Entwicklung einer einfachen und schnellen Methode zur Quantifizierung von Glutathion in Getreide

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1 Entwicklung einer einfachen und schnellen Methode zur Quantifizierung von Glutathion in Getreide Julia Reinbold 1, Herbert Wieser 2, Michael Rychlik 3, Peter Köhler 2 1 Hans-Dieter-Belitz-Institut für Mehl- und Eiweißforschung, Lichtenbergstrasse 4, D Garching 2, Lichtenbergstrasse 4, D Garching 3 Bioanalytik, Technische Universität München, Alte Akademie 10, D Freising

2 Gliederung 1. Einleitung 2. Literatur 3. Methodenentwicklung 4. Anwendung 5. Ausblick

3 Struktur und Vorkommen Tripeptid bestehend aus Glutaminsäure, Cystein und Glycin CH N H H 2 N N H SH CH ( GSH ) γ-glutamylcysteinylglycin ( GSSG ) Disulfid = Glutathion oxidiert Ubiquitäres Vorkommen Erythrocyten: 1,90-2,18 mmol GSH/L 0,17-0,21 mmol GSSG/L Plasma: 0,008-7,67 µmol GSH/L Wein: 6,8-16,6 µmol GSH/L Kartoffel (roh): 207 nmol GSH/g

4 Gliederung 1. Einleitung 2. Literatur 3. Methodenentwicklung 4. Anwendung 5. Ausblick

5 Hintergrund Schon geringe Mengen freier Thiole in Weizenmehl bewirken Teigerweichung und schlechtere Backeigenschaften Ziegler (1940a,b) Cereal Chemistry 17: und Glutathion wird in Weizenmehl nachgewiesen Kuninori und Matsumoto (1964) Cereal Chemistry 41: Freies Cystein wird in Weizenmehl quantifiziert Ewart (1988) Food Chemistry 28:

6 Analyse von Glutathion und Cystein in Weizenmehl Ewart J.A.D.: Thiols in flour and breadmaking quality (1988) Food Chemistry 28: Extraktion des Mehls mit sterilem Wasser Dialyse (4 C, 48 h) Einengen des Diffusates und Analyse der Aminosäuren nmol Cyst(e)in/ g Mehl

7 Analyse von Glutathion und Cystein in Weizenmehl Sarwin R, Walther C, Grosch W et al.: Determination of free reduced and total glutathione in wheat flours by an istotope dilution assay (1992) Z. Lebensm. Unters. Forsch. 195: Derivatisierung und Extraktion des Mehls mit N-Ethylmaleimid (ph 4,5) Zugabe von 14 C-GS-NEM als interner Standard Ultrafiltration (Mr 10000) des Extrakts R S H + C H 2 5 N C H 2 5 N Gelchromatographie des Filtrats an Sephadex G10 Thiol RS N-Ethylmaleimid N-Ethyl-succinimid RP-HPLC (C18) zur Aufreinigung der Derivate RP-HPLC (C8) zur Quantifizierung der Derivate Flüssigkeitsszintillationszählung nmol GSH/g Mehl

8 Analyse von Glutathion und Cystein in Weizenmehl Schofield J. D., Chen X.: Analysis of free reduced and free oxidised glutathione in wheat flour (1995) Journal of Cereal Science 21: Extraktion des Mehls mit 5 % iger PCA (4 C, 1 h, unter N 2 ) Zugabe von Iodessigsäure und Neutralisation mit NaHC 3 (40 C, 1 h, im Dunklen) Zugabe von 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (40 C, 4 h, im Dunklen) RP-HPLC (C18) zur Quantifizierung der Derivate 2 N I N 2 F CH nmol GSH/g Mehl nmol GSSG/g Mehl

9 Probleme und Zielsetzung Probleme xidation von reduzierten Thiolen Thiol/Disulfid-Austausch Langwierige Probenvorbereitung Arbeiten mit radioaktiv markierten Standards Entwicklung einer Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA) zur simultanen Quantifizierung von Glutathion und Cystein Verfolgung des Thiol/Disulfid-Austausches

10 Gliederung 1. Einleitung 2. Literatur 3. Methodenentwicklung 4. Anwendung 5. Ausblick

11 Isotopenmarkierte Standards γ-glutamyl-[ 13 C 3, 15 N] cysteinylglycin (reduziert) [ 13 C 3, 15 N]-Cystein CH H N 2 N H C C C N H SH CH H 2 N C C C SH H GSH M+4 γ-glutamyl-cysteinyl-[ 13 C 2, 15 N] glycin (oxidiert) HC H N CH C N H NH 2 S H 2 N NH S H N C HC CH GSSG M+6 CSH M+4 [ 15 N 2 ]-Cystin H NH 2 S S H 2 N H CSSC M+2

12 Chromatographie ohne Derivatisierung der Analyten Säule: TSK Gel Amid (2mm, 150mm; 5 µm) Gradient: A: 0,65 mmol Ammoniumacetat ph 5,5/Acetonitril (10/90; v/v) B: 2,6 mmol Ammoniumacetat ph 5,5/Acetonitril (40/60; v/v) uau relative intensity Glutathion (oxidiert) Glutathion (reduziert) Cystein Cystin time (min) m/z m/z m/z m/z Aber: zu geringe Empfindlichkeit ohne Derivatisierung der Analyten

13 Schutz der freien Thiolgruppen Mit 4-Vinylpyridin Vorteile: irreversibel N Nachteile: schlechte chromatographische Eigenschaften, schlechte Handhabung N 2 Mit Ellman s Reagenz Vorteile: schnelle Reaktion Nachteile: hoher Überschuss, Thiol-Disulfid-Austausch, reversibel Mit Iodessigsäure I CH Vorteile: irreversibel, hemmt Enzyme Nachteile: relativ langsame Reaktion Mit N-Etylmaleimid Vorteile: niedriger ph, schnelle Reaktion Nachteile: reversibel HC S S CH N 2 C 2 H 5 N

14 Probenvorbereitung Zugabe von 1 ml IAA in Borsäure/LiH Puffer zu 20 mg Mehl N H 2 H 2 N Thiol (RT, 30 min, ph 8,5, unter Lichtausschluss) H SH I H Iodessigsäure H S H 2 N Carboxymethylthiol Zugabe von 500 µl Dansylchlorid in Acetonitril (RT, 1 h, ph 8,5, unter Lichtausschluss) H S H Carboxymethylthiol mit freier Aminogruppe N S Dansylchlorid Cl N S N H H CHCl3 einengen H S dansyliertes Carboxymethylthiol H LC-MS/MS (SRM)

15 Chromatogramm eines derivatisierten Mehlextraktes ( mm Säule: Phenomenex Synergi HydroRP (2 mm; 250 ( Ameisensäure Acetonitril (0,1 %,Wasser Fließmittel: uau 100 m/z = UV 210 nm Glutathion (red) relative Intensität m/z = [ 13 C 3, 15 N]- Glutathion (red) m/z = Cystein m/z = [ 13 C 3, 15 N]-Cystein m/z = m/z = Glutathion (ox) [ 13 C 2, 15 N]-Glutathion (ox) m/z = Cystin m/z = [ 15 N, 15 N ]-Cystin Zeit (min)

16 Isotopenmarkierte Standards γ-glutamyl-cysteinyl-[ 13 C 2, 15 N] glycin (oxidiert) HC CH C N H H N NH 2 S GSSG M+6 H 2 N NH S H N C HC CH γ-glutamyl-[ 13 C 3, 15 N] cysteinylglycin (reduziert) CH H 2 N N H C C C N H SH GSH M+4 Asam S (2003) Semesterarbeit Teil I CH

17 Thiol/Disulfid-Austausch Modellansätze Alle Modelle enthielten GSH und GSSG unmarkiert (je 5 µg/ml) Modell 1: ohne Zusatz markierter Standards Modell 2: mit Zusatz von GSH M+4 (3 µg/ml) Modell 3: mit Zusatz von GSSG M+6 (5 µg/ml) Modell 4: mit Zusatz von GSH M+4 und GSSG M % 100 % 60 % 60 % 20 % 20 % Modell 1 Modell 2 Modell 3 Modell 4 Modell 1 Modell 2 Modell 3 Modell 4 GSH GSH M+4 GSH M+3 GSSG GSSG M+8 GSSG M+6

18 Thiol/Disulfid-Austausch Mehlextrakt 20 mg Mehl wurden wie bereits beschrieben aufgearbeitet Extrakt 1: ohne Zusatz markierter Standards Extrakt 2: mit Zusatz von GSH M+4 (3 µg/ml) Extrakt 3: mit Zusatz von GSSG M+6 (5 µg/ml) Extrakt 4: mit Zusatz von GSH M+4 and GSSG M % 500 % 300 % 300 % 200 % 100 % 100 % Extrakt 1 Extrakt 2 Extrakt 3 Extrakt 4 Extrakt 1 Extrakt 2 Extrakt 3 Extrakt 4 GSH GSH M+4 GSH M+3 GSSG GSSG M+8 GSSG M+6

19 Thiol/Disulfid-Austausch Mehlextrakt nach Zugabe des isotopenmarkierten Standards (GSSG M+6) in 0,1 % Ameisensäure (HCH) oder 5 % Perchlorsäure (PCA) 250% 200% 150% 100% 50% 0% GSSG M+6 zugegeben in HCH GSSG M+6 zugegeben in PCA GSH GSH M+4 GSH M+3 GSSG GSSG M+8 GSSG M+6

20 Zusammenfassung I Eine Derivatisierung der Analyten war notwendig, um eine genügend hohe Empfindlichkeit zu erreichen IAA erwies sich als am besten geeignet zum Schutz der freien Thiole Die isotopenmarkierten Standardsubstanzen werden in 5 %iger Perchlorsäure zugesetzt, um den Thiol/Disulfid- Austausch während der Probenaufarbeitung zu vermeiden

21 Gliederung 1. Einleitung 2. Literatur 3. Methodenentwicklung 4. Anwendung 5. Ausblick

22 Hintergrund Schwefeldüngung seit 80er Jahren wieder notwendig Wieser H, Gutser R, von Tucher S.: Influence of sulphur fertilisation on quantities and proportions of gluten protein types in wheat flour (2004) J Cereal Sci 40: Wieser H, Köhler P.: Einfluss der Schwefeldüngung auf die technologischen Eigenschaften von Weizenmehl (2005) Jahresbericht DFA Granvogl M, Wieser H, Koehler P, von Tucher S, Schieberle P.: Influence of sulfur fertilization on the amounts of free amino acids in wheat. Correlation with baking properties as well as with 3-aminopropionamide and acrylamide generation during baking (2007) J Agric Food Chem 55: Hagel I, Schnug E, Wieser H.: Wirkungen extremer Schwefeldüngung auf Mineralstoffgehalte, Proteinzusammensetzung und Klebereigenschaften von Weizen aus biologisch-dynamischem Anbau (1999) Jahresbericht DFA Wirken sich Schwefelmangel oder eine extreme Schwefeldüngung auf den Gesamtgehalt niedermolekularer Thiole wie Glutathion und Cystein aus?

23 Probenaufarbeitung Mehl Zugabe der isotopologen Standards in 5 % PCA Reduktion mit Tris-carboxyethylphosphin (TCEP) Alkylierung der freien Thiole mit Iodessigsäure Acylierung der Aminogruppen mit Dansylchlorid Vermessung mittels LC-MS/MS Entfernung des überschüssigen Dans-Cl mit Hilfe von CH 2 Cl 2

24 Validierung der Methode Präzision Bestimmung durch dreimaliges Aufarbeiten und Vermessen vier verschieden konzentrierter Mehle innerhalb von zwei Wochen Variationskoeffizient: < 7 % für GSH < 6 % für Cys Wiederfindung Bestimmung durch Zusatzversuche zu zwei unterschiedlich konzentrierten Mehlen in vier verschiedenen Konzentrationsstufen GSH: % Cys: % Nachweis- und Bestimmungsgrenze Bestimmung nach Hädrich und Vogelgesang (1996) NWG: 0,75 nmol/g Mehl für GSH; 0,72 nmol/g Mehl für Cys BG: 2,23 nmol/g Mehl für GSH; 2,12 nmol/g Mehl für Cys

25 Ergebnisse Weizenmehle mit Schwefelmangel Mehl S/Gefäß a Ertrag a S a Asche GSH b Cys b GSH+Cys b [mg] [g/gefäß] [% TM] [% TM] [nmol/g Mehl] [nmol/g Mehl] [nmol/g Mehl] ,1 0,087 0,57 84 ± 4 82 ± ,3 0,066 0,40 24 ± 1 43 ± ,3 0,084 0,46 28 ± 2 60 ± ,0 0,128 0,43 67 ± 2 68 ± ,3 0,143 0, ± ± ,3 0,158 0, ± ± 3 a Wieser H, Köhler P (2005) Jahresbericht DFA b Mittelwert (n=6-9) ± Standardabweichung 166 ± 5 66 ± 2 88 ± ± ± ± 9 Anstieg von Cystein- und Glutathion-Gehalt mit steigender S-Menge Korrelation mit rheologischen Eigenschaften?

26 Proteinbestimmung Rohproteingehalt Dumas-Methode (N x 5,7) Proteinextraktion (20 mg Mehl) sborne-fraktionierung 2 x 1,0 ml NaCl (0,4 mol/l) + HKNa P 4 (0,067 mol/l, ph 7,6) ( 20 C) (Albumine, Globuline) 3 x 0,5 ml 60 % (v+v) Ethanol ( 20 C) (Gliadine) 2 x 1,0 ml 50 % (v+v) 1-Propanol + Harnstoff (2 mol/l) + Tris-HCl (0,05 mol/l, ph 7,5) + DTE (1 %) (60 C, N 2 ) (Glutenine)

27 Proteinbestimmung RP-HPLC Säule: Nucleosil C 8 (5 µm, 30 nm) 4,6 x 240 mm, 50 C AU Elutionsmittel: A) 0,1 % Trifluoressigsäure B) 99,9 % Acetonitril/0,1 %Trifluoressigsäure Detektion: UV-Absorption bei 210 nm Quantifizierung: Absorptionsflächen der Chromatogramme µg Protein LMW-Untereinheiten Gliadin HMW-Untereinheiten + Rinderserumalbumin

28 Rheologische Bestimmungen Zugversuche Herstellen von Teigen am Farinographen (10 g Mehl, Wasser, 2 % NaCl) Kieffer-Kurve: Teigstränge pressen, 30 min entspannen Vermessen der Teigstränge am Texture Analyser mit Kieffer Extensibility Rig Dehnwiderstand [N] R max EA Dehnbarkeit [cm] E max

29 Rheologische Bestimmungen Kriech-Erholungs-Versuche Vorbereitung: ausstanzen des gepressten, gefrorenen Teiges Testphase 1 (t 0 -t 1 = 4 min): konstante Schubspannung (600 Pa) Messung der Verformung Testphase 2 (t 1 -t 2 = 8 min): entfernen der Schubspannung Messung der Entspannung Kriechphase Erholungsphase t 0 t 1 Zeit [min] t 2 γ 1 γ 2 γ 3 γ e γ v rein elastische Deformation viskoelastische Def. rein viskose Def. elastischer Anteil der Rückdeformation viskoser Anteil der Rückdeformation

30 Korrelation von Protein- und Thiolgehalten mit rheologischen Daten TEZ Rmax Emax EA γ(t 1 ) V/E BV GSH Cys GSH+Cys RP Gliadine Glutenine GLI/GLU HMW/LMW TEZ: Teigentwicklungszeit Rmax: maximaler Dehnwiderstand Emax: maximale Dehnbarkeit EA: Fläche unter der Kurve γ(t 1 ): Deformation V/E: Verhältnis Viskosität/Elastizität BV: Brotvolumen

31 Ergebnisse Überdüngte Weizenmehle Mehl S/ha a Ertrag a S a Asche GSH b Cys b GSH+Cys [kg] [t/ha] [% TM] [% TM] [nmol/g Mehl] [nmol/g Mehl] [nmol/g Mehl] ,77 0,121 0, ± ± ,95 0,121 0, ± ± ,95 0,126 0, ± ± ,91 0,126 0, ± ± ,99 0,129 0, ± ± 5 a Hagel I, Schnug E, Wieser H (1999) Jahresbericht DFA b Mittelwert (n=3) ± Standardabweichung 367 ± ± ± ± ± 5 Kein weiterer Anstieg von Cystein- und Glutathion-Gehalt bei Überdüngung mit Schwefel

32 Zusammenfassung II Mit der neue entwickelten Methode konnte gezeigt werden, dass der Gehalt an Gesamtglutathion und Gesamtcystein eines Mehles stark von der zur Verfügung stehenden Menge Schwefel abhängt Die Berechnung der Korrelationen zeigte dass der Gesamtgehalt von Glutathion und Cystein die rheologischen Eigenschaften von Teigen, als auch das Backergebnis in gleichem Maße beeinflusst wie die bisher untersuchten Proteinparameter. Bei der Überdüngung von Weizen konnte kein weiterer Anstieg von Gesamt-GSH und Gesamt-Cys im Mehl festgestellt werden

33 Gliederung 1. Einleitung 2. Literatur 3. Methodenentwicklung 4. Anwendung 5. Ausblick

34 Ausblick Bestimmung des Glutathion- und Cyst(e)ingehalts in Mehlen aus unterschiedlich lang gekeimten Weizen Verfolgung des Glutathion- und Cyst(e)ingehalts während der Teigbereitung und des Backvorgangs Modifizierung der neu entwickelten Methode zur Quantifizierung von Glutathion in biologischen Matrizes

35 Vielen Dank Prof. Dr. Köhler PD Dr. Rychlik Dr. Wieser AK SIVA AK Biopolymere