Wesentliche Bestandteile von Bakterien:

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1 Wochenbericht vom Mikrobiologisches Arbeiten Nils Volkening Wesentliche Bestandteile von Bakterien: Die Hauptbestandteile der Bakterienzelle sind Zellwand und Zytoplasmamembran sowie Zytoplasma mit dem darin eingelagerten Nukleoid und anderen Strukturen. Zellwand: Sie bildet den Abschluß der Zelle nach außen. Ihre starre Struktur verleiht dem Bakterium die charakteristische Gestalt und schützt es vor äußeren Einwirkungen. Außerdem spielt sie eine Rolle beim Stofftransport und offenbar auch bei Wachstum und Teilung. Das Murein, ein für die Bakterien charakteristisches, bei Pflanzen und Tieren nicht vorkommendes, polymeres Makromolekül, welches das Zellinnere wie ein Beutel oder Sack (Murein-Sacculus) umhüllt, ist für die starre Struktur der Zellwand verantwortlich. Es besteht aus zwei Aminoverbindungen (N- Azetylglukosamin und N-Azetyl-Muramin-säure), die zu langen, unverzweigten Ketten aneinander geheftet und durch Oligopeptide über Aminosäurebrücken querverbunden sind. Die Zellwand grampositiver Bakterienarten enthält eine dicke Mureinschicht. Sie ist dicker als diejenige der gramnegativen Arten, die ihrerseits aus einer Mureinschicht und einer äußeren Membran besteht. Zytoplasmatische Membran: Sie ist durch einen Spalt von der darüberliegenden Zellwand getrennt und umschließt als dünnes Häutchen das Zytoplasma. In dieses hinein entwickelt sie, vor allem bei grampositiven Bakterien, unregelmäßige Einstülpungen, die Mesosomen, die möglicherweise mit dem Energiestoffwechsel in Beziehung stehen. Die zytoplasmatische Membran ist der Sitz von Enzymsystemen, die der Energiegewinnung dienen, aktiv den Ein- und Austritt vieler Stoffe steuern und am Aufbau von Zellwand- und Kapselbestandteilen beteiligt sind. Zytoplasma: Neben RNA sind Eiweiße, Enzyme, Stoffwechselprodukte und Salze in dem wäßrigen Substrat vorhanden. Als essentieller Bestandteil jeder Bakterienzelle ist das Nukleoid im Zytoplasma lokalisiert. Es repräsentiert in Form eines stark gefalteten und verdrillten, doppelsträngigen DNA-Moleküls das Genom und bildet damit das Äquivalent des Zellkerns von Eukaryonten. Ribosomen setzen sich aus großen und kleinen Untereinheiten zusammen, bestehen aus RNA und Proteinen und dienen der Proteinsynthese. In Abhängigkeit von den einzelnen Bakteriengruppen bzw -arten kann die Bakterienzelle noch folgende weitere Strukturen aufweisen: Geißeln: Je nach Vorhandensein oder Fehlen wird zwischen begeißelten (beweglichen) und unbegeißelten Bakterien unterschieden. Geißeln sind etwa 0,02

2 µm dicke, bis zu 20 µm lange, fädige Instrumente der aktiven Fortbewegung. Sie bestehen aus Protein (Flagellin) und entspringen im Zellinnern; ihre Zahl und Anordnung ist für die einzelnen Bakterienarten charakteristisch. Polare Geißeln entspringen an einem oder beiden Bakterienpolen. Sporen: Einige Bakterienfamilien bilden unter gewissen Voraussetzungen Dauerformen, sog. Endosporen, die es ihnen ermöglichen, ungünstige Lebensbedingungen zu überstehen. Die Sporenbildung läuft im Innern des Zelleibes ab, wobei sich genetisches Material im Bereich der künftigen Spore konzentriert. Durch Ausbildung einer Hülle und einer Rinde erhält das Innere einen erhöhten, meist beträchtlichen Schutz gegen äußere Einwirkungen. Die Reste der ursprünglichen Zelle fallen nach Reifung der Spore ab. Ihr Inhalt bleibt gewöhnlich über viele Jahre lebensfähig. Unter geeigneten Bedingungen keimt die Spore zu einer durch Teilung vermehrenden Zelle aus. Formen von Bakterien: KugeIformen (Kokken, von gr. Kokkos: Kern, Korn): Zu diesen werden runde und (längs-)ovale oder, bei Zweier-(Diplo-)lagerung, an den benachbarten Seiten abgeplattete Zellen gerechnet. Bei längsovalen Kokken ist die Unterscheidung gegenüber kurzen (sog. kokkoiden) Stäbchen nicht immer leicht zu treffen. Stäbchenbakterien (von gr. Bakteria, Stab) unterscheiden sich durch Länge und Dicke (z.b. kurz, lang, fädig, dünn) und deren Verhältnis (schlank, plump), durch Gestaltung der Enden (z.b. eckig, zugespitzt). Schraubenbakterien sind gekrümmt bis spiralförmig; Windungen zeigen zusätzlich Unterschiede in Zahl und Breite (Teilstücke, etwa bei Kommabakterien; bis zu mehr als 20 Schraubengängen bei anderen Arten).

3 Größe der Bakterien: Die Größe der Bakterien schwankt in Abhängigkeit von der Spezies, aber auch von den Milieubedingungen. Die kleinsten Formen (etwa Rickettsien) liegen zum Teil unter der lichtoptischen Sichtbarkeitsgrenze (etwa 0,2-0,3 µm); nach oben gibt es keine eigentliche Grenze (meist 0,5-5, aber auch mehr als 50 µm). Der Durchmesser der Kokken und die Dicke der Stäbchen liegen meist bei 0,5-1,5 µm. Bei Schraubenbakterien gibt es Arten, die zwar µm lang, wegen ihrer geringen Dicke (unter 0,2 µm) aber im Hellfeld ohne besondere Färbung nicht sichtbar sind. Anzucht der Bakterien: Wenn man Keime hat, die schon etwas angeschlagen sind, ist es ratsam diese Keime in eine Bouillon zugeben, da die Keime von Nährstoffen umgeben sind und sie sich diese nicht aus dem Nährboden holen müssen. Wenn sich die Bouillion nach 12Std. Bebrütung trübe gefärbt hat, vermehrt sich der Keim. Eventuell muß der Keim auch länger bebrütet werden oder er braucht eine andere Zusammensetzung der Luft ( aerob und anaerob ).Nun kann man den Keim auf einen festen Nährboden beimpfen. Dazu nimmt man mit einer Öse etwas Bouillion auf und trägt diese auf den Nährboden auf. Hierzu benutzt man einen 3- Ösenausstrich. Das Material wird mit der ersten Öse auf der Hälfte des Nährbodens verteilt (siehe 1.), mit der zweiten Öse geht man am Rand durch den ersten Ausstrich und verteilt ihn weiter auf einem Viertel des Nährmediums ( siehe 2.) und mit der dritten Ösen geht man durch den zweiten Ausstrich und verteilt ihn im letzten Viertel ( siehe 3.). 1.) 2.) 3.) 4.) Der 3-Ösenausstrich wird verwendet um einzelne Kolonien auf dem Nährboden zu isolieren. (siehe 4. unten links ) Differenzierung: Durch die Kombination von Gestalt, Farbe und Größe (Morphologie) der Kolonien ergeben sich erste Hinweise auf die mögliche Zugehörigkeit zu größeren Gruppen, im Einzelfall auch zu Arten. Durch die Bunte Reihe kann man durch das biochemische Verhalten, Bakterien identifizieren. Weitere Hinweise liefern Enzymreaktionen, die man bei einigen Nährböden durch den Farbumschlag erkennt und durch die Hämolyse von einigen Bakterien oder durch eine Antigen Antikörperreaktion differenziert. Eine weitere Differenzierung kann man durch das Weiterbeimpfen der Keime auf verschiedene Nährböden bewirken, die z.b. Differenzialzusätze enthalten, die einige Keime hemmen und bei andere das Wachstum fördern oder unter anderen Bedingungen, wie z.b. ohne O 2 oder mit mehr CO 2. Viele Bakterien sind in der Lage ihren Stoffwechsel nur anaerob ( ohne Sauerstoff ) oder aerob ( mit Sauerstoff) durchzuführen. Einige sind sogar in der Lage, sowohl anaerob als auch aerob, zu wachsen.

4 Eine weitere Möglichkeit ist das Differenzieren von Keimen unter dem Mikroskop: Als erstes müssen Präparate angefertigt werden. Es gibt zwei Möglichkeiten Präparate herzustellen, 1.) Nativpräparate und 2.) fixierte Aufstrichpräparate. Zu 1.) Nativpräparate werden zur schnellen Orientierung über Größe und Form der Mikroorganismen hergestellt. Herstellung : 1.) Einen,,Tropfen'' flüssiges Untersuchungsmaterial mit der Öse auf einen Objektträger aufbringen bzw eine gerade sichtbare Menge Kulturmaterial in einen Tropfen physiologischer NaCl-Lsg. (oder Leitungswasser) homogen einreiben. 2.) Deckglas auflegen 3.) Mikroskopieren mit 10 x, 40x, oder 100x Ölimmersionsobjektiv, abgeblendet betrachten. Zu.2) Fixierte Aufstrichpräparate werden zum Färben benutzt. Herstellung : 1.) von flüssigen Medien. Mit einer Öse wird so viel Flüssigkeit auf einem sauberen Objektträger ausgestrichen, daß 2-3 cm 2 bedeckt werden. 2.) von Kolonien auf festen Nährmedien. Ein,,kleiner'' Tropfen physiologischer NaCl-Lsg. wird auf die Mitte eines Objektträgers gebracht, darin wird mit einer Öse wenig Bakterienmaterial von der zu prüfenden Kolonie gut verrührt. Die Suspension wird auf etwa 2-3 cm 2 des Objektträgers ausgestrichen. Achtung Erst luftgetrocknete Präparate dürfen erhitzt werden, indem der Objektträger - beschichtete Seite nach oben - dreimal durch die Flamme gezogen wird; das Präparat wird auf diese Weise fixiert. Vor allem die Gram-Färbung kann ein wichtiges Element der Identifizierung sein. Zu beachten ist jedoch, daß bestimmte Milieubedingungen (z.b. Anhäufung von Stoffwechselprodukten oder ph-verschiebungen, Antibiotikawirkung) zu Gestaltveränderungen führen. Färbung von Bakterien verbessert vielfach die Sichtbarmachung. Die am meisten angewandte Methode ist die Gram-Färbung. Sie ermöglicht eine Differenzierung in grampositive (nach Färbung blaue) und gramnegative (nach Färbung rote) Bakterien. Unterschiede der Färbbarkeit beruhen bei diesem Verfahren auf einem differenten Aufbau der Zellwand. Ein Teil der Bakterienarten ist durch Gram-Färbung nicht darstellbar, weil diese Organismen die Farben nicht annehmen (z.b. Mykobakterien ) oder weil sie bei der üblichen Hellfeldmikroskopie unterhalb der Grenze der Sichtbarkeit liegen (z. B. Treponemen). In diesem Fall sind besondere Formen der Darstellung erforderlich, wie Ziehl- Neelsen- oder Auraminfärbung.

5 Gram - Färbung Die Färbung nach Gram stellt eines der wichtigsten Färbeverfahren in der Bakteriologie dar, das die Aufteilung der Bakterien in zwei Gruppen (,,grampositive'' und,,gramnegative'' Bakterien) ermöglicht. Die Farbreaktion ist eng korreliert mit der Struktur der Zelle und mit verschiedenen weiteren Eigenschaften ; der Färbung kommt daher auch eine wesentliche Bedeutung zu. Bei Färbung mit Methylviolett und Beizung mit Lugolscher Lösung entsteht in der Zelle ein Farbe Jod - Komplex, der bei grampositiven Bakterien unter der Wirkung eines Entfärbungsmittels (Alkohol, Azeton) infolge verminderter Zellwand-Durchlässigkeit in der Zelle festgehalten wird; in diesem Falle behalten entsprechende Mikroorganismen ihre einmal angenommene blauschwarze (grampositive) Färbung bei. Bei den grammnegativen Bakterien verläßt der Farbe-Jod-Komplex unter der Einwirkung des Entfärbungsmittels die Zellwand nach außen. Bei der nachfolgenden Gegenfärbung, z.b. mit Fuchsin, nehmen die Keime nun diesen Farbstoff auf und erscheinen jetzt rot (gramnegativ). Identifizierung gramnegativer Bakterien mit der,,bunten Reihe" Eine Bunte Reihe besteht aus verschiedenen Nährmedien (Kligler Röhrchen, Harnstoff Röhrchen, MIO Röhrchen, Ammoncitrat Röhrchen und einem Mannit - Röhrchen), die zur Identifizierung von einigen charakteristischen Stoffwechseleigenschaften von Bakterien verwendet werden. Beimpfen der Bunten Reihe : Man nimmt eine Öse und nimmt eine oder mehrere Kolonien ( bei kleinen 2 4 Kolonien ) vom Nährboden und beimpft damit die Röhrchen. Die Öse wird in das Kligler - Röhrchen eingeführt und danach in das Harnstoff Röhrchen, beide werden in schlängelnden Linien auf dem Schräg - Agar beimpft. Beim MIO Röhrchen wird fast genauso verfahren, außer daß man mit der Öse bis auf den Boden sticht und somit das Röhrchen beimpft. Das Citrat Röhrchen wird auch wieder in schlängelnden Bewegungen beimpft. Im Mannit Röhrchen wird die Öse dann ausgeschüttelt. 1. GIucose- und Lactoseabbau sowie SchwefeIwasserstoffbiIdung Der fermentative Abbau von Glucose und Lactose erfolgt ebenfalls unter Säure- und gegebenenfalls auch unter Gasbildung. Schwefelwasserstoff kann aus anorganischen und organischen Schwefelverbindungen entstehen. Das,,Kligler- Röhrchen'' (Zweizuckereisenagar) ist ein sogenanntes polytropes Medium, d.h. ein Nährboden mit dem man mehrere bakterielle Stoffwechselleistungen gleichzeitig erkennen kann. Es enthält u.a. 1 Teil Glucose und 10 Teile Lactose, sowie Phenolrot als lndikator. Beim Abbau von Glucose schlägt der lndikator nur in der unteren Hälfte des Röhrchens ("dem Stich") nach gelb um. Beim Abbau von Glucose und Lactose wird der ganze Nährboden (Stich und Schrägfläche) gelb. Eine eventuelle Gasbildung ist leicht am Zerreißen des Nährbodens erkennbar. Das Kligler-Röhrchen enthält außerdem Natriumthiosulfat und Eisen-ll-Sulfat. Eine Schwefelwasserstoffbildung aus Natriumthiosulfat führt zur Schwärzung des Stichs durch entstehendes Eisensulfid. 2. HarnstoffspaItung Harnstoff kann unter Alkalisierung des Nährbodens in Ammoniak und Kohlendioxid gespalten werden. Das Harnstoff-Röhrchen enthält u.a. Harnstoff, dessen Spaltung durch den Farbumschlag des Indikators Phenolrot nach rot angezeigt wird.

6 3. MIO ( Motilität, Indol und Ornithin ) Motilität erkennt man wenn sich das ganze Röhrchen gleichmäßig getrübt ist. Manche Bakterienarten bauen die Aminosäure Tryptophan zu lndol ab. Das "lndol- Röhrchen" enthält tryptophanhaltiges Peptonwasser. Nach der Bebrütung wird Kovacs - Reagenz zugesetzt, das sich in Gegenwart von lndol kirschrot färbt. Den Ornithinabbau erkennt man am Farbumschlag nach gelb. 4. Verwertung von Ammoncitrat Das Vermögen mancher Bakterienarten, Ammoniumionen als einzige Stickstoffquelle und Citrationen als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten, führt zu einer Alkalisierung des Nährmediums. Das Ammoncitrat-Röhrchen enthält u.a. Ammoniumcitrat und Bromthymolblau als Indikator. Wenn sich Bakterien in diesem Medium vermehren können, führt dies zu einem Farbumschlag des Indikators von grün nach blau. 5. Mannitabbau Der fermentative Abbau von Mannit erfolgt unter Säurebildung. Das,,Mannit- Röhrchen" enthält u.a. den sechswertigen Alkohol Mannit und den Indikator Phenolrot, dessen Farbumschlag nach gelb Säurebildung und damit eine enzymatische Spaltung von Mannit erkennen läßt. Außerdem kann man die Gasbildung von Bakterien nachweisen. Wenn das kleine Glasröhrchen mit Gas gefüllt ist, ist das Ergebnis positiv. Antigen Antikörper Reaktion Auf einem Objektträger wird etwas Serum aufgetragen, dieses Serum enthält Antikörper gegen bestimmte Keime. Nun wird eine Kolonie genommen und in dem Serum verrieben. Anschließend schwenkt man den Objektträger einige Male hin und her. Nach kurzer Zeit bilden sich bei einer positiven Reaktion kleine Klumpen. Diese Reaktion nennt man Agglutinationsreaktion: Unter dieser Reaktion wird die Verklumpung von Partikeln als Folge einer Vernetzung zwischen den auf ihrer Oberfläche gelegenen oder angelagerten Antigenen und den Antikörpern verstanden. Dabei entstehen größere, körnige oder flockige Körner, die im Reaktionsgemisch makroskopisch oder bei geringer Vergrößerung (2.5- bis 5fach) unschwer zu erkennen sind.