Nutzpflanzenpraktikum

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1 Nutzpflanzenpraktikum Materialien Biologielehre Kurs 1 Folien Vorlesung Wozu Botanik der Nutzpflanzen? Pflanzliche Zellen. botanik.kit.edu/botzell/949.php Bedienungsanleitung Praktikumsmikroskop Olympus CH20 Bachelor Biologie Angewandte Biologie Bachelor Lebensmittelchemie Lichtmikroskopie. Pflanzliche Zellen Kursprogramm 1. Hellfeldmikroskopie 2. Wissenschaftliche Zeichentechnik 3. Präparat A: Plasmolyse der Zwiebel (Allium cepa L.) 4. Präparat B: Histochemie von Kartoffelstärke (Solanum tuberosum L.) 5. Präparat C: Pilzhyphen (Penicillium camenbertii) 1. Hellfeldmikroskopie Ein paar Grundregeln: Scharfstellen: immer vom Präparat weg nach oben, nie umgekehrt (Bruchgefahr!) Sauberkeit: mit einem sauberen Papiertuch Okular- und Objektivfrontlinsen ab und zu reinigen. Nicht mit den Fingern auf die Frontlinse der Objektive fassen. Objektivwechsel: an der Rändelschraube drehen, nicht am Objektiv festhalten (wenn es sich verzieht, stimmt die Optik nicht mehr). Köhlern: Präparat scharfstellen, Leuchtfeldblende schließen, man sieht eine Irisblende, Kondensorhöhe so einstellen, daß diese Irisblende scharf erscheint, Kondensorblende so einstellen, daß der Kontrast gut ist. Aufbau eines Lichtmikroskops: Das von der Sockelleuchte erzeugte Licht wird über einen Spiegel von unten her durch den Kondensor zum Objekttisch geleitet. Gute Bilder gibt es nur, wenn die Position des Kondensors, die Leuchtfeldblende (im Sockel) und die Kondensorblende richtig eingestellt sind. Dieses Einstellen nennt man Köhlern und es gehört zu den Grundfertigkeiten der Mikroskopie. Vergrößerung und Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops Bedeutung der Zahlenangaben auf den Okularen: 10x = Vergrößerung des Okulars, 18 = Feldzahl (Durchmesser der Sehfeldblende in mm) dient zur Berechnung des Durchmessers des beobachteten Objektausschnitts (Dingfelddurchmesser): Dingfelddurchmesser = Feldzahl / (Vergrößerung des Objektivs x Tubusfaktor) Beispiel: für das 40x Objektiv ergibt sich 18 mm / 40 x 1 und damit 0,45 mm (450 µm), d.h. das gesamte Sehfeld mißt in Wirklichkeit 450 µm. Bedeutung der Zahlenangaben auf den Objektiven: 40x = Vergrößerung des Objektives 0,65 = numerische Apertur (n sin α) Die numerische Apertur A ist eine Kenngröße für das Auflösungsvermögen.

2 α bezeichnet den Winkel zwischen der optischen Achse und dem Randstrahl des Lichtkegels, der von einem Punkt des mikroskopisches Objekts in das Objektiv einzutreten vermag. n = Brechzahl des Mediums zwischen Präparat und Objektiv (Brechungsindex von Luft = 1) 160 = Tubuslänge in mm 0,17 = Schichtdicke des Deckglases in mm (zur Kompensation der Deckglasaberration Linsenfehler ) Auflösung und Sichtbarkeit sind verschiedene Dinge. In A werden die beiden Punkte aufgelöst, in B nicht. Sichtbar sind sie in beiden Fällen. Der minimale Abstand, der noch Situation A zuläßt ist die Auflösungs- Grenze. Auflösungsvermögen und Vergrößerung: Die Grenze des Auflösungsvermögens liegt für Lichtmikroskope bei 0,2 µm (200 nm). Das menschliche Auge hat ein Auflösungsvermögen von 0,1 mm (100 µm), d.h. zwei parallele Linien, die weniger als 100 µm auseinander liegen, verschwimmen zu einem einzigen Punkt. Unter dem Auflösungsvermögen D versteht man die Möglichkeit voneinander getrennte, sehr nahe beieinander liegende Objekteinzelheiten (Strukturen) getrennt abzubilden Minimaler Abstand zweier Objektpunkte, die noch getrennt abgebildet werden können D = /A OBJ +A KON = Wellenlänge des verwendeten Lichtes A = numerische Apertur des Objektives und des Kondensors Durch die richtige Einstellung des Kondensors schafft man die Möglichkeit für eine Ausnutzung einer hohen numerischen Apertur im Objektiv. Definition der Vergrößerung Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops V ist gleich dem Produkt aus Objektivvergrößerung V obj und der Okularvergrößerung V ok mit dem Tubusfaktor T V = V obj x V ok x T 2. Wissenschaftliche Zeichentechnik Übersichtszeichnungen (ÜZ) Schematische Skizze. Darstellung der Lage und Ausdehnung der Gewebe in einem Organ oder Organteil nur in Umrissen. Keine Zeichnung von einzelnen Zellen! Detailzeichnung (DZ) Übersichtszeichnung eines Stängels mit den Leitbündeln. Es werden nur Umrisse gezeigt, keine zellulären Einzelheiten. Zellgetreue Wiedergabe von Gewebeausschnitten (Maßstabs- und Formgetreu)

3 Zeichentechniken Einstrich Zeichentechnik: Zellwände zwischen zwei Zellen werden nur mit einem Strich dargestellt - für Gewebe aus Zellen mit dünnen Zellwänden. Zweistrich Zeichentechnik: Zellwände zwischen zwei Zellen werden mit zwei Strichen dargestellt - für Gewebe aus Zellen mit verdickten Zellwänden. Dreistrich Zeichentechnik: Zeichnung benachbarter Zellen mit dreifacher Linienführung. Als Hilfslinie wird die Mitte zweier benachbarter Zellen benützt (=Mittellamelle), anschließend trägt man die Primär- bzw. Sekundärwand ein - für Gewebe mit dickwandigen und dünnwandigen Zellen. Einstrich-, Zweistrich- und Dreistrichtechnik. Beschriftung von wissenschaftlichen Zeichnungen: Eine wissenschaftliche Zeichnung ohne Beschriftung ist wertlos! Die Beschriftung ist die wissenschaftliche Interpretation des Beobachteten! Wichtige Details werden durch beschriftete Pfeile hervorgehoben und eingeordnet. Zur Beschriftung gehört auch ein Titel mit dem Namen des Objekts (Was für eine Art, welche Familie, welche Art von Gewebe/ Zellen, welche Art von Präparation) und Angaben zur Größe (Vergrößerung oder Maßstabsbalken). 3. Präparat A: Epidermis der Küchenzwiebel Epidermiszelle der Küchenzwiebel (Allium cepa - Amaryllidaceae). Detailzeichnung einer Zelle vor und nach Plasmolyse. Vorgehen: man bereite einen Objektträger mit einem Tropfen Wasser vor, nehme ein fleischiges Schuppenblatt der roten Küchenzwiebel mit der konvexen (vorgewölbten) roten Außenseite nach oben und fertigt mit der Rasierklinge einen dünnen Flächenschnitt an. Mit einer feinen Pinzette wird die Epidermis mit der rot gefärbten Seite nach oben in einen Tropfen Wasser gelegt und vorsichtig ein Deckglas aufgelegt. Nun kann mikroskopiert und gezeichnet werden. Dann setzt man am Rand des Deckglases ein Tröpfchen mit 1 M NaCl- Lösung an, an der gegenüberliegenden Seite ein Streifchen Filterpapier. Das Filterpapier saugt Flüssigkeit an und die Kochsalzlösung wird so durch das Präparat hindurchgesogen. Nun wird beobachtet und dieselbe Zelle nach einigen Minuten nochmals gezeichnet. Plasmolyse bei Epidermiszellen der Zwiebel: Bei der roten Küchenzwiebel ist der Zellsaft durch Anthocyane angefärbt, wodurch die Vakuole gut sichtbar ist. Durch Kontakt mit einer höhermolaren Salzlösung wird der Vakuole osmotisch Wasser entzogen, wodurch sie sich zusammenzieht und intensiver gefärbt ist (unteres Bild). Wird das Salz entfernt, dehnt sie sich wieder aus. Plasmolyse funktioniert nur solange, wie die Was ist zu sehen? Zunächst sieht man vor allem die rot gefärbte Vakuole (der rote Farbstoff gehört zu den Anthocyanen und ist unter anderem für die Rotfärbung vieler Blüten und Früchte verantwortlich) und die Zellwand. Das Cytoplasma, die Organellen (Zellkern, Mitochondrien usw.), die Plasmamembran und die Tüpfel sind nicht so gut zu sehen. Zwischen Plasmamembran und Tonoplast kann man den zumeist am Rand liegenden Zellkern und den Cytoplasmasaum sehen, manchmal auch transvacuolare Plasmastränge. Der Großteil des Zellinneren ist jedoch Vakuole. Mit etwas Glück sieht man noch die Plasmaströmung im randständigen Cytoplasmasaum und den

4 Membran semipermeabel ist und ist daher ein Nachweis für die Vitalität einer pflanzlichen Zelle. Plasmolyse (Film, wo man auch die Hecht schen Fäden gut sehen kann) botanik.kit.edu/botzell/947.php Wie werden neue Querwände gebildet? Wie teilen sich pflanzliche Zellen? (Film) Plasmolyse (Film, wo man auch die Hecht schen Fäden gut sehen kann) Plasmasträngen. Hier sind mit etwas Glück noch kleine Organellen zu erkennen, beispielsweise Mitochondrien (dunkel, wurstförmig), Oleosomen (dunkel, rund) und Leukoplasten (hell, eher trapezförmig). Wenn nun die Kochsalzlösung durchgesogen wird, zieht sich das Zellinnere zusammen und die Plasmamembran löst sich von der Zellwand ab. Dieser Vorgang heißt Plasmolyse und beruht letztendlich darauf, dass die Zelle Wasser an die salzige Umgebungslösung abgibt und dadurch kleiner wird. An manchen Stellen kann man nun fadenartige Strukturen erkennen, wo der Protoplast offenbar an der Zellwand festhaftet. Häufig haftet hier auch die Nachbarzelle auf der anderen Seite der Zellwand an. Diese sogenannten Hecht schen Fäden zeigen die Plasmodesmata an, Verbindungsstellen, die für die Kommunikation der Zellen untereinander sehr wichtig sind. Wenn man die Kondensorblende relativ weit schließt, kann man den zumeist am Rand liegenden Zellkern und den Cytoplasmasaum sehen, Zum Beobachten: Zählen Sie doch mal aus, wie viele Zellen an den Ecken einer Zelle jeweils aneinander grenzen (3, 4, 5,...) und formulieren Sie eine mögliche Erklärung dafür. 4. Präparat B: Histochemie von Kartoffelstärke Amyloplasten aus der Sprossknolle der Kartoffel (Solanum tuberosum - Solanaceae). Anfärbung und Detailzeichnung. Stärkekörner im Polarisationsmikroskop. Da Stärke ein Dipol ist (aufgebaut aus 1,4- verknüpften Glucoseresten) gibt es mit polarisiertem Licht eine Wechselwirkung, deren Stärke von der Orientierung der (langgestreckten) Stärkemoleküle abhängt. Dies führt zu einem Gangunterschied des polarisierten Strahls, der mithilfe eines Gipsplättchens Rot als Farbumschlag sichtbar wird. Die Farben zeigen also unterschiedliche Orientierungen der Stärkemoleküle an. Die geordnete Struktur der Stärkekörner rührt daher, dass die Stärke in spezialisierten Plastiden, den Amyloplasten, gebildet wird. Vorgehen: Man suspendiert etwas Kartoffelstärke (kann auch aus einer durchgeschnittenen Kartoffelknolle mit einer Nadel oder einem Skalpell etwas Gewebe gewonnen werden). Nach Zeichnung im Hellfeld wird ein Tropfen Lugol sche Lösung (Jod- Jodkalium-Lösung) seitlich neben dem Deckglas aufgesetzt und mithilfe eines Streifens Filterpapier (oder Küchenkrepp) durch das Präparat gezogen. Unter Umständen muss man die Lugol sche Lösung vorher noch verdünnen. Was ist zu sehen? Die Stärke ist in stärkespeichernde Plastiden (Amyloplasten) enthalten. Die grünen Brüder der Amyloplasten sind die Chloroplasten, die für die Photosynthese zuständig sind. Im Hellfeld kann man bei geschlossener Kondensorblende oft die Schichtung erkennen. Nach Färbung mit Lugol scher Lösung färbt sich die Stärke (Amylose) tiefblau. Demonstration Im Dunkelfeld leuchten die Stärkekörner oft prächtig auf, im polarisierten Licht entstehen aufgrund der Schichtung (Stärke ist ein langgestreckter Dipol) charakteristische Kreuzmuster (Malteserkreuz).

5 5. Präparat C: Pilzhyphen Präparat Weißschimmelkäse (Penicillium camenberti, Eurotaceae) Durchführung. Wasserpräparat von der weißen Käserinde, Detailzeichnung von Mycel und Konidien Penicillium camembertii 600 x Was ist zu sehen? Schimmel ist eine Bezeichnung für oberflächlich wachsende Pilzmycelien, zumeist der Gattungen Aspergillus oder Penicillium. Häufig bilden Schimmelpilze Giftstoffe (sogenannte Mycotoxine), beim Camembert ist das natürlich nicht so. Das Mycel von Penicillium camenberti besteht aus septierten fädigen Zellen, den Hyphen. Die Fortpflanzungsstrukturen sind charakteristisch büschelig gebaut und bestehen aus perlschnurartig abgegliederten Einzelzellen (Konidien oder Sporen), die der Fortpflanzung dienen. Wenn Speiseschimmel mit dem bloßen Auge sichtbar wird, ist es zumeist schon zu spät, die Entwicklung ist abgeschlossen und das Lebensmittel schon voll mit Mycotoxinen. Die bläuliche Schimmelfarbe kommt von den gefärbten Sporen. Lange davor kann man in der Probe mikroskopisch die fädigen Hyphen erkennen. Zur Nachbereitung Weiterführende Informationen zur Mikroskopie: Nultsch / Grahle: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum für Anfänger, Kapitel 1 (Thieme Verlag) Plasmamembran und Pflanzliche Cytologie: Strasburger: Lehrbuch der Botanik (34. Auflage) Dritter Abschnitt, S Lüttge / Kluge / Bauer: Botanik, Kapitel 5 (Wiley Verlag) Einfache Animation zur Plasmolyse Plastiden: Strasburger: Lehrbuch der Botanik (34. Auflage) Dritter Abschnitt, S Lüttge / Kluge / Bauer: Botanik, Kapitel 8 (Wiley Verlag) Weiterführende Informationen zur pflanzlichen Zelle: Nultsch / Grahle: Mikroskopisch-Botanisches Praktikum für Anfänger, Kapitel 2 (Thieme Verlag) Lüttge / Kluge / Bauer: Botanik, Kapitel 5 (Wiley Verlag)