die in reduzierter Zahl identifizierbaren Parabronchien befanden sich eine große Anzahl Zellen. Die Sekundär- und Parabronchien ließen sich durch ein Ödem des Bindegewebes klar abgrenzen. Die Anordnung dieser Zellen erschien organisiert um die verbliebenen Bronchien und ähnelte induzierten BALT Strukturen. Für eine nähere Charakterisierung der Zellen wurden mit Gefrierschnitten infizierter und nicht infizierter Lungen immunhistochemische Färbungen durchgeführt (siehe Abbildung 28). Diese bestätigten, dass in den Lungen infizierter Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren massive Zellansammlungen zu finden waren und nur wenig belüftetes Lungengewebe sichtbar war. Beim Hauptteil der Zellen handelte es sich um Leukozyten (CD45 positiv). Ein großer Teil der Zellen waren zytotoxische T-Zellen (CD8 positiv) oder mit KUL01 anfärbbare myeolide Zellen (Makrophagen) und möglicherweise Dendritische Zellen. CD4 positive T- Helferzellen wurden ebenso wie T-Lymphozyten (TCR ) und B-Lymphozyten (chb6) nur wenige gefunden. Interessanterweise waren in den Zellansammlungen auch nur wenige Granulozyten (GRL1 positiv) zu finden. Zusammenfassend konnten in der histologischen Untersuchung der Lunge NDV infizierter Tiere starke Gewebeverdichtungen und Ansammlungen von Leukozyten, die zum Großteil aus zytotoxischen T-Lymphozyten und Makrophagen bestehen, gefunden werden.

136 Ergebnisse 121 A B

137 Ergebnisse 122 Abbildung 28 Immunhistologische Charakterisierung der Lungen nach NDV Infektion Gefrierschnitte der Lungen von Kontrolltieren (A) und NDV infizierter Tieren (B) wurden mit den angegebenen Antikörpern immunhistologisch gefärbt. (20fache Vergrößerung)

138 Ergebnisse Durchflusszytometrische Charakterisierung der Lungen Neben der histologischen Untersuchung wurde die Zellzusammensetzung der Lungen nach NDV Infektion auch durchflusszytometrisch analysiert. Hierfür wurden die Lungen von NDV infizierten Tieren und Kontrolltieren entnommen, die Leukozyten isoliert und nach einer lebend-tot Färbung mit Trypan Blau die Anzahl lebender Zellen gezählt. Die Zählung der lebenden Zellen ergab durchschnittlich 1,7x10 7 (+/- 6x10 6 ) Zellen pro ml Suspension in den Lungen der Kontrolltiere und 3,6x10 7 (+/- 1x10 7 ) Zellen pro ml Suspension in den Lungen der infizierten Tiere. In der durchflusszytometrischen Messung konnte man feststellen, dass in den Lungen NDV infizierter Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren alleine innerhalb der Leukozytenpopulation der Prozentsatz der αβ T-Lymphozyten (TCR2 positiv) von etwa 34% in den Kontrolltieren auf etwa 44% in den infizierten Tieren zunahm, wobei sich gleichzeitig der Anteil an γβ T-Lymphozyten (TCR1 positiv) in den infizierten Tieren hoch signifikant von 37% in den Kontrolltieren auf 22% in den infizierten Tieren verringerte (siehe Abbildung 29 A). Des Weiteren stieg der Anteil an Granulozyten (GRL2 positiv) nach NDV Infektion hoch signifikant an. Der Anteil an myeloiden Zellen (KUL01 positiv) stieg nach NDV Infektion nicht an, allerdings könnten diese bei der Gewebepräparation verloren gegangen sein. Es konnte keine Veränderung der B-Lymphozyten Subpopulationen (AV20 positiv), weiteren antigenpräsentierenden Zellen (MHCII positiv, AV20 negativ) und NK-Zellen (CD56 positiv) festgestellt werden. Innerhalb der αβ T-Lymphozyten Population (CD4 positiv bzw. CD8positiv) konnte nach NDV Infektion eine Zunahme der CD8 positiven T- Lymphozyten festgestellt werden (siehe Abbildung 29 B).

139 Ergebnisse 124 NDV infiziert Kontrolle Abbildung 29 Durchflusszytometrische Charakterisierung der Lungen nach NDV Infektion Dargestellt sind der Anteil der jeweiligen Zellpopulationen an der Gesamtheit der CD45 positiven Zellen (A) und T-Lymphozyten (B), die mit den angegebenen Antikörpern detektierbar waren. GRL2 wurde an lebenden Zellen angewandt. (**p 0,01, *p 0,05. Students T-Test) Zusammenfassend bestätigt die durchflusszytometrische Analyse die Erkenntnisse aus der histologischen Untersuchung dahingehend, dass die Zahl der Leukozyten im NDV infizierten Lungengewebe zunahm, die sich nach weiterer Spezifizierung als zytotoxische αβ-tcr exprimierende CD8 positive T-Lymphozyten und Granulozyten darstellten.

140 Ergebnisse Mikroarray Experiment nach Infektion mit NDV Das Transkriptom von Lunge und Milz nach NDV Infektion sollte mit dem nach Behandlung mit rek ChIFN-α verglichen werden. Dafür wurde die RNA der Milz der infizierten Tiere (Milz NDV ) und der Kontrolltiere (Milz K ) und die RNA der in Abbildung 26 beschriebenen Lungenareale isoliert. Analog dem Mikroarray Experiment nach Injektion von rek ChIFN-α erfolgte die Hybridisierung der RNA-Proben auf dem customized chicken Agilent 4x44k Array. Die Hybridisierung einer Milzprobe der Kontrollgruppe misslang, daher konnten von dieser Gruppe nur drei Proben analysiert werden Heat Map Gruppenanalyse nach Infektion mit NDV Zunächst wurden die Mikroarraydaten mit dem Programm R (Version The R Foundation for Statistical Comuting) normalisiert und mit dem Bioconductor Paket Genplotter in einer Heat Map mit einem distance plot graphisch dargestellt. Der Vergleich der Signalintensitäten der analysierten Mikroarrays ist in Abbildung 30 dargestellt. A B Abbildung 30 Heat Map Darstellung von Milz und Lunge nach NDV Infektion Diese Darstellung wurde mit dem R Paket Genplotter (Version ) angefertigt. Die Signalintensitäten der einzelnen Mikroarrays der Milz (A) und der Lunge (B) wurden miteinander verglichen. Der Grad der Homologie der Proben wird in Farbstufen wiedergespiegelt, die von Rot bis Blau reichen. Sehr ähnliche Proben sind rot, unterschiedliche Proben blau. Das Dendrogramm zeigt die verwandtschaftliche Beziehung zwischen den Proben. Die Proben sind nach Gruppenzugehörigkeit benannt, gefolgt von der jeweiligen Tiernummer (T1-4).

141 Ergebnisse 126 Es zeigte sich, dass nach NDV Infektion die Genexpressionsmuster der einzelnen Proben innerhalb der verschiedenen Tiergruppen sehr homogen waren. Alle analysierten Proben wurden vom Programm R alleine aufgrund ihrer Genexpressionsmuster der Gruppe zugeordnet, der sie angehören - ein entscheidendes Kriterium dieser Analyse. Zwar wiesen in der Milz Kontroll- und NDV Proben ein recht ähnliches Genexpressionsmuster auf, das Dendrogramm zeigte jedoch, dass die Kontrollgruppen einer Genexpressionsgruppe zugeordnet wurden und drei der NDV infizierten Proben (T1, T2 und T4) in eine separate Genexpressionsgruppe fielen. Die Probe T3 aus der NDV infizierten Gruppe zeigte hingegen ein von den anderen infizierten Tieren leicht abweichendes Genexpressionsmuster. In der Lunge zeigten alle Tiergruppen innerhalb ihrer Gruppe ein sehr ähnliches Genexpressionsmuster, waren aber deutlich voneinander abgrenzbar. Dabei waren sich die Genexpressionsmuster der Gruppen NDV(U) und Kontrolle (K) verwandtschaftlich näher als der deutlich abgegrenzten und dem veränderten Gewebe entsprechenden Gruppe NDV(A). Dies spiegelt sich einerseits in der Farbverteilung, andererseits im Dendrogramm wider. Zusammenfassend zeigte die Heat Map Darstellung, dass die Gruppen sich eindeutig voneinander abgrenzen lassen. Dabei unterschieden sich insbesondere die Genexpressionsmuster der veränderten und unveränderten Lungenanteile beträchtlich, während die Genexpressionsmuster der in der Milz analysierten Gruppen und der unveränderten Lungenareale der infizierten Tiere und der Kontrolltiere einander ähnlicher waren. Damit erlaubt das Ergebnis weiterführende Analysen der Daten aus dem Mikroarray Experiment nach NDV Infektion Identifizierung signifikant regulierter Gene nach NDV Infektion Um signifikant regulierte Gene zu identifizieren, wurde eine SAM (significance analysis of microarrays) single class, unpaired Analyse durchgeführt. Dabei wurden folgende Vergleiche durchgeführt: Milz NDV vs K, Lunge NDV(A) vs Kontrolle, Lunge NDV(A) vs NDV(U)) und Lunge NDV(U) vs K. Hieraus wurden die Expressionsunterschiede (fold change (FC)) errechnet, wobei ein Spot mit einer FDR von kleiner als 5% und einer mindestens 2fachen Hoch oder Herunter-Regulation als signifikant reguliert beurteilt wurde. Tabelle 14 zeigt die Anzahl der signifikant regulierten Gene in den genannten Gruppenvergleichen. Bei Genen, die mehrmals auf dem Mikroarray zu finden sind, wurde der Mittelwert des FCs der einzelnen Spots errechnet.

142 Ergebnisse 127 Tabelle 14 Signifikant regulierte Gene in Milz und Lunge nach NDV Infektion Gelistet ist die Anzahl signifikant regulierter Gene nach Infektion mit NDV (FDR<5%, FC mindestens +/-2). In der Milz wurde der Expressionsunterschied von infizierten Tieren mit nicht infizierten Tieren verglichen. Die verschiedenen Vergleiche in der Lunge beziehen sich auf den Genexpressionsunterschied zwischen unverändertem Lungengewebe der infizierten Tiere zur Kontrollgruppe (NDV(U) vs K), dem veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere zur Kontrollgruppe (NDV(A) vs K) und dem veränderten Lungengewebe zum unveränderten Lungengewebe infizierter Tiere (NDV(A) vs NDV(U)). (+) bedeutet, dass ein Gen in der erstgenannten Gruppe im Vergleich zur zweitgenannten hoch reguliert wurde, (-) bedeutet, dass ein Gen in der erstgenannten Gruppe im Vergleich zur zweitgenannten herunter reguliert wurde. Anzahl der Gene Milz NDV vs K NDV(U) vs K Lunge NDV(A) vs K NDV(A) vs NDV(U) Die Analyse ergab, dass durch die NDV Infektion in Lunge und in Milz zahlreiche Gene signifikant reguliert wurden. In der Milz und im unveränderten Lungengewebe infizierter Tiere fanden sich ausschließlich hoch regulierte Gene im Vergleich zum Kontrollgewebe, im veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere waren sowohl im Vergleich zum Kontrollgewebe, als auch im Vergleich zum unveränderten Lungengewebe über Gene jeweils hoch oder herunter reguliert. Dieses Ergebnis spiegelte die Genexpressionsmuster der Heat Map wider, bei der bereits deutlich voneinander abweichende Genexpressionsmuster zwischen dem veränderten Lungengewebe und dem unveränderten Lungengewebe der infizierten Tiere bzw. dem Kontrollgewebe sichtbar waren. Auch die vergleichsweise geringe Anzahl signifikant regulierter Gene in der Milz und im unveränderten Lungengewebe der infizierten Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren bestätigte das Ergebnis der Heat Map Analyse, da die Signalintensitäten dieser Gruppen sich nur zu einem geringen Grad unterschieden. Eine Liste aller signifikant regulierten Gene ist auf der beiliegenden CD in Mappe 2, Tabelle 57 zu finden.

143 fold change Ergebnisse Verifizierung ausgewählter Gene in der qrt-pcr Auch nach NDV Infektion sollten die Expressionswerte einiger im Mikroarray signifikant regulierter Gene mittels qrt-pcr verifiziert werden. Hierfür wurden Il-6, CD40, Mx-1 und TLR21 als Beispiele für hoch regulierte Gene und TLR5 und TFRC (Transferrin Receptor (p90, CD71)) als Beispiele für herunter regulierte Gene ausgewählt (siehe Abbildung 31) TLR21 cd40 PKR Mx-1 Il-6 TLR5 TFRC qrt-pcr Mikroarray Abbildung 31 qrt-pcr Validierung ausgewählter Gene nach NDV Infektion Dargestellt sind die FC Werte und die Standardabweichung nach Mikroarray und qrt-pcr Analyse, errechnet aus den Expressionswerten des veränderten Lungengewebes der NDV infizierten Tiere Vergleich zur Kontrollgruppe. Wie bei der Überprüfung der FC-Werte nach Injektion von rek ChIFN-α zeigte auch die Kontrolle der FC Werte der in der qrt-pcr gemessenen Gene, dass die Ergebnisse aus dem Mikroarray Experiment und nach qrt-pcr Messung gut miteinander vergleichbar sind und dies sowohl für die hoch regulierten Gene, als auch für die herunter regulierten Gene gilt. Einzig Il-6 zeigte im Mikroarray mit einer 73fachen Hoch-Regulation und in der qrt-pcr mit einer 139fachen Hoch-Regulation einen 1,9fachen Expressionsunterschied Vergleichende Betrachtung der signifikant regulierten Gene nach NDV Infektion Vergleich des Lungengewebes Um das Genexpressionsverhalten nach NDV Infektion in den analysierten Lungenarealen besser beurteilen zu können, wurden die in der Lunge signifikant regulierten Gene miteinander verglichen und das Ergebnis in einem Venn-Diagramm dargestellt (siehe Abbildung 32).

144 Ergebnisse 129 Abbildung 32 Genexpression in der Lunge nach NDV Infektion Dargestellt ist die Anzahl signifikant regulierter Gene nach Vergleich der Genexpression in den diversen Lungenarealen nach NDV Infektion. Überschneidungen der Kreise entsprechen Schnittmengen an Genen. Die Zahlen geben die Anzahl von Genen innerhalb der Schnittmengen an. Wie das Venn Diagramm zeigt, gab es innerhalb der analysierten Lungenareale Überschneidungen in der Genexpression. So konnten 44 Gene gefunden werden die in allen analysierten Datensätzen signifikant reguliert wurden. Außerdem gab es Gene die sowohl im veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere im Vergleich zum Kontrollgewebe signifikant reguliert wurden, als auch im Vergleich zum unveränderten Lungengewebe der infizierten Tiere. Im unveränderten Lungengewebe der infizierten Tiere konnten 9 exklusiv regulierte Gene gefunden werden und lediglich weitere 11 Gene waren gemeinsam mit dem veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere reguliert. In den Vergleichen NDV (A) vs K und NDV (A) vs NDV (U) wurden exklusiv 900 bzw. knapp 800 Gene gefunden. Eine Liste der aufgeführten Genüberschneidungen in der Lunge ist auf beiliegender CD in Mappe 2, Tabelle 58 zu finden. Vergleich des Lungen- und Milzgewebes Verglich man die in der Lunge signifikant regulierten Gene mit den signifikant regulierten im Milzgewebe konnten 34 Gene identifiziert werden, die ebenfalls in allen analysierten Vergleichen in der Lunge reguliert wurden. Weitere 40 Gene waren sowohl in der infizierten Milz als auch im veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere, sowohl im Vergleich zum

145 Ergebnisse 130 Kontrollgewebe, als auch im Vergleich zum unveränderten Lungengewebe der infizierten Tiere signifikant reguliert. Neun Gene wurden im Milzgewebe und im unveränderten und veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere im Vergleich zum Kontrollgewebe gemeinsam hoch reguliert und 18 Gene gemeinsam mit dem veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere im Vergleich zum Kontrollgewebe. Zwei Gene wurden gefunden die zwischen Milzgewebe und verändertem Lungengewebe im Vergleich zum unveränderten Lungengewebe differentiell exprimiert wurden. Schließlich wurden 8 Gene ausschließlich in der Milz reguliert. Eine Liste der aufgeführten Genüberschneidungen von Milz und Lunge ist auf beiliegender CD in Mappe 2, Tabelle 59 zu finden. Signifikant regulierte Gene in der Milz In der Milz waren nach NDV Infektion 113 Gene hoch reguliert. Nur acht dieser Gene waren ausschließlich in der Milz reguliert. Von diesen zählen zwei zu den allgemeinen IRGs, wobei CSF3R (Colony Stimulating Growth Factor 3 Receptor) auch nach IFN Injektion reguliert wurde, nicht aber TFPI2 (Tissue Factor Pathway Inhibitor). Die meisten der stark hoch regulierten Gene wurden auch in allen Lungenanteilen stark exprimiert (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 23 A). Darunter waren viele allgemeine IRGs, wie MX-1, OASL, IFIT-5 (Interferon-Induced Protein with Tetratricopeptide Repeat 5) und USP18 (Ubiquitin Specific Peptidase 18), aber auch zahlreiche neu identifizierten IRGs wie mdvn106_g10, LYG2 (Lysozym G-like 2) und OSBPLA1A (Oxysterol Binding Protein-Like 1A). Das am stärksten exprimierte Gen war OASL, das eine 18fache Hoch-Regulation zeigte und damit sogar stärker exprimiert war, als in der Lunge. Alle außer acht Gene waren auch nach IFN Injektion reguliert. Vergleicht man die Gewebeexpression von Genen nach NDV Infektion mit der nach IFN Injektion, fällt auf, dass ein Großteil der Gene in beiden Experimenten in Milz und Lunge exprimiert wurde (siehe Abbildung 33 A). Zehn der Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Lunge exprimiert wurden, wurden nach NDV Infektion in der Milz (und auch in der Lunge) exprimiert. Zehn weitere Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Milz exprimiert wurden, wurden auch nach NDV Infektion in der Milz gefunden, wobei acht von ihnen nach NDV Infektion auch in der Lunge exprimiert wurden. Zwei Gene, Twist 2 und GBP6 (Guanylat Binding Protein 6) wurden auch nach NDV Infektion ausschließlich in der Milz exprimiert (siehe beiliegende CD, Mappe 2, Tabelle 60 (Genexpression) und Tabelle 61 (Gewebevergleich))

146 Ergebnisse 131 Signifikant regulierte Gene in der Lunge Unverändertes Lungengewebe: In den unveränderten Lungenarealen der infizierten Tiere fanden sich im Vergleich zum Kontrollgewebe 66 signifikant hoch regulierte Gene (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 24). Von ihnen gehören 33 Gene zu den allgemeinen IRGs, wovon 30 auch nach Typ I IFN Injektion reguliert wurden. Weitere 21 Gene zählen zu den neu identifizierten IRGs und 12 konnten keiner dieser Gruppen zugeordnet werden. Interessanterweise ist das meist hoch regulierte Gen, UGT1A9 (UDP Glucoronyltransferase 1 Family, Polypeptide A9) eines der ausschließlich nach NDV Infektion regulierten Gene. Es wurde nur in der Lunge im unveränderten Gewebe exprimiert. Ein Großteil der Gene wurde auch im Milzgewebe signifikant exprimiert. Zahlreiche dieser Gene sind bekannt IRGs wie Mx-1, OASL, IFIT-5 und PKR. Vergleicht man die Gewebeexpression der Gene nach NDV Infektion und IFN Injektion wurden nach IFN Injektion in Milz und Lunge auch ein Großteil der Gene exprimiert. Mit Il-10 und CCL19 wurden auch jeweils ein Vertreter der Zytokine und Chemokine im unveränderten Lungengewebe exprimiert. Drei Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Milz reguliert wurden, wurden nach NDV Infektion auch im unveränderten Lungengewebe exprimiert (siehe Abbildung 33 B). Weitere drei Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Lunge reguliert wurden, wurden auch im unveränderten Lungengewebe exprimiert. Diese Gene, RGS6 (Regulator of G-Protein Signaling 6), HMGA2 (High Mobility Group AT-hook 2) und EDNRB (Endothelin Receptor Type B) wurden auch nach NDV Infektion ausschließlich im unveränderten Lungengewebe reguliert (siehe beiliegende CD, Mappe 2, Tabelle 62 (Genexpression) und Tabelle 63 (Gewebevergleich)). Verändertes Lungengewebe: Von den im veränderten Lungengewebe signifikant regulierten Genen war ein Großteil sowohl im Vergleich zum Kontrollgewebe, als auch im Vergleich zum unveränderten Gewebe exprimiert (siehe beiliegende CD, Mappe 2, Tabelle 58). Andere Gene waren ausschließlich in einem dieser Vergleiche reguliert. Von diesen waren bei NDV (A) vs K nur 49 Gene (22 hoch und 26 herunter regulierte) und im Vergleich NDV (A) vs (U) nur 22 Gene (11 hoch und 11 herunter regulierte) mindestens 4fach hoch oder herunter reguliert. Eine Liste der in diesen Vergleichen exklusiv stark exprimierten Gene, findet sich auf beiliegender CD, Mappe 2, Tabelle 64. Da für eine genauere Betrachtung der Genexpression das Datenvolumen eingeschränkt werden musste, wurden folgende Untersuchung ausschließlich mit NDV (A) vs

147 Ergebnisse 132 K durchgeführt. Zwischen verändertem Lungengewebe der infizierten Tiere und Kontrollgewebe wurden Gene differentiell exprimiert (siehe beiliegende CD, Mappe 2, Tabelle 65). Mit Il-22 (FC 161), CCL19 (FC 81) und Il-6 (FC 74) waren die am stärksten hoch regulierten Gene Zytokine (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 23 B). Auch der Il-13RA2 ist mit einem FC von 40 stark exprimiert. Zudem findet sich das in allen Gruppen zu den 15 meist regulierten Gene gehörende mdvn106_g10 auch im veränderten Lungengewebe. Insgesamt zeigten die Gene im veränderten Lungengewebe wesentlich höhere Expressionswerte als im unveränderten Lungengewebe und in der Milz. Mehr als 40 Gene sind stärker hoch reguliert, als das am stärksten regulierte Gen (OASL) in der Milz. Etwa 30% der Gene wurden nach IFN Injektion ebenfalls signifikant reguliert. Etwa 1/8 der im veränderten Lungengewebe exprimierten Gene zählt zu den allgemeine IRGs, wobei weniger als die Hälfte auch nach IFN Injektion reguliert wurden. Vergleicht man die Gewebeexpression nach NDV Infektion und IFN Injektion (siehe Abbildung 33 C) fällt auf, dass 792 Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Milz reguliert wurden, nach NDV Injektion auch in der Lunge reguliert wurden. Weitere 243 Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Lunge reguliert wurden, wurden auch nach NDV Infektion in der Lunge exprimiert, könnten also möglicherweise lungenspezifisch exprimierte IRGs sein. Neun dieser Gene wurden nach NDV Infektion auch in der Milz hoch reguliert, darunter CXCL13L1, PSTA1 (Phosphoserine aminotransferase 1), der Trypsin Inhibitor CITI-1-like und das Interferon Induced Transmembrane Protein 1-like (siehe beiliegende CD, Mappe 2, Tabelle 66 (Expressionsdaten) und Tabelle 67 (Übersicht)).

148 Ergebnisse 133 A B C Abbildung 33 Vergleich der Gewebeexpression nach NDV Infektion und IFN Behandlung Die gewebespezifische Genexpression nach NDV Infektion im Vergleich zur IFN Injektion wurde in der Milz (A), unverändertem Lungengewebe (B) und verändertem Lungengewebe (C) in einem Venn Diagramm dargestellt. Überschneidungen der Kreise entsprechen Schnittmengen an Genen. Die Zahlen geben die Anzahl von Genen innerhalb der Schnittmengen an Insgesamt ist festzuhalten, dass nach NDV Infektion viele allgemeine IRGs und neu identifizierte IRGs, aber auch Gene die keiner dieser Gruppen zugeordnet werden konnten, in Milz und Lunge reguliert wurden. Zwischen Milz und dem unveränderten Lungengewebe überschneiden sich viele stark exprimierte Gene von denen fast alle bekannte allgemeine IRGs waren oder auch nach IFN Injektion reguliert wurden. Im veränderten Lungengewebe sind einige Zytokine stark exprimiert. Außerdem war die Genexpression im veränderten Lungengewebe stärker als in der Milz, zum einen hinsichtlich der Anzahl der signifikant regulierten Gene, zum anderen aber auch hinsichtlich der Expressionswerte. Vergleicht man die Gewebeexpression nach NDV Infektion und IFN Injektion, findet man viele Gene, die nach IFN Injektion ausschließlich in der Milz oder in der Lunge exprimiert wurden, nach NDV Infektion aber auch im jeweilig anderen Organ. Einige Gene jedoch, zeigen auch nach NDV Infektion eine gewebespezifische Expression.

149 Ergebnisse Funktionelle Analysen nach NDV Infektion Um eine bessere Aussage treffen zu können, an welchen Signalkaskaden und biologischen Prozessen die nach NDV Infektion regulierten Gene beteiligt waren, wurden die Gene mit Panther Gene List Analysis und KEGG Pathway Express untersucht. Funktionelle Gengruppen Analysen nach NDV Infektion (Gene Ontology) Die funktionelle Gengruppen Analyse (Gene Ontology) von signifikant regulierten Genen nach NDV Injektion wurde mit Panther Gene List Analysis durchgeführt. Analysiert wurden die in der Milz und im veränderten Lungengewebe hoch und herunter regulierten Gene (siehe Tabelle 15 und Abbildung 34) Zwischen 40 und 48% der signifikant regulierten Gene konnten von Panther analysiert werden. Die meisten funktionellen Gruppen konnten in allen Vergleichen gefunden werden. Einige funktionelle Untergruppen, die in der Lunge gefunden wurden, wurden in der Milz nicht gefunden. Allerdings wurden diesen Untergruppen auch in der Lunge nur einzelne Gene zugeordnet. In Cellular Component konnten in der Milz nur die Gruppen Extracellular region und Intracellular gefunden werden. Auffällig war, dass in der Milz ein wesentlich größerer Anteil an Genen in Response to stimulus und Immune System Process eingeteilt wurde, als in der Lunge. Hingegen wurden in der Lunge prozentual deutlich mehr Gene in Catalytic activity als in der Milz gefunden. Die meisten Gene fanden sich in Metabolic Process und Cellular Process. Cell adhesion stach dadurch ins Auge, dass in Milz und bei den herunter regulierten Genen in der Lunge anteilig viele Gene zu finden waren, während unter den hoch regulierten Genen in der Lunge nur ein kleiner Anteil dieser Gruppe zugeordnet wurde. Verglich man die funktionellen Gruppen der hoch und herunter regulierten Gene der Lunge, fiel auf, dass in Structural molecule activity, Cell communication und Cellular process anteilig mehr Gene bei den herunter regulierten Genen zu finden waren. Die Gene der in Tabelle 15 aufgeführten Gruppen finden sich auf beiliegender CD, Mappe 2 Tabelle 68.

150 Ergebnisse 135 Abbildung 34 Funktionelle Gruppen nach NDV Infektion Die nach NDV Infektion gefundenen funktionellen Gruppe und deren Untergruppen in der Milz und im veränderten Lungengewebe im Vergleich zur Kontrolle, als Kreisdiagramm (A) und die Legende (B). Zusammenfassend ist festzuhalten, dass nach NDV Infektion zwar in der Milz prozentual wesentlich mehr Gene in Immune System Process und Response to stimulus eingeteilt wurden, als im veränderten Lungengewebe, insgesamt aber nur sehr geringe GO Unterschiede feststellbar waren.

151 Ergebnisse 136 Tabelle 15 Funktionelle Gruppen nach NDV Infektion Gelistet sind die Anzahl der signifikant regulierten Gene nach NDV Infektion in der Milz und im veränderten Lungengewebe im Vergleich zum Kontrollgewebe und die Anzahl der von Panther Gene List Analysis identifizierten Gene. In der Lunge wurden die hoch (+) und herunter (-) regulierten Gene getrennt analysiert. Die analysierten Gruppen wurden in funktionelle Gruppen und mehrere Untergruppen eingeteilt, denen der offizielle GO Term beigefügt ist. Die Zahlen geben an, wieviele Gene in den funktionellen Untergruppen gefunden wurden, die Zahlen in Klammern geben deren prozentualen Anteil an der Gesamtzahl der gefundenen Gene wider. Funktionelle Gruppe Lunge + - Signifikant regulierte Gene Mit Panther gefundene Gene Funktionelle Untergruppe Molecular Function Ion channel activity (GO: ) 30 (3) 21 (2) 1 (2) Transporter activity (GO: ) 84 (9) 81 (9) 4 (7) Translation regulator activity (GO: ) 4 (0,5) 3 (0,5) - Transcription regulator activity (GO: ) 94 (10) 59 (6) 4 (7) Enzyme regulator activity (GO: ) 69 (7) 87 (9) 5 (9) Catalytic activity (GO: ) 302 (32) 301 (33) 13 (24) Motor activity (GO: ) 6 (0,5) 5 (0,5) - Receptor activity (GO: ) 110 (12) 126 (14) 6 (11) Antioxidant activity (GO: ) - 1 (0,1) - Structural molecule activity (GO: ) 84 (9) 129 (14) 5 (9) Binding (GO: ) 336 (35) 320 (35) 20 (37) Biological Process Cell communication (GO: ) 260 (27) 305 (33) 15 (28) Cellular process (GO: ) 361 (38) 413 (45) 19 (35) Localization (GO: ) 9 (1) 18 (2) 2 (4) Transport (GO: ) 189 (20) 195 (21) 9 (17) Cellular component organization (GO: ) 82 (9) 119 (13) 7 (13) Apoptosis (GO: ) 59 (6) 45 (5) 9 (5) System process (GO: ) 142 (15) 179 (19) 11 (20) Reproduction (GO: ) 52 (5) 53 (6) 4 (7) Response to stimulus (GO: ) 113 (12) 105 (11) 10 (19) Regulation of biological process (GO: ) 6 (0,5) 3 (0,3) - Homeostatic process (GO: ) 23 (2) 18 (2) 2 (4) Developmental process (GO: ) 187 (20) 228 (25) 16 (30) Generation of precursor metabolites and energy (GO: ) 19 (2) 26 (3) - Metabolic process (GO: ) 436 (46) 386 (42) 22 (41) Cell cycle (GO: ) 96 (10) 86 (9) 1 (2) Immune system process (GO: ) 158 (17) 164 (18) 14 (26) Cell adhesion (GO: ) 77 (8) 149 (16) 8 (19) Cellular Component Protein complex (GO: ) 7 (1) 8 (1) - Ribonucleoprotein complex (GO: ) 7 (1) 3 (0,3) - Extracellular region (GO: ) 34 (4) 77 (8) 7 (13) Plasma membrane (GO: ) 13 (1) 16 (2) - Intracellular (GO: ) 65 (7) 90 (9) 2 (4) Milz

152 Ergebnisse 137 Biologisch relevante Signalkaskaden nach NDV Infektion Neben der Einteilung in funktionelle Gruppen sollte auch untersucht werden, an welchen Signalkaskaden durch NDV Infektion induzierte Gene beteiligt sind. Daher wurden die zwischen veränderten Lungengewebe und Kontrollgewebe hoch und herunter regulierten Gene und die in der Milz differentiell exprimierten Gene mit KEGG pathway express analysiert. Dabei wurde ein corrected gamma p-value von kleiner als 0,5 als biologisch relevant angesehen. In der Lunge wurden 71 und in der Milz 22 biologisch relevante Signalwege gefunden (siehe beiliegende CD, Mappe 2, Tabelle 69 (Milz) und Tabelle 70 (Lunge). Um die Interferon Antwort nach NDV Infektion fokussiert zu betrachten, wurden die immunrelevanten Signalwege herausgesucht (siehe Tabelle 16). Es zeigte sich, dass 31 Signalwege, die bei einer Immunantwort von Bedeutung sind, in der Lunge biologisch relevant waren und nur 11 in der Milz. Zu den in der Lunge höchst relevanten zählten die Signalwege Leukocyte transendothelial migration, Cell adhesion molecules und Phosphatidyl inositol signaling system und damit wichtige Signalwege der Zellmigration und Zellkommunikation. Aber auch die Signalwege Cytokine-cytokine receptor interaction, Adherens junction und Focal adhesion sind als weitere wichtige Signalwege der Zellkommunikation mit Zytokinbeteiligung biologisch höchst relevant. Antigen processing and presentation ist ein weiterer alleine in der Lunge höchst relevant regulierter Signalweg. Damit sind in der Lunge zahlreiche Signalwege reguliert, die an vielen Schritten der angeborenen Immunantwort beteiligt sind. Hier wurden umfassende Signalwege zur Antigen Erkennung, zur Signaltransduktion, zur Zellantwort und sogar Signalwege, die eher zu einer adaptiven Immunantwort gehören, wie B-cell receptor interaction und FC epsilon RI signaling pathway, reguliert. Aber auch viele Signalwege, die etwas über die Art der Zellantwort aussagen, wie Regulation of autophagy, Natural Killer cell mediated cytotoxicity und Apoptosis und viele Signalwege der Zellkommunikation. Von den in der Lunge biologisch relevantesten Signalwegen, waren in der Milz lediglich Cell adhesion molecules und Cytokine-cytokine receptor interaction und Focal adhesion biologisch relevant. Die als höchst relevant beurteilten Signalwege in der Milz waren Toll-like receptor signaling pathway, Jak-Stat signaling pathway und ECMreceptor interaction, die auch alle in der Lunge identifiziert wurden. Damit wurden in der Milz Signalwege als höchst relevant beurteilt, die an der Pathogenerkennung und an der Signaltransduktion beteiligt sind, aber auch an der Vermittlung der Zelladhesion,

153 Ergebnisse 138 Zellmigration, Differenzierung, Proliferation und Apoptose. Als einziger ausschließlich in der Milz relevante Signalweg wurde Ubiquitin mediated proteolysis reguliert und damit ein Signalweg der and der Degradierung von Proteinen beteiligt ist und somit neben Apoptosis der einzige Signalweg in der Milz, der Rückschlüsse auf die Art der Zellantwort erlaubt. Insgesamt reflektieren die biologisch relevanten Signalwege in der Lunge das Bild einer umfassenden Immunantwort mit Tendenz zu Effektormechanismen mit zytotoxischen Schwerpunkten. In der Milz hingegen scheint eher die frühe Immunantwort mit Signaltransduktion und Zellkommunikation im Vordergrund zu stehen und nur einzelne Effektor-Signalwege sind relevant.

154 Ergebnisse 139 Tabelle 16 Biologisch relevante Signalwege nach NDV Infektion Dargestellt sind die in immunologischen Prozessen biologisch relevanten Signalwege nach NDV Infektion. Analysiert wurden die signifikant regulierten Gene in Milz und verändertem Lungengewebe im Vergleich zum Kontrollgewebe. Als biologisch relevant wurde ein corrected gamma p-value von <0,5 angesehen. Je niedriger dieser ist, desto höher ist die biologische Relevanz des Signalweges. Die corrected gamma p-values der drei höchst relevanten Signalwegen jedes Datensatzes sind rot geschrieben. Signalkaskade Lunge Milz Leukocyte transendothelial migration 1x Cell adhesion molecules (CAMs) 4x Phosphatidylinositol signaling system 7x Adherens junction 2x Antigen processing and presentation 4x Cytokine-cytokine receptor interaction 8x Focal adhesion 1x Hematopoietic cell lineage ECM-receptor interaction Toll-like receptor signaling pathway Jak-STAT signaling pathway MAPK signaling pathway Regulation of actin cytoskeleton Complement and coagulation cascades T cell receptor signaling pathway Calcium signaling pathway Tight junction p53 signaling pathway TGF-beta signaling pathway ErbB signaling pathway PPAR signaling pathway Natural killer cell mediated cytotoxicity Fc epsilon RI signaling pathway Apoptosis Cell cycle Regulation of autophagy Notch signaling pathway B cell receptor signaling pathway mtor signaling pathway VEGF signaling pathway ECM-receptor interaction - - Ubiquitin mediated proteolysis

155 Ergebnisse Zytokine und Chemokine Da viele Zytokine und Chemokine durch Relevanz in den Genexpressionsanalysen nach NDV Infektion reguliert wurden, wurde diese Gengruppe in der Milz und im veränderten Lungengewebe im Vergleich zum Kontrollgewebe genauer betrachtet (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 25). Von den 85 auf dem Mikroarray annotierten Zytokinen und deren Rezeptoren wurden nach NDV Infektion 46 Gene signifikant reguliert (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 25 A). Dabei wurden 30 davon auch nach IFN Injektion gefunden. Betrachtete man die Organexpression dieser 30 Gene in den beiden Experimenten fiel auf, dass ausschließlich die allgemeinen IRGs Il-6 und Il-1b in Milz und Lunge gleichermaßen exprimiert wurden. Alle nach NDV Infektion regulierten Zytokine und deren Rezeptoren wurden in der Lunge gefunden. Die einzige Ausnahme bildete CSF3R (Colony Stimulating Growth Factor 3 Receptor), das ausschließlich in der Milz hoch reguliert wurde. Insgesamt 18 Zytokine wurden nach IFN Injektion reguliert, nicht jedoch nach NDV Infektion. Weitere Zytokine bzw. deren Rezeptoren wurden ausschließlich nach NDV Infektion in der Lunge reguliert. Unter diesen Zytokinen befanden sich auch einige der Interferone selbst und deren Rezeptoren. So wurde im veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere IFN- 7fach hoch reguliert und IFN- 16fach hoch reguliert. IFN- wurde im veränderten Lungengewebe der infizierten Tiere 15fach hoch reguliert. Il-10R2 als Teil des Rezeptorkomplexes von IFN- wurde NDV Infektion im veränderten Lungengewebe 3fach hoch reguliert. Innerhalb der durch NDV regulierten Zytokine, konnten von den durch Datenbank Analysen identifizierten allgemeinen IRGs weitere 10 IRGs bestätigt werden. RIPK1 (Receptor (TNFRSF)- interacting serine-threonine kinase 1), Il-5, Il-4, Il-10, FAS Ligand (FASLG) und CD40 Ligand (CD40LG), CSF1R (Colony stimulating factor 1 receptor), IFNAR2, Il-17RA und Il- 16. Von den 30 auf dem Mikroarray annotierten Chemokinen und deren Rezeptoren wurden 17 durch die NDV Infektion reguliert (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 25 B). Der Großteil der Chemokine wurde hoch reguliert, nur drei Chemokine wurden herunter reguliert (XCR1 (Lymphotactin-Rezeptor), CXCL14 (BRAK) und CCL17 (TARC)). Die Chemokine CXCL14 und die Chemokin Rezeptoren CXCR5 und CCR9 waren ausschließlich nach NDV Infektion reguliert. Mit CCR9 und CXCR5 konnten zwei weitere Vertreter der allgemeinen IRGs bestätigt werden. Mit Ausnahme von CCL19 (MIP-3β) und ah221 wurden alle Chemokine ausschließlich in der Lunge differentiell exprimiert. Die zwei genannten Chemokine wurden auch in der Milz reguliert. Das Chemokine CCL17, das nicht zwischen verändertem

156 Ergebnisse 141 Lungengewebe und Kontrollgewebe differentiell exprimiert wurde, wurde zwischen verändertem Lungengewebe und unverändertem Lungengewebe 2fach herunter reguliert. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass nach NDV Infektion die Expression zahlreicher Zytokine und Chemokine bzw. deren Rezeptoren reguliert wurde. Die meisten wurden auch nach Interferon Injektion gefunden, jedoch wurden einige Gene auch ausschließlich nach NDV Infektion exprimiert, von denen der Großteil zu den allgemeinen IRGs zählt. Nur wenige Zytokine und Chemokine wurden auch in der Milz reguliert, jedoch wurden alle außer CSF3R in der Lunge gefunden. Unter ihnen fanden sich Vertreter aller Typen von Interferonen deutlich hoch reguliert Identifizierung von IRGs nach Infektion mit NDV Es wurde untersucht, wie viele der insgesamt nach NDV Infektion signifikant regulierten Gene in Übereinstimmung mit den allgemeinen IRGs und den neu identifizierten IRGs im Huhn waren (siehe Abbildung 35). Dafür wurden die Datensätze der signifikant regulierten Gene drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α, die durch Datenbank Analyse erstellte Liste an allgemeinen IRGs und die signifikant regulierten Gene nach NDV Injektion miteinander verglichen. Abbildung 35 IRGs nach NDV Infektion und IFN Injektion Dargestellt sind die Schnittmengen von signifikant regulierten Genen nach NDV Infektion, IFN Injektion in Milz und Lunge und den allgemeinen IRGs. Die Anzahl der Gene in der jeweiligen Schnittmenge ist auf dieser vermerkt.

157 Ergebnisse 142 Es zeigte sich, dass zahlreiche Gene beider durchgeführten Mikroarray Experimente und die allgemeinen IRGs Schnittmengen miteinander bilden. Von den im Kapitel beschriebenen 381 Genen, die drei Stunden nach Injektion von rek ChIFN-α in Übereinstimmung mit den allgemeinen IRGs waren, wurden 278 Gene auch nach NDV Infektion reguliert. 417 weitere allgemeine IRGs wurden nach NDV Infektion, nicht aber nach Injektion von rek ChIFN-α reguliert. Des Weiteren wurden Gene in beiden Mikroarray Experimenten gemeinsam signifikant reguliert. Die drei Stunden nach IFN Injektion signifikant regulierten Gene wurden zuvor als neu identifizierte IRGs bezeichnet. Es konnten dieser neu identifizierten IRGs durch Infektion mit dem starken IFN Induktor NDV bestätigt werden. Weitere Gene wurden ausschließlich nach NDV Infektion signifikant reguliert und konnten weder den allgemeinen IRGs noch den neu identifizierten IRGs zugeordnet werden. Eine Liste mit den Genen die in den besprochenen Gruppen enthalten sind, findet sich auf beiliegender CD in Mappe 2, Tabelle 71. Insgesamt wurden etwa 1/4 der Gene nach NDV Infektion auch durch IFN reguliert und etwa 1/10 der Gene gehörte zu den allgemeinen IRGs. Die Mehrzahl der Gene konnte jedoch keiner dieser Gruppen zugeordnet werden Funktionelle Analysen nach NDV Infektion regulierten IRGs und weiterer Gene Um einen Überblick zu erhalten an welchen Prozessen die nach NDV regulierten IRGs und restlichen regulierten Gene beteiligt sind, wurden sie hinsichtlich relevanter funktioneller Gengruppe und Signalkaskaden untersucht. Funktionelle Gengruppen Analyse der IRGs und weiterer Gene nach NDV Infektion Zuerst wurden die allgemeinen IRGs, neu identifizierten IRGs und die restlichen nach NDV Infektion regulierten Gene mit Panther Gene List Analysis untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Gene in den funktionellen Gruppen Molecular Function, Biological Process und Cellular Component in allen vier analysierten Gruppen gefunden werden konnten (siehe tabellarischer Anhang Tabelle 26 A). Lediglich einzelne Gene innerhalb einer analysierten Gruppe wurden funktionellen Untergruppen zugeordnet, die bei anderen analysierten Gruppen nicht erschienen, wie beispielsweise Antioxidant Activity welches ausschließlich bei den Gruppe der restlichen Gene die nach NDV Infektion reguliert

158 Ergebnisse 143 waren auftaucht. Innerhalb der Molecular Function fiel auf, dass den allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs prozentual mehr Gene Receptor Activity zugeordnet wurden als den restlichen regulierten Genen. Diese funktionelle Untergruppe soll laut Definition Gene enthalten, die sich mit einem extrazellulären oder intrazellulären Messenger verbinden um Veränderungen in der Zellaktivität auszulösen. In Biological Process konnte Folgendes festgestellt werden. In Transport, Cellular Component Organisation, System Process und Developmental Process waren in der Gruppe der allgemeinen IRGs, die auch nach IFN Injektion reguliert waren, deutlich weniger Gene enthalten, als in den anderen drei analysierten Gruppen nach NDV Infektion. Dabei enthielten diese Gruppen hauptsächlich Gene die an Zell- und Organkommunikation und Umbauvorgängen der Zelle beteiligt sind, wie am Zelltransport und der Organisation von Zellbestandteilen. Hingegen waren mit 22% in der Gruppe der allgemeinen IRGs die auch nach IFN Injektion zu finden waren, prozentual am meisten Gene, die zu Response to Stimulus gehören. In der Gruppe der restlichen regulierten Genen wurden nur 9% der Gene Response to Stimulus zugeordnet. Zu dieser funktionellen Untergruppe gehören Gene, die von der Einwirkung eines Stimulus bis hin zur Zellantwort eine Rolle spielen. Ähnliches ließ sich für Immune System Process feststellen. Hier wurden bei allen IRG- Gruppen prozentual deutlich mehr Gene gefunden als bei den restlichen regulierten Genen, insbesondere bei den allgemeinen IRGs, die auch nach IFN Injektion reguliert wurden (siehe Abbildung 36). Innerhalb Cellular Component gab es keine Auffälligkeiten. Lediglich die Tatsache, dass in allen analysierten Gruppen Gene enthalten waren, die in die gleichen funktionellen Untergruppen eingeteilt werden konnten fällt auf.

159 Ergebnisse 144 Abbildung 36 Gene Ontology der IRGs und weiterer Gene nach NDV Infektion Dargestellt ist die Zusammensetzung von Biological Process der analysierten Gruppen (A) und die Legende (B). Immune System Process und Response to Stimulus sind mit Pfeilmarkierung hervorgehoben. Als nächstes wurden diese Gruppen mit der Summe der allgemeinen IRGs und neu identifizierten IRGs die drei Stunden nach IFN-Injektion reguliert wurden verglichen (siehe Tabelle 26 B). Dabei wurden etwa 2/3 der neu identifizierten IRGs die nach IFN Injektion reguliert waren auch nach NDV Infektion reguliert. Es gab keine auffälligen Veränderungen in der Zugehörigkeit zu funktionellen Gruppen. Wenn man jedoch die allgemeinen IRGs die nach NDV Infektion reguliert wurden mit den allgemeinen IRGs die nach IFN Injektion reguliert wurden verglich, konnten folgendes festgestellt werden. Obwohl fast ¾ der allgemeinen IRGs, die nach IFN-Injektion reguliert waren auch nach NDV Infektion reguliert wurden, veränderte sich die Zusammensetzung von Apoptosis. Nach NDV Infektion zählten zu