EINFLUSS DER EISEN-RESTRIKTION AUF DAS WACHSTUM VON CHLAMYDIA PNEUMONIAE UND CHLAMYDIA TRACHOMATIS

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1 Aus dem Institute für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Abteilung Abteilung Mikrobiologie und Hygiene EINFLUSS DER EISEN-RESTRIKTION AUF DAS WACHSTUM VON CHLAMYDIA PNEUMONIAE UND CHLAMYDIA TRACHOMATIS I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 1999 von Heiko Billing geboren in Heidelberg

2 Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. H. E. Blum 1.Gutachter: PD Dr. med. Heike Freidank 2.Gutachter: Prof. Dr. rer.nat. GeorgBauer Jahr der Promotion: 2000

3 meinen lieben Eltern gewidmet

4 DANKSAGUNG Für die freundliche Überlassung des Themas, die stete Bereitschaft zur Diskussion und für die wertvollen Ratschläge danke ich besonders herzlich meiner Doktormutter Frau PD Dr. med. Heike M. Freidank. Ein großer Dank gilt auch den Mitarbeitern des Labors für die Einarbeitung in die Methodik und die gute Arbeitsatmosphäre in der Zusammenarbeit. Hier möchte ich besonders Heike Vögele und Margit Wiedmann-Al-Ahmad und die Doktoranden Jan Tomas und Philipp Losch erwähnen. Für die Unterstützung und Begleitung während meiner Arbeit möchte ich meiner ehemaligen Lebensgefährtin Constanze Berhalter und meinen Eltern, sowie meinen Freunden herzlich danken.

5 TEILE DER ARBEIT WURDEN VERÖFFENTLICHT: FREIDANK H. M., H. BILLING Influence of iron restriction on the growth of Chlamydia pneumoniae TWAR and Chlamydia trachomatis. 8 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Disease. Lausanne, Switzerland Clin. Microb. Infect. 3, Suppl. 2:193. FREIDANK H. M., H. BILLING, M. WIEDMANN-AL-AHMAD Influence of iron restriction on the growth of Chlamydia pneumoniae TWAR and Chlamydia trachomatis. 9 th International Symposium on Human Chlamydial Infection. Napa, California, USA. June

6 INHALTSVERZEICHNIS Seite LISTE DER ABKÜRZUNGEN 1 1. EINLEITUNG Klassifikation Entwicklungszyklus Morphologie und Eigenschaften Antigene Immunologie und Pathogenese Erkrankungen durch C. pneumoniae Häufigkeit und Epidemiologie Übertragungsweg Klinik Erkrankungen durch C. trachomatis Häufigkeit und Epidemiologie Trachom Okulo-Genitale Infektionen Rheumatologische Erkrankungen Lymphogranuloma venereum (LGV) Diagnostik Erregernachweis Zellkultur Antigentest und Nukleinsäurenachweis Serologie Therapie Ziel der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Chlamydienstämme Zell-Linien Reagenzien Anzucht der Chlamydien in der Zellkultur Kultivierung der Zell-Linien Infektion der Zell-Linien mit Chlamydien Infektion in Zellkulturröhrchen Versuch I a: Infektion mit Deferoxamin Versuch I b: Infektion mit FeCl 3 und Deferoxamin 22

7 Infektion in Zellkulturflaschen Versuch II : Infektion mit FeCl 3 und Deferoxamin zur Antigenherstellung für Immunoblots Nachweis einer Chlamydieninfektion mit direkter Immunfluoreszenz (DIF) Anfärben eines Deckgläschens der Zellkulturröhrchen Anfärben des Zellkulturüberstandes bzw. des Inokulums Mikroskopische Auswertung Berechnung Proteinanalytik Antigenaufreinigung Proteinbestimmung nach LOWRY et al.(1951), modifiziert von PETERSON (1977) Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) nach LAEMMLI (1970) COOMASSIE-Färbung Western-Blot Transfer auf PVDF (Polyvinylidendifluorid)-Membran Amidoschwarz-Färbung Immunoblot Statistik ERGEBNISSE Versuch I a: Infektion mit Deferoxamin Versuch I b: Infektion mit FeCl 3 und Deferoxamin Versuch II: Infektion mit FeCl 3 und Deferoxamin zur Antigenherstellung DISKUSSION ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS LEBENSLAUF 66

8 1. EINLEITUNG 2 1. EINLEITUNG 1.1 KLASSIFIKATION Chlamydien unterscheiden sich von anderen Bakterien durch ihre Größe, ihren obligaten Zellparasitismus sowie durch ihren speziellen Vermehrungszyklus. Die vier derzeit bekannten Arten der Gattung Chlamydia (Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und Chlamydia pecorum) gehören zu der Familie der Chlamydiaceae, welche der eigenständigen Ordnung Chlamydiales untergeordnet ist. Während die Spezies C. pneumoniae, C. trachomatis und C. psittaci humanpathogene Erreger sind, ist C. pecorum nach bisherigem Kenntnisstand ausschließlich tierpathogen. Die genannten Spezies werden nach Kriterien der Morphologie, des klinischen Bildes, der Wirtsspezifität sowie durch biochemische und genetische Merkmale voneinander unterschieden. Zwischen den Arten besteht eine nur geringfügige DNA-Homologie von höchstens 11%. C. trachomatis ist die am besten untersuchte Spezies, die in drei Biovare unterteilt wird. Anhand von Proteinantigenen der äußeren Zellmembran wird sie in 18 Serovare eingeteilt. Das Maus-Biovar verursacht eine Pneumonie bei Mäusen. Die zwei weiteren Biovare infizieren ausschließlich Menschen. Sie führen zum Trachom, Lymphogranuloma venereum (LGV) und anderen Genital- und Augeninfektionen. Zwischen den Serotypen bestehen DNA-Homologien von % (56). Das Trachom ist eine Augenerkrankung, die schon seit dem Altertum bekannt ist. Bereits im 4. Jahrhundert vor Christus wurden Komplikationen und Therapie dieser Erkrankung in Griechenland beschrieben. Der Begriff Trachom (gr. trachys: rauh) wurde 60 n.chr. geprägt. L. HALBERSTAEDTER und S. VON PROWAZEK gelang es 1907 erstmals pünktchenförmige Einschlüsse in Epithelzellen mittels Giemsafärbung darzustellen, die sie Chlamydozoa (gr. chlamys: Mantel) nannten (70) wurden im Konjunktivalabstrich

9 1. EINLEITUNG 3 von Neugeborenen Zellen mit zytoplasmatischen Einschlüssen entdeckt, die denen beim Trachom ähnelten. In der Folgezeit wurden vergleichbare Einschlüsse auch in Abstrichen von Zervix und Urethra der Eltern infizierter Kinder gefunden (Lit. bei 128). C. psittaci ist der Erreger der Ornithose, einer atypischen Pneumonie und kommt hauptsächlich bei Vögeln der Ordnung Psittaciformes (Psittacose: Papageienkrankheit ) vor wurde sie von JÜRGENSEN erstmalig beschrieben, 1879 beobachtete RITTER in der Schweiz einen ätiologischen Zusammenhang mit erkrankten Papageien erkannte MORANGE bei einer Häufung von Krankheitsfällen in Paris Papageien als Ursache. Nachdem der Besitz tropischer Vögel in Mode gekommen war, traten zwischen Pandemien mit einer Letalität von etwa 20% auf (145). Die Anzahl der Serovare ist bisher unbekannt. C. pneumoniae ist ein primär humanpathogener Erreger. Ähnlich wie C. psittaci verursacht er akute Atemwegserkrankungen, vor allem atypische Pneumonien, Pharyngitiden und Bronchitiden. Aus diesem Grund wurden die C. pneumoniae-isolate zunächst C. psittaci zugeordnet. Seit 1989 ist C. pneumoniae jedoch als eigene Spezies anerkannt, da u.a. DNA-Analysen gezeigt haben, daß zwischen C. psittaci und C. pneumoniae kaum Homologien vorliegen, während alle C. pneumoniae-isolate untereinander eine über 94%-ige DNA-Homologie aufweisen (59,60). Der typische Entwicklungszyklus der Chlamydien wurde 1932 als erstes von BEDSON und BLAND beschrieben. Aufgrund des ungewöhnlichen Verhaltens der Neuentdeckung hielt man Chlamydien zuerst für Protozoen, etwas später für ein Virus, bis sie in den 60er Jahren als Bakterien erkannt wurden (114,119). 1.2 ENTWICKLUNGSZYKLUS Allen Chlamydien ist der biphasische Entwicklungszyklus gemeinsam. Die Elementarkörperchen (EK) stellen die sehr kleine ( nm) infektiöse extrazelluläre Form dar. Die metabolisch inaktiven EK sind der Antibiotikatherapie unzugänglich. Sie werden über einen Endozytosevorgang in die Wirtszelle aufgenommen, jedoch nicht phagozytiert. Bei der Anheftung der Elementarkörperchen an die Wirtszelle spielen wahrscheinlich mehrere Chlamydienproteine (18-,32-,40- kda Protein) eine Rolle (163). Zwischen den einzelnen Chlamydien-Arten wurden Unterschiede bei den Bindungsmechanismen, sowie dem Aufnahmeprozeß der EK in die Wirtszelle beobachtet

10 1. EINLEITUNG 4 (67,92). Die birnenförmige Gestalt der C. pneumoniae-elementarkörperchen könnte hier eine funktionelle Bedeutung besitzen, da zunächst mit der Spitze eine Anlagerung an die Wirtszellmembran erfolgt. Anschließend werden durch Zellwandvorstülpungen andere Bindungsstellen gesichert, bevor die wirtseigene Membran die EK umschließt (113). Mehrere endozytierte Vakuolen verschmelzen nun miteinander und bilden einen sogenannten Einschluß. In diesem differenzieren die EK in die größeren ( nm) aufgelockerten Retikular- oder Einschlußkörperchen (RK), welche die nicht-infektiöse intrazelluläre Form darstellen (Abb.1). Die RK beginnen sich durch Zweiteilung zu vermehren; nur in diesem Stadium ist eine Antibiose erfolgreich. Von einer einzigen Membran umgeben, werden sie jetzt als Einschlüsse bezeichnet, die 18 bis 24 Stunden nach Infektionsbeginn im Lichtmikroskop beobachtet werden können. Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, daß die Membran, welche die Einschlüsse umgibt, eine hochselektive Barriere darstellt; ein passiver Durchtritt kleinster Moleküle wird dadurch verhindert (31,78). 6 h D V Z 12 h EK 0 h EK 30 h h Abb.1 : Entwicklungszyklus der Gattung Chlamydia. Dargestellt sind Z = Wirtszelle, N = Zellkern, V= Vakuole, D = Zweiteilung eines Einschluß- oder Retikularkörperchens (RK), EK = Elementarkörperchen

11 1. EINLEITUNG 5 Nach einer Wachstumszeit von Stunden (C. trachomatis bzw. C. pneumoniae) differenzieren sich die Retikularkörperchen zurück in die infektiöse Form (EK), welche nun durch Lyse der Wirtszelle oder einen Exocytosevorgang freigesetzt werden, um weitere Zellen zu infizieren. Chlamydien können auch in den Wirtszellen persistieren, durch mitotische Zellteilung weitergegeben werden und somit eine latente Infektion hervorrufen (142). Antibiotika, TNF-alpha, gamma-interferon und bestimmte Ernährungssituationen der Zelle sind in der Lage, diese nicht-produktive Infektion zu fördern (6,11,158). 1.3 MORPHOLOGIE UND EIGENSCHAFTEN Chlamydien weisen eine den gramnegativen Bakterien ähnliche Zellwand auf. Sie besitzen eine Zytoplasmamembran und eine äußere Membran, welche unter anderem Lipopolysaccharide (LPS) und Proteine ( outer membrane proteins, OMPs) enthält (53). Es fehlt ihnen jedoch die Peptidoglykanschicht. Die bakterienspezifische N-Acetyl- Muraminsäure konnte nur in Spuren nachgewiesen werden, so daß die Integrität der Zelle durch die OM-Proteine, insbesondere der cysteinreichen Proteine, gewährleistet wird. Chlamydien besitzen sowohl DNA, als auch RNA. Extrachromosomale DNA (Plasmide) findet man bei allen Chlamydien-Arten, außer bei C. pneumoniae (26). Unter den Bakterien haben Chlamydien mit ca Basenpaaren eines der kleinsten Genome (120). Charakteristisch ist der defekte Energiestoffwechsel, mit dem Fehlen von Enzymen der Atmungskette (Cytochrome, Flavine ), was den obligat intrazellulären Entwicklungszyklus erklärt. Chlamydien können ihre Energie z.t. über Substratstufenphosphorylierung gewinnen (162). Zusätzlich entziehen sie dem Wirt über einen ADP/ATP- Austauschmechanismus ATP (118). 1.4 ANTIGENE In der äußeren Zellmembran macht das Major Outer Membrane Protein (MOMP), ein 40 kda Protein, mit einem Anteil von 60% den Hauptbestandteil der Chlamydien- Membranproteine aus (23,126). Am besten ist es bei C. trachomatis untersucht, aber auch C. pneumoniae-stämme weisen ein analoges 39.5 kda Protein auf (27,81,106). Weitere Untersuchungen der beiden Chlamydienstämme ergaben eine 60-70%-ige

12 1. EINLEITUNG 6 Übereinstimmung der DNA-Sequenz (191). Das MOMP enthält bei C. trachomatis serovar-, spezies- und auch gattungsspezifische Epitope. Dies ist für Impfstudien von Bedeutung. Dagegen fanden einige Arbeitsgruppen heraus, daß das MOMP bei C. pneumoniae nicht an der Oberfläche lokalisiert, nicht immundominant und nicht speziesspezifisch ist (27,47,81). Neben dem MOMP finden sich auch cysteinreiche Proteine (cystein-rich OMPs) der Größenordnung 12- und 60 kda in der äußeren Zellmembran (152). Auch hier besteht unter den Chlamydien-Arten Ähnlichkeit in Struktur und molekularer Masse (122,132). Zusammen sind beide Proteine für die strukturelle Stabilität der Elementarkörperchen verantwortlich und übernehmen verschiedene Funktionen während des Entwicklungszykluses der Chlamydien (77,152). Immunoblot-Analysen haben weitere, allen Chlamydienarten gemeinsame Proteine (30,- 60,-68,- und 70 kda Proteine) gezeigt (27,28,81). Mehrere C. pneumoniae-spezifische Proteine wurden im Immunoblot identifiziert: das 98 kda Protein, ein cysteinreiches OMP, welches zur Stabilität der Membranstruktur beitragen könnte und die typische Birnenform der EK stützen soll (113). Des weiteren ein 43 kda Protein und solche mit einer molekularen Masse von 50 bis 60 kda (86,100). In einer Studie mit MIF-positiven Patientenseren fanden sich am häufigsten C. pneumoniae-spezifische Antikörperreaktionen gegen ein 54 kda Protein (47,185,186). Ebenso wie alle bisher untersuchten Mikroorganismen bilden Chlamydien Hitze-Schock- Proteine (heat shock protein, HSP) (167). Das am besten untersuchte ist das gattungsspezifische kda HSP, welches Homologien mit dem GroEL-Protein von E. coli und mit dem 65 kda HSP von Mykobakterien aufweist (90,116). Untersuchungen mit Chlamydienantigenen beim chronischen Trachom haben gezeigt, daß das HSP 60 für eine T-Zell vermittelte, verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion verantwortlich ist und dadurch letztendlich an der Erblindung beteiligt ist (116,161,184). Ein weiteres HSP ist ein 76 kda Protein (Chlamydien-HSP 70), das Homologien zum DnaK-Protein von E. coli aufweist (36,92). Antikörper gegen dieses Protein haben einen für die Chlamydien neutralisierenden Effekt (106). Dies könnte für eine Impfstoffentwicklung von großer Bedeutung sein. 1.5 IMMUNOLOGIE UND PATHOGENESE Chlamydien verursachen ein breites Spektrum von Erkrankungen beim Menschen. Die

13 1. EINLEITUNG 7 verschiedenen Chlamydien-Arten und -Serotypen infizieren unterschiedliche Zelltypen. Die natürlichen Wirtszellen für C. trachomatis Biovar Trachom sind Zylinderepithel- und Flimmerepithelzellen von Schleimhäuten. Die Ausbreitung der Infektion bleibt auf angrenzende Gewebe beschränkt. Dagegen sind C. psittaci und C. trachomatis Biovar Lymphogranuloma weniger spezialisiert, was ihre Wirtszellen betrifft. Sie können sich auch in mononukleären Phagozyten vermehren, und somit ist ihre Dissemination über den Lymph- oder Blutweg im Organismus möglich. Auch C. pneumoniae scheint invasive Infektionen verursachen zu können, weil sich diese Chlamydienart in menschlichen Monozyten und Makrophagen vermehren kann und bei Mäusen nach lokaler Infektion eine Dissemination zu beobachten ist. In vitro kann C. pneumoniae auch eine Infektion in Endothelzellen hervorrufen und in Zellen, die aus dem Respirationstrakt stammen (189). Es wurde auch gezeigt, daß C. pneumoniae in Bronchialepithel-Zellkulturen eine Ziliostase bewirken kann (159), was mit C. trachomatis nicht möglich war. Trotz der Unterschiede im Wirts- und Gewebetropismus und der verschiedenen klinischen Erkrankungen sind die immunhistopathologischen Veränderungen an unterschiedlichen Lokalisationen bemerkenswert ähnlich. Sowohl die Rolle der Immunantwort des Wirtes bei der Pathogenese, als auch die Tendenz chronische Infektionen durch Persistenz oder durch Reinfektionen zu verursachen, sind wohl allen Chlamydien-Arten gemeinsam. Die Abwehrmechanismen des Wirtes scheinen weder vor einer Reinfektion zu schützen, noch die Chlamydien wirksam zu eliminieren, aber sie scheinen Gewebeschädigungen hervorrufen zu können. Die klinische Ausprägung einer Primärinfektion kann von einer asymptomatischen Infektion bis zu einer schweren Krankheit reichen, Symptome und Befunde sind jedoch meist vorübergehender Natur. Obwohl wiederholte Infektionen häufig klinisch stumm verlaufen, können sie ausgedehnte histopathologische Schäden hervorrufen, die allmählich zur funktionellen Beeinträchtigung des betroffenen Organs führen (10,12). Mehrere Faktoren können für die Unfähigkeit des Wirtes verantwortlich sein, Chlamydien- Infektionen vollständig zu eliminieren: Die Antikörperantwort ist unvollständig, kurzlebig und Serovar-spezifisch. Die kurze Halbwertszeit des IgA kann ein weiterer Grund sein. Antigene Variationen im MOMP führen zu Serovar-spezifischen Antikörpern, was die begrenzte Schutzwirkung einer vorangegangenen Infektion vor heterologen Infektionen durch einen anderen Serotyp bedingen kann. Der intrazelluläre Lebensraum der Chlamydien könnte ein weiterer Faktor sein, warum Schutzmechanismen des Wirtes wenig Wirkung zeigen. Während der intrazellulären Phase können die Chlamydien den

14 1. EINLEITUNG 8 Abwehrmechanismen entgehen, denen sie extrazellulär ausgesetzt sind (z.b. Neutralisierung und Opsonisierung). Persistierende Infektionen können eine permanente Antigenquelle darstellen, was lang anhaltende entzündliche Reaktionen zur Folge haben kann. Zum Beispiel wird das Chlamydien-HSP 60 aus latent infizierten Zellen freigesetzt, was möglicherweise zu einer Hypersensitivitätsreaktion führt. Lange Zeit nachweisbare Chlamydien-Proteine oder LPS-Immunkomplexe und IgA-Antikörper wurden als Anzeichen einer chronischen, entweder persistierenden oder rekurrierenden Infektion gewertet (96). 1.6 ERKRANKUNGEN DURCH C. PNEUMONIAE HÄUFIGKEIT UND EPIDEMIOLOGIE C. pneumoniae ist die beim Menschen am häufigsten vorkommende Chlamydienart. Im Durchschnitt werden 10% aller Pneumonien durch C. pneumoniae hervorgerufen (57,61,63); damit gehört diese Spezies zu den dritt- bis vierthäufigsten Pneumonie- Erregern (56,62). Über 50% der erwachsenen Bevölkerung besitzt Antikörper gegen C. pneumoniae (49,50,84,148,176). Eine Erstinfektion löst eine auf 3 bis 5 Jahre begrenzte Immunantwort aus. Man kann davon ausgehen, daß die meisten Menschen während ihres Lebens infiziert und reinfiziert werden (73,130). Akute Erstinfektionen haben einen Gipfel bei Schulkindern im Alter zwischen 5 und 9 Jahren (3,187). Während die Antikörper-Rate bei Jungen und Mädchen unter 15 Jahren gleich verteilt ist, hat bei Erwachsenen das männliche Geschlecht eine weitaus höhere Serumprävalenz vorzuweisen (28,97) ÜBERTRAGUNGSWEG Über die Verbreitung, die Inkubationszeit und den Pathomechanismus bestehen noch keine genauen Kenntnisse. Es handelt sich um einen primär humanpathogenen Erreger, dessen Übertragung von Mensch zu Mensch vergleichsweise langsam erfolgt (14,21,55,79,94,95,151). Neuere Studien lassen auf eine Übertragung über Aerosole durch Tröpfcheninfektion schließen. Ein enger zwischenmenschlicher Kontakt begünstigt die Übertragung, da C. pneumoniae zwar auf Gegenständen relativ lange überleben und über Händekontakt weiter gegeben werden kann. Die Überlebenszeit auf der Haut ist jedoch sehr kurz (42,169,173). Aufgrund des raschen Anstiegs der Antikörper-Prävalenz im

15 1. EINLEITUNG 9 Schulalter, sowie der häufiger bei einzelnen Familienmitgliedern als bei einer ganzen Familie gefundenen akuten Infektion wird vermutet, daß die Mehrzahl der Übertragungen außerhalb der Familie erfolgt. Es wurden jedoch auch einige Familieninfektionen mit C. pneumoniae beschrieben (2,52b,91,139,190) KLINIK C. pneumoniae verursacht häufig Infektionen des Respirationstraktes, die in der Mehrzahl durch den milden oder asymptomatischen Verlauf kaum auffallen und vor allem jüngere Patienten betreffen. Eine atypische Pneumonie oder eine Bronchitis sind die am häufigsten diagnostizierten Krankheitsbilder. Ein schwerer Verlauf ist eher bei älteren Patienten anzutreffen. Es gibt keine eindeutigen Zeichen bzw. Symptome einer C. pneumoniae-infektion, doch helfen einige charakteristische klinische Erscheinungsbilder, sie von anderen Ursachen zu unterscheiden (56,170): Im frühen Krankheitsstadium sind eine Sinusitis und Pharyngitis mit Halsschmerzen und Heiserkeit, außerdem ein lang anhaltender Husten typisch. Es kann zu einem zweigipfeligen Verlauf kommen, in dem sich eine typische Bronchitis oder Pneumonie entwickelt. Fieber ist bei den meisten Patienten nicht vorhanden, kann aber in einer früheren Phase des Krankheitsverlaufs schon aufgetreten sein. Selbst bei milden Verlaufsformen und nach Antibiotikatherapie verläuft die vollständige Genesung oft sehr langsam. Krankheitsgefühl und Husten können über mehrere Wochen hinweg erhalten bleiben. In den letzten Jahren wurde C. pneumoniae eine immer größere extrapulmonale Bedeutung zugeordnet. SAIKKU et al. beschrieben 1988 erstmals eine Assoziation zwischen C. pneumoniae-infektionen und der koronaren Herzkrankheit (150). Aus Atheromen von Herzgefäßen konnte C. pneumoniae isoliert werden, was den möglichen Zusammenhang mit arteriosklerotischen Herz- und Gefäßerkrankungen unterstreicht (149). Die Mitbeteiligung von Endokard, Myokard und Perikard wurde bereits mehrfach beschrieben (108,110,127,182). Asthma bronchiale, Guillain-Barré Syndrom und die pulmonale Sarkoidose sind weitere Krankheitsbilder, die mit einer C. pneumoniae-infektion in Verbindung gebracht werden (65,68,69).

16 1. EINLEITUNG ERKRANKUNGEN DURCH C. TRACHOMATIS HÄUFIGKEIT UND EPIDEMIOLOGIE Abgesehen vom Biovar Maus ist das Wirtsspektrum von C. trachomatis auf den Menschen begrenzt. C. trachomatis gehört zu den bedeutendsten Krankheitserregern in Entwicklungsländern und der westlichen Welt. Nach Angaben der WHO sind weltweit 500 Millionen Menschen infiziert, wovon 7-9 Millionen erblindet sind. Damit ist das Trachom bis heute die häufigste Ursache einer Erblindung und kommt in Regionen mit mangelhaften hygienischen Verhältnissen endemisch vor (85). Sowohl das Lymphogranuloma venereum, das durch die Serovare L 1 bis L 3 ausgelöst wird, welche eine größere Invasivität als die übrigen Stämme aufweisen, als auch das Trachom (Serovare A- C) stellen in Deutschland eine meldepflichtige Krankheit dar. In den westlichen Ländern mit gehobenerem hygienischen Standard treten gehäuft die von den Serovaren D bis K verursachten okulo-genitalen Infektionen auf. Die Urethritis gehört zu den am häufigsten sexuell übertragenen Krankheiten und wird von Chlamydien mehr als doppelt so häufig verursacht wie von Neisseria gonorrhoeae (9) TRACHOM Serotyp: A-C Erregerreservoir: Mensch, Epithelzellen der Bindehaut Übertragungsweg: Schmierinfektion Klinik: Die Krankheit beginnt als mukopurulente Konjunktivitis mit einem akut entzündlichen Exsudat (Neutrophile Granulozyten, Monozyten). Darauf folgt eine zelluläre Infiltration aus Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen. Es kommt zu einer chronischen Infektion mit einer follikulären Keratokonjunktivitis (177). Nekrosen der Follikel werden durch Bindegewebssprossungen ersetzt. Innerhalb von Jahren tritt eine Vernarbung der Konjunktiven mit Liddeformationen (Entropium, Trichiasis) ein, an deren Ende nach Jahren die völlige Erblindung steht. Zudem kommt es zu einer Vaskularisierung der Hornhaut, was zur Bildung eines bindegewebigen Pannus führt. Die akute Infektion verläuft nach einer Inkubationszeit von 5-7 Tagen meist mit milder Symptomatik, wie Jucken, Brennen und Tränenfluß. Spätfolgen können durch rechtzeitige Antibiotikatherapie

17 1. EINLEITUNG 11 verhindert werden. Je nach Symptomatik unterscheidet die WHO vier Krankheitsstadien. GRAYSTON et al. führten 1985 fortgeschrittene Stadien des Trachoms mit irreversiblem Schaden auf Reinfektionen zurück (64,131) OKULO-GENITALE INFEKTION Serotyp: D-K Erregerreservoir: Mensch, Übergangsepithelien der männlichen und weiblichen Harnröhre, Epithelien des Genitaltraktes Übertragungsweg: sexuelle Kontakte, Schmierinfektion bei der Geburt Klinik: Urogenitaltrakt Beim Mann tritt eine nicht-gonorrhoische Urethritis auf, häufig mit asymptomatischem Verlauf. Komplikationen wie Prostatitis, Epididymitis mit möglicher Beeinträchtigung der Fertilität und Arthritis können auftreten (41,179). Bei der Frau ist die häufigste Infektion eine Zervizitis mit asymptomatischem Verlauf. Sie kann aber auch mit gelblichschleimigem Ausfluß und Kontaktblutungen einhergehen. Aufsteigende Infektionen können auf das Endometrium, die Adnexe und die Peritonealhöhle (Perihepatitis, Appendizitis, Peritonitis) übergreifen. Dieser Verlauf wird auch Pelvic Inflammatory Disease (PID) genannt und birgt das Risiko einer späteren Infertilität und Eileiterschwangerschaft (66,129,137,183). Kontrovers diskutiert wird die Rolle der Chlamydieninfektion bei vorzeitigem Blasensprung, frühzeitigem Wehenbeginn und dadurch gesteigerter Abortrate bzw. die Geburt sog. Low birth weight Infants (5,19). Ophthalmologische und pulmonale Infektionen Die Einschlußkonjunktivitis des Erwachsenen, früher auch Schwimmbadkonjunktivitis genannt, wurde vor Einführung der Chlordesinfektion häufiger beobachtet. Der Verlauf gleicht dem milde ausgeprägten Trachom. Pneumonien des Erwachsenen, ausgelöst durch C. trachomatis können bei immunsupprimierten Patienten eine Rolle spielen (117).

18 1. EINLEITUNG 12 Neonatale Infektionen Ungefähr zwei Drittel der Kinder chlamydieninfizierter Mütter (ca. 5-10% der Schwangeren) infizieren sich bei der vaginalen Geburt (16,153). Nach einer Inkubationszeit von 2-4 Wochen entwickelt ein Drittel der infizierten Neugeborenen eine Keratokonjunktivitis, bei Besiedelung des Nasopharynx und des Respirationstraktes auch eine Lungenentzündung (4,15,16,38,79,107,138). Im Gegensatz zum Trachom kommt es hier selten zur Narbenbildung am Auge RHEUMATOLOGISCHE ERKRANKUNGEN Etwa 1-3% beider Geschlechter, insbesondere HLA B27-positive Personen, entwickeln nach einer chlamydienbedingten Urogenitalinfektion eine Arthritis (88,89,168). Vorwiegend bei Männern kann eine unbehandelte Urethritis mit einem später auftretenden Morbus Reiter in Verbindung gebracht werden (88,93,109,124) LYMPHOGRANULOMA VENEREUM (LGV) Serotyp L 1 -L 3 Erregerreservoir: Übertragungsweg: Mensch, Zellen des lymphatischen Gewebes sexuelle Kontakte Klinik: Die systemische Infektion beginnt mit einer papulösen bis ulzerösen Primärläsion, meist im Genitalbereich und befällt über Lymphbahnen die regionären Lymphknoten. Das Sekundärstadium ist durch eine schmerzhafte Lymphadenitis und Fieber gekennzeichnet. Nach der bindegewebigen Vernarbung der Lymphknoten kann es im Tertiärstadium zu Elephantiasis und Fistelbildung kommen (175). 1.8 DIAGNOSTIK ERREGERNACHWEIS Zellkultur Unter optimalen Bedingungen erreicht die Zellkultur zum Nachweis von C. trachomatis eine Sensitivität von 70-80% (9,99,155). Die kurze Überlebenszeit außerhalb der

19 1. EINLEITUNG 13 Wirtszelle und die geringe Infektiosität der Chlamydien bedingen eine relativ hohe Zahl falsch negativer Ergebnisse. Eine Kontamination der Zellkultur durch Mikroorganismen und/oder toxische Substanzen kann trotz Antibiotikazusatz vorkommen und die Diagnostik unmöglich machen. Bei genitalen Infektionen durch C. trachomatis wurde die Zellkultur wegen ihrer hohen Spezifität bisher als zuverlässigste Methode des Erregernachweises gewertet, an der sich andere Direktnachweisverfahren orientieren. Bei der Kultur von C. trachomatis üblich wird auch hier durch Zentrifugieren des infektiösen Untersuchungsmaterials auf einen Zell-Monolayer eine höhere Ausbeute erreicht. Für die Anzucht von C. trachomatis werden üblicherweise McCoy (maligne Mausfibroblasten) oder HeLa 229 (menschliche Zervixkarzinom-Zellen)- oder BGM (Buffalo Green Monkey, eine Affennierenzell-Linie)- Zellen verwendet (51,94,142). Die Chlamydieneinschlüsse in den infizierten Zellen können mit gattungs- oder speziesspezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachgewiesen werden (25,115). Es ist wichtig, positive und negative Kontrollen mitzuführen, da Chargen-Schwankungen der monoklonalen Antikörper zu falsch negativen Befunden führen können (H.M. FREIDANK et al., pers. Mitteilung). Das Anzüchten von C. pneumoniae ist erheblich schwieriger. Geeignet hierfür sind HL- Zellen, eine menschliche Zell-Linie, und HEp-2-Zellen, eine Zell-Linie aus menschlichem Larynx Karzinom (32,189). Mit BGM-Zellen kann sowohl C. trachomatis als auch C. pneumoniae gut angezüchtet werden (51,52). C. psittaci läßt sich ebenfalls in der Zellkultur isolieren, aufgrund der hohen Infektionsgefährdung ist dies jedoch nicht das Verfahren der Wahl. In der Praxis wird eine Ornithose serologisch durch Nachweis eines hohen Antikörper-Titers oder eines Titeranstieges diagnostiziert Antigentests und Nukleinsäurenachweis Tests zum Antigennachweis sind technisch einfacher und wesentlich schneller durchzuführen als die Zellkultur. Die direkte Immunfluoreszenz (DIF) spielt in der Routinediagnostik nur bei C. trachomatis-infektionen eine Rolle, während für C. pneumoniae die direkte Immunfluoreszenz nicht als alleiniges Nachweisverfahren empfohlen wird (46,50). Der Antigennachweis mittels ELISA-Verfahren ist in der Diagnostik von C. trachomatis- Infektionen weit verbreitet und hat Sensitivitäts- und Spezifitätswerte von % bzw.

20 1. EINLEITUNG %. Positive Befunde sollten immer mit einer zweiten Methode bestätigt werden, insbesondere in Patientengruppen mit niedriger Prävalenz der Infektion, da der positive prädiktive Wert stark von der Prävalenz des untersuchten Kollektivs abhängt (30). Mit der PCR (polymerase chain reaction) und der LCR (ligase chain reaction) gelingt der Nachweis kleinster DNA-Mengen; sie ermöglichen zudem den Nachweis von nicht mehr vermehrungsfähigen Erregern (29). Bei der Diagnostik von C. trachomatis-infektionen haben beide Amplifikationsmethoden eine höhere Sensitivität als die Zellkultur oder die DIF (41,105,165,174,189). Um optimale Sensitivitäten der DNA-Amplifikation zu erreichen - mit dieser Methode ist es theoretisch möglich das Erbgut eines einzelnen Erregers nachzuweisen - sind noch einige Inhibitorenprobleme zu lösen SEROLOGIE Die Serologie hat je nach Chlamydienspezies einen unterschiedlichen Stellenwert in der Diagnostik. Die Serologie stützt sich häufig auf den Nachweis einer Serokonversion oder einen signifikanten Titeranstieg in mindestens zwei Serumproben. Ein positives Ergebnis im Nachweis von spezifischen Antikörpern über die Komplementbindungsreaktion (KBR), darf nur der Chlamydien-Gattung zugeschrieben werden und nicht einer bestimmten Chlamydien-Spezies. Die KBR gilt als Methode der Wahl zur Diagnose der Ornithose (40,154). Da aber die Durchseuchung mit C. pneumoniae erheblich größer ist als mit C. psittaci, hatten in der Vergangenheit viele Patienten, bei denen mittels KBR eine Ornithose diagnostiziert wurde, in Wirklichkeit eine C. pneumoniae-infektion, was besonders bei fehlender Angabe eines Vogelkontaktes oder beruflicher Exposition wahrscheinlich ist (17,45,48,58). Der einzige bisher anerkannte Test zum Nachweis speziesspezifischer Antikörper ist der von S.P. WANG & J.T. GRAYSTON 1970 entwickelte Mikroimmunfluoreszenz-Test (MIF). Bei der Neugeborenenpneumonie und den respiratorischen Infektionen durch C. pneumoniae ist er diagnoseweisend (175). Das Verfahren ist sehr empfindlich, benötigt in der Ablesung und Bewertung jedoch viel Erfahrung. Zudem ist dieser Test relativ aufwendig und wird daher in der Routinediagnostik kaum angewandt. Neuere speziesspezifische Tests sind in Erprobung.

21 1. EINLEITUNG THERAPIE Bis heute gibt es noch immer keine kontrollierten Studien zur Therapie einer C. pneumoniae-infektion. Die Hauptprobleme bei der Beurteilung der Wirksamkeit antibiotischer Therapien gegen C. pneumoniae bestehen in der Definition der Infektion und dem Nachweis des Erregers (87). Die klinische Erfahrung hat gezeigt, daß es häufig zu Rezidiven der Beschwerden kommt, selbst wenn eine Therapie mit geeigneten Antibiotika (Erythromyzin, Tetracyclin, Doxycyclin) durchgeführt wird, deren Dauer und Dosis sich nach Empfehlungen bei anderen Infektionen richtet (72,74). In Veröffentlichungen wurde von Therapien mit täglich 1 g Erythromycin für 5-10 Tage berichtet, wie sie für Mycoplasmen-Pneumonien erfahrungsgemäß wirksam sind (60). Für C. pneumoniae- Infektionen erwies sich diese Therapie als unwirksam, so daß eine längere Behandlung oder höhere Dosen empfohlen werden (43). Auf der Basis bisher vorliegender Berichte wird die Gabe von Doxycyclin (2 x 100 mg pro Tag, 2-3 Wochen) oder Erythromycin (2 g pro Tag, 2-3 Wochen) oder Azithromycin (in einer Gesamtdosis von 1.5 g verteilt auf 5 Tage) als gleich wirksam betrachtet (75,76). Bei C. trachomatis-infektionen sind die genannten Antibiotika ebenfalls wirksam. Die Wahl des Antibiotikums richtet sich im Einzelfall auch nach der Patienten- Compliance, der Verträglichkeit und den Kosten.

22 1. EINLEITUNG ZIEL DER ARBEIT Eisen ist für nahezu alle Lebewesen essentiell, seine Akquisition, Verwertung und Speicherung ist ein stark regulierter Prozeß. Seine Bedeutung für das intrazelluläre Wachstum der Chlamydien wurde bisher wenig untersucht. Einige Studien weisen darauf hin, daß Wachstum und Vermehrung der Chlamydien eisenabhängig sind(141,156,172). Zahlreiche Untersuchungen bei anderen pathogenen Bakterien haben gezeigt, daß diese Eisen zum Wachstum und zur Vermehrung benötigen; sie konkurrieren mit ihrem Wirt durch die Induktion von virulenz-assoziierten Genen um Eisen. Bei fakultativ intrazellulären Bakterien, wie zum Beispiel Salmonella, Shigella, Legionella und Listeria führt eine Eisenrestriktion zur Expression spezieller Eisen-bindender Proteine, sogenannter Siderophore. Es handelt sich dabei um einen niedermolekularen Eisen-Carrier, welcher Fe 3 aktiv ins Zellinnere transportiert. Bei den gramnegativen Bakterien sind die Siderophore in der äußeren Membran (TonB- und ExbD-Protein) und in der Zytoplasmamembran (ExbB-Protein) lokalisiert. Mit ihrer Hilfe wird der bakterielle Eisenbedarf (10-5 mol/l freie Eisenionen) von eisenhaltigen Proteinen (Transferrin, Lactoferrin und Ferritin; jedoch nicht Hemin) gedeckt (20). Bei Gonokokken konnte ein Protein ausfindig gemacht werden, welches für die Induktion von Virulenzgenen und Eisenrezeptoren verantwortlich ist (35,54). Daß diese Proteine auch eine Rolle im Wirts- und Gewebetropismus spielen, haben Studien an Neisseria meningitidis und N. gonorrhoeae gezeigt, welche Schleimhautzellen befallen. In einer Studie infizierte man eine Gruppe Freiwilliger mit einer Mutante von N. gonorrhoeae, bei der das Eisen-bindende Protein fehlte. Das Bakterium war in dieser Form nicht fähig, die zu erwartende Urethritis auszulösen (34). In einer weiteren Studie wurden Mäuse mit N. meningitidis infiziert. Die Behandlung der Maus-Gruppe mit spezifischen Antikörpern gegen einen Transferrin-Rezeptor in der äußeren Membran von N. meningitidis konnte eine Infektion verhindern (37). Besonders gut untersucht ist in diesem Zusammenhang Y. enterocolitica; diese Spezies gehört zu den Enterobacteriaceae, besitzt kein eigenes Eisen-bindendes System und ist lediglich in der Lage, Siderophore anderer Bakterien zu benutzen. In der äußeren Membran wurden Rezeptoren für die Siderophore Deferoxamin b und Enterobactin identifiziert (13,144). In vitro wurde bereits 1984 von R.M. ROBINSON-BROWN et al. ein Synergismus von Salmonella typhimurium und Y. enterocolitica beobachtet, wodurch die Eisenversorgung der Yersinien gewährleistet wird (144). Y. enterocolitica ist der Auslöser

23 1. EINLEITUNG 17 einer Enteritis. Eine systemische Dissemination ist ungewöhnlich und kommt dann vor, wenn eine Grunderkrankung, wie z.b. eine Hämosiderose oder Zirrhose vorliegt. Viele Patienten mit solch einer Eisenüberladung erhalten zur Therapie Deferoxamin (DFA). Es wird angenommen, daß das DFA zur Deckung des Eisenbedarfs von Yersinia enterocolitica genutzt wird und somit zur Entstehung einer systemischen Yersiniose beitragen könnte. Untersuchungen von MELBY et al. (1982) haben ergeben, daß diese Substanz in vitro einen Wachstumsfaktor für Y. enterocolitica darstellt (112). Dieser Zusammenhang spiegelt möglicherweise die Schwierigkeit von Y. enterocolitica wieder, Eisen vom Wirt aufzunehmen (144). Reguliert wird die Eisenaufnahme bei Yersinien und mehreren gramnegativen Bakterien durch das `Fur -System (ferric uptake regulation). `Fur ist im Zytoplasma lokalisiert und bindet bei hohem Eisenspiegel an eine spezifische DNA-Sequenz, wodurch die Transkription gehemmt wird. Unter Eisenmangel löst sich das eisenfreie `Fur von der DNA-Sequenz und das Operon kann abgelesen werden (133). Bei Chlamydien ist die Rolle des Eisens in der Pathogenese bisher wenig untersucht. Dagegen ist der Gewebetropismus der Chlamydien relativ gut bekannt: C. trachomatis befällt hauptsächlich Schleimhautzellen und C. pneumoniae Epithelzellen des Respirationstraktes. Die Rolle des Eisens wurde in einer kürzlich erschienenen Arbeit von J.U. IGIETSEME und Mitarbeitern (1998) mit berücksichtigt. Untersucht wurde die antimikrobielle Aktivität T-Zell-vermittelter Zytokine, insbesondere -Interferon, gegen Chlamydia trachomatis in Epithelzellen des Menschen (80). Durch das Interferon kam es zur Induktion dreier Abwehrmechanismen, die das intrazelluläre Chlamydienwachstum hemmen. Zu diesen drei Mechanismen gehören die Bildung von NO (Stickoxid), der Tryptophankatabolismus und der Entzug des intrazellulären Eisens. Die Ergebnisse haben gezeigt, daß über Zytokine mehrere Mechanismen ausgelöst werden können, um das Chlamydienwachstum zu kontrollieren und daß eine Eisenreduktion dazu beiträgt. In einer Studie zeigten SCIDMORE & HACKSTADT 1995, daß Chlamydien ihren Eisenbedarf aus Transferrin decken, indem sie mit 55 Fe beladenes radioaktives Transferrin als endosomalen Marker in Chlamydien-infizierten Mäusen benutzten. Nach einem Entwicklungszyklus fanden sie Radioaktivität bei den isolierten EK (156). Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, daß Transferrin-haltige Endosome unmittelbar an der Einschlussmembran der Chlamydien angrenzen (166,172). Auf welchem Weg das Eisen über die Membran in die Chlamydien gelangt, ist noch nicht geklärt.

24 1. EINLEITUNG 18 Bei meinen Untersuchungen beschäftigte ich mich mit dem Einfluß der Eisenrestriktion durch die intrazellulär Eisen-bindende Substanz Deferoxamin (DFA) auf die Vermehrung von C. pneumoniae und C. trachomatis in insgesamt vier verschiedenen Zell-Linien mit der Fragestellung eines unterschiedlichen Gewebetropismus der Chlamydien. In einem zweiten Teil untersuchte ich, in wieweit Änderungen im Proteinmuster durch die Abnahme der Eisenverfügbarkeit nachzuweisen sind. J.E. RAULSTON (1997) fand mittels 2D-PAGE (zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese) und anschließendem Western-Blot mehrere C. trachomatis-proteine, welche eisenabhängig exprimiert wurden. Eines davon wurde als das Hitze-Schock Protein 60 (HSP 60) der Chlamydien identifiziert, welches im Zusammenhang mit destruktiven immunopathologischen Folgeerscheinungen in infizierten Patienten beschrieben wurde (141).

25 2. MATERIAL UND METHODEN MATERIAL UND METHODEN Alle Versuche, die unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurden (Zellkultur und Infektion), erfolgten an einer Reinraum-Werkbank mit Laminar Flow System. 2.1 CHLAMYDIEN - STÄMME Bei den Versuchen wurden folgende Chlamydienstämme der Washington Research Foundation (WRF, Seattle, USA) verwendet: Chlamydia pneumoniae Stamm AR-39 Chlamydia trachomatis Serovar E und L ZELL - LINIEN Bei den Versuchsdurchführungen wurden vier verschiedene Zell-Linien verwendet: HEp-2-Zellen, menschliche Larynx Karzinom Zellen (Flow Laboratories, England). HL-Zellen, menschliche Zellen ungeklärter Herkunft (Cavallaro&Monto, 1972), freundlicherweise von Dr. Kuo, Seattle, USA zur Verfügung gestellt. BGM-Zellen, Buffalo Green Monkey Kidney Zellen (Affennierenzellen; Flow Laboratories, England). BHK-Zellen, Baby Hamster Kidney Zellen, aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Abteilung Virologie, Freiburg.

26 2. MATERIAL UND METHODEN REAGENZIEN Deferoxamin (DFA) C 25 H 48 N 6 O 8 ; eine intrazellulär eisen-bindende Substanz (CIBA Pharma, Wehr). Eisen-III-Chlorid; FeCl 3 (SIGMA, Deisenhofen) holo-transferrin (SIGMA, Deisenhofen) 2.4 ANZUCHT DER CHLAMYDIEN IN DER ZELLKULTUR KULTIVIERUNG DER ZELL-LINIEN Alle Zell-Linien wurden in Eagle`s Minimal Essential Medium (E-MEM) der Firma BIOCHROM (Berlin) unter Zusatz von 5% inaktiviertem (56 C, 30 min) fötalem Kälberserum (FCS, Vitromex, Selters) bei 37 C im Brutraum gehalten und nach Wachstum zu einem konfluierendem Monolayer alle 2-3 Tage gesplittet. Das FCS weist auch einen stabilisierenden Effekt auf das Wachstum von Chlamydien auf (169). Um die Zellen zu splitten, wurde das Medium abgegossen und auf den Zellrasen zweimal ein Trypsin-Versen-Gemisch (1:4) gegeben. Nach kurzer Einwirkzeit ließen sich die Zellen ablösen. Die abtrypsinierten Zellen wurden in 10 ml E-MEM mit 5% FCS gut resuspendiert und dann auf weitere Flaschen verteilt (Minimum 3 ml), die wiederum mit E-MEM 5% FCS aufgefüllt wurden INFEKTION DER ZELL-LINIEN MIT CHLAMYDIENSTÄMMEN Eine Infektion kann sowohl in kleinen Zellkultur-Röhrchen, als auch in Zellkultur- Flaschen erfolgen, falls eine größere Chlamydien-Ausbeute erforderlich ist Infektion in Zellkulturröhrchen Für die Infektion wurden Kobalt sterilisierte PS-Zellkulturröhrchen (Ø 12,5 mm; Greiner, Frickenhausen) verwendet. Der für eine Infektion notwendige gleichmäßige Zellrasen wuchs in den Röhrchen auf vorher gereinigten und sterilisierten Deckgläschen (Reinigung mit Ethanol und 3%-iger HCl-Lösung). Ihr Durchmesser beträgt 12 mm, ihre Dicke 1,5

27 2. MATERIAL UND METHODEN 21 mm (Firma Langenbrinck, Emmendingen). Um einen gleichmäßigen Zellrasen zu erhalten, wurde eine 175 cm 3 Zellkulturflasche wie unter beschrieben, abtrypsiniert. Anstelle des Splittvorgangs wurden die abtrypsinierten Zellen in 75 ml E-MEM 5% FCS aufgenommen und gut resuspendiert. Anschließend wurden 10 mit Deckgläschen versehene PS-Zellkulturröhrchen mit jeweils 1 ml dieser Zellsuspension gefüllt. Auf die Zellsuspension wurde sofort jeweils 100 µl Inokulum pipettiert. Die PS-Zellkulturröhrchen wurden schließlich für 1 Stunde bei 37 C und 3470 x g (Varifuge 3 0R, HERAEUS, Osterode) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation erfolgte das Absaugen des Überstandes und Hinzufügen von jeweils 1 ml CMGA-Medium (52). Zur Vermehrung der Chlamydien in der Zellkultur wurde Culture Medium Glucose and Antibiotics (CMGA) in folgender Zusammensetzung eingesetzt : Nährmedium (E-MEM) 0,5% Glukose (E. Merck, Darmstadt) 100 µg/ml Vancomycin (LILLY, Gießen) 50 µg/ml Streptomycin (SIGMA, Deisenhofen) 50 I.E./ml Nystatin (SIGMA, Deisenhofen) 0,6 µg/ml Cycloheximid (SIGMA, Deisenhofen) und 10% FCS (BIOCHROM, Berlin) Cycloheximid setzt den Zellstoffwechsel herab und erleichtert den Chlamydien die Infektion (52). Es folgte eine Inkubation in 5%-iger CO 2 -Atmosphäre bei 37 C, 72 Stunden für Chlamydia pneumoniae und 48 Stunden für Chlamydia trachomatis. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Überstände erst in einem sterilen Gefäß gesammelt und in zwei Röhrchen je 0,5 ml SP-Medium (Sucrose-Phosphat) gegeben. Die wieder verschlossenen zwei Röhrchen wurden nun in einem Ultraschallbad für etwa 30 sec. beschallt und anschließend in die nächsten zwei Röhrchen umgefüllt. Diese Prozedur wurde nun bis zum letzten Röhrchen wiederholt, so daß 1 ml Inokulum resultierte. Ein Deckgläschen und 40 µl des Überstandes wurden zur Kontrolle angefärbt (2.5.1). Zusammensetzung des SP-Mediums :

28 2. MATERIAL UND METHODEN 22 68,46 g Saccharose (E. Merck, Darmstadt) 0,52 g Na 2 HPO 4 (E. Merck, Darmstadt) 2 g Rinderserumalbumin ad 1 l Aqua bidest.; ph 7,4-7,6 50 mg/l Streptomycin (SIGMA, Deisenhofen) 100 mg/l Vancomycin (LILLY, Gießen) 25 I.E./ml Nystatin (SIGMA, Deisenhofen) Die Aufbewahrungstemperatur für CMGA, SP-Medium und FCS betrug 4ºC, während E-MEM auch bei Zimmertemperatur gelagert werden kann Versuch I a: Infektion mit Deferoxamin Im ersten Teil der Versuche wurden vier verschiedene Zell-Linien HL, Hep-2, BGM und BHK jeweils mit 100 µl C. pneumoniae AR-39 und 100 µl C. trachomatis E in PS- Zellkulturröhrchen (siehe unter ) in einem Dreifachansatz infiziert. Dem CMGA wurde DFA in den Konzentrationen 0 µm, 50 µm, 100 µm, 200 µm, 250 µm und 500 µm hinzugefügt. DFA bindet intrazellulär Eisen. Damit sollte den Chlamydien das Eisen entzogen werden, um zu untersuchen, in wieweit Eisen einen Einfluß auf Wachstum und Vermehrung der Chlamydien hat. Die 48 bzw. 72 Stunden Inkubation und das Anfärben mit anschließendem Auszählen erfolgten wie unter und beschrieben Versuch I b: Infektion mit FeCl 3 und Deferoxamin In diesem Teil der Versuche wurde neben DFA Eisen-III-Chlorid (FeCl 3 ) in zwei Konzentrationen zugesetzt. Bei den Infektionen mit den zwei Chlamydienspezies und den vier Zell-Linien galt es zu untersuchen, ob mit der Zugabe von Eisen die Wirkung des DFA aufgehoben wird. Für diesen Versuch wurde DFA in den Konzentrationen 0 µm, 100 µm, 200 µm und 500 µm sowie FeCl 3 jeweils in den Konzentrationen 20 µm und 100 µm zugesetzt. Als Kontrolle diente eine Infektionsreihe mit DFA, jedoch ohne Zugabe von Eisen. In Vorversuchen wurde auch holo-transferrin in Konzentrationen von 0,6 mg/ml und 6 mg/ml eingesetzt, mit dem sich die gleichen Wirkungen zeigten.

29 2. MATERIAL UND METHODEN Infektion in der Zellkulturflasche Steht ein gut konzentriertes Inokulum (ca IFU /ml) zur Verfügung, kann man Chlamydien in großen Mengen, z.b. für die Proteinanalytik oder auch als Vorrat, anzüchten. Hierzu gaben wir 1 ml gewonnenes Inokulum, wie unter beschrieben, auf eine große Flasche (175 cm 3 ) mit BGM-Monolayer ohne Medium und ließen es auf einem langsam eingestellten Schüttler etwa 3 h im Brutraum inkubieren. Danach wurden 75 ml CMGA hinzugefügt und die Zellkulturflasche zur Inkubation für 48 bzw. 72 h in den Brutschrank (37 C/ 5 % CO 2 ) gelegt. Zum Abernten wurde der Zellkultur-Überstand in einem sterilen Gefäß gesammelt. Der Zellrasen wurde mit 10 ml SP-Medium im Ultraschallbad (Elma, Transonic T 460/H, Singen) abgelöst. Sowohl ein Aliquot des abgelösten Zellrasens als auch ein Aliquot des Überstandes wurden wie unter 2.5 beschrieben zur Infektionskontrolle angefärbt. War die Infektion gut, so wurden 1 ml Aliquots bei -70ºC eingefroren oder direkt weiterverarbeitet Versuch II: Infektion mit FeCl 3 und Deferoxamin zur Antigenherstellung für Immunoblots Um eventuelle Änderungen im Proteinprofil unter dem Einfluß von DFA und FeCl 3 feststellen zu können, mußten große Mengen an Chlamydienantigenen produziert werden. Hierzu erfolgte die Anzüchtung der Stämme C. pneumoniae AR-39 und C. trachomatis Serovar L 2, wie unter beschrieben auf den vier genannten Zell-Linien. Es wurden je drei Versuchsansätze mit und ohne Infektion durchgeführt: 1. CMGA 2. CMGA 200 µm DFA 3. CMGA 200 µm DFA 100 µm FeCl 3 Nach der Inkubation (48 bzw. 72 h / 37 C / CO 2 Brutschrank) wurde die Zellkulturflasche, wie unter beschrieben, abgeerntet und das Antigen gereinigt und konzentriert; ein Aliquot wurde für die Proteinbestimmung nach LOWRY (1951), modifiziert von PETERSON (1977) eingesetzt (104,134).

30 2. MATERIAL UND METHODEN 24 Nach der Proteinbestimmung wurden die Proben auf ein SDS-Gel aufgetragen (siehe 2.7.3) und mit Coomassie-Blau gefärbt oder für den Immunoblot (2.8.4) verwendet. 2.5 NACHWEIS EINER CHLAMYDIENINFEKTION MIT DIREKTER IMMUNFLUORESZENZ ( DIF ) ANFÄRBEN EINES DECKGLÄSCHENS DER ZELLKULTURRÖHRCHEN Nach Absaugen des Mediums erfolgte die Fixierung der infizierten Zellen mit 1 ml Methanol für 10 min in das Zellkulturröhrchen, um die Zellen zu fixieren. Dann wurde das Deckgläschen herausgenommen und zum Trocknen auf ein Saugpapier gelegt. Danach wurde das Deckgläschen mit dem gattungspezifischen, fluoreszeinmarkierten monoklonalen Antikörper (Pathfinder, Kallestadt) in einer feuchten Kammer für 30 min gefärbt. Anschließend wurde das Deckgläschen mit Aqua dest. 15 sec gewaschen. Nach Trocknung, wurde das Deckglas mit einem Tropfen `Mounting Fluid (Syva Mikro Track) auf einem beschrifteten Objektträger luftblasenfrei eingebettet. Schließlich konnte das Präparat unter dem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop, Zeiss, Jena) bei 400-facher Vergrößerung betrachtet werden ANFÄRBEN DES ZELLKULTURÜBERSTANDES BZW. DES INOKULUMS Von der Chlamydien-Zell-Suspension bzw. dem Überstand wurden mit einer Pipette etwa 40 µl herausgenommen, auf die runde Aussparung in der Mitte eines `Pathfinder Objektträgers gegeben und gut getrocknet. Danach folgten die Fixierung mit Methanol für 10 min, erneutes Trocknen und das Färben mit einem Tropfen des gattungsspezifischen monoklonalen Antikörpers in einer feuchten Kammer für 30 min. Dann wurde der Objektträger für ca. 15 sec mit Aqua dest. gewaschen und schließlich mit einem Tropfen `Mounting Fluid luftblasenfrei eingebettet. Die Beurteilung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop, Zeiss, Jena) bei 400-facher und 1000-facher Vergrößerung.

31 2. MATERIAL UND METHODEN MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNG Die Einschlußkörperchen leuchten im Fluoreszenzmikroskop apfelgrün mit leichter Granulierung (S. 39, Abb. 6a). Das Zytoplasma der durch Evans Blue rötlich angefärbten Wirtszellen ist glatt und begrenzt. Bei starken Infektionen waren auch im Überstand Elementarkörperchen zu sehen, die sich leuchtend grün im Extrazellulärraum anfärben ließen. Artefakte, wie z.b. Fussel oder Staubkörnchen können gut durch ihre Form und gelbliche Anfärbung von Chlamydien abgegrenzt werden. Das Auszählen der Einschlußkörperchen auf einem Deckgläschen erfolgte durch meanderförmiges Durchmustern eines Präparates bei 200-facher Vergrößerung. Ein Deckgläschen hat ca. 88 Gesichtsfelder. Bei einer Infektionsdichte von über 400 Einschlußkörperchen (RK) pro Präparat erfolgte deshalb das Auszählen, indem der Mittelwert dreier Gesichtsfelder mit 88 multipliziert wurde BERECHNUNG Um eine Vorstellung davon zu bekommen, wie hoch der Chlamydiengehalt im hergestellten Inokulum war, wurde eine Verdünnungsreihe von 1:10, 1:50 und 1:100 hergestellt und damit eine Infektion wie unter beschrieben, in je einem Flachbodenröhrchen durchgeführt. Die nach Anfärben des Deckgläschens durch mikroskopische Auswertung erhaltene Anzahl (n) der Einschlußkörperchen (RK) pro Gesichtsfeld (G) wurde auf das stärker konzentrierte Inokulum hochgerechnet : 1:10 n RK / G x 88 = n x 10 Ifu/100µl 1:50 n RK / G x 88 = n x 50 Ifu/100µl 1:100 n RK / G x 88 = n x 10 2 Ifu/100µl Die Vermehrungsrate (burst size) wird durch die Bildung des Quotienten aus Ernte und Einsaat bestimmt. Das Wachstumsverhalten der Chlamydien und der Zellen ist schwer abzuschätzen und unterliegt gewissen Schwankungen. Aus diesem Grund wurde bei den Versuchen bei jeder Infektionsreihe ein 3-facher Ansatz durchgeführt und der Mittelwert bestimmt.

32 2. MATERIAL UND METHODEN 26 Die Verdünnung des Inokulums zur Einsaat für die notwendigen Infektionen richtete sich zum einen nach der erwarteten `burst size und zum anderen nach der gewünschten Infektionsdichte, damit ein gut auszählbares Ergebnis erzielt wurde. Für die Durchführung der Versuche wurde eine Infektionsausbeute zwischen RK pro Präparat angestrebt. 2.7 PROTEINANALYTIK ANTIGENAUFREINIGUNG Um Chlamydienproteine elektrophoretisch darstellen zu können, benötigt man Antigen in großer Menge, d.h. es wurde eine Anzucht in großen Zellkultur-Flaschen, wie unter beschrieben, durchgeführt und anschließend aufgereinigt: 1. Der mit Chlamydien infizierte Zellrasen wurde im Ultraschallbad von der Zellkulturflasche abgelöst, die Wirtszell/Chlamydien-Suspension wurde in Zentrifugenröhrchen überführt. 2. Zentrifugation bei x g, 30 min und 4 C (Sorvall, Rotor SS 34). 3. Danach wurde das Pellet in 20 ml PBS gut resuspendiert und mit dem Ultraschallstab (Branson, SONIFIER, Schwäbisch Gmünd) 40 sec beschallt. 4. In der Mini-Fuge II (HERAEUS, Instruments, Osterode) bei 100 x g wurde ein Großteil der Wirtszellen von den RK getrennt. Der Überstand wurde abgegossen und nochmals bei x g, 30 min, 4 C pelletiert. 5. Das Pellet wurde in PBS resuspendiert und in der Sorvallzentrifuge nochmals 30 min zentrifugiert ( x g, 30 min, 4 C). 6. Nun wurde das Pellet in 1ml PBS gut resuspendiert und in der Eppendorf Tischzentrifuge 15 min bei x g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde insgesamt dreimal wiederholt. 7. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert und bis zur Proteinbestimmung nach LOWRY et al. (1951), modifiziert von PETERSON (1977) bei -20 C gelagert.

33 2. MATERIAL UND METHODEN PROTEINBESTIMMUNG NACH LOWRY ET AL. (1951), MODIFIZIERT VON PETERSON (1977) Die Proteinbestimmung wurde mit einer von PETERSON (1977) modifizierten Methode nach LOWRY (1951) durchgeführt. Als Standard diente Rinderserumalbumin (BSA-Lsg. 1mg/ml) (104,134). Die Messung erfolgte bei 750 nm. Stammlösungen: CTC (Kupfertartratcarbonat) -Lösung: 100 mg Kupfersulfat- Pentahydrat und 200 mg Natriumtitrat werden in 50 ml Aqua dest. gelöst 10 mg Natriumtitrat werden in 50 ml Aqua dest. gelöst Beide Lösungen unter Rühren vereinigen. Haltbarkeit der Lösung 2 Monate bei Raumtemperatur. 10%-ige SDS -Lösung 0,8 M NaOH (E. Merck, Darmstadt) 2 N Folin-Ciocalteau-Phenolreagenzlösung (E. Merck, Darmstadt) Reagenz A: CTC / SDS -Lsg. / NaOH / Aqua dest ( v/v : 1:1:1:1) 2 Wochen bei Raumtemperatur stabil. Reagenz B Folin / Aqua dest (v/v : 1:5 ) Durchführung: Vom Standard wurden jeweils 2 x 5 µl und 1 x 100 µl in je ein Well einer Mikrotiterplatte gefüllt und von den zu bestimmenden Proben jeweils 10 µl bzw. 20 µl. Mit Aqua dest. wurde auf 400 µl aufgefüllt und anschließend wurden 400 µl Reagenz A hinzugefügt. Nach Durchmischen erfolgte eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Nun wurden 200 µl Reagenz B hinzupipettiert, gut durchmischt und für 30 min bei

34 2. MATERIAL UND METHODEN 28 Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte bei 750 nm in einem Spektrometer (TECAN, Spectra SLT, Germany) DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) NACH LAEMMLI (1970) Die Gelelektrophorese dient der Analyse von Proteinmischungen und ermöglicht die schnelle Bestimmung des Molekulargewichtes (MG). Zur Auftrennung der Chlamydienproteine wurden diskontinuierliche 10,5%-ige SDS-Gele (LAEMMLI, 1970) hergestellt (98). Als Apparatur wurde verwendet: `Mini Protein II Electrphoresis -Zelle (Firma Bio-Rad, München). Stammlösungen: 1. Bis-Acrylamidstammlösung (Roth, Karlsruhe) 2. Bottomgel-Stammlösung, ph 8,8 36,3 g Tris (1,5 M) 0,8 SDS (0,4%) in 100 ml Aqua dest. lösen, ph mit 1 N HCl einstellen, mit Aqua dest. auf 200 ml auffüllen, bei 4 C lagern 3. Uppergel-Stammlösung, ph 6,8 6 g Tris (0,5 M) 0,4 g SDS (0,4%) in 50 ml Aqua dest. lösen, ph mit 1 N HCl einstellen, mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen, bei 4 C lagern 4. SDS-Laufpuffer 3 g Tris 14,4 g Glycin 1 g SDS ad 1 l Aqua dest x Probenpuffer nach LAEMMLI (1970), ph 6,8 1,51 g Tris 4 g SDS

35 2. MATERIAL UND METHODEN g Glycerin 9 ml Mercaptoethanol 2 mg Bromphenolblau ad 100 ml Aqua dest. 6. Ammoniumpersulfat 10% 100 mg Ammoniumpersulfat in 1 ml Aqua dest. lösen Das 10,5%-ige SDS-Gel war folgendermaßen zusammengesetzt: 2,5 ml Bottomgellösung 3,50 ml Acrylamid 4,00 ml Aqua dest. 50 µl APS (10%) und 5 µl TEMED (N, N, N`, N`-tetramethylethylenediamine; Serva, Heidelberg) Die Proben wurden in Probenpuffer aufgenommen, 5 min gekocht, bei x g zentrifugiert und die Überstände in der Konzentration von 10 µg pro Gelspur aufgetragen. Als Größenmarker wurde der Electrophoresis Calibration Kit (Pharmacia) verwendet: Molekulargewicht (Da) Phosphorylase b Albumin Ovalbumin Carbonic Anhydrase Trypsin Inhibitor Lactalbumin Trennbedingungen: Zunächst wurde eine Spannung von 75 Volt angelegt bis die Proben ausreichend weit in das Sammelgel gelaufen waren. Danach erfolgte eine Spannungserhöhung auf 150 Volt.

36 2. MATERIAL UND METHODEN 30 Die Dauer des Elektrophoreselaufs betrug etwa 1 h. Die Gele wurden nachfolgend für den Elektrotransfer (2.7.5) vorbereitet oder wie unter beschrieben angefärbt COOMASSIE- Färbung Färbelösung: 2 g Coomassie Brilliant-Blau R-250 (SERVA, Heidelberg) 250 ml Isopropanol (E. Merck, Darmstadt) 100 ml Essigsäure (E. Merck, Darmstadt) 650 ml Aqua dest. Entfärber: 100 ml Isopropanol 100 ml Essigsäure 800 ml Aqua dest. Die Gele wurden 30 min gefärbt und anschließend durch mehrfachen Wechsel des Entfärbers auf einem Schüttler über 3-4 Stunden entfärbt WESTERN-BLOT Der Elektrotransfer von elektrophoretisch aufgetrennten Proteinen wurde nach der Methode von TOWBIN et al. (1979) in einer größeren Elektrophorese-Kammer durchgeführt (171) Transfer auf PVDF (Polyvinylidendifluorid) -Membran Nach Beendigung des Gellaufs wurde das Gel vorsichtig und luftblasenfrei auf eine PVDF- Membran (Immobilon/Millipore, Eschborn) gelegt. Zuvor wurde die PVDF-Membran für einige Sekunden in Methanol aktiviert, dann für 2 min in Aqua dest. gewaschen und schließlich in Blottingpuffer äquilibriert. Pufferzusammensetzung für den Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran: 3 g Tris (25 mm) 11,25 g Glycin (150 mm)

37 2. MATERIAL UND METHODEN ml Methanol (E. Merck, Darmstadt) 800 ml Aqua dest. Der Elektrotransfer erfolgte bei einer konstanten Stromstärke von 30 Volt über Nacht Amidoschwarz-Färbung Amidoschwarz-Färbelösung: 1 g Amidoschwarz (SERVA, Heidelberg) 450 ml Methanol 100 ml Essigsäure 450 ml Aqua dest. Amidoschwarz -Entfärber: 900 ml Methanol 20 ml Essigsäure 80 ml Aqua dest. Die Markerspur, welche auch als Transferkontrolle diente, wurde 15 min in die Amidoschwarz-Färbelösung gelegt. Danach wurde der Streifen bis zum Sichtbarwerden der Banden in den Entfärber gelegt und in Aqua dest. gewaschen.

38 2. MATERIAL UND METHODEN Immunoblot Blockierungslösung: 3 % Magermilchpulver (Glücksklee, Nestlé, Frankfurt) in PBS / 0,05% Tween 20 1 x PBS : 8 g Natriumchlorid (NaCl) (E. Merck, Darmstadt) 0,2 g Kaliumhydrogenphosphat (KH 2 PO 4 ) 2,9 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4 ) 0,2 g Kaliumchlorid (KCl) 0,2 g Natriumazid (NaN 3 ) in 1 l Aqua dest. lösen Waschlösung: 0,05 % Tween 20 in PBS Primär-Antikörper : a. Chlamydia pneumoniae und Chlamydia trachomatis Antikörper-positive Patientenseren werden 1:100 in Blockierungslösung verdünnt. b. Chlamydia pneumoniae-spezifische anti-p54 monoklonale Antikörper (MAK) wurden in der Verdünnung 1:10 eingesetzt (185,186). Sekundär-Antikörper: a. Anti-Human IgG (Jackson Immuno Research Lab., West Baltimore), Verdünnung 1:1000 b. Anti-Mouse IgG (Jackson Immuno Research Lab., West Baltimore), Verdünnung 1:5000 Die Sekundärantikörper sind mit Alkalischer Phosphatase konjugiert. Entwickler: 1 Tablette RAD-FREE (BCIP/NBT Substrate Tablets; Schleicher&Schuell, INC., Keene, NH) wurden in 30 ml Aqua dest. gelöst.

39 2. MATERIAL UND METHODEN 33 Durchführung: Nach Beendigung des Proteintransfers auf die PVDF-Membran wurde diese der Blottingkammer entnommen. Die einzelnen Spuren wurden markiert, in Streifen geschnitten und für eine Stunde in der Blockierungslösung inkubiert, damit die unspezifischen Proteinbindungsstellen abgesättigt wurden. Daraufhin folgte eine 60 min dauernde Inkubation mit dem Primärantikörper. Bei C. pneumoniae wurde jeder Streifen nochmals in zwei Streifen unterteilt, wovon der zweite mit Antiserum b (p 54, MAK) inkubiert wurde. Nachdem die Membranstreifen 3 x 10 min mit PBS/ 0,05% Tween 20 gewaschen worden waren, folgte die Inkubation mit dem jeweiligen Sekundärantikörper für eine Stunde. Der Waschschritt wurde wiederholt, bevor die Membranstreifen mit BCIP/NBT-Substrat in Aqua dest. entwickelt wurden. 2.8 STATISTIK Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit der Methode einer Multivariaten Analyse (Multivariate Regressionsanalyse) mit freundlicher Unterstützung von Herrn Prof. J. Schulte-Mönting aus dem Institut für Medizinische Biometrie und Medizinische Informatik der Universität Freiburg.

40 3. ERGEBNISSE ERGEBNISSE 3.1 VERSUCH I a: INFEKTION MIT DEFEROXAMIN (DFA) Bei den Infektionsversuchen im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluß des Eisen- Chelatbildners DFA auf die Infektionsrate zweier Chlamydienspezies in vier verschiedenen Zell-Linien untersucht (siehe ) Die Einschlüsse pro Konzentrationsstufe wurden Tab. 1: Einfluß verschiedener DFA-Konzentrationen auf die Einschlußzahl (Ifu) von C. pneumoniae AR-39 und C. trachomatis Serovar E auf vier verschiedenen Zell- Linien; n= Anzahl der ifu, Mittelwerte aus drei Versuchen mit je drei Deckgläschen; % = verglichen mit der unbehandelten Kontrolle *: statistisch signifikanter Unterschied (p< 0.05) (Multivariate Analyse) Chlamydien -spezies Zell- Linie Deferoxamin (DFA) Konzentration in µm BGM Chlamydia n pneumoniae % * Chlamydia n trachomatis % HL Chlamydia n * 43* 39.1* 32.4* pneumoniae % * 68.1* 62.0* 51.3* Chlamydia n * 48.5* trachomatis % * 56.4.* BHK Chlamydia n * 29.2* pneumoniae % * 64.7* Chlamydia n trachomatis % HEp-2 Chlamydia n * 31.3* 27.9* 18.3* pneumoniae % * * 36.7* Chlamydia n * 26.9* --- trachomatis % * 42.4* ---

41 3. ERGEBNISSE 35 ausgezählt und aus dem Dreifach-Ansatz der Mittelwert bestimmt. Jeder Versuchsansatz wurde dreimal wiederholt und die Werte nochmals zusammengefaßt (Tab.1). Die Tabelle 1 gibt den Einfluß verschiedener DFA-Konzentrationen auf die Einschlußzahlen wieder. Deutliche Unterschiede der Ergebnisse waren sowohl zwischen den Chlamydienspezies als auch den verschiedenen Zell-Linien zu beobachten. 1. Bei Chlamydia pneumoniae nahm die Einschlußzahl auf HEp-2 und HL-Zellen mit DFA-Konzentrationen von 100 µm signifikant ab. Dagegen zeigte sich auf BHK- Zellen erst bei DFA-Konzentrationen ab 250 µm und auf BGM-Zellen sogar erst bei 500 µm DFA ein signifikanter Einfluß auf die Vermehrung dieser Chlamydien-Art (Abb. 2). 2. Um eine Abnahme der Einschlüsse bei Chlamydia trachomatis zu bewirken, waren insgesamt höhere DFA-Konzentrationen erforderlich. Auf der HEp-2-Zell-Linie zeigte sich ab 200 µm DFA eine signifikante Abnahme, während auf HL-Zellen eine DFA- Konzentration von 250 µm erforderlich war. Auf den BHK- und BGM-Zellen resultierte keine signifikante Abnahme der Einschlußzahlen (Abb. 3). Bei C. pneumoniae zeigte sich auch eine morphologische Änderung der Einschlüsse, die unter dem Einfluß der Eisenrestriktion deutlich verkleinert waren (Abb. 6b, S.39) Ifu Hep DFA ( µm ) BGM HL BHK Hep-2 Abb.2: Anzahl der Einschlüsse (Ifu) von C. pneumoniae AR-39 auf BGM-, HL-, BHK- und HEp-2-Zellen unter dem Einfluß verschiedener DFA- Konzentrationen. = DFA-Konzentration, mit der ein signifikanter Einfluß zu beobachten war.

42 3. ERGEBNISSE Ifu DFA ( µm ) BGM HL BHK Hep-2 Abb.3: Anzahl der Einschlüsse (Ifu) von C. trachomatis E auf BGM-, HL-, BHKund HEp-2-Zellen unter dem Einfluß verschiedener DFA-Konzentrationen. = DFA-Konzentration, mit der ein signifikanter Einfluß zu beobachten war. 3.2 VERSUCH I b: INFEKTION MIT FECL 3 UND DEFEROXAMIN Durch Hinzufügen von Eisen in das System galt es zu prüfen, ob die Infektionsrate tatsächlich von der Eisenverfügbarkeit abhängig ist ( ). Bei der Zugabe von Eisen- III-Chlorid (oder in den Vorversuchen von holo-transferrin) zu den verschiedenen DFA- Konzentrationen, zeigte sich, daß der DFA-Effekt insgesamt reversibel ist (siehe Tab. 2). Die eingesetzte niedrigere Konzentration von 20 µm FeCl 3 erwies sich bei C. pneumoniae AR-39 auf HL-, HEp-2- und BGM-Zellen und bei C. trachomatis E auf BGM- und HEp-2- Zellen (Abb. 4) als wirkungsvoller verglichen mit 100 µm FeCl 3. Bei den übrigen Zell- Linien zeigte die Anzahl der Einschlüsse von C. pneumoniae und C. trachomatis bei beiden Eisenkonzentrationen keinen Unterschied (Abb. 5). In beiden Konzentrationen war keine Zunahme der Einschlüsse bei alleiniger Zugabe des Eisens (bei 0 µm DFA) zu beobachten.

43 3. ERGEBNISSE 37 Tab.2: Reversibilität des DFA-Effektes auf die Zahl der Einschlüsse von C. pneumoniae AR- 39 und C. trachomatis Serovar E auf A= BGM, B= HL, C= BHK, D= HEp-2-Zellen durch Eisen-III-Chlorid (FeCl 3 ) in zwei Konzentrationen; K.= Kontrolle mit DFA, ohne FeCl 3 ;n = Anzahl der Ifu; % = Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle A: BGM-Zellen B: HL-Zellen Chlamydien FeCl 3 -spezies Deferoxamin Konzentration (DFA) in µm Chlamydien --spezies FeCl 3 Deferoxamin Konzentration (DFA) in µm Chlamydia 100 µm, n Chlamydia 100 µm, n pneumonia e % pneumoniae % µm, n µm, n % % K., n K., n % % Chlamydia 100 µm, n Chlamydia 100 µm, n trachomatis % trachomatis % µm, n µm, n % % K., n K., n % % C: BHK -Zellen D: HEp- 2-Zellen Chlamydien -spezies FeCl 3 Deferoxamin Konzentration (DFA) in µm Chlamydien --spezies FeCl 3 Deferoxamin Konzentration (DFA) in µm Chlamydia 100 µm, n Chlamydia 100 µm, n pneumonia e % pneumoniae % µm, n µm, n % % K., n K., n % % Chlamydia 100 µm, n Chlamydia 100 µm, n trachomatis % trachomatis % µm, n µm, n % % K., n K., n % %

44 3. ERGEBNISSE Ifu DFA (µm) -- FeCl 3 (20 µm) -- FeCl 3 (100 µm) -- DFA ( µm) Abb.4: Anzahl der Einschlüsse (Ifu) von C. trachomatis E auf HEp-2-Zellen unter Zugabe von zwei verschiedenen Eisenkonzentrationen zum DFA. Als Kontrolle diente ein Versuch mit DFA ohne FeCl Ifu DFA (µm) -- FeCl 3 (20 µm) -- FeCl 3 (100 µm) -- DFA (µm) Abb.5: Anzahl der Einschlüsse (Ifu) von C. pneumoniae AR-39 auf BGM-Zellen unter Zugabe von zwei verschiedenen Eisenkonzentrationen zum DFA. Als Kontrolle diente ein Versuch mit DFA ohne FeCl 3.

45 3. ERGEBNISSE VERSUCH II: INFEKTION MIT FECL3 UND DEFEROXAMIN ZUR ANTIGENHERSTELLUNG Um eventuelle Änderungen im Proteinprofil der Chlamydien unter dem Einfluß von Deferoxamin und Eisen-III-Chlorid zu erkennen (siehe ), wurden ImmunoblotAnalysen von C. pneumoniae und C. trachomatis nach Anzucht auf BGM- und HEp-2Zellen durchgeführt. Hierzu wurden die Chlamydien in großen Zellkulturflaschen auf den zwei genannten Zell-Linien angezüchtet (siehe 2.4), um ausreichend Chlamydienantigen zu gewinnen. In den Immunoblots (Abb. 9 bis Abb. 12) waren alle spezifischen Banden von C. trachomatis bzw. C. pneumoniae nachweisbar, inklusive der C. pneumoniaespezifischen 54 kda Bande. Die Tabellen 3 und 4 zeigen jeweils eine tabellarische Auflistung der vorhandenen Banden nach Immunoblot von C. trachomatis bzw. C. pneumoniae- Antigen. Die Abbildungen 9 und 10 zeigen Immunoblots mit C. trachomatis Antikörper-positivem Serum (aufgetragen: 10 µg Antigen/Spur). Die Spuren 1-3 enthalten jeweils nur Antigene nicht infizierter Zellen: 1. ohne DFA, 2. mit DFA und 3. mit Eisen DFA. Unterschiede im Bandenmuster konnten nur in der Intensität festgestellt werden (z.b. im Bereich kda). In den Spuren 4-6 sind die gereinigten Chlamydienproteine aufgetragen. Auch hier kann man nur Ausprägungsunterschiede einzelner Banden feststellen. Abb.9: Immunoblot mit C. trachomatis Antikörper-positivem Patientenserum. BGM-Zellen: 1. ohne DFA, µm DFA, µm DFA und 100 µm FeCl3. C. trachomatis: 4. ohne DFA, µm DFA, µm DFA und 100 µm FeCl3.

46 3. ERGEBNISSE 43 Tab.3 Vorhandene Banden von C. trachomatis unter dem Einfluß von 1. CMGA, 2. DFA 200 µm, 3. FeCl3 100 µm DFA 200 µm auf BGM-und HEp-2-Zellen. = Bande vorhanden ; = Bande stark ausgeprägt. BGM HEP-2 kda CMGA DFA FeCl3 CMGA DFA FeCl MOMP Abb.10: Immunoblot mit C. trachomatis Antikörper-positivem Patientenserum. HEp-2Zellen: 1. ohne DFA, µm DFA, µm DFA und 100 µm FeCl3. C. trachomatis: 4. ohne DFA, µm DFA, µm DFA und 100 µm FeCl3. In den Abbildungen 11 und 12 sind Immunoblots sowohl mit nicht-infizierten HEp-2Zellen als auch mit C. pneumoniae-antigenen nach Reaktion mit C. pneumoniae

47 3. ERGEBNISSE 44 Antikörper-positiven Seren dargestellt. Die Antigengewinnung erfolgte mit und ohne DFA bzw. FeCl3. In Abbildung 11, Spur 7 war keine 54 kda Bande nach vorausgegangener Behandlung mit 200 µm DFA vorhanden. Bei den Wiederholungsversuchen (insgesamt vier) unter gleichen Bedingungen, zeigte sich, daß die 54 kda-bande zwar darstellbar war, obwohl 200 µm DFA eingesetzt wurden. Vergleicht man in den Abbildungen 11 und 12 die Spuren 5, 7 und 9 untereinander, ist jedoch eine Intensitätsabnahme der 54 kda Bande in Spur 7 zu beobachten. Bei den Wiederholungsversuchen waren alle Banden insgesamt intensiver, was durch eine stärkere Chlamydia pneumoniae-infektion bedingt war. Die Reduktion der 54 kda Bande ist möglicherweise Resultat der Eisenrestriktion. In den Spuren 4, 6 und 8 waren keine nennenswerten Änderungen festzustellen. Abb: 11 Immunoblot mit C. pneumoniae Antikörper-positivem Patientenserum (Spur 1-3; 4, 6, 8) und einem monoklonalen Antikörper gegen p-54 (Spur 5, 7, 9). HEp-2-Zellen unter Zugabe von: 1. ohne DFA, µm DFA, µm DFA und 100 µm FeCl3. AR-39 : 4., 5. ohne DFA; 6., 7. mit 200 µm DFA; 8., 9. mit 200 µm DFA und 100 µm FeCl3.

48 3. ERGEBNISSE 45 Tab.4: Vorhandene Banden von C. pneumoniae unter dem Einfluß von 1. ohne DFA, 2. DFA 200 µm, 3. FeCl µm 200 µm DFA mit BGM und HEp-2-Zellen. = Bande vorhanden; = Bande stark ausgeprägt; - = nicht vorhanden. BGM kda CMGA/ p54 DFA/p54 FeCl3/ p54 CMGA/ p54 HEP-2 DFA/p / () FeCl3/ p54 39,5 MOMP Abb. 12: Immunoblot mit C. pneumoniae Antikörper-positivem Patientenserum (Spur 1-3; 4, 6, 8) und einem monoklonalen Antikörper gegen p 54 (Spur 5, 7, 9). HEp-2- Zellen: 1. ohne DFA, µm DFA, µm DFA und 100 µm FeCl 3. AR-39: 4., 5. ohne DFA; 6., µm DFA; 8., µm DFA und 100 µm FeCl 3.