6 Diskussion. 6.1 Diskussion der Ergebnisse

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1 6 Diskussion 6.1 Diskussion der Ergebnisse 86,05 % der Operationspräparate wurden mittels Immunhistochemie und 80,95 % mittels Immunfluoreszenz positiv auf Cdp. psittaci-antigene getestet. In der Kontrollgruppe von Gewebeproben, die aus dem Nasopharynx adulter Probanden entnommen wurden, waren lediglich 33,33 % in beiden Verfahren positiv für das Bakterium. Ob tatsächlich eine Altersabhängigkeit besteht bleibt spekulativ, da ein Vergleichskollektiv von Kindern ohne Adenoide fehlt. Normann et al. konnten im Gegensatz zu den hier gezeigten Ergebnissen Cdp. pneumoniae in kindlichen Adenoiden mittels immunhistochemischer Methoden nachweisen [72, 73]. Vorangegangene Studien der Forschergruppe um Theegarten et al. wiesen ein überdurchschnittlich häufiges Vorkommen von Cdp. psittaci bei Pat. mit COPD und in verschiedenen Emphysemformen nach. Aus den bislang durchgeführten Studien ergab sich die Frage, ob Cdp. psittaci in kindlichen Adenoiden und auch in nicht verändertem adultem Nasopharynxgewebe mit gleicher Häufigkeit gefunden werden kann. Das lymphatische System des Waldeyer schen Rachenringes könnte eine Bedeutung für die Persistenz der Erreger besitzen. In unserer Studie wurde im Gegensatz zu Normann et al. Cdp. pneumoniae in der PCR nicht nachgewiesen. Die Unterschiede hinsichtlich des Nachweises von Cdp. pneumoniae bzw. Cdp. psittaci könnten auch regional begründet sein, da die Studie von Normann et al. in Schweden durchgeführt wurde. Weiterhin wurden nicht dieselben PCR-Protokolle für Cdp. pneumoniae benutzt, unterschiedliche Protokolle und Primer können aber auch zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Eine Klärung wäre nur durch einen direkten Vergleich der PCR-Verfahren und Kollektive möglich. Das hier eingesetzte Protokoll entsprach zum Zeitpunkt der Probennahme dem internationalen Standard, inzwischen ist jedoch die Realtime-PCR übliche Praxis. Die Untersuchung sollte also mit diesem Verfahren überprüft werden. Die ebenfalls durchgeführte PCR-Untersuchung der kindlichen Präparate ergab in Relation zu IHC und IF erheblich niedrigere positive Resultate in Bezug auf eine Besiedlung mit Cdp. psittaci. Ursache für eine niedrigere Detektionsrate in der PCR könnte einmal sein, dass zu wenig DNA für die Untersuchung zur Verfügung stand. Dies kann

2 6 Diskussion 77 Folge einer suboptimalen Behandlung der Probe postoperativ (unterschiedliche Zeiten und Temperaturen bis zum Einfrieren in der Pathologie), der Aufbewahrung, sowie dem Transport bis zur Untersuchung im Labor in Jena sein. Hierdurch kommt es zu DNA- Verlusten und somit zu niedrigeren Nachweisraten. Zudem spielt das Phänomen des Antigen-Shedding bei der Untersuchung von Präparaten auf einen Chlamydienbefall mittels immunologischer und Nukleinsäureamplifikationsverfahren eine Rolle. Durch IHC und IF werden Antigene nachgewiesen, die bei Chlamydien-Infektionen bekanntermaßen in größerem Umfang auftreten, als die im Zellinneren gelegenen Nukleinsäuren [10]. Im Vergleich zu immunhistochemischen Detektion werden bei der PCR außerdem wesentlich kleinere Proben verwandt. Daher finden sich quantitativ mehr positive Präparate bei der IHC, bei der manche Befunde auch nur an einzelnen Stellen (z. B. in Epithelverbänden) positiv sind [72, 73]. Außerdem sind, verglichen mit Nukleinsäureamplifikationsverfahren, positive IHC- Ergebnisse häufiger, da die Degradation von DNA durch im Gewebe enthaltene Enzyme schneller vonstatten geht, als die von Antigenen (Proteinen). Die DNA-Extraktion aus Geweben ist zudem schwieriger und anfälliger für Störungen als die Aufarbeitung von Proben für immunhistochemische und immunfluoreszenzoptische Nachweisverfahren. Das Resultat von PCR/LCR-Verfahren wird des Weiteren durch Inhibitoren der Nukleinsäuresynthese beeinflusst [10, 35, 40, 49]. Daher ist die Entfernung aller die Replikation beeinflussenden Faktoren vor der Amplifikation unabdingbar. Ein Nachteil der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Nachweismethoden ist jedoch die Kreuzreaktivität verschiedener Antigene mit denen anderer Chlamydienarten und somit eine verminderte Spezifität. Diese Kreuzreaktivität ist Folge von unter den Chlamydiaceae konservierten Proteinstrukturen (z. B. dem MOMP), damitwerdendie verschiedenen Chlamydienspezies nicht erkannt. Neuere Antikörper, wie die in unserer Versuchsreihe verwendeten, weisen hingegen nach Firmenangaben und durch vorausgegangene Studien bestätigt Fab-Anteile auf, die nur noch mit Epitopen einer einzigen Spezies reagieren. Die Firmenergebnisse konnten durch eigenen vorangegangene Studien bestätigt werden [9, 20]. Auch in den Studien von Normann et al. fand sich in der PCR lediglich eine sehr niedrige Nachweisrate von Cdp. pneumoniae, wohingegen in Immunhistochemie und Immunfluoreszenz ein hoher prozentualer Anteil positiv getestet wurde. Eine Testung der von diesen Autoren eingesetzten Antikörper hinsichtlich der sicheren Abgrenzung von Cdp. psittaci hat jedoch nicht stattgefunden [72, 73].

3 6 Diskussion 78 Durch die essentielle Nähe zur distalen Region des Golgi-Apparates erklärt sich bei richtiger Anfärbung des Präparates und der Verwendung des richtigen Antikörpers das typische Erscheinungsbild der Chlamydien im Mikroskop als meist perinukleäre Einschlusskörperchen. Bereits zwei bis vier Stunden post infectionem sind Cluster von EB neben dem Golgi-Apparat nachweisbar [94]. Diese Gegebenheit und die im Vorfeld der eigentlichen Untersuchung durchgeführten Kontrollversuche verhindern so eine Verwechslung mit anderen Farbsignalen (endogenem Pigment, positives Signal durch das verwandte Ziegen-Normalserum oder anderen Bestandteilen des Versuchsaufbaus). Für die IF gilt dies in gleicher Weise, zudem ist die Eigenfluoreszenz des Gewebes bei der Auswertung zu berücksichtigten. Letztere ist jedoch ein allseits bekanntes Phänomen. Bei der IHC und IF werden Erregerantigene nachgewiesen. Diese können auch bei abgelaufenen Infektionen zum Teil noch in reichlichem Umfang beobachtet werden. Der Nachweis von Einschlusskörperchen in dieser Studie jedoch lässt zwingend auf eine relevante Infektion schließen. Eine Erklärung für das häufige Vorkommen von Chlamydien könnte die Tatsache sein, dass bereits ein kurzer Kontakt mit infizierten Tieren oder auch Exkrementen von Tieren oft genügt, um den Mikroorganismus zu übertragen. Daher berichten viele Personen nicht von einem Kontakt mit Vögeln oder erinnern sich nicht an ihn. Eine Übertragung der Psittakose wird sowohl von in Gefangenschaft aufgewachsenen als auch von frei lebenden Vögeln berichtet [70]. Chlamydien wurden bislang aus etwa 100 Vogelarten isoliert, am häufigsten jedoch aus psittacinen (papageienähnlichen) Vögeln. Bei anderen in Gefangenschaft gehaltenen Vögeln sind Chlamydien am häufigsten in Tauben zu finden, aber die dort gefundenen Serovare gelten als weniger ansteckend [74]. Andere Chlamydienstämme, die früher als Untergruppen von Chlamydophila psittaci aufgefasst wurden, werden auch bei Säugetieren gefunden, sodass es auch bei einem Kontakt insbesondere mit Meerschweinchen und Katzen zu einer Ansteckung führen kann. Auch Viehherden wurden bereits als Quelle für eine humane Infektion beschrieben [70]. Eine Studie aus Japan zeigte neben anderen Bakterien wie Salmonellen und Mykobakterien eine besonders hohe Kontaminierung (22,9%) von Kot freilenbender Tauben mit Cdp. psittaci und Cdp. pecorum [101]. Eine genaue Zeit und ein genauer Ort der Ansteckung von Menschen können somit bei vielen Chlamydieninfektionen schwer zu bestimmen sein.

4 6 Diskussion 79 Andere Studien, die einen hohen Durchseuchungsgrad mit Chlamydien zeigten, stützen sich auf Ergebnisse aus serologischen Untersuchungen. Das Problem bei serologischen Untersuchungen ist jedoch einerseits, dass Chlamydien aufgrund ihres intrazellulären Vorkommens gehäuft bei klinisch manifesten Infektionen keinen oder nur einen geringen Anstieg der Immunglobulin-Titer im Serum hervorrufen. Andererseits können stumm oder subklinisch verlaufende Infektionen mit einem hohen IgG- oder IgM-Titer einhergehen [11, 26]. Die pathogenetische Relevanz der in unserer Studie gewonnenen Ergebnisse kann nicht sicher abgeschätzt werden. Vorangegangene Studien, die sich mit anderen Mikroorganismen als Auslöser von Rachenmandelhyperplasien bei Voschulkindern beschäftigten, fanden in einer großen Anzahl der Fälle einen persistierenden Befall mit nicht kapselbildenden Hämophilus influenzae-stämmen, anderen Viren und Bakterien (u. a. HIV, Adenoviren, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis) [32, 62, 107]. Die meisten infizierten Zellen waren Makrophagen oder Monozyten, in manchen Fällen wurden die Erreger aber auch intraepithelial gefunden. Somit wächst die Anzahl der an der Ätiologie der Rachenmandelhyperplasie beschuldigten Mikroorganismen stetig. Eine pathophysiologische Erklärung für einen ursächlichen Zusammenhang von Chlamydieninfektion und der Entstehung einer Rachenmandelhyperplasie könnte durch eine veränderte Cytokinausschüttung seitens des Wirtsorganismus bei chronischer Infektion erklärt werden. Bei einer Infektion der Schleimhäute wird die immunologische Reaktion des Wirtes in der Regel überwiegend durch Th1-Zellen vermittelt. Sie erscheinen relativ früh am Entzündungsort und verschwinden nach der Auflösung der Entzündung relativ schnell wieder [79]. Eine vermehrte Th1-Antwort aktiviert nachfolgend hauptsächlich Makrophagen und Granulozyten und bindet diese am Entzündungsort. Kommt es jedoch fälschlicherweise zu einer überwiegenden Th2-Antwort, führt diese eher zu einer Aktivierung von B-Lymphozyten und aufgrund einer unzureichenden Elimination von mit dem Erreger infizierten Zellen und dem Mikroorganismus an sich zu einer persistierenden Infektion [44, 48]. In Studien wurde ebendieses Missverhältnis von Th1- zu Th2-Antwort in Rachenmandelhyperplasien nachgewiesen. T-Zellen in Adenoiden produzieren weniger Th1- Zytokine als normales Nasopharynx-Gewebe bei einer Infektion mit Chlamydien. Dies könnte ein möglicher Grund für eine verminderte Elimination von Chlamydien und eine konsekutive Hypertrophie des Gewebes durch eine chronische Besiedlung mit einhergehender (Fehl-) Aktivierung des Immunsystems sein [7]. Eine chronische Infektion mit Chlamydophila psittaci könnte also tatsächlich Ursache einer Rachenmandelhy-

5 6 Diskussion 80 perplasie sein. Andererseits wäre denkbar, dass sich die Chlamydien aufgrund der gestörten Immunität der bereits vergrößerten Adenoide erst opportunistisch etablieren können. Da nicht alle Menschen eine Rachenmandelhyperplasie entwickeln, spielen sicher auch genetische Polymorphismen eine Rolle. Beim okulären Marginalzellen-B-Zell-Lymphom wurde von Ferreri et al. eine Imbalance zwischen Th1- und Th2-Zell-Antwort gefunden [30]. Da auch bei einer Persistenz von Cdp. psittaci wie oben angeführt in humanem Gewebe, sowie in der Pathogenese der Adenoide eine Imbalance dieser Lymphozyten-Untergruppen beschrieben wurde, könnte ein Zusammenhang zwischen Chlamydieninfektion und der Entstehung von malignen Entartungen lymphatischer Gewebe bestehen. Insbesondere bzgl. des Tonsillenlymphoms sollten weitere Untersuchungen auf eine Assoziation mit Cdp. psittaci erfolgen. Der Nachweis von Cdp. psittaci in Adenoiden sollte zudem der Anstoß für weitere Untersuchungen bezüglich eines Zusammenhangs von einer Besiedlung mit dem Mikroorganismus und malignen Erkrankungen des Nasopharynx wie dem Nasopharynxcarcinom sein. Eine Infektion mit Cdp. psittaci verursacht eine Aktivierung des lymphatischen Systems und somit die Ausschüttung von Cytokinen. Bei einer Persistenz des Errgers und einer dauerhaften Aktivierung kann es unter Umständen durch zytoproliferative Substanzen zu malignen Entartungen kommen. Ähnliche Zusammenhänge zwischen einer chronischen Entzündung und malignen Entartungen bestehen z. B. im weiblichen Genital- und im Magen-Darmtrakt. So gilt sowohl der Zusammenhang einer Infektion des Epihels mit humanen Papillomviren beim Cervixcarcinom als auch eine Besiedlung der Schleimhaut mit Helicobacter pylori beim Magencarcinoms als gesichert. Beide Erkrankungen werden insbesondere durch die Ausschüttung zytoproliferativer Substanzen im Rahmen der persistierenden Infektion, wie sie auch bei einer Infektion der Schleimhäute mit Cdp. psittaci zu beobachten ist, hervorgerufen. 6.2 Weiterer Ausblick Weitere Studien müssen zeigen, ob Chlamydien tatsächlich in der Lage sind, eine Rachenmandelhyperplasie auszulösen, oder ob sie nur in bereits vergrößerten Adenoiden gehäuft vorkommen, weil sie dort aufgrund der veränderten immunologischen Verhältnisse vom Wirtsorganismus nicht suffizient bekämpft werden können.

6 6 Diskussion 81 Um die pathogenetische Relevanz des Chlamydienbefalls auf die Entstehung der Adenoide zu ergründen, sollte im fortführenden Studien probatorisch eine gegen Chlamydien wirksame antibiotische Therapie für mindestens drei Wochen erfolgen und der Effekt auf die Entwicklung der Adenoide beobachtet werden. Zudem sind weitere Untersuchungen wie die Chlamydien-Anzucht aus Adenoiden unter optimalen Bedingungen, experimentelle Untersuchungen zur Frage der Stimulation von Lymphozyten durch Cdp. psittaci und Untersuchungen von Kindern ohne Adenoide als Vergleichskollektiv z. B. durch Rachenabstriche erforderlich.