Mikroinjektion, Markergene, Plastidentransformation

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1 BMBF-Verbund - Gezielte Übertragung minimierter Transgensequenzen mit optimierter Funktion Mikroinjektion, Markergene, Plastidentransformation Neue Methoden für eine sichere Gentechnik? Inge Broer

2 BMBF-Verbund - Gezielte Übertragung minimierter Transgensequenzen mit optimierter Funktion Gezielter Einbau von Genen, IPK Gatersleben Entwicklung alternativer Marker, Sungene Ausschneiden unerwünschter Gene mit Hilfe springender Gene, Planta Ausschneiden unerwünschter Gene: Cre/lox-System, BBA Braunschweig Ausschneiden unerwünschter Gene mit Hilfe eines neuen Rekombinationssystems, Bayr. LA Landwirtschaft, Freising Negative Marker, Universität Rostock Mikroinjektion bei Pflanzen, Universität Giessen geeignete Pflanzenzellen für die Mikroinjektion, Bioplant Gene für die Mikroinjektion, Bioplant Mikroinjektion, FI Schmallenberg Sicherheitssysteme zur Proteinproduktion mittels pflanzlicher Viren Direkte Veränderung von Pflanzengenen, BBA Braunschweig Verbesserte binäre Vektoren BAZ Siebeldingen Markergenfreie Pflanzen durch Auskreuzuen, MPIZ Köln Transformation bei Plastiden, Sungene Inge Broer, Universität Rostock, Agrar- und Umweltwissenschaftliche Fakultät Inge Broer, Universität Rostock, Agrar- und Umweltwissenschaftliche Fakultät

3 BMBF-Verbund - Gezielte Übertragung minimierter Transgensequenzen mit optimierter Funktion Gezielter Einbau von Genen, IPK Gatersleben Entwicklung alternativer Marker, Sungene Mikroinjektion, Ausschneiden unerwünschter Gene mit Hilfe springender Gene, Planta Ausschneiden unerwünschter Gene: Cre/lox-System, BBA Braunschweig Markergene, Ausschneiden unerwünschter Gene mit Hilfe eines neuen Rekombinationssystems, Bayr. LA Landwirtschaft, Freising Plastidentransformation Negative Marker, Universität Rostock Mikroinjektion bei Pflanzen, Universität Giessen Neue geeignete Methoden Pflanzenzellen für die Mikroinjektion, Bioplant für Gene für die Mikroinjektion, Bioplant Mikroinjektion, FI Schmallenberg eine sichere Gentechnik? Sicherheitssysteme zur Proteinproduktion mittels pflanzlicher Viren Direkte Veränderung von Pflanzengenen, BBA Braunschweig Verbesserte binäre Vektoren BAZ Siebeldingen Markergenfreie Pflanzen durch Auskreuzuen, MPIZ Köln Inge Broer, Universität Rostock, Agrar- und Umweltwissenschaftliche Fakultät

4 Warum brauchen wir neue Methoden? Beispiel: Gentechnisch veränderte Pflanzen sollten nur die notwendigen Gensequenzen enthalten Plasmid Antibiotikaresistenzgen SPEKTRUM DER WISSENSCHAFT JANUAR 2001 Also keine Antibiotika-Resistenzgene oder Plasmidsequenzen

5 Vermeidung der Übertragung von Vektorsequenzen BAZ Siebeldingen Vektor Sequenz außerhalb der T-DNA LB T-DNA RB T-DNA 2 x LB 4 x LB

6 Vermeidung von Markergenen Fraunhofer Institut Aachen Bioplant Universität Giessen Mikroinjektion Plasmid Farbstoff und Plasmid ohne Markergen Medium Haltekapillare Pflanzenzelle Objektträger

7 SunGene Nutzung von alternativen Markergenen Plasmid Gen für Zuckerresistenz Medium enthält toxischen Zucker SPEKTRUM DER WISSENSCHAFT JANUAR 2001

8 Entfernen von Markergenen I Herausschneiden des Markergens nach der Transformation BBA Braunschweig Universität München Universität Karlsruhe Planta LBP Bayern Freising mit Selektionsmarker Schnittstelle Schnittstelle Plasmid Antibiotikaresistenzgen Molekulare Schere Reparatur des Bruchs ohne Selektionsmarker

9 Entfernen von Markergenen II Verlust des Markers in der Folgegeneration Universität Rostock BAZ Siebeldingen MPI Köln Plasmid Antibiotikaresistenzgen S1: 50% M+Z 50% Wildtyp S1: 25% M+Z 25% M 25% Z 25% Wildtyp S1: Bis zu 100% M+Z Ziel: : Trennung von Marker und

10 Entfernen von Markergenen II Universität Rostock BAZ Siebeldingen MPI Köln Verlust des Markers in der Folgegeneration Marker- Ziel & gen Ziel gen Marker gen Marker gen Agrobakterium Agrobakterium + Erwartung: Hohe Kotransformation Hohe Kopplung Erwartung: Etwas geringere Kotransformation Etwas geringere Kopplung Ziel gen Agrobakterium Erwartung: Geringe Kotransformation Geringe Kopplung

11 Universität Rostock Selektion der Markerfreien Pflanzen Kopplung des Antibiotikaresistenzgens an einen negativen Selektionsmarker Plasmid getrennt vom Markergen in einer Kopie integriert? In d u r o t k Negativer Selektionsmarker Antibiotikaresistenzgen

12 Vermeidung des Fremdgentransfers durch Pollen SunGene Pollen enthalten normalerweise keine Plastiden Wenn sich das Fremdgen in den Plastiden befindet kann es also nur über die Eizelle der Mutter vererbt werden Plastiden Pollen Zellkern unveränderte Pflanze Zellkern Fremdgen Plastiden Eizelle Transgene Pflanze

13 Machen die neuen Methoden Gentechnik sicherer? Die Übertragung unnötiger Sequenzen kann vermieden werden Antibiotikaresistenzgene können entfernt oder ersetzt werden Die Auskreuzung der Transgene kann in einigen Kulturarten vermieden werden Der Verbund ist auf dem richtigen Weg Gentechnik noch sicherer zu gestalten

14 Transiente Produktion von Proteinen durch Virusinfektion BBA Braunschweig Fremdgen Applikation Volllängenklon Virusvermeh rung Proteinproduktion Pflanzenzelle Fremdprotein Wirtspflanze