Albumin als Carrier zur laserinduzierten Fluoreszenzdiagnostik und Chemotherapie maligner Tumoren

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1 Abteilung für Neurochirurgie der Universitätsklinik Heidelberg (Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Stefan Kunze) Albumin als Carrier zur laserinduzierten Fluoreszenzdiagnostik und Chemotherapie maligner Tumoren Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia Legendi für das Fach Neurochirurgie der Medizinischen Fakultät Heidelberg der Ruprecht-Karls-Universität vorgelegt von Dr. Paul Kremer aus Bad Säckingen 2002

2 Euntes eunt et plorant semen spargendum portantes: Venientes venient cum exsultatione, portantes manipulos suos. Psalm 126 2

3 Inhaltsverzeichnis Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung 1.1 Das Konzept der gezielten Tumortherapie mit makromolekularen Trägerstoffen 1.2 Die Eigenschaften von Serum-Albumin 1.3 Der Albuminmetabolismus in malignen Tumoren 1.4 Die Entwicklung von Albuminkonjugaten 1.5 Methotrexat-Albumin 1.6 Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit Kapitel 2 Intraoperative Fluoreszenzdiagnostik maligner Gliome mit 5-Aminofluorescein - HSA (AFLc-HSA) 2.1 Einführung 2.2 Physikalische Eigenschaften von 5-Aminofluorescein (AFL) 2.3 Die kovalente Bindung von 5-Aminofluorescein an Albumin (AFLc-HSA) 2.4 Die Makierung von AFLc-HSA mit radioaktivem 111 Indium 2.5 Das C6-Gliom Modell 2.6 Plasmaclearance von AFLc-HSA 2.7 Die Aufnahme von 111 In-DTPA-AFLc-HSA in das C6-Gliom 2.8 Fuoreszenzdiagnostik von AFLc-HSA und AFL am C6-Gliom der Ratte 2.9 Fluoreszenzdiagnostik von AFLc-HSA in Zellkultur 2.10 Konfokale Mikroskopie mit AFLc-HSA und an C6-Gliomzellen 2.11 Klinische Studien mit 111 In-DTPA-HSA 2.12 Klinische Studien mit AFLc-HSA 2.13 Diskussion Kapitel Albuminvermittelte Chemotherapie mit Aminopterin-HSA (AMPT-HSA) in vivo Einführung Die Koppelung von Aminopterin (AMPT) an Albumin (HSA) Die Markierung von Aminopterin-Albumin (AMPT-HSA) mit 111 Indium Tumormodell (Walker-256-Karzinom) und Versuchstiere Die Plasmaclearance von AMPT-HSA Die Bioverteilung und Tumoraufnahme von AMPT-HSA Vergleichende Toxizität von AMPT-HSA versus AMPT an Walker-256 Karzi nom tragenden Ratten Wirksamkeit von AMPT-HSA versus AMPT an Walker-256-Karcinom tragenden Ratten 3

4 3.2 Untersuchungen von AMPT-HSA in Zellkultur Einführung Optimierung der Kulturbedingungen Das Wachstumsverhalten von C6-Gliomzellen unter dem Einfluß von AMPT- HSA Der Einfluß von lysosomalen Proteaseinhibitoren auf die Wirkung von AMPT-HSA Der Einfluß von AMPT-HSA auf die Walker-256-Karzinomzelllinie Diskussion Kapitel 4 Klinische Phase-I und II-Studien mit Methotrexat-Albumin (MTX- HSA) bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren 3.3 Einleitung 3.4 Klinische Phase-I-Studie mit zweiwöchentlichen Applikationen von MTX-HSA bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren 4.3 Vergleichende Phase-II-Studie von MTX-HSA und Carmustin/Lomustin bei Patienten mit primären und sekundären Glioblastomrezidiven 4.4 Diskussion Kapitel 5 Albuminvermittelte Lymphdiagnostik mit TCPC- oder TCPP-HSA und Gadolinium-HSA 5.1 Einleitung 5.2 Die Diagnostik von Lymphwegen mit TCPC HSA 5.3 Diagnostik von Lymphwegen und reaktiv veränderten Lymphknoten des Kaninchens mit TCPC HSA 5.4 Die Darstellung von Lymphbahnen und Lymphknoten mit Gd-HSA 5.5 Diskussion Kapitel 6 Perspektiven 6.1 Tumordiagnostik mit Gadolinium-HSA 6.2 Die Behandlung der rheumatoiden Arthitis mit Methotrexat-Albumin 6.3 Die Konjugierung von Hydrocortison, Prednison und Dexamethason an HSA 4

5 Kapitel 7 Zusammenfassung Laserfluoreszenzdiagnostik mit 5-Aminofluorescein - Albumin (AFLc-HSA) Albuminvermittelte Chemotherapie Albuminvermittelte Sentinel-Lymph-Node-Diagnostik 7.2 Schlußfolgerung Kapitel 8 Literatur Kapitel 9 Danksagung 5

6 Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung 1.1 Das Konzept der gezielten Tumortherapie mit makromolekularen Trägerstoffen Paul Ehrlich ( ) prägte als erster den Begriff der Chemotherapie (1). Chemische Substanzen sollten ohne Mithilfe körpereigener Abwehrvorgänge im Stande sein, Mikroorganismen zu töten, ohne den Makroorganismus zu schädigen ( = Therapia magna sterilisans). Gewarnt durch Nebenwirkungen erster Präparate und angeregt durch die Entdeckung von Antitoxinen im Serum, entwickelte Ehrlich schon damals Vorstellungen einer gezielten medikamentösen Therapie, welche über den Einsatz von Trägerstoffen, der Haptophore, den Wirkstoff, die Toxophore, in den Tumor einschließen soll. Dieses Prinzip wurde von ihm mit dem einer Zauberkugel ( = magic bullet) verglichen. Heutzutage wird dieses Prinzip des gezielten Einschließens von Wirksubstanzen im Tumorgewebe drug targeting genannt. Jedoch ist bislang aber nur wenig realisiert. Die meisten der zur Tumortherapie verwendeten Substanzen sind niedermolekular (Molmasse < 1000 g/mol) und passieren Tumorgewebe nur über einen kurzen Zeitraum. Zudem bewirkt das geringe Molekulargewicht eine weite Verbreitung im gesundem Organismus mit einer dadurch bedingten Schädigung physiologisch proliferierenden Gewebes. Auch werden die meisten Wirksubstanzen rasch eleminiert, was zur Folge hat, daß die Plasmazeiten der meisten Zytostatika unter einer Stunde liegen (2-5). Dies wiederum hat zur Folge, daß das Zeitdauer, in dem niedermolekulare Substanzen in das Tumorgewebe eindringen und dort ihre Wirkung entfalten sollten, sehr kurz ist (6). Eigentlich müßte in Kenntnis der pharmakokinetischen Eigenschaften niedermolekularer Substanzen die Applikation wiederholt und in kurzzeitigen Abständen erfolgen, doch gerade bei den meisten Chemotherapeutika verbietet die systemische Toxizität ein solches Behandlungsschema. 6

7 Daher wurde schon in den 60er Jahren versucht, die Wirkung von Zytostatika durch Koppelung an makromolekulare Trägersysteme zu verbessern (7-9). Doch bislang blieb ein durchschlagender Erfolg in der Tumortherapie aus. Eine wesentliche Eigenschaft maligner Tumoren ist die Neoangiogenese. Induziert wird sie durch das Tumorwachstum selbst, denn ohne eine Einsprossung neuer Gefäße würde die Tumorversorgung bald zum Erliegen kommen. Bereits ab einer Tumorgröße von 3 mm 3 ist die Ernährung des Tumores durch Diffusion nicht mehr gewährleistet (10). Durch eine Vielzahl von Mediatoren, wie z. B. dem basic fibroblast growth factor (BFGF) oder dem vascular endothelial growth factor (VEGF) wird die Gefäßeinsprossung in das Tumorgewebe induziert (11-14). Aber nicht alle Tumorareale werden gleichmäßig durchblutet. Gerade in den zentralen Tumoranteilen bilden sich Nekrosen. Denn hier übersteigt der deutlich erhöhte interstitielle Druck im Tumor von bis zu 50 mm Hg den intravasalen Druck (15-17), was wiederum zu einer Verminderung des Blutflusses und zu einem Gefäßkollaps führt (18). Begünstigt wird dieses Phänomen durch das in der Regel weitgehende Fehlen funktionierender Lymphdrainagen, welches einen Rückstau makromolekularer Substanzen im Tumor bewirkt. Ganz anders ist die Situation in der Tumorperipherie, den Arealen höchster Zellproliferation. Hier übersteigt der intravasale Druck den interstitiellen. Eine Vielzahl von fenestrierten Kapillaren fördert hohe kapilläre Filtrationsraten, welche fach höher sein können als im normalen Gewebe (19). So werden bei verschiedenen Rattentumoren 6 14 % des Plasmas in den extravasalen Raum der Tumorperipherie abgegeben (20-21). Mit dieser hohen Filtrationsrate geht die Besonderheit einher, daß fenestrierte Tumorkapillare Makromoleküle nicht zurückhalten. Und weil bei malignen Tumoren in der Regel ein funktionstüchtiges lymphatisches System fehlt (22), kommt es zu einer Akkulumation von Makromolekülen im Tumorgewebe, im Englischen enhanced permeability and retention genannt (23). 7

8 Während für den Eintritt der Makromoleküle in das Interstitium des Tumors der Blutfluß (Konvektion) verantwortlich ist, bestimmt nun die Diffusion die weitere Verteilung. Diese ist in erster Linie abhängig von der Molekülgröße (24-25). Makromoleküle, wie z. B. Liposomen ( kda) oder Immunglobuline (ca. 150 kda) diffundieren nur sehr langsam. Ein IgG benötigt für die Überwindung einer Strecke von 1 mm ca. 2 Tage, ein kleineres Makromolekül wie Albumin (66439 Da) diffundiert ca. 10fach schneller (26-28). Niedermolekulare Substanzen diffundieren jedoch weitaus schneller. Substanzen mit einem MG von bis zu diffundieren binnen weniger Minuten bis Stunden aus dem Bereich der Tumorproliferationszone entweder zurück in die Blutzirkulation oder werden aus dem umgebenden Interstitium abgeschwemmt. Zusammenfassend gilt jedoch, daß gerade in den proliferationsaktiven Arealen solider Tumoren Makromoleküle akkumulieren. Das Konzept der makromolekularen Trägersysteme wurde an zahlreichen Verbindungen erprobt, von denen allerdings nur wenige Eingang in die klinische Prüfung erfuhren. Grundsätzlich lassen sich zwei verschiedene Trägersysteme unterscheiden. Partikuläre Trägerssysteme Eine klinische Bedeutung für partikuläre Trägersysteme haben Liposomen erlangt, welche mit ihrer Doppelschichtmembran die eigentliche Wirksubstanz umschließen (29-32). Je nach Herstellungsverfahren haben diese Partikel einen Durchmesser von 50 nm bis 1 µm. Liposomen können mit der Zellmembran verschmelzen und so die in der inneren wässrigen Phase enthaltene Wirksubstanzen in die Tumorzellen einschleusen. Durch eine selektive Instillation von Liposomen soll dadurch eine gezielte Abgabe von Substanzen in den Tumor erreicht werden. Polymere Trägersysteme Polymere Trägersysteme sind entweder biologische Makromoleküle, wie z. B. monoklonale Antikörper, oder synthetische Makromoleküle, wie z. B. Polysaccaride oder Polyäthylenglycol. Monoklonale Antikörper, 1975 von Köhler und Milstein erstmals hergestellt (33), sollen im Rahmen einer passiven Immuntherapie im Patienten spezifisch Tumorzellen auffinden und zerstören. Ihre Aktivität entfalten Antikörper nach 8

9 Bindung an der Tumorzelle über die Blockierung von Signaltransduktionswegen, wie z. B. Inhibierung von Proliferationsreizen, lokale Initiierung der Komplementkaskade oder durch Rekrutierung von Effektorzellen (34-36). Trotz zahlreicher Therapiestudien blieben die Erfolge jedoch aus. Probleme bereiteten vor allem die nach wiederholter Anwendung regelmäßig auftretenden blockierenden humanen Anti-Maus-Antikörper. Erst die Entwicklung rekombinanter humanisierter Antikörper Mitte der 90er Jahre ermöglichte wiederholte Therapiezyklen. Zwischenzeitlich sind von der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) neun Antikörper mit unterschiedlicher Indikation zugelassen. Auch in Europa wurde der humanisierte Antikörper Tratuzumab (Herceptin) zugelassen, welcher HER2-überexprimierende Mammakarzinome erkennt. Während hingegenen dieser Antikörper als Monotherapeutikum in ca. 15% ein Ansprechen zeigt (37), kann dieser Effekt durch gleichzeitige Verwendung verschiedener Chemotherapeutika auf ca. 60% gesteigert werden (38). Ähnliches gilt für einen weiteren Antikörper C225, der den von vielen epithelialen Tumoren überexprimierenden epidermal growth factor receptor (EGF-R) erkennt (39). Auch hier kann die alleinige Wirkung des Antikörpers durch den gleichzeitigen Einsatz chemotherapeutischer Substanzen deutlich gesteigert werden (40). Ein generelles Problem der Antikörpertherapie solider Tumoren liegt aber zum einen in der unzureichenden Zugänglichkeit des Zielantigens und zum anderen dem fehlenden Vorhandensein eines tumorassoziierten Antigens überhaupt. Ebenfalls ist die Verwendung von Antikörperkonjugaten, bei denen der Antikörper als Vehikel für Chemotherapeutika oder Radionukleide dient, Gegenstand klinischer Studien an verschiedenen Tumorentitäten (41-42). Bei den synthetischen Makromolekülen konnte ein Polyethylenglycolkonjugat, die PEG-L-Asparaginase, bis zur klinischen Zulassung entwickelt werden. Hierbei wird Asparaginase kovalent an Polyethylenglykol (PEG) gebunden, wodurch eine verlängerte Halbwertszeit und ein verbessertes Ansprechen auf Lymphosarkome und andere Mäusetumore erreicht werden konnte (43). Inzwischen ist L-Asparaginase-PEG (Oncaspar ) bei akuten lymphoblastischen Leukämien im Kindesalter als therapeutische Option etabliert (44-46), wobei auch hier über eine Wirkungsverstärkung in Kombination mit Methotrexat, Vincristin und Prednison berichtet wird (47). Auch eine kovalente Bindung von PEG an Interferon α2a (Pegasys ) oder PEG-Interferon α2b (PegIntron ) 9

10 bewirkt eine Wirkungsverstärkung in der Behandlung der chronischen Hepatitis C gegenüber der Kombinationstherapie ohne PEG (48-49). Weitere synthetische Makromoleküle stellen die supramagnetischen monocristallinen Eisenoxide (MION) oder ultrakleine supramagnetische Eisenoxidpartikel (USPIO) dar. MIONs bestehen aus einem kristallinen Eisenoxidkern (Durchmesser ca. 6,5 nm) und einer Carboxydextranhülle. Der hydrodynamische Durchmesser der Partikel beträgt ca nm. MIONs werden von der Tumorzelle phagozytiert, wobei das dadurch eingeschleuste Eisenoxid kernspintomographisch nachgewiesen werden kann. Allerdings sind die Zirkulationszeiten kurz, da die Polysaccharide effektiv vom retikuloendothelischen System (RES) oder der Leber abgefangen werden (50-51). Auf Grund der bisherigen Erfahrungen mit makromolekularen Trägersystemen sollte ein Konjugat, welches als drug carrier fungieren soll, folgende Eigenschaften besitzen (52): Keine Immunogenität oder Toxizität des Trägermoleküles Gewährleistung einer stabilen chemischen Koppelung zwischen Trägermolekül und Wirksubstanz Lange Verweildauer des Trägermoleküles im Kreislauf Hohe Aufnahmerate des Trägermoleküles im Tumor Die Wirksubstanz soll erst im Tumorgewebe freigesetzt werden. 1.2 Die Eigenschaften von Serum-Albumin Humanes Serumalbumin besteht aus 585 Aminosäuren. Sein Molekulargewicht beträgt Dalton (D). Albumin hat die Form eines rotationselipsoiden Körpers ähnlich dem einer Zigarre. Die Längsachse mißt 14 nm, die Querachse 4 nm. Im Inneren befindet sich ein hydrophober Kanal. Während an den Öffnungen positive Ladungen vorherrschen, so befinden sich an der Gesamtoberfläche negative Ladungen (53). Albumine sind gut wasserlösliche Proteine mit einem isoelektrischen Punkt bei ph 4,8. Im Blutplasma zirkulieren ca. 100 weitere Proteine, jedoch stellt Albumin mit ca. 60 % 1 0

11 den größten Anteil dar. Beim Menschen schwankt der Serumalbuminspiegel zwischen 3,5 5,5 g/dl. Bereits kurze Zeit nach intravenöser Injektion sind ca. 50 % der applizierten Albuminmenge ins Interstitium diffundiert. Von dort gelangt Albumin über das Lymphbahnsystem in das Blut zurück. Im Schnitt zirkuliert jedes Albuminmolekül mal durch den Kreislauf, macht dabei 15 Passagen durch das Gefäßendothel um über das lymphatische Gewebe innerhalb weniger Tage wieder in die systemische Zirkulation zu gelangen (54-56). Die Halbwertszeit von humanem Serumalbumin beträgt ca. 19 Tage. Täglich müssen ca. 2,5 % Albumin durch Neusynthese ersetzt werden. Der Albuminverlust ist vor allem durch Verstoffwechselung bedingt, die renale Filtration ist ohne Belang (57). Der Hauptteil des physiologischen Albuminabbaues findet in den Lysosomen von Fibroblasten der Haut und der Muskulatur statt (58-59). Hauptsyntheseort von Albumin sind die Hepatozyten der Leber. Täglich produziert eine gesunde Person ca. 11 ±3 g Albumin (60-64). Bereits 1839 entdeckte H. Ancell, daß Albumin bei der Verhinderung von Ödemen eine Rolle spielt und in die Transportprozesse im Blut involviert sei (65). In der Tat tragen die Plasmaproteine und davon vor allem Albumin mit 60 % wesentlich zur Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes bei. Ein Mangel an Albumin reduziert somit den onkotischen Druck im Plasma, was zu einer generellen Ödemneigung führt. Schließlich stellen Plasmaproteine, und damit vor allem Albumine, als schwache Säuren eine Pufferkapazität dar, welche stärkere ph-schwankungen des Blutes zu verhindern helfen (66). Eine weitere wichtige Eigenschaft von Albumin ist der Transport von verschiedenen Stoffen im Blut. Die zu transportierenden Substanzen werden dabei aber nicht kovalent, sondern adhäsiv gebunden. Eine Vielzahl von Liganden, wie z. B. Fettsäuren, Bilirubin, Gallensäure, Hämatin, Histamin, Thyroxin oder Thryptophan, sind beschrieben. Auch Kalzium oder Chlorid werden durch Albumin gebunden. Ebenfalls werden über 90 % der niedermokelularen Medikamente, wie z. B. Penizillin, Sulfonamide, Diazepan, Digitoxin, Methotrexat, Indozyanin, temporär durch Albumin im Plasma transportiert (67). Die Liganden werden vorwiegend in der Leber oder den Glomeruli der Nieren von Albumin abgelöst. Gerade in der Leber wird dann ein Großteil der so freigesetzten Medikamente metabolisiert und ausgeschieden (68). 1 1

12 Albumin stellt mit g im Plasma eine wichtige Eiweißreserve dar. Ein Molekül Albumin beinhält dabei 779 Stickstoffatome. Diese Menge stellt eine bei Bedarf sehr schnell verfügbare Eiweiß- und Stickstoffreserve im Organismus dar (54). Die Aminosäuren des dominierenden Plasmaproteins Albumin enthalten insgesamt ca. 30 mal mehr Energie als das Glucoseangebot des Blutes. Etwa 200 mal mehr Aminosäuren sind albumingebunden verfügbar als frei zirkulierende Aminosäuren (57). 1.3 Der Albuminmetabolismus in malignen Tumoren Die Vorstellung, daß Eiweiße, wie z. B. Albumin, eine wichtige Rolle in der Versorgung maligner Tumoren darstellen, wurde bereits 1948 von Mider (69) beschrieben. Ihnen war aufgefallen, daß sich maligne Tumoren wie Stickstofffallen verhalten, d. h. mehr stickstoffhaltige Substrate, wie z. B. Aminosäuren, aufnehmen als abgeben. Wenige Jahre später zeigte Babson und Winnick (70), daß maligne Tumoren eher Plasmaproteine als Aminosäuren verstoffwechseln, und folgerten daraus, daß die Tumorkachexie erkrankter Patienten durch den erhöhten Eiweißstoffwechsel maligner Tumoren bedingt ist. Erstmals wurde von diesen Autoren auf die Möglichkeit, Medikamente an Albumin zu binden und in maligne Tumoren einzuschleusen, hingewiesen (71-72). Allerdings wurde dem Plasmaeiweißkatabolismus maligner Tumoren im weiteren nicht viel Beachtung geschenkt. In Übersichtsarbeiten über Tumorkachexie finden sich diesbezüglich nur wenig Hinweise (73-77). Möglicherweise war dies methodisch bedingt, denn nach Markierung von Plasmaeiweißen mit Radiojod, 3 H oder 14 C entstehen nach Abbau des Proteins sehr rasch eine Vielzahl niedermolekularer Katabolite, die eine exakte Zuordnung und Verteilung des Proteins im Körper nicht möglich machen (78-81). Diese radioaktiv markierten Aminosäuren oder Proteinspaltprodukte unterliegen dann normalen niedermolekularen Verteilungsvorgängen und werden entweder ausgeschieden oder in die Neusynthese anderer Proteine eingeschleust (82-83). Um diesen Schwierigkeiten zu begegnen, wurden in den letzten Jahren metabolisch stabile sog. kumulative Markierungstechniken entwickelt (84-87). Wesentliches Merkmal dieser stabilen Markierung ist, daß der radioaktive Marker am Ort des Abbaus, also 1 2

13 bei Proteinen am Lysosom, verbleibt. Diese metabolisch stabilen Marker bestehen meist aus einem Kohlenhydrat, welches mit dem radioaktiven Marker verknüpft ist. Mit Hilfe dieser metabolischen Marker war es möglich, den Nachweis des Plasmaabaues von Gesunden zu untersuchen (88-89). Hierbei wurden Fibroblasten als wesentlicher Ort des Albuminabbaues erkannt (59). 1.4 Die Entwicklung von Albuminkonjugaten Ende der 80er Jahre übernahmen Hansjörg Sinn und seine Mitarbeiter das Prinzip der metabolisch stabilen bwz. kumulativen Markierungstechniken, um der Frage nachzugehen, ob und in welcher Weise Albumin als Trägersubstanz genutzt werden kann. Zudem sollte untersucht werden, ob Albumin durch die Koppelungstechnik in seiner pharmakokinetischen und biologischen Funktion beeinflußt wird und wie hoch Albumin als Trägersubstanz beladen werden darf. Ausgehend von den Untersuchungen von Pitman (84), welcher Tyraminzellobiose (TCB) zur Markierung von Low-Density-Lipoproteinen in der Arterioskleroseforschung genutzt hatte, wurde ein kumulativer 131 Jod- Label mit Tyramindesoxysorbitol (TDS) entwickelt, welcher kovalent an Albumin gebunden werden konnte (87). Nach intravenöser Injektion dieses kumulativ radioaktiv markierten 131 I-TDS-Albumins zeigte sich bei O-342 (tierexperimenteller Ovarialtumor) tragenden Ratten auch 72 h nach i. v. Applikation eine deutlich erhöhte Aufnahme des markierten Albumins im Tumor. In weiteren Untersuchungen mit 131 I-TDS-Albumin fand sich gegenüber nativem Albumin keine Veränderung in der Plasmahalbwertszeit. Auch war als Ausdruck der stabilen kovalenten Bindung und alleinigen intrazellulären Metabolisierung von 131 I-TDS-Albumin gegenüber konventionell markiertem 131 I- Albumin keine Aufnahme von 131 I-Albumin-Spaltprodukten in der Schilddrüse der Versuchstiere zu finden (90). Diese Ergebnisse wurden auch mit einem weiteren kumulativen Marker, dem 111 Indium-Diethylentriamin-Pentaessigsäure ( 111 In-DTPA) bestätigt. So zeigte sich bei Walker-256-Karzinom tragenden Ratten 48 h nach intravenöser Applikation ca. 20 % der initial verabreichten Substanz im Tumor (91). Sowohl 131 Jod- TDS wie auch 111 Indium-DTPA markiertes Albumin war in der Lage, den Albuminstoffwechsel im tumortragenden Tier darzustellen. Die Pharmakokinetik entsprach dabei natürlichem Albumin, wobei sich bei der Ratte keine Unterschiede in den Zirkula- 1 3

14 tionzeiten zwischen mit 111 Indium markiertem Ratten-Serumalbumin, humanem Serumalbumin oder bovinen Serumalbumin zeigte (92). Allerdings erwies sich, daß lediglich eine schonende Beladung von 1 : 1 molar eine stabile Markierung und eine dem natürlichen Albumin entsprechende Zirkulation im Plasma erlaubt (93). Werden mehr Moleküle an Albumin gebunden, so verkürzen sich die Zirkulationszeiten erheblich, d. h. Albumin verändert seine Tertiärstruktur und wird als Fremdprotein vom retikuloendothelialen System (RES) erkannt und abgefangen. Immunologische Reaktionen werden ausgelöst, was eine wiederholte Injektion unmöglich macht. Dies gilt auch für Koppelungsverfahren, wie z. B. der Bindung von Fluorescein-Isothiozyanat an Albumin (Fa. Sigma, Deisenhofen), bei denen höhere Beladungsraten für Albumin vorgenommen wurden (Abb. 1). 111In-DTPA-RSA (Ratten-Serumalbumin) 111In-DTPA-HSA (Humanes Serumalbumin) cpm In-DTPA-BSA (Bovines Serumalbumin) 111In-DTPA-AFLc-HSA (5-Aminofluorescein-HSA) 111In-DTPA-FITC-BSA (Fluorescein-Isothiozyanat-Albumin) h Abb. 1: Die Zirkulationszeiten 1 : 1 molarer Beladungen mit 111 Indium-DTPA an verschiedene Albumine, sowie die 1 : 1 molare Beladung von 5-Aminofluorescein an HSA und die hochmolare Beladung von FITC-Albumin. 1 4

15 1.5 Methotrexat-Albumin Präklinische Untersuchungen Schon seit Ende der 60er Jahre hatte eine Vielzahl von Arbeitsgruppen Methotrexat- Albumin-Konjugate synthetisiert und in der Regel, um einen besseren therapeutischen Effekt zu erzielen, hohe Beladungsraten (bis zu 56 Methotrexat-Moleküle pro Albumin) gewählt (Tabelle 1). Tabelle 1: Die Beladungsraten von 1 Mol Albumin mit x Mol MTX Magenat et al (94) Shen et al (95) Bures et al (96) Bures et al (97) Kim et al (98) Sett et al (99) MTX-(6, 11, 17) - HSA MTX-(17) - HSA MTX-(26) - HSA MTX-(56) - HSA MTX-(17) - HSA MTX-(30) mannosyl - HSA Diese Konjugate waren in Zellkultur wie auch im Tierexperiment teilweise erfolgreich, doch wurde über eine klinische Anwendung nicht berichtet. Es bleibt zu vermuten, daß die hohen Beladungsraten bei Albumin zu verkürzten Zirkulationszeiten führten und auch allergische Reaktionen eine weitere Anwendung verhinderten. Nach seinen Erfahrungen mit kumulativen Marken entschlossen sich Sinn und seine Mitarbeiter zu einer möglichst schonenden Koppelung von Methotrexat an Albumin. Dabei wurde die γ-carboxylgruppe von Methotrexat durch eine Reaktion mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Hydroxysuccinimid (HSI) aktiviert, um dann kovalent eine Säureamidbindung mit einem Lysinrest des Albumins zu knüpfen (100). Die Koppelungstechnik wurde so verfeinert, daß Quervernetzungen (cross-linking) des Albumins, welche eine Veränderung des Proteins zur Folge hätte, vermieden werden konnten. Entsprechend der Konzentrationsverhältnisse gelang so eine Beladung von 1,3 Mol 1 5

16 Methotrexat auf 1 Mol Albumin. In pharmakokinetischen Studien an Ratten zeigte sich, daß die Verweildauer von MTX-HSA natürlichem HSA entsprach. Auch konnte 1-2 Tage nach intravenöser Applikation des Albuminkonjugates an verschiedenen tierexperimentellen Tumoren eine bis zu 20%ige Aufnahme im Tumor nachgewiesen werden. Diese Konjugateigenschaften konnten jedoch durch eine höhere Beladungsrate des Albumin deutlich beeinflußt werden. Waren nach Applikation von MTX-RSA 1 : 1 molar 15 % der Substanz nach 24 h in Zirkulation, so wurde dies bei einer 10 : 1 molaren Beladung auf 3 % verkürzt (93). Entsprechend zeigte die Leber eine 7fach erhöhte Aufnahme des durch die höhere Beladung denaturierten Proteins, wie Analysen in der hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatographie, HPLC) bestätigten. Denn je höher Albumin beladen wird, desto breiter und atypischer ist das Albuminsignal in der HPLC verglichen mit nativem Albumin. Auch die Aufnahme des Konjugates im Tumor wurde durch die hohe Beladung beeinflußt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden für weitere präklinische Untersuchungen das MTX- Albumin (MTX-SA) Konjugat mit der nahezu 1 : 1 molaren Beladungsrate gewählt, da hier lange Zirkulationszeiten, hohe Tumoraufnahmeraten und fehlende allergische Reaktionen zu vermuten waren. Die in-vivo Prüfung des Konjugates erfolgte am Walker-256-Karzinom der Ratte, wobei die Wirkung des Konjugates mit der von freiem MTX verglichen wurde. Als Dosis limitierende Toxizität (DLT) wurde für beide Gruppen eine 4fach wiederholte i. v. Injektion an den Tagen 1, 3, 8 und 10 festgestellt. Danach traten typische MTX-Nebenwirkungen, wie Durchfall, Mukositis und struppiges Fell auf. Somit wurde die Effektivität in Höhe der maximal tolerablen Dosis (MTD) für beide Gruppen als repetitive Injektionen von 3 x 2mg MTX/kg Körpergewicht (KG) oder 3 x 2mg MTX-SA/kg KG untersucht. MTX erreichte dabei eine Heilrate von 55 %, während hingegen sie für MTX-SA bei 60 % lag. Durch eine Mischung von freiem MTX mit MTX-SA wurde bei gleichem Applikationsschema und gleicher Dosis eine Heilrate von 70 % erreicht (101). Die Effektivität von MTX-Konjugaten gegenüber freiem MTX bestätigte sich ebenfalls bei Dunning R 3327 Prostataadenokarzinomen an Copenhagen-Ratten, wo in einer Dosierung 4 x 2 mg/mtx-sa/kg KG eine deutlich verzögerte Tumorprogression gegen- 1 6

17 über freiem MTX erreicht wurde (102). Auch an verschiedenen Xenograft-Tumoren, wie z. B. Nierenzell-, Blasen-, Kolon-, Bronchial-, Pankreas-, Mamma-Karzinomen wie auch bei Mesotheliomen und malignen Melanomen, konnte eine verbesserte Wirksamkeit von MTX-HSA gegenüber freiem MTX nachgewiesen werden. Zwischenzeitlich fand sich auch eine verbesserte Wirksamkeit von MTX-HSA an 2 von 4 malignen Gliomxenografts ( ). Klinische Studien mit MTX-HSA Ermutigt durch zahlreiche präklinische Untersuchungen mit MTX-HSA erfolgte 1997 eine erste klinische Phase-I-Studie an 17 Tumorpatienten mit MTX-HSA. Es erfolgte eine vorsichtige Dosiseskalation mit wöchentlichen Injektionen ab 20 mg/m 2. Ab einer Dosis von 40 mg/m 2 pro Woche wurden erste Toxizitätssymptome (Common-Toxic- Criteria: CTC Grade) beobachtet. Insgesamt erschien eine wöchentliche Applikation von mg/m 2 alsgut verträglich. Unerwünschte Arzneimittelreaktionen, wie z. B. leichte Übelkeit, Diarrhoe, Obstipation, Epistaxis, Mukositis oder Müdigkeit, bildeten sich durch eine Therapieunterbrechung innerhalb von 1 2 Wochen komplett zurück. In keinem Fall war die Gabe von Folinsäure (Leucovorin ) notwendig. An hämatologischen oder laborchemischen Veränderungen fanden sich dreimal eine Thrombozytopenie (2 x Grad 2, 1 x Grad 4) sowie viermal ein Anstieg der Transaminasen auf Grad 3. Auch hier konnte eine Rückbildung der Veränderungen durch eine Spreizung des Applikationsschemas erreicht werden. Bei den 10 Patienten, welche mit einer wöchentlichen Applikation von 50 bzw. 60 mg/m 2 behandelt wurden, kam es in drei Fällen (1 x Pleuramesotheliom, 2 x Hypernephrom) zu einer langanhaltenden Remission (105). Die Ergebnisse der präklinischen und klinischen Erfahrungen mit MTX-HSA bildeten die Grundlage für eine Lizenzvergabe von MTX-HSA an Klinge-Pharma, München, jetzt Fujisawa-Deutschland, um MTX-HSA im Rahmen eines Zulassungsverfahrens weiter zu untersuchen. 1 7

18 1.6 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit Aufgabe dieser Arbeit war es, die Möglichkeit von Albumin als vielfach verwendbarer Trägerstoff in der Diagnostik und Therapie maligner Tumoren aufzuzeigen. Albumin wurde hierzu bei verschiedenen Aufgabestellungen eingesetzt: Die laserinduzierte Fluoreszenzdiagnostik mit 5-Aminofluorescein-HSA bei malignen Gliomen Es sollte die Frage geklärt werden, ob durch eine albuminvermittelte Fluoreszenzanfärbung bei malignen Gliomen eine intraoperative Tumordarstellung möglich sei, wobei folgende Eigenschaften an den albumingebundenen Farbstoff gestellt wurden: Fehlende Toxizität Hohe, selektive und langanhaltende Anreicherung des Farbstoffkonjugates im Tumorgewebe Keine oder nur unwesentliche Ausbleichung des Farbstoffes Hohe Kontrastierung und Detektion des Farbstoffes ohne Zuhilfenahme optischer Verstärkersysteme Albuminvermittelte Chemotherapie mit Aminopterin-HSA Gerade besonders toxische Chemotherapeutika erscheinen für eine Albuminbeladung interessant, da durch die kovalente Bindung des Chemotherapeutikums an den Trägerstoff Albumin ein pro-drug ensteht, welcher dadurch bedingt eine reduzierte systemische Toxizität aufweist und die Wirksubstanz erst im Lysosom der Tumorzelle freisetzt. Ziel war es, das bereits Mitte der 50er Jahre verwendete hochwirksame aber systemisch zu toxische Antifolat Aminopterin an Albunim zu binden und es im Tierexperiment auf seine pharmakokinetischen Eigenschaften, seine Verteilung, seine Verträglichkeit und Wirksamkeit zu untersuchen. 1 8

19 1.6.3 Klinische Phase-I und II-Studien mit Methotrexat-Albumin (MTX-HSA) bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren Nach Auslizensierung der von Sinn entwickelten Patente (MTX-HSA; AFlc-HSA etc.) an Firma Klinge-Pharma, jetzt Fujisawa-Deutschland, wurde entsprechend dem Arzneimittelgesetz eine zweite Phase-I-Studie mit aufsteigenden Dosierungen von 50 mg/m 2 ; 70 mg/m 2 ; 80 mg/m 2 und 90 mg/m 2 MTX-HSA in zweiwöchentlichen Abständen bei insgesamt 23 Karzinompatienten initiiert. Wir selbst nahmen an dieser Studie mit vier Patienten teil. Danach wurde unter der Leitung der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg eine vergleichenden Phase-II-Studie bei Patienten mit primären und sekundären Glioblastomrezidiven veranlaßt Albuminvermittelte Lymphdiagnostik mit Tetra(4-Carboxy-Phenyl- Chlorin- (TCPC) oder Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Porphyrin (TCPP) HSA und Gadolinium-HSA Durch Einführung des sentinel lymph note (SLN) Konzeptes hat die Diagnostik und Therapie von tumordrainierende Lymphbahnen und deren Lymphknoten eine Renaissance erfahren. Mit 99m Tc-HSA ist präoperativ eine Lymphabstromszintigraphie möglich, intraoperativ kann dann der SLN mit speziellen Gammasonden und auch unter Zuhilfenahme von intraoperativ appliziertem Patentblau aufgesucht werden. Da bislang hauptsächlich kolloidales 99m Tc-HSA mittels der Lymphabstromszintigraphie und intraoperativ Gammasonden zum Einsatz kommen, sollte versucht werden, ob nicht auch durch eine Fluoreszenzbeladung von HSA eine direkte Darstellung von Lymphwegen und von im Abstromgebiet liegenden Lymphknoten (SLN) möglich sei. Dies sollte tierexperimentell durch eine Beladung von Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Chlorin (TCPC) oder Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Porphyrin (TCPP) an HSA und auch kernspintomographisch mit Gadolinium-HSA untersucht werden. 1 9

20 Kapitel 2 Intraoperative Fluoreszenzdiagnostik maligner Gliome mit 5-Aminofluorescein-HSA (AFLc-HSA) 2.1 Einführung Als Anfang der 90er Jahre in unserer Klinik unter Leitung von Albert (1-2) das frühe postoperative Kernspintomogramm vermehrt zur Beurteilung der Radikalität nach mikrochirurgischer Resektion von Glioblastomen herangezogen wurde, stellten er und seine Mitarbeiter fest, daß in vielen Fällen solide kontrastmittelaufnehmende Tumoranteile verblieben waren, die der intraoperativen Wahrnehmung des Neurochirurgen trotz Verwendung moderner Operationsmikroskope entgangen waren. Diese soliden und im frühen postoperativen Kernspintomogramm entdeckten Tumoranteile stellten dann im weiteren Verlauf den Ursprung des klinisch manifesten Tumorrezidives dar und waren statistisch gesehen prognostisch von entscheidender Bedeutung. Aus diesen Beobachtungen heraus ergab sich unmittelbar die Konsequenz einer verbesserten intraoperativen Darstellung von solidem Tumorgewebe. Auch wenn andere Verfahren, wie z. B. Neuronavigation, intraoperatives CT oder Kernspintomogramm und Ultraschall (3-9), ebenfalls Gegenstand intensiver wissenschaftlicher Betrachtungen bezüglich der verbesserten intraoperativen Tumordarstellung sind, so galten unsere Überlegungen der Verwendung fluoreszenzaktiver Substanzen, wie z. B. dem Fluorescein, welches bereits 1948 seinen Einsatz zur intraoperativen Darstellung von Gehirntumoren fand (10). Ähnlich den sonst zur Tumordiagnostik applizierten Kontrastmittel passiert das Fluroescein-Natriumsalz die bei malignen Gliomen gestörte Blut-Hirn- Schranke und lagert sich dann interstitiell im Tumorgewebe ab. Auf Grund der aber schon im Jahre 1948 beschriebenen Penetration von Fluorescein ins umliegende Tumorödem ist eine lang anhaltende und selektive Darstellung von Tumorgewebe jedoch nur bedingt möglich. 2 0

21 2.2 Physikalische Eigenschaften von 5-Aminofluorescein (AFL) 5([4,6-Dichlorotriazin-2-YL]Amino)-Fluorescein (5-Aminofluorescein, AFL) ist ein hell leuchtender Fluoreszenzfarbstoff mit einem Molekulargewicht von 531,7 Dalton. Folgende chemische Strukturformel liegt ihm zu Grunde (Abb.1): Abb. 1: Chemische Struktur von 5-Aminofluorescein AFL zeigt im Bereich von 200 bis 700 nm drei Absorptionsmaxima (238 nm, 269 nm und 490 nm), wobei das Absorptionsmaximum bei 490 nm am größten ist. Sein Emissionsmaximum liegt mit 519 nm nur wenig neben dem Absorptionsmaximum von 490 nm. Im Gegensatz zu vielen anderen fluoreszenzaktiven Substanzen ist AFL nicht photoaktiv im Sinne der Photodynamischen Therapie und zeichnet sich durch einen nur geringen Ausbleicheffekt (sog. bleaching) aus (Abb. 2). AFL ist ähnlich dem in der Humanmedizin verwendeten Dinatriumsalz-Fluorescein wasserlöslich und wird hauptsächlich renal eleminiert Aminofluorescein Minuten Abb.2: Ausbleichverhalten (sog. bleaching) von 5-Aminofluorescein bei einer maximalen Anregung bei 490 nm. 2 1

22 2.3 Die kovalente Bindung von 5-Aminofluorescein an Albumin (AFLc-HSA) Ein Volumen von 65 mg 5-([4,6-Dichlorotriazin-2-yl]-Amino)-Fluorescein (AFL, Sigma, Deisenhofen) wird in 3 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wird unter kontinuierlichem langsamen Rühren zu 4 g humanem Serumalbumin 20 %(Pharma Dessau GmbH, Dessau), in 20 ml Albuminlösung und 60 ml 0,34 Mol NaHCO 3 gelöst, hinzugefügt. Während des Hinzufügens von AFL zur Proteinlösung färbt diese sich grün-gelb, bleibt aber absolut klar. Ungefähr 45 Minuten später wird die Proteinlösung mit 350 ml Ampuwa verdünnt. Verunreinigungen, wie z. B. ungebundenes Fluorescein oder DMSO, werden dann vom gebundenen Protein AFLc-HSA durch Ultrafiltration (YM 30 Millipore) abgetrennt. Die Reinheit des hergestellten Proteinkonjugates wurde mittels der hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie (HPLC) überprüft: HPLC Bedingungen: Vorsäule: Phenomenex GFC , 4 mm L x 3 mm ID Säule: Zorbax GF Laufmittel: 0,25 Mol Li-acetat, 0,05 Mol Li-citrate ph 7,4 (Ampuwa) 2. Laufmittel: 95% Methanol, 5% Wasser (HPLCgrad/Am-puwa) Fluß: 0-15 min Laufmittel 1 (100%); 1,0 ml/min Gradient: min Laufmittel 2 (von 0 auf 100%); 1,3 ml/min min Laufmittel 2 (100%) min Laufmittel 2 (von 100 auf 0%) min Laufmittel 1 (100%); 1,0 ml/min Druck: ungefähr 65 Bar Retentionszeiten für AFLc-HSA: dimere Albuminfraktion 8,25 min monomere Albuminfraktion 9,16 min ungebundene Albuminfraktion 31,34 min 2 2

23 100 µv (%) 8 0 AFLc-HSA Minuten Abb. 3: Die Retetentionszeiten von AFLc-HSA in der HPLC Bei der Überprüfung der Retentionszeiten für AFLc-HSA durch HPLC-SEC lag die dimere Fraktion bei 8,53 Minuten, die monomere Fraktion bei 9,35 Minuten und ungebundenes AFL bei 33,3 Minuten. Die prozentualen Anteile betrugen für die dimere Fraktion 1,63%, für die Albuminfraktion 99,81% und für ungebundenes AFL 1,57% (Abb.3). 2.4 Die Markierung von AFLc-HSA mit radioaktivem 111 Indium Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) wird in DMSO in einer Konzentration von 20 mg/ml unter Erwärmung aufgelöst. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird eine 1,2fache molare Menge Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und eine 10fache molare Menge Hydroxysuccinimide (HSI) zugefügt. Über Nacht ist bei Raumtemperatur die Reaktion zum Succinimidylester (DTPA-HSIE) vollzogen. Die klare, farblose DMSO- Lösung wird langsam einem zweifachen molarem Überschuß zu der Proteinlösung (10 mg AFLc-HSA/ml 0.17 M NaHCO 3, ph 8.5) hinzugefügt. Über 15 Minuten bilden sich weiße kolloidale Aggregate, welche nicht reagiertem DCC und noch in DMSO gelö- 2 3

24 stem di-cyclohexyl-harnstoff (DCH) entsprechen. Diese werden mit Hilfe eines Filters entfernt (0,22 µm Millipore), während hingegen DMSO und freies DTPA durch Ultrafiltration (C30 Millipore) abgetrennt werden. DTPA-aktiviertes AFLc-HSA wird dann mit 111 InCl 3 durch Hinzufügen einer entprechenden Menge Radioaktivität als ein 111 In- Citrat-Komplex an10 mg Protein gebunden. Direkt nach Hinzufügens des 111 In-Citrat- Komplexes werden ungebundenes 111 In durch Ultrafiltration mit einer C30 Millipore Einheit abgetrennt. Mit Hilfe dieser Technik können 98 % des verwendeten 111 In kovalent an DTPA-AFLc-HSA gebunden werden. Um die Plasmazirkulationszeiten zu vergleichen, wurde AFLc-HSA auch in einer 3:1 molaren Beladung mit 111 In-DTPA markiert. Ebenfalls wurde das käuflich zu erwerbende Fluorescein-Isothiozyanat (FITC- SA) mit 111 In-DTPA beladen. 2.5 Das C6-Gliom Modell Weibliche, pathogenfreie (specific pathogen free, SPF) Sprague-Dawley-Ratten (n = 25) mit einem Körpergewicht von g wurden für die Fluoreszenzuntersuchungen mit AFLc-HSA verwendet. Die Tiere wurden unter standardisierten SPF Bedingungen in einem Mikroisolator gehalten. Die C6-Gliom Zelllinie (11) wurde in Gewebekultur in 90 % DMEM Medium (PAA Laboratories, Östereich) und 10 % fetalen Kälberserum (Gibco, Eggenstein) gehalten. Die Analgosedierung der Versuchstiere erfolgte durch intraperitoneale Injektionen von Ketanest (Park-Davis& Company, Berlin) und Rompun (Bayer, Leverkusen), danach konnte der Kopf in einem stereotaktischen Ringsystem (David Kopf Instruments, USA) fixiert werden. Nach Bohrlochtrepanation wurde in einer Geschwindigkeit von 2 mm/minute eine 10 µl Hamilton Spritze, versehen mit einer 26-Gauge Nadel, in das linke frontale Marklager der Ratte in einer Tiefe von 6 mm, 4 mm lateral des Bregmas eingebracht. Nach Zurückziehen der Nadel um einen Millimeter erfolgte die intrazerebrale Injektion in einer Dosierung von 1 x 10 5 C6-Gliomzellen in 5 µl serumfreiem DMEM Medium über einen Zeitrahmen von 5 Minuten (1 µl/minute). Nach langsamem Zurückziehen der Nadel (2 mm/minute) wurde das Bohrloch mit Knochenwachs verschlossen und die Haut vernäht. In mehr als 90 % der Tiere entwickelte sich ein solider Tumor im linken frontalen Marklager. Typischerweise war eine Gewichtsstagnation ein 2 4

25 Frühsymptom bei ausreichender Tumorgröße von 4-5 mm im Durchmesser. Die Tumorgewichte lagen zwischen mg. 2.6 Die Plasmaclearance von AFLc-HSA Diese pharmakokinetischen Untersuchungen von AFLc-HSA wurden an 7 nicht tumortragenden Tieren durchgeführt, welche 3,7 MBq 111 In-DTPA-ALFc-HSA intravenös appliziert bekamen. Die Plasmahalbwertszeit wurde durch Blutproben von 20 µl aus der Schwanzvene nach 5 Minuten, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h und 96 h ermittelt, wobei das Blutvolumen der Tiere nach der Formel (0,06 x Körpergewicht x 0,77) berechnet wurde (12). Die Plasmaproben wurden auf ihre Radioaktivität in einem γ Zähler (Berthold, Wildbad) untersucht. Insgesamt zeigte sich kein Unterschied in der Plasmahalbwertszeit zwischen 111 In-DTPA-ALFc-HSA und 111 In-DTPA-HSA, was als Ausdruck einer der nicht das Protein alterierenden und stabilen Beladung zu werten ist. Die Halbwertszeit des Albuminkonjugates AFLc-HSA wurde mit 2,5 Tagen angegeben und entspricht der normalen Halbwertszeit von Albumin bei der Ratte. Bereits bei eine Beladung von 3 : 1 molar AFLc-HSA wurden verkürzte Zirkulationszeiten beobachtet. Am deutlichsten war der Unterschied bei Fluorescein-Isothiozyant-Albumin (FITC-Albumin, Fa. Sigma, Deisenhofen), welches durch die Belandung deutlich verändert und 24 Stunden nach intravenöser Applikation fast nicht mehr nachweisbar war (Abb. 4). cpm In-DTPA-SA 111In-DTPA-AFLc-SA 1:1 111In-DTPA -AFLc-SA 3:1 111In-DTPA-FITC-SA h Abb.4: Semilogarithmische Darstellung der Plasmahalbwertszeit vom AFLc-HSA in verschiedenen Beladungsraten verglichen mit nativem Albumin und FITC-SA 2 5

26 2.7 Die Aufnahme von 111 In-DTPA-AFLc-HSA in das C6-Gliom Szintigraphische Untersuchungen sollten die Aufnahme des Proteinkonjugates im Tumor sowie seine Bioverteilung aufzeigen. Dazu wurden die Versuchstiere (n=5) 5 Minuten, 1 h, 4 h, 8 h und 24 h nach Applikation von 3,7 MBq 111 In-DTPA-ALFc-HSA szintigraphisch untersucht. Zudem wurden 24 h nach Applikation des radioaktiv markierten Proteinkonjugates die Rattengehirne entnommen, um die Radioaktivität im Gehirn selbst im γ-zähler untersuchen zu können. Die Aufnahme der Radioaktivität wurde sowohl im gesamten Gehirn wie auch der rechten nicht tumortragenden Hemisphäre, der linken tumortragenden Hemissphäre und nach Entnahme des Tumors in ihm selbst gemessen. Szintigraphisch fand sich kein Unterschied zwischen tumortragenden und nicht tumortragenden Tieren, so daß die Bestimmung der Aufnahme der Radioaktivität im C6- Gliom der Rattengehirne nur im γ-zähler möglich war. Insgesamt war der Anteil an Radioaktivität mit 0,04 0,34 % an der Gesamtverteilung im Körper gering. Dennoch fanden sich deutliche Unterschiede bei den einzelnen Gewebeproben zwischen den Tieren mit Tumor und denen ohne Tumor. Die Messung der gesamten Rattengehirne ohne Tumor ergab lediglich eine Aufnahme 0,1 % an Radioaktivität. Bei den tumortragenden Rattengehirnen dagegen steigerte sich die Aufnahme der applizierten Radioaktivität auf 0,23 %(Probe A). Die Messung der linken Gehirnhemisphären (Probe B) ergab dann aber eine Steigerung der Aufnahme an Radioaktivität bei den tumortragenden Tieren um das Dreifache. Kein Unterschied ergab sich bei der Messung der rechten Gehirnhälften (Probe C). Der spezifische Aktivitätsquotient berechnet den Anteil der applizierten Radioaktivität in Relation zum Tumorgewicht und dem Gewicht der Versuchstiere. Bei einer homogenen Verteilung berechnet sich somit ein spezifischer Aktivitätsquotient von 1, während hingegen ein Quotient von > 1 eine spezifische Aufnahme beweist. Die spezifischen Aktivitätsquotienten bei den nicht tumortragenden Rattengehirnen lag bei 0,12, bei den tumortragenen Rattengehirnen bei 0,26 und bei den linken Tumor tragenden Hemissphären bei 0,4. Die Berechnung des spezifischen Aktivitätsquotienten im Tumor selbst wies mit 2,8 eine 23fach höhere Aufnahme gegenüber dem normalen Gehirn nach (Abb.5). 2 6

27 Anteil (%) 0,3 0,25 Spezifischer Aktivitätsquotient 3 2,5 0,2 2 0,15 1,5 0,1 1 0,05 0,5 0 0 Probe 1 A Probe B Probe C Tumor Probe 1A Probe B Probe C Tumo Probe A: Rattengehirne gesamt Probe B: Tumotragende Gehirnhälften Probe C: Nicht tumortragendegehirnhälften. Abb.5:Anteile der aufgenommenen Radioaktivität von 111 In-DTPA-AFLc-HSA an verschiedenen Rattenhirnen. Die schwarzen Balken entsprechen der Kontrolltieren ohne Tumor, die grauen Balken den Tumortieren, die weißen Balken den entnommenen C6-Gliomen. 2.8 Fluoreszenzdiagnostik mit AFLc-HSA und AFL am C6-Gliom der Ratte Das mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5-Aminofluorescein kovalent konjugierte humane Serumalbumin wurde vergleichend zu freiem AFL für die laserinduzierte Fluoreszenzdiagnostik am C6-Gliom der Ratte herangezogen. Durch die kovalente Bindung an humanes Serumalbumin in einer 1 : 1 molaren Beladung ergab sich eine minimale Verschiebung des Absorptionsmaximums auf 497 nm (freies AFL 490 nm) und ebenfalls eine Verschiebung des Emissionsmaximums von 519 nm auf 523 nm (Abb. 6) nm/ 523 nm 2,5 Laser nm nm AFLc-HSA AFL 2 1,5 1 0, Wellenlänge (nm) Abb. 6: Absorptions- und Emissionsspektren von AFL und AFLc-HSA. Das Anregungslicht des Argonlasers liegt bei 488 nm. 2 7

28 Das Farbstoffkonjugat wurde den tumortragenden Tieren in Konzentrationen von 0,5 mg/kg Körpergewicht sowie 1,0 und 2,0 mg/kg Körpergewicht (5 Tiere pro Dosierungsgruppe) intravenös appliziert und die Rattenhirne 24 Stunden später in toto entnommen und bei - 70 C tiefgefroren. Vergleichend zur Fluoreszenzdarstellung mit AFLc-HSA wurde ungebundenes AFL bei 5 Tieren in einer Konzentration von 2,0 mg/kg Körpergewicht ebenfalls intravenös appliziert und ebenfalls die Rattengehirne 24 h danach entnommen. Als Anregungsquelle diente ein 10 Watt Argonlaser (Spectra Physics, USA). AFLc- HSA oder AFL wurden bei 488 nm angeregt (Ausgang Argonlaser 1,2 Watt, Bescheinung bei mwatt/cm 2 ). Zur Fluoreszenzbetrachtung wurde das Anregungslicht des Lasers durch einen Langwellengelbfilter bei 515 nm abgeschnitten. Makroskopische Fluoreszenzbetrachtung An koronaren Schnitten der 24 Stunden nach intravenöser Farbstoffapplikation entnommenen Gehirne wurden die tiefgefrorenen Proben in Höhe des maximalen Tumordurchmessers untersucht. Bei allen C6-Gliomen zeigte sich unter der laserinduzierten Fluoreszenzanregung eine gute Darstellung des durch AFLc-HSA markierten Tumors, wobei die Betrachtung der Fluoreszenzemission bereits mit bloßem Auge möglich war. Subjektiv war kein Unterschied in der Fluoreszenz zwischen den verschiedenen Konzentrationen bemerkbar. Im Gegensatz zu der sehr deutlichen Tumordarstellung mit AFLc-HSA fehlte diese 24 Stunden nach intravenöser Applikation von freiem AFL gänzlich (Abb. 7 a und b). Eine Autofluoreszenz des Gehirns wurde bei einer Anregung von 488 nm nicht beobachtet. Mikroskopische Fluoreszenzbetrachtung Um die Fluoreszenzdarstellung mit AFLc-HSA der histopathologischen Tumorgrenze zuordnen zu können, wurden koronare Kryostatschnitte in einer Dicke von 10 µm angefertigt. Die so gewonnenen Kryostatschnitte wurden im Fluoreszenzmikroskop betrachtet und mit einem direkt benachbarten H & E gefärbten Kryostatschnitt verglichen. 2 8

29 Dabei zeigte sich ein gutes Übereinstimmen der fluoreszenzoptischen Tumordarstellung mit der durch H & E markierten histopathologischen Tumorgrenze (Abb. 8 a und b). 2.9 Fluoreszenzlokalisation von AFLc-HSA in der C6-Gliom Zellkultur Um die Lokalisation des Farbstoffkonjugates in der Tumorzelle selbst genauer definieren zu können, wurden C6-Gliom Zellkulturen über 72 Stunden mit AFLc-HSA in einer Konzentration von 10 µg/ml inkubiert. Der nicht zellulär verbliebene Farbstoff wurde dann durch zweimaliges Waschen der Zellkultur mit Phosphatpuffer entfernt. Danach konnten die C6-Gliomzellen im Fluoreszenzmikroskop bei einer 1.000fachen Vergrößerung betrachtet werden. Dabei zeigte sich eine punktuelle, den Lysosomen entsprechende Akkumulation des Farbstoffkonjugates in den C6-Gliomzellen (Abb. 9). Somit kann vermutet werden, daß das Albuminkonjugat via Endozytose intrazellulär aufgenommen wird und sich dann im Lysosom der Zelle anreichert (Abb. 10). Trotz des sauren ph- Wertes im Lysosom (die Fluoreszenzemission ist ph abhängig) fand sich eine gute Fluoreszenz von AFLc-HSA in der Tumorzelle. Somit war die aktive Aufnahme des Farbstoffkonjugates in die Tumorzelle bewiesen, welche im Gegensatz zu den meisten gängigen Kontrastmitteln AFLc-HSA als intrazelluläres Kontrastmittel aufweist. 2 9

30 A B Abb. 7 a und b: Makroskopische Darstellung eines C6-Glioms der Ratte in Höhe des maximalen Tumordurchmessers einerseits gefärbt durch H&E (A), andererseits durch Fluoreszenzanregung mit Argonlaser (488 nm, 150 mw/cm 2 ) 24 h nach intravenöser Applikation von AFLc- HSA (B). Die Fluoreszenzbetrachtung wird ermöglicht durch Verwendung eines Langwellenfilters. 3 0

31 A B Abb. 8 a und b: Mikroskopische Tumordarstellung (Vergrößerung 200 fach) am Kryostatschnitt im Bereich der C6-Gliomtumorgrenze, einerseits dargestellt durch H&E (A), andererseits dargestellt durch AFLc-HSA (B). 3 1

32 Abb. 9: C6-Gliomzellen in Zellkultur 72 h nach Inkubation mit AFLc-HSA (10 µg/ml) bei einer 1000 fachen Vergrößerung. Der schwarze Pfeil gibt die Lokalisation des Farbstoffkonjugates im Lysomom der C6-Gliomzellen an. Abb. 10: Schematische Darstellung der Aufnahme von AFLc-HSA in maligne Gliomzellen. 3 2

33 2.10 Konfokale Mikroskopie mit AFLc-HSA und lysosomaler Markierung an C6-Gliomzellen Die Kultivierung der C6-Gliomzellen erfolgte in RMPI 1640 mit 10 % FCS und 1 % Glutamin. Für die konfokale Laserscanningmikroskopie (clsm, Fa. Zeiss, Oberkochen) wurden die Zellen abtrypsiniert, in einer Neubauer Kammer gezählt und auf 5 x 10 4 Zellen/ml eingestellt. Davon wurden µl auf Deckgläschen ausgesät (Durchmesser 12 mm) und für 24 Stunden bei 37 C mit 5 % CO 2 inkubiert. Auf 1 % reduziertem FCS Medium wurden die Zellen mit 50 µg/ml AFLc-HSA bzw. 50 µg/ml AFL überflutet und für weitere 24h kultiviert. Für die Lysosomenmarkierung wurden die C6-Gliomzellen dreimal mit RMPI ohne Zusätze gewaschen. Danach wurde Lyso Tracker Red (Absorption: 577 nm; Emission: 590 nm; Molecular Probes, USA) in einer Konzentration von 50 nm über 40 Minuten hinzugefügt. Wiederum wurden die Zellen dreimal mit RMPI ohne Zusätze gewaschen und anschließend am konfokalen Laserscanningmikroskop untersucht. Einerseits wurden die Zellen im Differentialkontrast inspiziert, andererseits wurde der Lyso Tracer bei 577 nm (rote Fluoreszenz) und AFL oder AFLc-HSA bei 488 nm (grüne Fluoreszenz) angeregt. Werden beide Fluoreszenzen übereinandergelegt, zeigen Orte, an denen beide Farstoffe lokalisiert sind, eine gelbe Fluoreszenz (Abb. 11 a). Somit war die Aufnahme von AFLc-HSA im Lysosom der C6-Gliomzellen bewiesen. Dagegen war nach Inkubation der Zellen mit freiem AFL keine punktförmige, den Lysosomen entsprechende Aufnahme zu erkennen. Hier konnte man eine unspezifische Verteilung von AFL im Zytoplasma beobachten (Abb. 11b). 3 3