Entwicklung von quantitativen Fluoreszenzmikroskopischen Messverfahren mit Einzelmolekülempfindlichkeit, nm Ortsauflösung sowie ps Zeitauflösung

Transkript

1 Entwicklung von quantitativen Fluoreszenzmikroskopischen Messverfahren mit Einzelmolekülempfindlichkeit, nm Ortsauflösung sowie ps Zeitauflösung S. Rüttinger, R. Macdonald, P. Kapusta, B. Krämer, F. Koberling, R. Erdmann Abschlussbericht BMWi-Kennzeichen: II D 5 12/06 Projektbeginn: Berichtzeitraum: Projektleitung: Prof. Dr. R. Macdonald (PTB, 8.3), Dipl. Phys. R. Erdmann (PicoQuant GmbH) 1

2 1. Einleitung Ziel des Projektes war die Untersuchung und Erprobung von Verfahren zur Quantifizierung der Messwerte der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sowie der Fluoreszenz-Lebensdauer Bildgebung (FLIM) im Sinne einer vorwettbewerblichen Entwicklung. Aufbauend auf gemeinsamen Vorarbeiten wurden hierzu erforderliche Hardware-Erweiterungen und Datenanalyseverfahren als Funktionsmuster soweit entwickelt, dass die beim Projektpartner PicoQuant (PQ) vorhandenen Systemlösungen für die Fluoreszenzmikroskopie mit den für derartige quantitative Messungen erforderlichen Hard- und Softwarekomponenten zukünftig erweitert werden können. Dies umfasst auch die Entwicklung von geeigneten Kalibrierstandards. Durch diesen Transfer von technisch-wissenschaftlichem Know- How ließ sich die Leistungsfähigkeit der von PicoQuant angebotenen Fluoreszenzmikroskopischen Messmöglichkeiten erheblich über den derzeitigen Stand der Technik anderer Anbieter hinaus verbessern. Zur Erreichung der Projektziele wurden im Verlauf des Vorhabens folgende Aufgabenstellungen bearbeitet: 1. Planung, Entwicklung, Charakterisierung und Erprobung einer geeigneten Referenz-Probe zur Charakterisierung konfokaler Fluoreszenzmikroskope. 2. Verifizierung und Integration zeitaufgelöster Methoden der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) mit dem Ziel, eine artefaktfreie (quantitativ korrekte) Analyse zu ermöglichen. 3. Evaluierung sowohl einer kurzpulsigen, spektral breitbandigen Anregungsquelle (Weisslichtlaser), als auch eines infraroten Femtosekundenlasers am vom Projektpartner vertriebenen konfokalen Mikroskop. 4. Übertragung der gewonnen Erkenntnisse und Konzepte auch auf Systeme mit Weitfeldbeleuchtung und Kameradetektion. 2. Stand der Wissenschaft und Technik Der Einsatz und die Anwendung Fluoreszenz-mikroskopischer Techniken auf einzelne oder wenige Moleküle wird derzeit international in vielen Forschungsgruppen vorangetrieben, da sich mit ihnen u.a. Erkenntnisse über wichtige elementare biochemische, biologische und biomedizinische Prozesse gewinnen lassen, während mit Ensemblemessungen nur sehr schwerlich Rückschlüsse auf die Funktion von Biomolekülen in realer, stark heterogener Umgebung (z.b. Zellen, Zellbestandteile) gezogen werden können. Um in den Lebenswissenschaften Fortschritte im Verständnis der Funktion biologischer Makromoleküle erzielen zu können, ist u.a. eine genaue Analyse der physikalischen Prozesse biomolekularer dynamischer Vorgänge erforderlich. Dies ist neben dem grundlagenwissenschaftlichen Erkenntnisgewinn insbesondere auch für Anwendungen auf dem Gebiet der molekularen Medizin (molekulare Diagnostik und Therapiekontrolle) wichtig. Hierfür werden insbesondere hochempfindliche, präzise mikroskopische Messverfahren benötigt, die hinsichtlich ihrer Genauigkeit validiert sein müssen. 2

3 Vor diesem Hintergrund wurden während der Projektlaufzeit zwei, Fluoreszenzmikroskopische Messmethoden zur Untersuchung intra- und intermolekularer dynamischer Prozesse auf der Ebene einzelner Makromoleküle weiterentwickelt und auch kombiniert: i) Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS), mit deren Hilfe lokale Fluktuationen in der Konzentration von Molekülen sowie deren dynamische Eigenschaften, z.b. Diffusion durch Brownsche Molekularbewegung quantitativ untersucht werden können. ii) Die Fluoreszenz-Lebensdauerspektroskopie und bildgebung (FLIM), womit lokale Veränderungen der mikroskopischen Umgebung von Sondenmolekülen untersucht und sichtbar gemacht werden können. Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie von einzelnen Molekülen wird seit den neunziger Jahren untersucht und angewendet. Von besonderem Interesse ist diese Technik zur Bestimmung der Diffusion sowie der lokalen Konzentration von fluoreszierenden Spezies im pico- bis nanomolaren Konzentrationsbereich, aber auch zur Untersuchung der Photophysik einzelner Moleküle sowie zur Bestimmung der molekularen Helligkeit einzelner Fluorophore [1]. Bisher konnten insbesondere im Bereich FCS meist nur sehr ungenaue oder relative Daten angegeben werden. Die Genauigkeit des Verfahrens und dessen Grenzen, insbesondere für Messungen der Konzentration sowie der Diffusion wurde im Rahmen einer Doktorarbeit in der PTB erstmalig genauer untersucht [2]. Die dabei gewonnenen Erfahrungen und Erkenntnisse waren eine wichtige Grundlage für die im Projekt durchgeführten Arbeiten. Durch die Kombination von FCS mit zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung [3] (TCSPC) zur Fluoreszenz-Lebensdauer Korrelationsspektroskopie (FLCS) [4] lässt sich darüber hinaus die Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung entscheidend verbessern. Ein derartiges Konzept wurde bisher von keinem Mikroskophersteller angeboten. Die Fluoreszenzlebensdauer ist ein wichtiger Messparameter, der zur Unterscheidung verschiedener (auch gleichfarbiger) Fluorophore dient oder die Anwesenheit von Molekülen (Akzeptoren) verrät, indem z. B. ein Energietransfer vom Fluorophor (Donor) zum Akzeptormolekül stattfindet und damit die Fluoreszenzlebensdauer des Donors verringert. Dieses lässt sich z. B. für nanometrische Abstandsmessungen intraoder intermolekularer Abstände durch Fluorescence resonance energy transfer oder auch Förster resonance energy transfer (FRET) ausnutzen [1, 2]. Obwohl FCS und auch Fluoreszenzlebensdauermessungen mittlerweile gängige Methoden im Bereich der biomedizinischen Forschung sind, werden sie fast ausschließlich qualitativ verwendet. Nach unseren Erkenntnissen sind während der Projektlaufzeit keine Veröffentlichungen bzw. Arbeiten anderer Gruppen zur besseren Quantifizierung von zeitaufgelösten Fluoreszenzmessungen bekannt geworden. Das Projekt wurde unter der Randbedingung begonnen, dass Erfahrungen aus gemeinsamen Vorarbeiten der Projektpartner in das Vorhaben mit einfließen können und eine wichtige Grundlage der weiteren Zusammenarbeit bilden. Bezüglich des wissenschaftlichen und technischen Standes, an den dabei angeknüpft wurde, ist zu erwähnen, dass sowohl die PTB als auch PQ über langjährige Erfahrungen auf dem Gebiet der quantitativen Einzelmoleküldetektion verfügen. Dabei liegt der 3

4 Schwerpunkt des Know-How seitens der PTB auf dem Gebiet der Metrologie, während das Know-How auf der Seite von PQ verstärkt instrumentell und applikativ ist. Durch die enge Zusammenarbeit von PQ mit zahlreichen internationalen Forschungseinrichtungen ist auch gewährleistet, dass die im Projektzeitraum angestrebten Aufgabenstellungen praxisrelevant waren. Spezifische Angaben zum wissenschaftlich-technischen Stand sind in den jeweiligen Absätzen des Ergebniskapitels zitiert. Der vorliegende Abschlussbericht fasst die Ergebnisse zusammen, die von den Projektpartnern während der Laufzeit des Vorhabens erzielt worden. 3. Projektverlauf 3.1. Projektmitarbeiter Projektmitarbeiter von Seiten der PTB war Herr Dr. Steffen Rüttinger aus dem PTB Fachbereich 8.3. Herr Rüttinger hatte bereits während seiner Dissertation Erfahrungen an Geräten des Kooperationspartners (PQ) gesammelt und verfügte zu Beginn des Projektes über metrologische Erfahrungen auf dem Gebiet der quantitativen Fluoreszenz-Mikroskopie. Diese Vorkenntnisse machten es möglich, sehr zügig mit den Projektarbeiten starten zu können. Auf der Seite von PicoQuant wurde das Projekt hauptsächlich von Herrn Dr. Felix Koberling und Herrn Dr. Peter Kapusta unterstützt. Herr Dr. Koberling ist Leiter der Systementwicklung und für die Entwicklung des in diesem Projekt verwendeten konfokalen Mikroskops MicroTime 200 verantwortlich. Herr Dr. Peter Kapusta ist Produktverantwortlicher für die von der Fa. PicoQuant entwickelten zeitaufgelösten Fluoreszenzspektrometer und Einzelphotonendetektoren. Weiterhin waren seitens der Firma PicoQuant Herr Dr. Benedikt Krämer, Dr. Volker Buschmann, Dipl.-Phys. Rainer Erdmann sowie Herr Volker Völlkopf in das Projekt involviert. Von der PTB haben noch mitgewirkt: Herr Dr. Andreas Kummrow, Frau Bettina Kupper und Prof. Dr. Rainer Macdonald Projekttreffen und Zusammenarbeit Projekttreffen wurden in regelmäßigen Abständen (viertel- bis halbjährlich) durchgeführt. Dabei waren alle unmittelbar an der Durchführung des Projektes beteiligen Mitarbeiter beider Projektpartner anwesend. Orientiert am Arbeitsprogramm wurden die erreichten Zwischenergebnisse und Probleme diskutiert sowie die nächsten Schritte festgelegt. Am 10. Juni 2008 fand außerdem ein Audit durch Herrn Dr. Mitschang vom BMWi statt. PicoQuant hat stets die im Arbeitsprogramm fixierten Aufgaben erfüllt. Darüber hinaus erwies sich die Kooperation mit PicoQuant als äußerst vorteilhaft, da umzugsbedingt an der PTB zeitweilig das Mikroskopielabor nicht zur Verfügung stand. Während dieser Zeit konnte der Fachbereich 8.3 der PTB auf die Infrastruktur und Mikroskope bei PicoQuant zurückgreifen und dort Messungen durchführen. Dies erwies sich auch für die Evaluierung des während des Projektes beschafften Weisslichtlasers als sehr hilfreich, da PicoQuant als Diodenlaserhersteller einschlägige Erfahrungen und kompetenter Ansprechpartner für die Evaluierung von Laserperformance ist und hier über eine sehr umfangreiche messtechnische Ausstattung verfügt. 4

5 3.3. Externe Kooperationspartner In das Projekt floss auch Erfahrung und Arbeit nicht direkt am Projekt beteiligter Partner ein. Dies war notwendig, da zum Einen weder die PTB noch PicoQuant über Möglichkeiten verfügen, z. B. biologische Proben zu präparieren, und zum Anderen auch nicht in der Lage sind, die entsprechenden Ergebnisse im Bezug auf die biologische Forschung zu interpretieren. Gleichzeitig liefert die Kooperation mit externen Partnern ein Feedback, das für die Evaluierung der Relevanz der entwickelten Konzepte und Methoden unabdingbar ist. Es folgt, nach Kapiteln sortiert, eine Auflistung der beteiligten externen Kooperationspartner und deren Zuarbeiten, für die die Projektpartner sehr dankbar sind: Gruppe Angewandte Laser Sensorik (ALS) der Universität Potsdam unter der Leitung von Dr. Carsten Dosche: Bereitstellung, Präparation und Färbung des Speicheldrüsenapparates der amerikanischen Küchenschabe (s. Kapitel 4.2) Prof. Jörg Enderlein, Universität Göttingen: Methodische Unterstützung für FLCS (s. Kapitel 4.5). Arbeitsgruppe von Prof. Petra. Schwille, TU-Dresden: Bereitstellung von Proben für FLCS in vitro (Kreuzkorrelation zweiter spektral nicht unterscheidbarer Fluoreszenzmarker) sowie für FLCS Messungen in Zellen (s. Kapitel 4.8.1). 5

6 4. Ergebnisse 4.1. Spektral breitbandige Einzelmolekülspektroskopie mit einem Pikosekunden-Weisslichtlaser Im Rahmen des Projekts wurde ein gepulster Weißlichtlaser (fianium SC450 AOTF, fianium Ltd.) beschafft und evaluiert. Die Evaluierung erfolgte sowohl unter technischen als auch unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten. Als zweiter Schritt wurde der Weisslichtlaser in das konfokale Mikroskop MicroTime 200 von PicoQuant integriert. Die ursprüngliche Idee, den Weisslichtlaser als eine universelle, durchstimmbare Anregungsquelle zu verwenden, stellte sich dabei derzeit als nicht realisierbar heraus, da das mit einem AOTF schmalbandig selektierte Laserlicht spektrale Seitenbanden zeigt, die die Fluoreszenzdetektion massiv stören.. Abbildung 1: Zeitaufgelöstes Spektrum des kurzpulsigen Weisslichtlasers. Eingestellte Wellenlänge 460 nm. Wärmere Farben bedeuten höhere Laserleistung. Idealerweise wird ein möglichst schmaler Punkt erwartet. Es ist sowohl ein zeitliche Verbreiterung (Antwortfunktion des Detektors, waagerechte Verteilung) als auch eine spektrale Verbreiterung (Unzulänglichkeit des verwendeten Monochromators senkrechte Verteilung) sichtbar. Die Seitenbanden des Weisslichtlasers zeigen sich als zusätzliche Verteilung auf einer gedachten schrägen Linie nach links oben (Dispersionskurve der Weisslichtfaser) (zur besseren Erkennbarkeit mit roten Kreisen markiert). Diese Seitenbänder wurden mit einem Monochromator basierten, zeitaufgelösten Spektrometer der Firma PicoQuant (FluoTime200) detailliert untersucht (siehe Abbildung 1). Für die Einzelmoleküldetektion erwies sich eine spektrale Filterung des Laserlichtes mittels schmalbandiger Anregungsfilter als zwingend notwendig. Der Einsatz dieser Filter steht einer Durchstimmbarkeit jedoch prinzipiell entgegen. Weiterhin werden in konfokalen Mikroskopen gewöhnlicher Weise dichroitische Strahlteiler zur Separation von Anregungs- und Fluoreszenzlicht verwendet. Für eine durchstimmbare Anregung wäre somit auch ein durchstimmbarer dichroitischer Filter erforderlich. Diese Technik ist allerdings von der Firma Leica patentiert und als singuläres Bauteil nicht frei kommerziell auf dem Markt verfügbar. Alternativ wäre auch die Benutzung eines 10/90 Strahlteilers vorstellbar. Dies erwies sich aber auf Grund der erwähnten Seitenbanden und der deshalb nötigen zusätzlichen spektralen Aufbereitung als problematisch. 6

7 Es wurde daher beschlossen, den Weisslichtlaser als mehrbandige Quelle bei festen, üblichen Wellenlängen (470 nm, 532 nm, 640 nm) zu verwenden. Dadurch könnten zum Beispiel mehrere Diodenlaser ersetzt werden. Dies bietet den Vorteil, austauschbare preiswerte Filter und dichroitische Strahlteiler verwenden zu können. Die bei der Integration des Weisslichtlasers in das MicroTime 200 gewonnenen Erfahrungen haben sich auch für den Wiederaufbau bzw. die Erweiterung des an der PTB entwickelten zeitaufgelösten, konfokalen Mikroskops als sehr hilfreich erwiesen, da sie sich direkt übertragen ließen Einzelmolekülspektroskopie mit Zweiphotonenanregung am MicroTime 200 Im Rahmen des Projektes wurde bei der Fa. PicoQuant mit Hilfe eines von der PTB zur Verfügung gestellten durchstimmbaren, infraroten Femtosekunden- Titansaphirlasers (fs-ti:sa, Spectra Physics MaiTai) die Integration dieser Lichtquelle in das MicroTime 200 System erprobt. Dabei konnte auf die Erfahrungen von Herrn Dr. Rüttinger sowohl in Bezug auf die technische Integration als auch hinsichtlich der Messung von Fluoreszenzkorrelationsspektren (FCS) mit Zweiphotonenanregung zurückgegriffen werden (2PE FCS). Abbildung 2 zeigt eine Korrelationskurve von Rhodamin 6G mit Zweiphotonenanregung. Der mit Zweiphotonenanregung bestimmte Diffusionskoeffizient ist dem Diffusionskoeffizienten für Einphotonenanregung [5] erwartungsgemäß nah. Eine genaue Bestimmung des Diffusionskoeffizienten erfordert Dual Fokus FCS [6, 7] oder ein exakt kalibriertes konfokales Volumen [P1]. Abbildung 2: FCS Kurve von Rh6G in H 2 O: Zweiphotonenanregung mit einer Wellenlänge von 800 nm.) 7

8 Der Einsatz von Zweiphotonenanregung ist wegen der guten Eindringtiefe besonders für die Bildgebung im Gewebe interessant. Im Rahmen des Projektes war es jedoch nicht möglich (auch nicht mit Hilfe anderer Kooperationspartner), Gewebeproben zu beschaffen, an denen Einzelmolekülexperimente möglich gewesen wären. Um die erfolgreiche Integration des fs-ti:sa Lasers am MicroTime 200 dennoch zu demonstrieren, wurden deshalb gemeinsam mit der Gruppe Angewandte Laser Sensorik (ALS) der Universität Potsdam Fluoreszenzlebensdauerbilder (Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM) von großformatigen Bereichen des Speichelapparates der amerikanischen Küchenschabe nach Zweiphotonenanregung aufgenommen. Die FLIM-Bilder wurden mit dem PTB fs-ti:sa Laser am MicroTime 200 aufgenommen, das für die Messungen mit einem Piezomotor betriebenen Weitbereichsscanner ausgestattet wurde. Dadurch war im Gegensatz zum standardmäßig eingesetzten Piezotisch (max. 100 x 100 µm²), die Aufnahme eines viel größeren Bildausschnitts (bis zu 80 x 80 mm 2 ) möglich. Neben der Autofluoreszenzbildgebung bei einer Anregungswellenlänge von 780 nm wurde die Cl - -Verteilung im Speichelapparat mittels eines Cl - -sensitiven Farbstoffs (MQAE) untersucht (siehe Abbildung 3). Dieser Farbstoff (MQAE) hat ein Absorptionsmaximum im UV Bereich (350 nm). Eine Verwendung derart kurzer Anregungswellenlängen ist in Gewebeproben jedoch aufgrund der geringen Eindringtiefe und der starken Autofluoreszenz des Gewebes nicht praktikabel, weshalb auf Zweiphotonenanregung zurückgegriffen wurde. Konkret wurde die Anregungswellenlänge auf 780 nm festgelegt, da sich bei dieser Wellenlänge der stärkste Bildkontrast ergab. Abbildung 3: FLIM-Bilder der Speicheldrüsen einer amerikanischen Hausschabe, beladen mit dem Cl - -sensitivem Farbstoff MQAE. Die mittlere Fluoreszenzlebensdauer ist mit einem Regenbogenfarbverlauf codiert dargestellt (man erwartet etwa Lebensdauern zwischen 3.5 ns und 7 ns). Wärmere Farben stellen eine längere Fluoreszenzlebensdauer und damit eine geringere intrazellulare Cl - - Konzentration dar. (A) Übersichtsbild des Speichelapparates (512 x 512 Pixel) Die Speicheldrüsen bestehen aus den traubenartigen Acini (a) dem verzweigten Gangsystem (d) und dem Reservoir (r). (B) Vergrößertes Detail: Das Epithelium des Gangsystems ist stark gefärbt, während die Acini eine schwächere Färbung aufweisen, hauptsächlich in den peripheren Acini Zellen. (C-D) Effekt von Cl - -freiem Speichel auf die intrazelluläre Chlorid Konzentration. Der 8

9 Speichelapparat wurde für 30 min mit einer sogenannten Null-Ringer Lösung gespült um Cl - -zu entfernen. Die Chloridreduktion erfolgt aber anscheinend nicht gleichmäßig, nur in einigen bestimmten Bereichen kann eine signifikante Chloridreduktion festgestellt werden (z.b. einige periphere Acini, markiert mit Pfeilen). Ionenkonzentrationen in Geweben sind für die biologische Forschung von großem Interesse. Allerdings ist die Messung in-vivo schwierig, da man nicht nur an ausgewählten lokalen Konzentrationen (die z. B. durch die Verwendung von Mikroelektroden zugänglich sind) sondern vor allem an Verteilungen der Ionen interessiert ist, also bildgebende Verfahren benötigt. Die gezeigten Experimente (siehe Abb. 3) demonstrieren, dass eine intrazelluläre Cl - Konzentrationsmessung im Gewebe am MT200 mittels Zweiphotonenanregung möglich ist Fluoreszenzstandards im Einzelmolekülbereich und quantitative Fragestellungen im Bereich konfokale Fluoreszenzmikroskopie Einzelmolekülmessungen sind für die konfokale Mikroskopie von großem Interesse, da sie die inhärente Möglichkeit der Quantifizierung bieten. Dabei fungiert ein einzelnes Molekül quasi als kleinste Einheit, und damit als abzählbare (Quanten-) Messgröße. Als wichtigste Messgrößen in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie wurden die Fluoreszenzintensität sowie die Fluoreszenzlebensdauer identifiziert. Für Messungen in Lösungen kommen noch weitere dynamische Messgrößen, wie die Diffusionszeit oder Messgrößen zur Erfassung photophysikalischer Prozesse (Beispielsweise Triplett-Dynamik oder cis-trans Isomerie) hinzu. Ein Fluoreszenzstandard sollte daher die Möglichkeit bieten, als Standard sowohl für Messungen der Fluoreszenzintensität als auch für die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer sowie Diffusionszeit dienen zu können. Neben einem Standard für diese Messgrößen ist weiterhin eine Kontrolle des Auflösungsvermögens des konfokalen Mikroskops wichtig. Zur Beschreibung des Auflösungsvermögens wird gewöhnlich die Punkverwaschungsfunktion (Point Spread Function, PSF) verwendet. Bereits am Anfang der Projektlaufzeit stellte sich heraus, dass für die Beantwortung der genannten Fragestellungen die Entwicklung von zwei grundsätzlich verschiedenen Standardproben notwendig sein wird. Eine Überlappung der Funktionalität beider Proben ist jedoch beabsichtigt und dient der zusätzlichen Validierung Standardprobe zur Bestimmung der PSF Als Standardprobe zur Vermessung der PSF wurde die in Abbildung 4 dargestellte Probe entwickelt. Sie besteht aus einem Aluminiumrahmen, in den auf zwei gegenüberliegenden Seiten 2 Glasdeckgläschen eingelassen sind. Eines der Deckgläschen wurde auf der Oberseite durch Spincoating mit einzelnen Cy5 und Atto-655 Molekülen in einem PVA Film versehen, während auf das andere Deckgläschen fluoreszenzmarkierte Kügelchen (Durchmesser 100 nm) (TetraSpeckTM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aufgetragen wurden. Dabei ist die Probe so hergestellt, dass die beschichteten Seiten der Deckgläser nach innen zeigen. 9

10 Abbildung 4: Standardprobe für die Vermessung der PSF auf einem invertierten Mikroskop. Durch Verklebung mit Epoxy-Klebstoff ist eine Versiegelung und damit höhere Haltbarkeit und leichtere Handhabbarkeit gegeben. Während die eine Probenseite mit den TetraSpeck-Kügelchen der direkten Visualisierung und Vermessung der PSF dient, kann die andere Seite mit den einzelnen Farbstoffmolekülen zur Demonstration der Einzelmolekülempfindlichkeit verwendet werden. Auch die Bestimmung der Fluoreszenzintensität einzelner Cy5und Atto655-Moleküle ist durch stufenweises Ausbleichen möglich. Abbildung 5 zeigt eine typische Messung der PSF in drei Raumebenen (xy, xz, yz) und zweifarbiger Anregung/Detektion. Eine einzige Messung erlaubt es so, die PSF für zwei Anregungs- und zwei Detektionswellenlängen zu bestimmen. Ein Fit der Schnitte (ebenfalls in Abbildung 5 dargestellt) erlaubt die Bestimmung der Größe und Lage des Zentrums der PSF. Der Überlapp der PSFs verschiedener Wellenlängen ist nicht perfekt, wie aus Tabelle 1 ersichtlich wird. Der relativ kleine Offset ist durch geringe chromatische Abberationen des Mikroskopobjektives und nicht auf fehlerhafte Justage zurückzuführen. Abbildung 5: xy- (Links), xz- (Mitte) und yz- (Rechts) Schnitte durch ein fluoreszentes TetraSpeck gemessen mit dem MicroTime. Zur Anregung wurden alternierend 480 nm und 640 nm Laserpulse verwandt. Die Detektionswellenlängen waren (520 ± 18) nm (grün) and (690 ± 35) nm (rot). Intensitätsprofile mit den jeweiligen Gauss Fits durch den Mittelpunkt erlauben die Bestimmung des Zentrums und der Ausdehnung des konfokalen Volumens. Die erhaltenen Abmessungen sind in Tabelle 1 aufgelistet. 10

11 Tabelle 1: Ausdehnung und Lage der in Abbildung 5 dargestellten konfokalen Volumina exc. 480 nm em. 520 nm exc. 640 nm em. 690 nm center position offset in µm width (FWHM) in µm x = 0.06, y = 0.01, z = 0.08 w x w y w z Abbildung 6 zeigt ein Bild der zweiten Seite des in Abbildung 4 dargestellten Referenzslides, das Deckgläschen, welches mit einzelnen Cy5 und Atto655 Moleküle, eingebettet in einem PVA-Film, beschichtet ist. Zehn dieser Referenzproben befinden sich momentan im Dauertest. Bei diesem Dauertest werden in unregelmäßigen Abständen die in Abbildung 5 dargestellten Bilder aufgenommen und analysiert. Abbildung 6: Fluoreszenz Intensitätsbild (links) und Fluoreszenzabklingkurven (rechts) zweiter, verschiedener einzelner Moleküle. Deutlich zu erkennen ist die unterbrochene Struktur der Spots, welche nicht auf einen Fehler bei der Aufnahme des Bildes zurückzuführen sind, sondern durch das Blinken bzw./und Ausbleichen der einzelnen Moleküle zurückzuführen sind. Rechts: Die rote Fluoreszenzzerfallkurve ist charakteristisch für Cy5 während die blaue Kurve der Fluoreszenzzerfallcharakteristik von Atto655 entspricht Standardprobe zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer und der molekularen Helligkeit (via FCS) Die zweite Standardprobe baut auf der Möglichkeit auf, die molekulare Helligkeit mittels FCS zu vermessen. Da FCS die Möglichkeit bietet, die absolute Partikelkonzentration pro Detektionsvolumen zu bestimmen, kann in Verbindung mit 11

12 dem gemessenen Signal, die pro Molekül detektierte Fluoreszenzintensität bestimmt werden. Da in einem konfokalen Mikroskop die Anregungs- und Detektionseffizienz nicht ohne Weiteres unabhängig voneinander vermessen werden kann, ist die molekulare Helligkeit eines ausgewählten Standardmoleküls prinzipiell ein geeigneter Kalibrationsparameter für die kombinierte Anregungs- und Detektionseffizienz. Weiterhin kann, unter der Voraussetzung, dass der Diffusionskoeffizient bekannt ist und ein entsprechendes Diffusionsmodell vorliegt/zutrifft, auch die axiale und laterale Ausdehnung der PSF durch FCS Messungen bestimmt werden. Durch Messung beider Standardproben ist also eine Validierung des Auflösungsvermögens möglich. In der konfokalen Mikroskopie wird eine Vielzahl verschiedener Fluoreszenzmarker eingesetzt. Da es unmöglich ist, alle verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zu vermessen, wurde beschlossen, die vier in Tabelle 2 aufgelisteten Fluoreszenzfarbstoffe zu benutzen. Bei der Auswahl wurden die folgenden Kriterien berücksichtig: Gute Wasserlöslichkeit Hohe Langzeitstabilität in Wasser Hohe Quantenausbeute Hoher Extinktionskoeffizient Monoexponentielle Fluoreszenzabklingkurve Möglichst einfache Photophysik Die ausgewählten Farbstoffe decken den üblicherweise benutzten Anregungs- sowie Detektionsspektralbereich gut ab. Tabelle 2 listet die ausgewählten Fluorophore zusammen mit ihren Fluoreszenzlebensdauern (in wässriger Lösung), Absorptionsund Emmissionsmaxima sowie die zu ihrer Anregung bzw. Detektion typischerweise eingesetzten Laserwellenlängen sowie Detektionsfilter auf. Alle Farbstoffe zeigen das gewünschte monoexponentielle Fluoreszenzabklingverhalten in Wasser. Tabelle 2: Ausgewählte, bei PicoQuant charakterisierte Fluoreszenz Referenz Farbstoffe. Name Absorptionsmaximum Emissionsmaximum Fluoreszenzabklingzeit Typische Anregungswellenlängen verwendete Detektionsfilter Atto nm 484 nm (3.5±0.1) ns 405 nm 430LP Atto nm 523 nm (3.8±0.1) ns 470 nm, 485 nm (520±20) nm Rh6G 530 nm 550 nm (3.9±0.1) ns 532 nm (580±35) nm Atto nm 684 nm (1.8±0.1) ns 633 nm, 640 nm (690±35) nm 12

13 Dabei spielen Atto488 und Atto655 eine besondere Rolle, da Farbstoffe in diesem Spektralbereich besonders weit verbreitet sind. Eine wesentliche Herausforderung stellt die Entwicklung einer geeigneten, dauerhaften Probenkapselung dar, da auch diese Standardprobe leicht zu handhaben und damit nicht jeweils frisch präpariert werden soll. Im Laufe des Projekts wurden verschiedene Konzepte getestet und weiterentwickelt (Abbildung 7). Abbildung 7: Verschiedene Referenzprobenkapselung frühe Prototypen für die Das aktuelle Konzept basiert auf den Erfahrungen, die mit den vorhergehenden Prototypen gesammelt wurden. Ursprünglich waren rechteckige GlasKapillaren als Prototyp vorgesehen (Abbildung 7, oben). Leider erwies sich die optische Qualität dieser Kapillaren als unzulänglich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Ein weiterer Prototyp ähnelte bereits dem aktuellen, in Abbildung 8 dargestellten. Als Material wurde Aluminium gewählt (Abbildung 7, Mitte). Es stellte sich jedoch heraus, dass sich in dem Aluminiumträger die Konzentration der Farbstoffmoleküle ständig verringert, vermutlich verursacht durch Adsorptionseffekte an den Wänden. Somit war es nicht möglich, die Standardproben reproduzierbar mit konstanten Konzentrationen zu befüllen. Aus diesem Grund wurde entschieden, Kunststoff als Trägermaterial zu verwenden. Als Kunststoff wurde zunächst Polypropylen gewählt, da es sich dabei um ein relativ hydrophobes, chemisch resistentes und inertes Material handelt. Da die Referenzproben in größerer Stückzahl gefertigt werden sollen, wurde ein externer Fertiger mit der Herstellung des in Abbildung 7 unten dargestellten Kunststoffträgers beauftragt. Die durch die Fräsung verursachte Oberflächenrauhigkeit stellte sich aber als viel zu grob heraus und die Herstellung mit glatterer Oberfläche als zu aufwändig bzw. teuer. Deshalb wurde als Alternative Polyoxymethylen Kunststoff (POM, Handelsname z. B. Delrin ) ausgewählt. POM hat den Vorteil, dass es härter als Polypropylen ist. Es besitzt ebenso wie Polypropylen eine stark hydrophobe Oberfläche, und ist resistent gegenüber laborüblichen Lösungsmitteln. Abbildung 8 zeigt den finalen Prototyp. Die vier Kammern werden mit einer wässrigen Farbstofflösung mit unterschiedlicher Konzentration befüllt. Der Konzentrationsbereich wurde auf die Größenordnungen 10-6, 10-8, 10-9 und < 10-9 Mol/Liter festgelegt. Dies entspricht bei einem Detektionsvolumen von ca. 1 fl einer gleichzeitigen, mittleren Anzahl von Molekülen im Detektionsvolumen von 7500, 75, 7.5 und < 1. 13

14 Der gewählte Konzentrationsbereich deckt den typischen und möglichen Konzentrationsbereich für FCS Messungen [P1] ab. Damit ist eine Justage des Mikroskops (z. B. Einstellung der Tubuslinse, oder der Deckglaskorrektur des verwendeten Objektivs) mit der Kammer mit der hohen Konzentration 10-6 Mol/L bei vergleichsweise deutlicher Signalstärke möglich, während mit den geringen Konzentrationen auch die Fähigkeit zu Messungen im Einzelmolekülbereich überprüft werden kann. Da die konfokalen Volumina verschiedener Mikroskopie-Systeme unterschiedlich sein können ist es von Vorteil, einen mehrere Größenordnungen abdeckenden Konzentrationsbereich zur Verfügung zu haben. Eine Anleitung zur Verwendung des Referenzslides wurde in die Bedienungs- und Justageanleitung des MicroTime 200 mit aufgenommen [P2]. Abbildung 8: Finaler Prototyp der Probenkapselung für die Standardprobe zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer und der molekularen Helligkeit. Wie erwähnt, ist die Fluoreszenzlebensdauer eine weitere wichtige Messgröße. Eine als Standardprobe geeignete Probe soll deshalb auch eine stabile, möglichst monoexponentielle, Fluoreszenzabklingkurve aufweisen, um als Standard zu dienen. Für die praktische Verwertbarkeit hat es sich weiterhin als nötig erwiesen, Standardproben mindestens in den 2 am häufigsten genutzten spektralen Bereichen (Anregung bei 470 nm und 640 nm) zur Verfügung zu haben. Deshalb wurden für den roten Spektralbereich Atto-655 in PBST (Phosphate Buffered Saline, 0.2 % Tween) und für den blauen Spektralbereich Atto-488 in PBST ausgewählt. Die Pufferlösung wird zur Stabilisierung des ph-wertes benötigt, da die Fluoreszenzlebensdauer ph- Wert abhängig ist. Die beiden Farbstoffe wurden gewählt, da sie einerseits einen monoexponentiellen Fluoreszenzzerfall haben und andererseits keinerlei (Atto-655) oder vernachlässigbare (Atto-488) Triplett-Dynamik zeigen. Damit können besonders einfache Modelle für die Auswertung verwendet werden, was die zu erwartende Genauigkeit der Ergebnisse verbessert. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Atto-655 als Referenzfarbstoff ist die sehr genau bekannte, mittels Dual Fokus FCS absolut bestimmte Diffusionskonstante [6] in Wasser. Zur Untersuchung der Stabilität befinden sich mehrere Referenzproben mit Atto-655 in PBST im Dauertest. Sollte dieser erfolgreich verlaufen, ist eine Ausweitung der Tests auf Atto-488 und evtl. auch andere Farbstoffe geplant. Im Rahmen dieser Dauertests werden mehrmals wöchentlich die Konzentration, die molekulare Helligkeit, die Diffusionskonstante sowie die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt. 14

15 Abbildung 9: Langzeitstabilität der Konzentration der Fluoreszenz Referenzproben. Die Schwankungen werden durch die Schwankungen der Justage des konfokalen Mikroskops hervorgerufen. Während der Projektlaufzeit wurden Langzeit- und Stresstests mit dem in Abbildung 8 dargestellten Prototyp durchgeführt. Abbildung 9 zeigt einen solchen Dauertest. Bei dieser Probe handelt es sich allerdings um ausschließlich mit Atto-655 gefüllte Probenkammern. Dauertests mit einer Mischung aus Atto-488 und Atto-655 wurden im Dezember 2009 begonnen und werden von PicoQuant auch über die Laufzeit des Projektes hinaus weitergeführt. Ziel dieses Dauertests ist nicht nur die Prüfung von Funktionalität und Langzeitstabilität/-praktikabilität sondern auch die Abschätzung der Genauigkeit bzw. Streuung der Standardproben. Die Proben waren innerhalb der Projektlaufzeit über einen Zeitraum von 3 Monaten mechanisch und photochemisch stabil. Es konnte bislang keine signifikante Veränderung der angesprochenen Parameter festgestellt werden. Die beiden verschiedenen Referenzproben werden von PicoQuant mittlerweile routinemäßig bei der Produktion des MT200, als auch bei Installationen und bei Kundenmessungen durch die Support bzw. Servicetechniker vor Ort eingesetzt. Somit werden die Proben einem erweiterten Praxistest unterzogen. Auch wenn es noch zu früh erscheint, die Tauglichkeit abschließend zu beurteilen, sind die Rückmeldungen sehr positiv. Die leichte und unkomplizierte Handhabbarkeit zusammen mit der mechanischen Stabilität wurde auch von den Servicetechnikern als sehr gut beurteilt. Die Referenzproben wurden auf Fachkonferenzen (PQ Single Molecule Workshop 2009, Photonics West San Francisco 2010) vorgestellt und sind auf reges Interesse bei Kunden gestoßen. Vorbehaltlich des erfolgreichen Dauertests ist eine Vermarktung seitens PicoQuant vorgesehen. 15

16 4.4. Quantitative Bestimmung der Dynamik von Fluorophoren in Flüssigkeiten: Diffusionskonstanten, Konzentrationsänderungen Neben der routinemäßigen Bestimmung der Diffusionsdynamik der oben erwähnten Standardproben wurde im Rahmen des Projektes auch die Genauigkeit der mit FCS bestimmbaren Messgrößen untersucht. Traditionell gibt es bei quantitativen FCS Messungen eine Reihe von Problemen, welche die Genauigkeit [9] der erzielten Messergebnisse beeinträchtigen. 1. FCS misst die Anzahl der Fluoreszenzmoleküle im Detektionsvolumen. Zur Konzentrationsbestimmung ist somit die Kenntnis des Detektionsvolumens nötig. Im Rahmen des Projektes wurden 3 verschiedene Möglichkeiten zur Bestimmung des Detektionsvolumens untersucht. Diese Arbeit wurde 2008 veröffentlicht [P1]. 2. Besonders bei niedrigen Konzentrationen (nm bis pm Bereich) beeinträchtigen unkorrelierte Untergrundsignale (z.b. durch Ramanstreuung oder Detektorrauschen) die Korrelationsmessung. Dadurch wird die Korrelationsamplitude gedämpft und die berechnete Konzentration wird als zu hoch ermittelt. 3. Alle Detektoren, die typischerweise für Einzelmolekülmessungen verwendet werden, zeigen so genannte Nachpulse (Afterpulsing). Dabei folgt dem initialen Detektionspuls (ausgelöst z.b. durch ein Fluoreszenzphoton) ein zweiter Puls. Der zeitliche Abstand des originären und des Nachpulses liegt typischerweise im Bereich von Mikrosekunden. Die Nachpulse verfälschen daher die Korrelationskurve und erschweren (bzw. verhindern) die Auswertung. Die genannten Probleme (2 und 3) lassen sich durch die Verwendung einer vergleichbar neuen Technik, der sog. Fluoreszenz-Lebensdauer-Korrelations- Spektroskopie (FLCS) [4] vermeiden. FLCS beruht auf gepulster Anregung und zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung [3] und kann somit sehr gut mit dem Produktspektrum von PicoQuant realisiert werden. Durch die gepulste Anregung und zeitaufgelöste Detektion ist es möglich, mittels aus dem Fluoreszenzzerfall berechneten Filterfunktionen, zwischen Komponenten mit unterschiedlicher zeitlicher Charakteristik zu unterscheiden. So kann Untergrund und Afterpulsing heraus gefiltert werden, aber auch beispielsweise zwischen zwei Fluorophoren mit unterschiedlicher Fluoreszenzzerfallsdauer unterschieden werden. Es wurden deshalb die Umsetzungs- und Einsatzmöglichkeiten dieses Ansatzes im Rahmen des vorliegenden Projektes näher untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass FLCS den quantitativen Konzentrationsbereich von FCS für sehr kleine Konzentrationen von ca. 10 nm bis hinab zu Konzentrationen von 1 pm erweitert. Abbildung 10 zeigt dies beispielhaft an einer Atto-655-Lösung mit einer Konzentration von 12.5 pm. Bei einem konfokalen Volumen von (1.5 ± 0.2) fl wird eine Korrelationsamplitude von ca. 85 erwartet. Die gemessene Autokorrelationskurve ist in Abbildung 10 schwarz dargestellt. Klar ersichtlich ist der Anstieg der schwarzen Kurve bei kurzen Korrelationszeiten, ein Artefakt, der durch Detektor Afterpulsing hervorgerufen wird. Dieses Artefakt lässt sich zwar vermeiden, indem man das Fluoreszenzsignal auf zwei Detektoren aufteilt und deren Messspuren 16

17 dann kreuzkorreliert (rote Kurve); die Korrelationsamplitude ist jedoch um einen Faktor 4 zu niedrig. FLCS (blau) hingegen liefert die erwartete Korrelationsamplitude und damit auch die richtige Konzentration. Weiterhin wurde beispielhaft an einer gemischten Lösung der Farbstoffe Cy5 und Atto655 demonstriert, dass es mit FLCS möglich ist binäre, spektral nicht unterscheidbare Mischungen von Farbstoffen zu separieren und quantitativ zu analysieren. Abbildung 10: FCS Kurven einer wässrigen, 12.5 pm Atto-655Lösung. Vergleich von Autokorrelation (schwarz), Kreuzkorrelation (rot) und FLCS (blau). FLCS liefert die, auf Grund der Konzentration erwartete, Korrelationsamplitude von 85, während sowohl Autokorrelation als auch Kreuzkorrelation auf Grund des unkorrelierten Untergrundes zu niedrige Amplituden liefern. Abbildung 11: Konzentrationsbestimmung unterschiedlicher binärer Mischungen aus Atto655 und Cy5 in einer wässrigen Lösung mittels FLCS. 17

18 Mittels FLCS konnten sowohl die Konzentrationen als auch die Diffusionskonstanten der zwei Farbstoffe bestimmt werden. Abbildung 11 zeigt die entsprechenden Ergebnisse der Konzentrationen. Die schwarzen Linien entsprechen den erwarteten (d.h. eingewogenen) Werten. Die Differenz der Diffusionskonstanten betrug dabei nur 25% und konnte dennoch klar unterschieden werden, während mit traditioneller FCS erst Diffusionskonstanten, die sich um einen Faktor von 1.6 unterscheiden, separat bestimmt werden können [9]. Durch Einsatz der FLCS-Methode, lassen sich eine Reihe von neuen Anwendungen einfacher und genauer realisieren, insbesondere für Kreuzkorrelationsmessungen. Für Kreuzkorrelationsexperimente wurden bisher typischerweise spektral separierbare Fluorezenzmarker eingesetzt, bei denen jedoch die Quantifizierung durch inhärent verschiedene Detektionsvolumina behindert wurde. Mittels FLCS lassen sich Kreuzkorrelationsmessungen mit nur einem Detektionskanal durchführen. Die Unterscheidung der beiden Fluoreszenzmarker erfolgt durch ihre unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauer und nicht ihr Spektrum. Dadurch wird der experimentelle Aufwand geringer und damit nicht zuletzt auch signifikant preiswerter. Die Ergebnisse zur FLCS sowie FCS plus TCSPC wurden auf mehreren internationalen Fachtagungen präsentiert und als Konferenzartikel [P3, P4] bzw. im Journal of Fluorescence veröffentlicht [P5]. Die im Rahmen des Projektes gezeigte Robustheit und Korrektheit von FLCS führte auf Seiten von PicoQuant zur Entscheidung, diese Technik in ihre Mikroskop-Software SymPhoTime aufzunehmen. Während dieses Projektes wurde die Integration aktiv begleitet [P6, P7] Absolute Diffusionskonstanten: Zusammenstellung von Referenzdaten für die FCS Kalibrierung Für die Kalibrierung von FCS-Messungen ist die genaue Kenntnis des Diffusionskoeffizienten von großer Bedeutung. Im Rahmen desprojektes wurde daran mitgewirkt, eine Zusammenstellung der Diffusionskonstanten verschiedener Farbstoffe zu erstellen. Dabei wurden sowohl auf Literaturangaben als auch auf eigene Messungen zurückgegriffen. Diese Zusammenstellung wurde in einer Application Note auf der PicoQuant Webseite veröffentlicht [P8] Übertragung der gewonnen Methoden und Ergebnisse auf konventionelle (nicht zeitaufgelöste) konfokale Laser Scanning Mikroskope Die Methoden zur System-Charakterisierung basierend auf den vorgehend beschriebenen Standardproben sind auch auf konventionelle konfokale Laser Scanning Mikroskopiesysteme übertragbar; teilweise allerdings in eingeschränkter Form falls die Mikroskope nicht über die notwendige Zeitauflösung verfügen. Für Fluoreszenzlebensdauermessungen und FLCS ist die Aufrüstung der Systeme durch entsprechende Upgrade-Kits nötig, wie sie zum Beispiel von der PicoQuant GmbH oder von der Becker&Hickl GmbH angeboten werden. Ein weiterer Vorteil der Verfügbarkeit von Standardproben ist, dass es damit erstmals möglich ist, die Performance verschiedener Geräte direkt miteinander zu vergleichen. Dies wurde von PicoQuant insbesondere anhand der molekularen Helligkeit schon erfolgreich an verschiedenen Konfokalmikroskopen anderer Hersteller ausprobiert. Nach Abschluss der Dauertests der Standardproben ist eine Vergleichsstudie mit konfokalen Mikroskopen verschiedener Hersteller angedacht. 18

19 Bei der Vorstellung der Referenzproben auf der Photonics West Messe 2010 in San Francisco [P9] wurde ein starkes Interesse von potentiellen Anwendern als auch Mikroskopherstellern (Leica, Zeiss) festgestellt Aufrüstung von CLSMs zur Detektion der Moleküldynamik von Fluorophoren in Flüssigkeiten (Fluorescence Correlation Spectroscopy) Ergebnisse, die im Verlauf des hier dargestellten MNPQ-Vorhabens sowie weiteren Förderprojekten gewonnen wurden, flossen bei PicoQuant in die Entwicklung und Weiterentwicklung von Upgrade Kits für nachfolgende Laser Scanning Mikroskope (LSM) anderer Hersteller ein: Zeiss LSM 510, Leica SP5 und Olympus FV300 bzw. FV1000 ein [P10] FLCS Kreuzkorrelationsmessungen an einem Zeiss LSM 510 mit PicoQuant Upgrade-Kit Durch Erweiterung des Zeiss-LSMs 510 mit einem PicoQuant Upgrade-Kit sind mit diesem konfokalen LSM zeitaufgelöste und damit auch FLCS Messungen möglich.. Neben der oben beschriebenen Vermeidung von Artefakten, die zu systematischen Fehlern bei der Konzentrationsmessung führen, ist es dadurch auch möglich Kreuzkorrelationsexperimente mit spektral nicht unterscheidbaren Fluoreszenzmarkern durchzuführen. Die Methode benennt sich in Anlehnung an FLCS: FLCCS (Fluorescence Lifetime Cross Correlation Spectroscopy). Dadurch ergibt sich der Vorteil eines identischen konfokalen Volumens für beide Korrelationskanäle; eine aufwendige Korrektur der Artefakte, die durch verschiedene konfokale Volumina bei spektraler Trennung hervorgerufen werden, ist nicht nötig. Abbildung 12 zeigt eine Kreuzkorrelationsmessung von mit Alexa-633 und Alexa-647 markierter doppelsträngiger DNS. Die Proben wurden in der Gruppe von Petra Schwille an der TU-Dresden präpariert und dort an einem Zeiss LSM 510 mit nur einem Detektionskanal vermessen. Diese Experimente zeigen, dass FLCCS Messungen auch an für die biologische Forschung relevanten Proben möglich sind. Abbildung 12: FLCS in vitro: Kreuzkorrelation zweiter spektral nicht unterscheidbarer Fluoreszenzmarker. Bei der Probe handelt es sich um ein markiertes, doppelsträngiges DNS Molekül. Die Unterscheidung der beiden Fluoreszenzmarker erfolgt über deren Fluoreszenzlebensdauer. Die niedrigere Amplitude der Kreuzkorrelationskurve ist auf unvollständige Bindung (Hybridisierung der DNS) oder fehlende Fluoreszenzmarker an einigen Molekülen zurückzuführen. (Abbildungen zur Verfügung gestellt von: M. Gärtner, P. Schwille, TU-Dresden) 19

20 Bei FCS Messungen in Zellen kann FLCS zur Reduzierung des Einflusses des Untergrundes verwendet werden, in dem nur Signale mit der erwarteten Fluoreszenzlebensdauer korreliert werden. Abbildung 13 zeigt eine solche Messung. Deutlich sichtbar ist die höhere Amplitude der FLCS Messung im Vergleich zur herkömmlichen FCS Messung im Zellkern. Diese höhere Amplitude ist auf die Reduktion des Autofluoreszenz-Untergrundes zurückzuführen. Abbildung 13: Vergleich von FCS und FLCS Messungen an ER-293-Zellen mit konstantem egfphago2-expressions-level (10 G- Zellen), sowohl im Zellkern als auch im Zellplasma. FLCS hilft den autofluoreszenten Untergrund zu unterdrücken. Dies wird deutlich durch die reduzierte Amplitude der FCS Kurve im Vergleich zur FLCS Kurve. Autofluoreszenter Untergrund ist unkorreliert und senkt so die Korrelationsamplitude. Dadurch kann die schwierige Untergrundkorrektur bei Anwendung von FLCS entfallen. (Abbildungen zur Verfügung gestellt von: M. Gärtner, P. Schwille, TU-Dresden) 4.8. Erweiterung und Kombination mit Weitfeldbeleuchtung und EMCCD Kameradetektion Für Weitfeldmikroskopie mit Einzelmolekülempfindlichkeit sind die Aussagen zur Quantifizierung auf der Basis der Fluoreszenzintensität einzelner Farbstoffmoleküle als kleinste Einheit übertragbar. Dabei soll die Fluoreszenzintensität verschiedener 20