GEWINNUNG EINES FUSIONSPROTEINS VON GLUTATHION S-TRANSFERASE UND DEM GENPRODUKT VON PEX14

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1 Aus dem Institut für Physiologische Chemie, Abteilung für Zellbiochemie der Ruhr-Universität Bochum Leiter: Prof. Dr. rer. nat. W.-H. Kunau GEWINNUNG EINES FUSIONSPROTEINS VON GLUTATHION S-TRANSFERASE UND DEM GENPRODUKT VON PEX14 Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Angelika Basu aus Gütersloh 2001

2 Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. med. G. Muhr Prof. Dr. rer. nat. W.-H. Kunau Prof. Dr. med. J.T. Epplen Tag der mündlichen Prüfung:

3 Für meine Familie und Verwandtschaft in Deutschland und Indien in Dankbarkeit

4 Abstract Basu Angelika Gewinnung eines Fusionsproteins von Glutathion S-Transferase und dem Genprodukt von PEX14 Durch heterologe Überexpression des Hefeproteins Pex14p in dem Bakterium E. coli wurde das Protein Pex14p gereinigt, damit es als Antigen zur Antikörperherstellung verwendet werden konnte. Als Fusionsprotein (Glutathion S- Transferase-Pex14p) wurde es über Affinitätschromatographie in einem Schritt gereinigt. Das Fusionsprotein, das aus dem E. coli- Stamm TG1 stammte, wurde durch präparative Gele von seinen Abbauprodukten getrennt. Somit wurde denaturiertes Protein als Antigen erhalten. Der Protease - defiziente Stamm BL21 ermöglichte eine native Aufreinigung des GST- Pex14p. Beide Fusionsproteine (jeweils aus verschiedenen Stämmen) wurden zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Von diesen Tieren konnten die Antiseren AK1 (E. coli Stamm TG1) und AK2 (Protease - defizienter Stamm BL21) gewonnen werden. Die Antiseren können in E. coli das GST-Pex14p-Fusionsprotein des pgex- Konstruktes detektieren.

5 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Peroxisomen Bedeutung der Peroxisomen in der Medizin Biogenese der Peroxisomen Beteiligte Faktoren des Proteintransports in Peroxisomen Peroxisomale Mutanten Charakterisierung der Genprodukte Heterologe Expression von Genen Expressionsvektor pgex-4t Problemstellung Material und Methoden Chemikalien Mikroorganismen Vektoren Antiseren Zentrifugen und Rotatoren Analytische Methoden Proteinbestimmung nach Bradford Proteinbestimmung nach Pierce ph-messung Bestimmung der molaren Masse von denaturierten Proteinen Kultivierungen von Saccharomyces cerevisae Dauerkulturen Festagarplatte Aufschluß von Saccharomyces cerevisiae Zellen Zellaufschluß nach Yaffe und Schatz (1984) Mechanischer Zellaufschluß mittels Glasperlen Expression des GST-PEX 14 in Escherichia coli Überexpression der GST-PEX 14-Fusionsproteine unter Verwendung des GST-Systems 18

6 Inhaltsverzeichnis Überprüfung der Löslichkeit Säulenchromatographische Aufreinigung der Fusionsproteine über Glutathion-Sepharose Konzentrierung der Protein-Lösung Gewinnung von Antiseren SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Immunologische Methoden Elektrophoretischer Protein-Transfer auf Nitrozellulose (Western-Blotting) Trennung des Fusionsproteins durch präparative Gele Molekularbiologische Methoden für Escherichia coli Anzucht von Escherichia coli-zellen Präparation CaCl 2 -kompetenter E. coli-zellen Transformation von CaCl 2 -kompetenter E. coli-zellen Ergebnisse Expression und Reinigung des Fusionsproteins GST-Pex14p aus Saccharomyces cerevisiae GST-PEX14-Fusionskonstrukte zur Überexpression von Pex14p in E. coli Überprüfung der Expression des GST-Pex14p-Fusionsproteins in E. coli Überprüfung der Löslichkeit des GST-PEX Präparative Aufreinigung des Fusionsproteins Trennung des Fusionsproteins von seinen Abbauprodukten durch präparative SDS-Gelektrophorese Überexpression und Aufreinigung des Glutathion S-Transferase-Pex14p im E. coli-stamm BL21 (DE3) Expression und Reinigung des Fusionsproteins GST-Pex14p Präparative Aufreinigung des Glutathion S-Transferase-Pex14p- Fusionsproteins Charakterisierung des gegen GST-Pex14p gewonnenen Antiserums 44

7 Inhaltsverzeichnis 4. Diskussion Überexpression von Proteinen in E.coli Expressionsrate Löslichkeit Wahl des E.coli-Stammes Genprodukt Pex14p Heterologe Expression Entwicklung eines Antigens gegen Pex 14p Literatur Danksagung Lebenslauf 74

8 Abkürzungen Abkürzungen Abb. Abbildung A. dest. Aqua destilata Amp. Ampicillin APS Ammoniumpersulfat Bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin CHO Chinese-hamster-ovary Da Dalton DNA Desoxyribonukleinsäure DTE Dithioerythritol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis-N,N,N`,N`-Tetraacetic Acid fox Fatty acid oxidation g Erdbeschleunigung GST Glutathion-S-Transferase h Hour H 2 O 2 Wasserstoffperoxid IgG Immunglobulin G IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactosid KCl Kaliumchlorid KH 2 PO 4 Kaliumdihydrogenphosphat min Minuten mv Millivolt NaCl Natriumchlorid NaH 2 PO 4 Natriumdihydrogenphosphat Na 2 HPO 4 Natriummonohydrogenphosphat NBT Nitro-Tetracolium-Blauchlorid OD optische Dichte onu oleat-non-utilizer ORF offener Leserahmen

9 Abkürzungen pas peroxisome assembly system PBS Phosphat- Buffered Saline pex peroxisome assembly PMSF Phenylmethansulfonylfluorid PTS peroxysomales targeting`-signal rpm Umdrehung pro Minute RT Raumtemperatur s Sekunde S. cerevisiae Saccharimyces cerevisiae SDS Sodiumdodecylsulfat s.u. siehe unten Tab. Tabelle TCA Trichloressigsäure TEMED N, N, N`, N`-Tetramethylendiamin Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan v Volumen w Gewicht YE p `yeast episomal plasmid YPG Yeast extract, Pepton, Glukose

10 1. Einleitung 1. Einleitung Eukaryontische Zellen besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher, charakteristischer Zellorganellen. Dadurch wird die Voraussetzung für einen effizienten Ablauf verschiedener räumlich getrennter Stoffwechselprozesse geschaffen. Diese durch Membranen getrennte Kompartimente (Organellen), üben entsprechend ihrer spezifischen Proteinausstattung, unterschiedliche Funktionen aus. Die meisten Polypeptide sind kernkodiert und werden an Ribosomen im Cytoplasma oder am Endoplasmatischen Retikulum synthetisiert. Daher werden bestimmte Verteilungs- und Transportmechanismen benötigt, damit die Proteine durch einen gezielten Transport vom Ort der Synthese zu ihrem Wirkungsort gelangen können (Lodish et al., 1995). Diesen sehr komplexen Vorgang nennt man intrazellulärer, gerichteter Proteintransport. Aufgrund näherer Untersuchungen der Ausstattung von Mitochondrien (Glick et al., 1992; Schwarz und Neupert, 1994; Wachter et al., 1994), Chloroplasten (Theg und Scott, 1993), Vakuolen (Raymond et al., 1992), des endoplasmatischen Retikulums (Rapport, 1992; Hartmann et al., 1994), des Golgi-Apparats (Rothmann und Orci, 1992) und des Nukleus (Silver, 1991; Fabre und Hurt, 1994) wurden teilweise grundlegende Funktionen dieses Vorgangs geklärt Peroxisomen Peroxisomen wurden 1954 erstmals von Rhodin in einer Studie über Nierentubuli von Mäusen beschrieben. Es handelt sich hierbei um Zellorganellen, die ubiquitär in eukaryontischen Zellen vorkommen. Peroxisomen zählen neben Glyoxysomen (Breidenbach und Beevers, 1967) und Glykosomen (Opperdoes und Borst, 1977) zu der morphologisch einheitlichen, aber funktionell heterogenen Gruppe der `microbodies (Lazarow und Fujiki, 1985; Borst, 1989). Sie besitzen meistens einen Durchmesser von 0,1-1 µm (Subramani, 1993) und sind von einer einfachen Membran umschlossen. Sie können entweder als einzelnes oder komplexes Netzwerk auftreten (Gorgas, 1985; Yamamoto und Fahimi, 1987). 1

11 1. Einleitung Peroxisomen werden von einer einfachen Lipidmembran begrenzt und enthalten keine DNA (Subramani, 1996a). Durch die Entdeckung meistens tödlich verlaufender Erkrankungen beim Menschen (Lazarow und Moser, 1995; Subramani, 1997), die aufgrund von Störungen der peroxisomalen Struktur und/oder Funktion entdeckt wurden, wurden die Peroxisomen jetzt sehr interessant. Durch den Versuch, die molekularen Ursachen der peroxisomalen Erbkrankheiten zu verstehen, wurden Modelsysteme zur Peroxisomenbiosynthese (Lazarow, 1993; Kunau, 1998) entwickelt. Peroxisomen verfügen über eine Vielzahl an Oxidasen, die unterschiedliche Substrate oxidieren und dabei Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduzieren. Durch die auch in den Peroxisomen vorkommende Katalase wird H 2 O 2 zu Wasser und Sauerstoff gespalten oder aber durch gleichzeitige Oxidation einer anderen Verbindung (z.b. Ethanol, Methanol, Formaldehyd, Nitrit) nur in Wasser umgewandelt (de Duve und Baudhuin, 1966). Aufgrund dessen wurde zunächst angenommen, die Funktion der Peroxisomen läge nur in der Entsorgung zelleigener, toxischer Substanzen. Jedoch wurden mittlerweile annähernd 50 Enzyme in verschiedensten Stoffwechselwegen erforscht, die in Abhängigkeit des Entwicklungsgrades der Zelle, des Zelltyps, des Substratangebotes und bestimmter Wirkstoffe in der Lage sind, weitere metabolische, besonders auch anabolische Funktionen auszuführen (Tolbert, 1981; siehe auch van den Bosch et al., 1992). Peroxisomen kommen in größerer Zahl und überdurchschnittlicher Größe in Nierenund Leberzellen des Säugetiers vor. Abgesehen von der schon erwähnten H 2 O 2 - abhängigen Zellatmung (de Duve und Baudhuin, 1966) ist auch das Enzym Cu, Zn- Superoxid-Dismutase in den Peroxisomen lokalisiert, das zwei Superoxid-Anionen in ein Molekül O 2 umwandelt (Keller et al., 1991b). Zusätzlich werden die bei der Biotransformation von Xenobiotika entstehenden Epoxide, die durch Reaktionen mit Nukleinsäuren und Proteinen zu Mutationen und Zellschäden führen können, durch zum Teil peroxisomal lokalisierte Epoxid-Hydrolasen inaktiviert (Waechter et al., 1983). Die Synthese von Plasmalogenen zählt zu einer wichtigen Aufgabe der Peroxisomen höherer Eukaryonten (Wanders et al., 1992; van den Bosch et al., 1993). Nervengewebe ist besonders reichhaltig an Plasmalogenen, die bis zu 90% des Phospholipidanteils von 2

12 1. Einleitung Myelin ausmachen (Wykle, 1977). Sie haben vermutlich die Funktion, die Zellmembranen vor Oxidationen zu schützen (Zoeller et al., 1988). Zu den weiteren metabolischen Stoffwechselfunktionen der Peroxisomen gehört die Bildung von Gallensäuren (Krisans, 1992), der Katabolismus von Purinen und Aminosäuren (Noguchi und Takada, 1978), zu einem gewissen Teil auch die Verstoffwechselung von Ethanol (Khanna und Israel, 1980). Sie sind aber auch an der Biosynthese von Penicillin (Müller et al., 1991) beteiligt. Die β-oxidation von besonders langkettigen und mehrfach ungesättigten Fettsäuren findet ebenfalls in Peroxisomen statt. (Lazarow und de Duve, 1976). Während der Fettsäureabbau bei Säugetieren zusätzlich in den Mitochondrien stattfindet, wird die β- Oxidation in eukaryontischen Mikroorganismen nur peroxisomal durchgeführt (Kunau et al., 1988). 1.2 Bedeutung der Peroxisomen in der Medizin Durch peroxisomale Fehlfunktionen wird die Bedeutung der Peroxisomen im Menschen anhand zahlreicher, meist autosomal-rezessiver Erbkrankheiten deutlich. Diese Stoffwechselerkrankungen können zu Fehlentwicklungen führen, die aufgrund schwerer neurologischer Schäden, aber auch andere Organe betreffend, schon innerhalb der ersten Jahren den Tod herbeiführen (Fournier et al., 1994; Wanders et al., 1994; Lazarow und Moser, 1995). Diese peroxisomalen Erkrankungen (`peroxisomal disorders ) werden in drei Gruppen eingeteilt: Zur Gruppe I werden alle Krankheiten zugeordnet, bei denen eine Störung der Bildung von Peroxisomen vorliegt. Gruppe II umfaßt Erkrankungen mit mehreren metabolischen Funktionseinschränkungen und Gruppe III stellt angeborene Defekte dar, die ausschließlich ein einzelnes Enzym betrifft. Primär ist in der ersten Gruppe das Zellweger-Syndrom anzuführen (Bowen et al., 1964; Opitz et al., 1969). Diese auch als Zerebro-hepato-renales Syndrom bezeichnete 3

13 1. Einleitung Erkrankung ist eine Kombination von Hirnfehlbildungen (Schädel- und Gesichtsanomalien), neurologischen Fehlfunktionen (extreme Hypotonie, Anfälle, Entwicklungsstörungen) und neurosensorischen Defekten sowie durch Leberfibrose, Lebervergrößerung (Ikterus und Hypothrombinämie), adrenale Atrophie und polyzystischen Nieren gekennzeichnet. Bei Patienten mit dem Zellweger-Syndrom konnten in Leber- und Nierenzellen entweder keine Peroxisomen (Goldfisher, 1973) oder zum Teil leere Membranhüllen (`ghosts ) gefunden werden (Santos et al., 1988a; Santos et al., 1988b). Unter den festgestellten Fehlfunktionen sind besonders hervorzuheben die äußerst herabgesetzte Plasmalogensynthese (Heymans et al., 1982), die Fehlfunktion der Enzyme des peroxisomalen Fettsäureabbaus mit enorm hohen Spiegel an langkettigen Fettsäuren im Gewebe (Suzuki et al., 1986; Schutgens et al., 1993) wie auch der Überfluß an Phytansäure (Poulos et al., 1985) und Intermediärsubstanzen des Gallensäurenmetabolismus (Hanson et al.; 1979). Weitere Krankheiten, die zur Gruppe I zählen sind die neonatale Adrenoleukodystrophie (Ulrich et al., 1978; Kelley et al., 1986), die infantile Refsum- Krankheit (Scotto et al., 1982; Herbert et al., 1994) und die Hyperpipecolatämie (Gattfield et al.,1968). Die Symptome dieser Erkrankungen sind denen des Zellweger- Syndroms sehr ähnlich, jedoch sind sie schwächer in der Ausprägung. Es wird angenommen, daß diese Krankheiten vor allem durch einen Ausfall bzw. durch eine Blockade der posttranslationalen Importwege für die peroxisomalen Proteine hervorgerufen werden (Small et al., 1988a; Walton et al., 1992; Lazarow und Moser, 1995). Diese Hypothese konnte durch das Auffinden von Mutationen in zwei peroxisomalen Membranproteinen bei drei Zellweger-Patienten gestützt werden (Shimozawa et al., 1992). Bei drei von fünf untersuchten Patienten konnten in Fibroblastenzellen Defekte des Imports von Proteinen gezeigt werden, die denen der pex-mutanten von Saccharomyces cerevisiae (s.u.) entsprechen (Motley et al., 1994). Die rhizomelische Form der Chondrodysplasia puncta (Spranger et al., 1971; Rizzo et al., 1993) wird zu der Gruppe II peroxisomaler Erkrankungen gezählt, die durch eine beachtliche Störung der Plasmalogensynthese gekennzeichnet wird. Außerdem konnten in einigen wenigen Fällen eine Fehlfunktion der β-oxidation registriert werden (Hoefler et al., 1988). 4

14 1. Einleitung Die Gruppe III beinhaltet die Hyperoxalurie Typ I (Danpure et al., 1994), die X- chromosomale Adrenoleukodystrophie (Moser et al., 1984; Mosser et al., 1993; Contreras et al., 1994) und Defekte bei verschiedenen Enzymen der β-oxidation (Schram et al., 1986; McGuinness et al., 1993). 1.3 Biogenese der Peroxisomen Zur weiteren Erforschung peroxisomaler Krankheiten ist nun die Differenzierung und Proliferation von Peroxisomen und auch der damit in Zusammenhang stehende Proteinimport von großer Bedeutung. Zunächst wurde angenommen, daß Peroxisomen durch Abknospung aus dem endoplasmatischen Retikulum entstehen (Novikoff und Shin, 1964; Beevers, 1969). Im Widerspruch zu dieser Abschnürungstheorie stehen eine unterschiedliche Proteinzusammensetzung der Membranen von Peroxisomen und der Nachweis eines posttranslationalen Imports (Goldmann und Blobel, 1978), so daß diese Theorie offenbar auf einer Fehlinterpretation beruht (Fujiki et al., 1982; Oppendoes et al., 1988; Zinser et al., 1991). Nach heutigen Vorstellungen entstehen die Peroxisomen nicht de novo, sondern durch Teilung und Wachstum der bereits existierenden Organellen (Lazarow und Fujiki, 1985; Borst, 1989). Peroxisomale Matrix- und Membran-Proteine werden im Cytosol an Ribosomen synthetisiert und posttranslational in die Organellen importiert. Elektronenmikroskopisch konnte tatsächlich diese Teilung bei Hansenula polymorpha (Veenhuis et al., 1987) und Candida boidinii (Veenhuis und Goodman, 1990) nachgewiesen werden. Vermutlich spielt das peroxisomale Membranprotein Pmp27 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae eine wichtige Rolle im Segregationsprozeß der Peroxisomen an Tochterzellen (Erdmann und Blobel, 1995; Marshall et al., 1995). Nach dieser Vorstellung der Biogenese muß zur Vermehrung und Vererbung mindestens ein Peroxisom in jeder Zelle vorliegen. Es konnte praktisch auch in Hefezellen, unter für Peroxisomen reprimierenden Wachstumsbedingungen, immer 1-2 Zellorganellen pro Zelle nachgewiesen werden (Veenhuis et al., 1983). 5

15 1. Einleitung 1.4. Beteiligte Faktoren des Proteintransports in Peroxisomen Wie bei dem gerichteten Proteinimport von Mitochondrien, Chloroplasten und des endoplasmatischem Retikulum (ER), so benötigt auch der peroxisomale Proteintransport folgende Komponenten: 1. Signalsequenzen: `Peroxisomal targeting signals (PTS) an den zu importierenden Proteinen 2. Rezeptoren, die diese Signalsequenzen erkennen 3. Eine Translokationsmaschinerie, die in der Lage ist, das PTS zu erkennen und die Translokation des Proteins über die Membran zu ermöglichen. Peroxisomale targeting`-signale unterscheiden sich von bislang erforschten Sortier- Signalen anderer Zellorganellen in zwei wesentlichen Punkten. Sie sind im Vergleich zu diesen kurz und können sowohl Amino- als auch Carboxyterminal vorliegen (Baker et al., 1995). Die bislang untersuchten peroxisomalen Matrixproteine führten zur Identifizierung von zwei peroxisomalen targeting`-signalen, das am äußersten Carboxyende gelegene PTS1 (Gould et al., 1987; Subramani, 1992), und das aminoterminale PTS2 (Swinkels et al., 1991; Osumi et al., 1991; de Hoop und Ab, 1992). Das am carboxyterminale Ende liegende PTS1 weist ein Tripeptid SKL (Serin - Lysin - Leucin) auf, das in Form von Variationen in zahlreichen peroxisomalen Proteinen nachgewiesen werden konnte (Gould et al., 1988 und 1989). Dieses SKL-Motiv wurde in peroxisomalen Proteinen sehr unterschiedlicher Organismen (Säuger, Pflanzen, Insekten und Hefen) entdeckt. Dies spricht für eine hohe Konservierung der beteiligten Importkomponenten (Gould et al., 1990a; 1990b). Außerdem konnten SKL-haltige Proteine nachgewiesen werden, die in Glyoxysomen und Glykosomen verschiedener Spezies vorhanden sind (Keller et al., 1991a). Obwohl bei zahlreichen peroxisomalen Matrixproteinen die zum Proteinimport benötigten PTS1-Sequenzen vorkommen, existieren beispielsweise auch peroxisomale Proteine, die kein SKL-Motiv haben. Dieses deutet auf das Vorhandensein von 6

16 1. Einleitung mindestens einem zweiten peroxisomalen targeting`-signals hin. Das PTS2 wurde in der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Glover et al., 1994; Erdmann und Kunau, 1994), in Amin-Oxidase der Hefe Hansenula polymorpha (Faber et al., 1994), in Malat- Dehydrogenase der Wassermelone (Gietl et al., 1994) und in der Ratte (Tsukamoto et al., 1994) entdeckt. Abgesehen von diesen bislang gut charakterisierten Signalsequenzen PTS1 und PTS2 werden aber auch noch andere Sequenzen diskutiert (Small et al., 1988b; Kragler et al., 1993; McCammon et al., 1994). Für den Proteinimport in die Peroxisomen werden Rezeptoren benötigt, die in der Lage sind, die peroxisomale targeting`- Signale (PTS1 und PTS2) zu erkennen. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist das PAS10- Genprodukt notwendig, das als Rezeptor für den Import von PTS1-Proteinen auftritt (van der Leij et al., 1993; Brocard et al., 1994). Der PTS1-Rezeptor in der Hefe Pichia pastoris ist das PAS8-Genprodukt (Terlecky et al., 1995) und in der Hansenula polymorpha Per3 (van der Klei et al., 1995). Diese werden inzwischen alle als PEX5 bezeichnet. Durch die vorhandenen Sequenzinformationen der orthologen PTS1- Rezeptoren aus den verschiedenen Hefen konnte inzwischen der menschliche PTS1-Rezeptor, hspex5, mit Hilfe von EST-Datenbanken erkannt werden. Bei zwei Patienten mit peroxisomaler Erkrankungen traten Mutationen auf, die das hspex5-gen betrafen (Dodt et al., 1995; Wiemer et al., 1995; Yahraus et al., 1996, Braverman et al., 1997; Purdue et al., 1997; Chang et al., 1997). Die subzelluläre Lokalisation des PTS1-Rezeptors wird widersprüchlich beschrieben. Für den PTS1-Rezeptor des Menschen wird sowohl eine cytosolische (Dodt et al., 1995; Wiemer et al., 1995) als auch eine peroxisomale Lokalisation an der cytosolischen Seite der Peroxisomen angegeben (Fransen et al., 1995). Somit bleibt eine genaue Aussage über die Lokalisation noch aus. Im Gegensatz zum PTS1-Rezeptor, diente die Isolierung des PEX7-Gens aus der Saccharomyes cerevisiae zur Identifizierung des PTS2-Rezeptors (PTS2r) (Marzioch et al., 1994; Zhang und Lazarow, 1995). Die Sequenz des PEX7-Genprodukt, Pas7p, zeigte, daß es zur Familie der WD-40-Protein gehört (Mazioch et al., 1994; Zhang und Lazarow, 1995). Dieses Protein ist beteiligt an der Überführung eines extrazellulären Lichtsignals in den entsprechenden Nervenimpuls in der Retina von Säugern (Neer und 7

17 1. Einleitung Clamham, 1988). Das prominenteste Mitglied dieser Familie ist die β-untereinheit des heteromeren G-Proteins Transducin. Ähnlich wie bei anderen β-untereinheiten von G- Proteinen besitzt das β-transducin acht WD40-Segmente. Jedes Segment enthält ca. 40 Aminosäuren mit einem charakteristischen Trp-Asp-Paar (Simon et al., 1991). Ein solches WD-40 repeat`-motiv (van der Voorn und Pleoegh, 1992) konnte auch in zahlreichen anderen Proteinen nachgewiesen werden. Die Sequenzen von repetitiven Segmenten kommen in ihnen in unterschiedlichen Zahlen zwischen fünf bis acht Wiederholungen vor. Mittlerweile konnte das WD-40-Protein des β-transducins kristallisiert und die 3D-Struktur bestimmt werden (Wall et al., 1995; Lambright et al., 1996; Sondek et al., 1996). Die Kristallstruktur läßt sich in Form eines Propellers darstellen, wobei die einzelnen Propellerblätter aus dem WD-40-Motiv bestehen. Es wird eine ähnliche Struktur auch für das Pas7p angenommen. 1.5 Peroxisomale Mutanten Da sowohl die klassische als auch die molekulare Genetik der Bäckerhefe S.cerevisiase besonders gut untersucht ist, eignen sich Mutanten dieser Hefe, die einen peroxisomalen Defekt aufweisen, hervorragend als eukaryontisches Modellsystem zur Untersuchung der Biogenese von Peroxisomen. Beispielhaft für den Modellcharakter der Hefe, wie oben schon erwähnt, ist die vor kurzem erfolgte Identifizierung menschlicher PEX- Gene mithilfe ihrere homologen Hefegene. Die Untersuchung der Biogenese von Peroxisomen in S. cerevisiae wurde aber erst durch die Entdeckung ermöglicht, daß Ölsäure als einzige Kohlenstoffquelle sowohl zur Induktion der β-oxidationsenzyme als auch zur Proliferation der Peroxisomen führt (Veenhuis et al., 1987). Da S. cerevisiae keinen mitochondrialen Fettsäureabbau aufweist (Kunau et al., 1988), ist für den Abbau der Fettsäuren ein intaktes peroxisomales β-oxidationssystem essentiell. Mutanten, die nicht mehr auf Ölsäure wachsen können, könnten einen peroxisomalen Defekt besitzen. Diese Vermutung bildete die Grundlage für ein Selektionsverfahren, das zur Isolierung von onu [oleat-non-utilizer] -Mutanten führte, denen die Fähigkeit zum Wachstum auf Ölsäure fehlt. 8

18 1. Einleitung Infolgedessen wurden Hefezellen mutagenisiert und auf das Vorhandensein von onu- Mutanten überprüft. Es konnten zwei unterschiedliche Mutanten-Gruppen dargestellt werden. Hierbei handelt es sich zum einen um fox-mutanten [fatty-acid-oxidation], die Defekte in einzelnen β-oxidationsgenen aufweisen (Erdmann et al., 1989; Erdmann und Kunau 1992; Hiltunen et al., 1992) und zum anderen um pex-mutanten [peroxisomal assembly] mit Defekten in den entsprechenden Genen der Biogenese der Peroxisomen (Erdmann et al., 1989; Erdmann und Kunau; 1994; Liu et al.; 1992; Gould et al., 1992; Cregg et al., 1990; Nuttley et al., 1993). Bisher konnten 19 Komplementationsgruppen von pex-mutanten isoliert werden (Kunau et al., 1993; Rehling et al., 1996; Erdmann et al., 1997). Nach ihrem morphologischen Phänotyp werden die pex-mutanten in drei unterschiedliche Klassen eingeteilt (Höhfeld et al., 1992): TypI-Mutanten lassen keine elektronenmikroskopisch detektierbaren Peroxisomen erkennen. Während in TypII- Mutanten nach Oleat-Induktion nur einige wenige Peroxisomen vorliegen, befinden sich unterdessen die Zellen der TypIII-Mutanten durch Fehllokalisation entweder der PTS1- oder der PTS2-Proteine im Cytoplasma (Höhfeld et al., 1991). Abgesehen von den oben erwähnten pex-mutanten in S. cerevisiae konnten auch in vier anderen Hefen solche Mutanten isoliert werden: Hansenula polymorpha (Cregg et al., 1990; Didion und Roggenkamp, 1990; Nuttley et al., 1995), Pichia pastoris (Gould et al., 1992; Liu et al., 1992) und Yarrowia lipolytica (Nuttley et al., 1993, 1995) wie auch in CHO-Zellen [chinese hamster ovary] des Hamsters (Zoeller et al., 1989; Tsukamoto et al., 1990). Ferner wurden Fibroblasten von Zellweger-Patienten untersucht, wobei neun Komplementationsgruppen erkannt werden konnten (Roscher et al., 1989; Lazarow, 1993). 1.6 Charakterisierung der Genprodukte Die Primärsequenzen der Translationsprodukte können über die funktionelle Komplementation der pas-mutanten aus identifizierten Genen abgeleitet werden. Spezifische Protein-Motive bzw. Domänen lassen sich mittels einer Computeranalyse 9

19 1. Einleitung der Proteinsequenz erkennen, aus der manchmal die Funktion des Polypeptids hervorgeht. Anhand der Funktion des Polypeptids kann der Defekt der Mutante erklärt werden. Die Kenntnis der Lokalisation des Genproduktes innerhalb der Zelle kann Hinweise auf die Funktion eines Proteins und molekulare Mechanismen liefern. Dafür sind spezifische Antikörper notwendig, die durch Immunisierung eines Tieres ausgebildet werden, dessen Immunantwort auf das Antigen unter anderem aus der Bildung von spezifischen Antikörpern besteht. 1.7 Heterologe Expression von Genen Durch Klonierung und heterologe Überexpression eines gewünschten Proteins in Bakterien ist es möglich, das Antigen für spezifische Antikörper zu gewinnen und in Immunisierungen einzusetzen (Ausubel et al., 1989). Die auf diese Weise aus einem fremden Wirtsorganismus gewonnen Proteine werden als rekombinante Proteine bezeichnet, da sie ihr Vorkommen der rekombinanten DNA-Technologie verdanken. Als sowohl genetisch wie auch biochemisch gut untersuchter Wirtsorganismus, hat sich der Prokaryont Escherichia coli für diese Methoden der Klonierung und Expression beliebiger Gene bewährt. Die kurze Generationszeit, die leichte Kultivierungsmethoden und die Verfügbarkeit vieler speziell entwickelter Vektoren und Phagen sind nützlich. Zur heterologen Expression von Proteinen in Escherichia coli werden spezielle Expressionsvektoren benutzt, in die das gewünschte Gen kloniert werden kann, um nach der Transformation in den Wirtsorganismus das Translationsprodukt kontrolliert produzieren zu können. Ein starker Promotor, ein Startcodon am Anfang des Gens und die in Eukaryonten fehlende Ribosomenbindungsstellen der mrna sind notwendige Elemente eines solchen Systems. Zusätzlich können Vektoren verwendet werden, die die Expression eines Fusionsproteins ermöglichen. Dabei wird das gewünschte Gen hinter eine im Wirtsorganismus gut exprimierte Sequenz kloniert, so daß die oben genannten Bedingungen für eine Expression gegeben sind. 10

20 1. Einleitung 1.8 Expressionsvektor pgex-4t Der allgemeine Aufbau von Plasmiden ist durch charakteristische Elemente gekennzeichnet. Zur Transformationskontrolle enthalten sie immer einen Selektionsmarker, durch den die transformierten Zellen eine Antibiotikaresistenz erhalten. Ein solcher Selektionsmarker ist z.b. das ß-Lactamase-Gen. Dessen Genprodukt die β-lactamase baut β-lactam-antibiotika wie Ampicillin ab. So können nur Zellen in einem ampicillinhaltigen Medium wachsen, die ein resistenzverleihendes Plasmid besitzen. Zusätzlich müssen diese Vektoren ein weiteres Element den Replikationsstartpunkt (origin) zur Verfügung haben, damit bei jeder Mitose der Zelle auch das Plasmid reproduziert wird. Weiterhin sind für den generellen Aufbau von Plasmiden eine sog. `multiple cloning site oder ein `polylinker für den Einbau fremder DNA notwendig. Diese sollten mehrere DNA-Restriktionsschnittstellen enthalten, die sonst nicht noch einmal auf dem Plasmid vorkommen. Ferner ist ein Promotor für die kontrollierbare Expression des klonierten Gens notwendig. Der Expressionsvektor pgex-4t der Firma Pharmacia Biotech basiert auf dem GST- Vektor von Smith und Johnson (1988). Dieser enthält den hybriden tac-promoter (De Boer et al., 1983), der synthetisch aus Anteilen des trp-promotors und des lac- Promotors zusammengesetzt ist. Er schließt die kanonische -10 Region des lacuv5- Promoters mit der -35 Region des trp-promoters in einem als optimal angesehenen Abstand zusammen. Ferner ist die lac-operator-region eingebaut, so daß der tac- Promotor durch den lac-repressor, dessen laci q Allel sich ebenfalls auf dem Plasmid befindet, in seiner Expression kontrolliert wird. Dieser tac-promotor reguliert die Transkription des Gens für das 26 kda Protein Glutathion S-Transferase (GST) von Schistosoma japonicum. Ihm folgt eine `multiple cloning site aus 6 Restrinktionsschnittstellen hinter der sich Stopcodons in allen Leserastern befinden. Desgleichen erfaßt dieser Vektor das Gen bla und das Origin ColE1 des Plasmids pbr322. In diesem Expressionsvektor können beliebige Gene ohne eigenes ATG und Stopcodon an das Trägergen GST im richtigen Leserahmen eingeordnet werden. Nach Transformation in den Wirtsorganismus wird durch Zugabe von IPTG der starke laci q -Repressor gebunden, und so wird dessen sterische 11

21 1. Einleitung Behinderung der starken Expression des Fusionsproteins durch den tac-promotor verhindert. Das pgex-4t bietet die Möglichkeit, große Mengen löslicher Hybridproteine zu bilden. Diese GST-Fusionsproteine können mittels immobilisiertem Glutathion über eine Affinitätschromatographie aus dem Zellysat aufgereinigt werden (Ausubel et al., 1989). 1.9 Problemstellung Grundlegende Zielstellung dieser Arbeit war die Herstellung spezifischer polyklonaler Antikörper gegen das Pex-Protein Pex14p aus Saccharomyces cerevisiae. Mit diesem Antiserum sollte die Bestimmung der intrazellulären Lokalisation und eine weitere Charakterisiserung dieses Proteins ermöglicht werden. Da Versuche vor dieser Arbeit das Gen PEX 14 aus S. cerevisiae in E. coli zu exprimieren nicht erfolgreich waren, wurde in dieser Arbeit versucht, das Ziel mit einem Fusionskonstrukt zu erreichen. Als Fusionsanteil wurde das Gen für die Glutathion S-Transferase (GST) gewählt. Hierdurch soll die Wahrscheinlichkeit erhöht werden, ein lösliches Fusionsprotein zu exprimieren, damit anschließend eine Affinitätsreinigung an immobilisiertem Glutathion möglich ist. Damit bestand der experimentelle Teil dieser Arbeit aus folgenden Teilschritten: 1. Schritt: Überexpression des GST-Pex 14p-Fusionsprotein in E.coli 2. Schritt: Affinitätsreinigung des Fusionsproteins 3. Schritt: Gewinnung und Charakterisierung von polyklonalen Antikörpern gegen das Fusionsprotein 4. Schritt: Immunologischer Nachweis des Pex14-Proteins 12

22 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Chemikalien Es wurden bezogen: ECL-Western-Blotting-Detektionssystem von der Fa. Amersham Buchler GmbH, Braunschweig (BRD); Einweg-Mikro-Konzentratoren von der Fa. Amicon GmbH, Witten (BRD) reduziertes Glutathion von der Fa. Boehringer, Mannheim (BRD); Röntgenfilme Cronex 4 von der Fa. Du Pont de Nemours, Bad Nauenheim (BRD); Hefeextrakt, Select Peptone und Select Agar von der Fa. Gibco BRL, Eggenstein (BRD); Agar und Hefeextrakt für Ölsäure-Platten von der Fa. Difco Laboratories, Detroit, Michigan (USA); EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), EGTA (Ethylenglycol-bis-N,N,N,N - Tetraacetic Acid), ß-Mercaptoethanol, PMSF (Phenylmethylsulfonylflourid) von der Fa. Merck, Darmstadt (BRD); Glutathion-Sepharose 4B, One-Phor-All -Reaktionspuffer von der Fa. Pharmacia, Freiburg (BRD); Nitrozellulose-Folie (0,45 µm und 0,2 µm) und Einmal-Filterhalter (0,2 µm) von der Fa. Schleicher & Schuell, Dassel (BRD); Acrylamid, Ampicillin, APS, Bromphenolblau, BSA, N, N -Methylenbisacrylamid, PEG, SDS, Serva Blau R-250 und G-250 (Coomassie Brillant Blue), Tween 20, Tween 40 und Xylencyanoblau von der Fa. Serva, Heidelberg (BRD); anti-gst (Glutathion S-Transferase) Antikörper, Ethidiumbromid, IPTG (Isopropyl-β- D-thiogalactosid), Lysozym, NBT (Nitro-Tetracolium-Blau-Chlorid), Ponceau S, TEMED (N-N-N -N -Tetramethylethylendiamin) von der Fa. Sigma, München (BRD); Röntgenentwickler LX24 und Röntgenfixierer AL4 von der Fa. Tetenal Photowerke GmbH, Nordstedt (BRD); Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit von der Fa. Pierce Chemicals Co., Rockford (USA); Whatmann 3MM-Papiere von der Fa. Whatmann, Maidstone (Großbritannien); 13

23 2. Material und Methoden Alle weiteren Chemikalien wurden in p. A. Qualität von üblichen in der BRD vertretenen Firmen bezogen. 2.2 Mikroorganismen Die folgenden Organismen fanden in dieser Arbeit Verwendung: Escherichia coli-stämme Tabelle 2.1: E. coli-stämme Bakterienstamm Genotyp Referenz TG1 (lac,pro),supe,thi,hsdd5 Prof. Dr. Pongs, Universität Bochum, F [trad36pro + lac q1 lac ZM15] (BRD) BL21(DE3) F -, ompt r - - B m - B [(lambda sits857 Dr. Erdmann, FU Berlin, ind1 Sam7 nin5 lac UV5-T7 genel)] (BRD) 2.3 Vektoren Folgende Vektoren und Plasmide wurden in diese Arbeit benutzt: Tabelle 2.2: Vektoren und Plasmide Vektor pbluescript SK + pgex-4t-2 Referenz Stragene, San Diego (USA) Pharmacia Biotech, Freiburg (BRD) 14

24 2. Material und Methoden 2.4 Antiseren Tabelle 2.3: Antiseren Antikörper gerichtet gegen Glutathion S-Transferase (affinitätsgereinigt) Glutathion S-Transferase-Pex14p Quelle AG-Kunau, Bochum (BRD) vorliegende Arbeit 2.5 Zentrifugen und Rotoren Eppendorf-Zentrifuge (Centrifuge 5414) Fa. Eppendorf, Hamburg (BRD) Heraeus Sepatech Cryrofuge Rotor Rotor HFA Fa. Heraeus Christ GmbH, Osterode (BRD) Haeraus Sepatech Suprafuge 22 - Rotor HFA Fa- Haeraus Christ GmbH, Osterode (BRD) Minifuge GL - Tragingrotor Fa. Heraeus Christ GmbH, Osterode (BRD) Sorvall Zentrifuge RC5B, Rotor SS34, Du Pont Instruments, Bad Nauheim (BRD) 2.6 Analytische Methoden Proteinbestimmung nach Bradford Die Proteinbestimmungen wurden nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt, wobei BSA als Standardprotein zur Erstellung der Eichgeraden verwendet wurde. 15

25 2. Material und Methoden Proteinbestimmung nach Pierce Die Proteinbestimmungen wurden mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit nach Herstellerangaben durchgeführt ph-messung Die ph-wertbestimmung von Lösungen erfolgte mit einem Knick Mikroprozessor ph- Meter 743 der Fa. Knick Elektro-Meßgerätebau GmbH, Berlin (BRD) Bestimmung der molaren Masse von denaturierten Proteinen Zur Bestimmung der molaren Masse denaturierter Proteine, z. B. bei der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2.10) wurden als Größen-Marker entweder ein 10 kda-protein-marker eingesetzt, dessen Protein-Banden sich in 10 kda-abständen befinden, oder ein BSA-Marker mit einer Protein-Größe von 68 kda Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae Dauerkulturen YPG-Festagarplatten wurden unter sterilen Bedingungen beimpft, 2 Tage bei 30 C inkubiert und je nach Stamm 8-16 Wochen bei 4 C gelagert. Zur Lagerung über einen längeren Zeitraum wurden Glyzerinkulturen angelegt. Dazu wurde Zellmaterial aus stationär gewachsenen YPG-Flüssigkulturen im Verhältnis 1:1 mit 50%-igem Glyzerin vermischt und bei -80 C gelagert Festagarplatten Die auf Festagarplatten kultivierten Saccharomyces cerevisiae-zellen wurden je nach Stamm 2-3 Tage bei 30 C inkubiert. Auxotrophien wurden auf Minimalmedien nach Ausstrich von Zellmaterial bzw. nach dessen Transfer durch Replattieren überprüft. 16

26 2. Material und Methoden 2.8 Aufschluß von Saccharomyces cerevisiae Zellen Zellaufschluß nach Yaffe und Schatz (1984) Zur Präparation von denaturierten Hefe-Rohlysaten wurden ca. 10 mg Zellmaterial mit 1 ml H 2 O, 148 µl 2N NaOH und 12 µl ß-Mercaptoethanol versetzt. Nach einer Inkubation von 10 min auf Eis wurden die Proben mit 160 µl 50%- iger TCA für 30 min auf Eis gefällt. Die durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Tischzentrifuge gewonnenen Sedimente wurden nachfolgend für 19 min bei 95 C denaturiert und zur Gelelektrophorese (2.10) eingesetzt Mechanischer Zellaufschluß mittels Glasperlen Für die Gewinnung von Extrakten für Ko-Immunopräzipitationsexperimente wurden Hefe-Zellen angezogen. Nach Bestimmung des Feuchtgewichtes wurden 0,8-1,0 g des Zellmaterials in 3 ml Aufschlusspuffer (I) resuspendiert und mit 3 g Glasperlen ( 0,5 mm) versetzt. Durch vierminütiges Mischen [8x30 Sekunden, Lamb et al., 1994)] auf einem Wirbelmixer wurden die Hefe-Zellen aufgeschlossen und zur Abtrennung der Glasperlen vom Zellysat bei 300 x g in einer mit Watte gefüllten Plastikkartusche zentrifugiert. Das resultierende Filtrat wurde anschließend einer weiteren Zentrifugation bei x g in Cortex-Gläsern unterzogen und der erhaltene Überstand zu Ko- Immunopräzipitationsexperimenten eingesetzt. Die Präparation für Enzymaktivitätsbestimmungen aus Rohextrakten bzw. zur Gelelektrophorese nach Fällung der Proteine (2.8.1) erfolgte unter Verwendung von Aufschlusspuffer II, nach Mertens (1991). Aufschlußpuffer I Aufschlußpuffer II 50 mm Tris-HCl ph 7,5 10 mm Tris/HCl, ph 7,4 50 mm NaCl 1 mm EDTA 0,2 % Triton X-100 0,5 mm EGTA 0,02 % PMSF 0,5 mm DTE 15 µg/ µl Bestatin 10 mm PMSF 1 µg/µl Pepstatin und Leupeptin 0,1 µg/µl Chymostatin 17

27 2. Material und Methoden 2.9 Expression des GST-PEX14 in Escherichia coli Überexpression des GST-PEX14-Fusionsproteins unter Verwendung des GST-Systems Für die Überexpression des Fusionsproteins Glutathion S-Transferase wurden mit entsprechendem Plasmid transformierte E.coli TG1- und BL21-Stämme in 10 ml 2 x TY Medium mit Ampicillin (0,1 mg/ml) über Nacht bei 37 C angezogen. Am Morgen wurden zum Vergleich auf gleiche Weise untransformierte Bakterienzellen (in 2 x TY Medium ohne Ampicillin) sowie alleinige mit dem pgex-vektor (ohne Fragment) transformierte Bakterienzellen angezogen. Mit dieser Vorkultur wurde am Morgen eine Hauptkultur im Verhältnis 1:10 mit der entsprechenden Vorkultur angeimpft und 1,5 h bei 37 C inkubiert. Im Anschluß wurde die Expression des Fusionsproteins durch Zugabe des Induktors IPTG (Endkonzentration 1mM IPTG) und erneuter Inkubation der Ansätze für 2 h bei 37 C inkubiert. Zur Überprüfung der Überexpression wurden 1 ml Bakterienkultur in der Eppendorf- Tischzentrifuge bei rpm für 2 min zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in 100 µl 2 x SDS-Probenpuffer aufgenommen und anschließend 10 min bei 100 C denaturiert. Die Expression wurde durch Analyse des Zellysats im SDS-Gel (SDS- Gelelektrophorese 2.10) überprüft. Für diese gelelektrophoretische Analyse wurde ca. 2,5 µl des bakteriellen Lysats eingesetzt Überprüfung der Löslichkeit Um die Löslichkeit des exprimierten Fusionsproteins in Abhängigkeit von der Induktionsdauer zu untersuchen, wurden die restlichen Bakterienzellen aufgeschlossen. Hierzu wurden die induzierten Bakterienzellen (Gesamtvolumen 1 l) bei 5000 rpm für 15 min bei 4 C zentrifugiert (Cryofuge 8500). Das Sediment wurde in 20 ml PBS gelöst und mit Lysozym (2 mg/ml) versetzt. Der Zellverdau erfolgte 1-2 h auf Eis. Anschließend wurde das Detergenz Triton-X-100 zugesetzt (10%-ige Stammlösung, Endkonzentration 1%). Dieser Ansatz wurde 30 min unter Schütteln inkubiert. Als Ergänzung zum enzymatischen und chemischen Zellaufschluß wurden die lysierten 18

28 2. Material und Methoden Zellen nachfolgend zweimal für 20 min bei -80 C eingefroren. Nach dem Auftauen erfolgte eine Ultraschallbehandlung der lysierten Zellen, die in Form von einer stark viskosen Zellösung vorlagen. Zum Scheren der DNA bzw. RNA wurden die zerstörten Zellen jeweils bei 350 Watt beschallt (Labsonic 1510, Fa Braun, Melsungen, BRD). Es erfolgte eine Zentrifugation für 10 min bei rpm (Suprafuge 22). Der Überstand wurde abgenommen und das Sediment im gleichen Volumen 1 PBS aufgenommen. Sowohl von dem Überstand, als auch von dem resuspendierten Sediment wurden Aliquots von 50 µl entnommen, mit 50 µl SDS-Probenpuffer verdünnt, 5 min bei 100 C erhitzt und über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert ( 2.10). Der Überstand wurde durch ein 0,45 µm-filter filtriert und das Sediment in dem gleichen Volumen 1 PBS resuspendiert. Der Überstand, in dem sich fast das gesamte Fusionsprotein gelöst befand, wurde anschließend säulenchromatographisch aufgereinigt. 2 TY-Medium (ph 7,3-7,5): PBS-Puffer ( ph 7,3 ): 1,6 % (w/v) Select-Pepton 140 mm NaCl 1,6 % (w/v) Hefeextrakt 2,7 mm KCl 170 mm NaCl 10 mm Na 2 HPO 4 1,8 mm KH 2 PO 4 1 mm EDTA 0,5 mm EGTA 0,5 mm Benzamidin 0,5 mm DTE 0,1 mm PMSF 1 % TritonX Säulenchromatographische Aufreinigung der Fusionsproteine über Glutathion-Sepharose Die Aufreinigung des GST-Fusionsproteins erfolgte über Glutathion-Sepharose 4B als stationäre Phase, an die das Fusionsprotein über das GST binden kann und anschließend mit freiem reduzierten Glutathion von der Säule eluiert werden kann. Für die Aufreinigung wurde 20 ml Sepharose verwendet. Für alle chromatischen Abschnitte wurden Perpex Peristaltikpumpen (LKB, Bromma, Schweden) eingesetzt. Die kontinuierliche Aufzeichnung der 19

29 2. Material und Methoden Proteinabsorbtion erfolgte durch ein Durchflußphotometer Absorbance Monitor UA-5 (ISCO, Lincoln, USA) bei einer Wellenlänge von 280 nm. Die verwendeten Gelmaterialien wurden nach Angaben der Hersteller vorbehandelt und in dem entsprechenden Säulenpuffer äquilibriert. Alle chromatographischen Arbeitsschritte wurden bei 4 C durchgeführt. Das Säulenmaterial wurde zunächst mit 1 PBS gewaschen. Nach dem Auftragen der entsprechenden Probe (filtrierter Überstand der aufgeschlossenen Zellen, 2.8.2) wurde die Säule erneut mit 1 PBS gewaschen, bis keine Proteine mehr im Durchlauf detektiert werden konnten. Der Durchlauf der Säule wurde hierbei in 5 ml-fraktionen gesammelt. Es folgte die Elution des Fusionsproteins mit ca. 50 ml Elutionspuffer, wobei das Eluat in 1 ml-fraktionen gesammelt wurde. Von jeweils einer Durchlauf-Fraktion und mehreren Elutions-Fraktionen wurden Aliquots entnommen, mit dem gleichen Volumen SDS-Probenpuffer verdünnt, 10 min bei 100 C erhitzt und über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert ( 2.10.). Elutionspuffer: (ph: 8,0) Säulenpuffer (ph: 7,3) Säulendaten: 50 mm Tris/HCl ( ph 8,0 ) 140 mm NaCl Bettvolumen 10 ml 10 mm reduziertes Glutathion 2,7 mm KCl Fraktionsvolumen 01 ml 10 mm NaH 2 PO 4 Durchflußvolumen 30 ml/h 1,8 mm KH 2 PO 4 1% (v/v) Triton X-100 Bei weiteren Affinitätsreinigungen wurde die Glutathion S-Transferase-Säule abwechselnd mit dem High -ph-puffer und dem Low -ph-puffer regeneriert. Regenerationspuffer: High -ph-puffer (ph: 8,5) Low -ph-puffer (ph: 4,5) 0,1 M Tris-HCl 0,1 M Natriumacetat 0,5 M NaCl 0,5 M NaCl 20

30 2. Material und Methoden Konzentrierung der Protein-Lösung Die Elutions-Fraktionen wurden zu einem Ansatz vereinigt und mit Hilfe des Centripreps/ Typ 30 bzw. Typ 50 (Amicon) nach Vorschrift des Herstellers konzentriert. Mit dieser Konzentrierung erfolgte zugleich eine Entfernung von reduziertem Glutathion sowie eine Entsalzung der Lösung Gewinnung von Antiseren Zur Immunisierung wurde das aufgereinigte native Glutathion S-Transferase-Pex14p- Fusionsprotein (2.9.3) eingesetzt. Um die Menge an aufgereinigten Fusionsprotein zu bestimmen, wurde ein Aliquot der Proteinlösung mit 2 x SDS-Probenpuffer versetzt und nach Denaturierung auf ein analytisches SDS-Polyarcylamidgel aufgetragen. Die Mengenabschätzung erfolgte anhand des Vergleichs mit BSA-Standardlösungen bekannter Proteinkonzentrationen. Von der Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) wurde die Immunisierung eines Kaninchens mit dem Glutathion S-Transferase-Pex14p-Fusionsproteins vorgenommen. Über den Verlauf der Immunisierung gibt die folgende Tabelle Aufschluß: Tabelle 2.4: Verlauf der Immunisierung Immunisierung Injektionsweg Menge an einge- zeitlicher Abstand der Nr. setzten Protein Immunisierung in Tagen 1 Kaninchen 1,1mg/0,5mg 0 2 Kaninchen 0,7mg/0,5mg 14 3 Kaninchen 0,6mg/0,5mg Blutentnahme Kaninchen Kaninchen 0,6mg/0,5mg 56 2.Blutentnahme Kaninchen Kaninchen 0,5mg/0,5mg 84 6 Kaninchen 0,5mg/0,5mg Blutentnahme Kaninchen und letzte 21

31 2. Material und Methoden 2.10 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen wurden diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele nach Laemmli (1970), modifiziert nach Kionka (1986), verwendet. Die Elektrophorese des Gels (Dimension: 8 cm x 10 cm x 0,08 cm) mit einer Polyacrylamidkonzentration des Trenngels von 7,5-15% erfolgte in einer Mini PII-Zelle (Biorad Laboratories GmbH, München, BRD) für ca. 1 h bei einer konstanten Stromstärke von 30 bzw. 60 ma. Bei hohem Proteingehalt wurden die Proben mit einfachem Volumen doppeltkonzentriertem SDS-Probenpuffer versetzt; lag nur eine geringe Proteinkonzentration vor, so wurde eine Proteinfällung mit 1/5 Volumen 50%-iger TCA durchgeführt. Anschließend wurde das Protein- Präzipitat in einfach konzentriertem SDS-Probenpuffer resuspendiert, falls erforderlich mit 1 M Tris-Base titriert und 5 min bei 95 C erhitzt. Die Proteinbanden wurden mit kolloidalem Coomassie nach Neuhoff et al. (1985) angefärbt. Hierzu wurde das Gel in Coomassie-Färbelösung für 30 min geschwenkt und anschließend in Entfärbelösung wieder entfärbt. Das Gel konnte daraufhin in VE- Wasser oder 1% Essigsäure aufbewahrt oder auf Whatman-Papier getrocknet werden. Tabelle 2.5: Trenn- und Sammelgel Trenngel 7,5% 10% Sammelgel Acrylamid/Bisacrylamid 3,1 ml 4,16 ml Acrylamid/Bisacrylamid 1,5 ml 1,875M Tris/HCl,pH 8,9 2,1 ml 2,1 ml 1,875 M Tris/HCl, ph 8,9 1,5 ml A.dest 3,13 ml 2,1 ml A.dest 2,9 ml APS (20%) 57 µ l 57 µl APS (20%) 60 µl TEMED 5,2 µl 5,2 µl TEMED 6 µl 8,5 ml 8,5 ml 6 ml Laufpuffer 3 g Tris und 14,4 g Glycin ad 1 l A. dest. 22

32 2. Material und Methoden Elektroden-Puffer ph 8,3: SDS-Probenpuffer: 0,3% (w/v) Tris 10% (v/v) Glycerin 1,44% (w/v) Glycin 5% (v/v) ß-Mercaptoethanol 0,1% (w/v) SDS 3% (w/v) SDS 1% (w/v) Bromphenolblau 62,5 mm Tris/HCl, ph 6,8 Färbelösung: Entfärbelösung: 0,1% (w/v) Coomassie -Blue R % (v/v) Essigsäure 10% (v/v) Essigsäure 20% Methanol 40% (v/v) Methanol 2.11 Immunologische Methoden Elektrophoretischer Protein-Transfer auf Nitrozellulose (Western-Blotting) Der Transfer der im Polyacrylamidgel (2.12) aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulosemembranen erfolgte mit Hilfe einer Mini-Transblot-Zelle (Fa. Biorad GmbH, München, BRD) bei einer konstanten Stromstärke von 300 ma. Der Protein-Transfer dauerte 1 h und wurde in einem Natriumcarbonatpuffer durchgeführt. Das erfolgreiche Blotten wurde mit Pouceau-S überprüft, indem die Membran überschichtet wurde. Die Proteine wurden rot angefärbt. Nach Markierung des Markers wurde die Membran mit TBS-Tween 20 gewaschen. Zur Immundetektion von Proteinen mit Meerettichperoxidase-gekoppelten Antikörpern (anti-kaninchen IgG: 1: ) wurde das ECL-Western-Blotting-Detektionssystem der Fa. Amersham GmbH (Braunschweig, BRD) verwendet. Alle eingesetzten Antiseren wurden in TBS/Tween 20 verdünnt. TBS/Tween 20 Natriumcarbonatpuffer, ph 9,9: Ponceau S-Lösung 50 mm TRIS/HCl; ph 8,0 10 mm NaHCO3 0,5 % (w/v) Ponceau S 200 mm NaCl 3 mm Na2CO3 1 % (v/v) Essigsäure 0,1 % Tween 20 0,01% (w/v) SDS 2,0 % (v/v) Methanol 23

33 2. Material und Methoden Trennung des Fusionsproteins durch präparative Gele Zur Immunisierung wurde das aufgereinigte Glutathion S-Transferase-Pex14p- Fusionsprotein (2.8.3) eingesetzt. Das gereinigte Fusionsprotein wurde hierfür zunächst auf einem 12,5%-igen präparativen SDS-Gel nach Laemmli, U.K (Dimension: 11,5 cm x 16,5 cm x 0,4 cm) bei ma aufgetrennt. Nach der Anfärbung des Gels mit Coomassie-Brilliant-Blue für 30 min und anschließend die Entfärbung mit 10%-iger Essigsäure wurde die dem Fusionsprotein entsprechende Bande aus dem Gel ausgeschnitten. Der Gelstreifen wurde für die Proteinelution zerkleinert (ca.1-2 mm 3 Würfel). Im Anschluß erfolgte die Elution des Proteins aus den Polyarcylamidgel-Stücken mittels eines Elektroseparationssystem (S & S Biotrap, Fa.Schleicher & Schuell, Dassel, BRD). Die Proteinelution erfolgte über Nacht bei einer konstanten Stromstärke von 60V. Nach der Elution lag das Fusionsprotein in einem größeren Volumen SDS- Elektrodenpuffer gelöst vor und mußte durch Fällung ankonzentriert werden. Hierzu wurde die Proteinlösung mit vierfachen Volumen an Aceton vermischt, mindestens 2 h bei -80 C inkubiert und anschließend für 30 min in der Eppendorf-Tischzentrifuge (- 4 C) abzentrifugiert. Das Proteinsediment wurde unter Vakuum getrocknet und in PBS- Puffer gelöst. Um die Menge an aufgereinigtem denaturiertem Fusionsprotein zu bestimmen, wurde ein Aliquot der Proteinlösung mit 2 x SDS-Probenpuffer versetzt und auf ein analytisches SDS-Polyarcylamidgel aufgetragen. Parallel wurde zur Mengenabschätzung BSA-Standardlösungen bekannter Proteinkonzentrationen aufgetrennt. Von der Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) wurde die Immunisierung eines Kaninchens mit dem Glutathion S-Transferase-Pex14p-Fusionsproteins vorgenommen. 24

34 2. Material und Methoden Über den Verlauf der Immunisierung gibt die folgende Tabelle Aufschluß: Tabelle 2.6: Verlauf der Immunisierung Immunisierung Injektionsweg Menge an einge- zeitlicher Abstand der Nr. setzten Protein Immunisierung in Tagen 1 Kaninchen 1,0 mg/0,5 mg 0 2 Kaninchen 0,5 mg/0,5 mg 14 3 Kaninchen 0,5 mg/0,5 mg Blutentnahme Kaninchen Kaninchen 0,5mg/0,5mg 56 2.Blutentnahme Kaninchen und letzte 2.12 Molekularbiologische Methoden für Escherichia coli Molekularbiologische Experimente wurden, wenn nicht gesondert angegeben, nach Standardprotokollen von Maniatis et al. (1982) bzw. Ausubel (1989) durchgeführt Anzucht von Escherichia coli-zellen E. coli-stämme wurden in 2 x TY-Vollmedium in sterilen Reagenzgläsern oder Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen maximal 1/5 des Gefäßvolumens) auf einem Rundschüttler TMR (HT Infos AG, Bottmingen, Schweiz) bei 37 C kultiviert. Die Anzucht in Flüssigkulturen erfolgte für mindestens 6 h, auf Festagarplatten (Zusatz von 2% (w/v) Selekt Agar) über Nacht. Falls erforderlich (Plasmidselektion), wurden den Medien Ampicillin (100 µg/ml) zugesetzt. Alle Medien wurden autoklaviert, das Ampicillin sterilfiltriert zugegeben. 2 x TY-Medium Ampicillin-Stocklösung (100x) 1,6% (w/v) Selekt Pepton 10 mg/ml Ampicillin 1,0% (w/v) Hefeextrakt 1 M Tris/HCl ph 8,0 170 mm NaCl 25

35 2. Material und Methoden Präparation CaCl2-kompetenter E. coli-zellen Die Herstellung kompetenter E.coli-Zellen erfolgte nach einer Vorschrift von British Research Laboratories, Graithersburg (USA). Hierzu wurden 400 ml 2 x TY-Medium mit 1 ml einer E.coli-Übernachtkultur angeimpft und bis zu einer OD600nm von 0,2 bei 37 C kultiviert. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen bei xg (Minifuge GL) sedimentiert, in 20 ml gekühltem 0,1 M CaCl2 resuspendiert und erneut sedimentiert. Das Sediment wurde in 40 ml 0,1 M CaCl2 resuspendiert und für 20 min auf Eis belassen. Die Zellen wurden abermals bei xg abzentrifugiert und in 1 ml 0,1 M CaCl2, 15% (v/v) Glyzerin aufgenommen und in 50 µl Aliquots bei -80 C eingefroren und bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die Transformationseffizienz wurde durch Transformation mit Standard-DNA überprüft Transformation von CaCl2-kompetenter E. coli-zellen Zur Transformation wurden 50 µl kompetente Zellen (3.10.1) aufgetaut und mit ng Plasmid-DNA versetzt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei 42 C für 2 min wurde der gesamte Ansatz auf Selektionsplatten (2 x TY/Amp.) ausplattiert und die Transformanten über Nacht angezogen. 26

36 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Expression und Reinigung des Fusionsproteins GST-Pex14p aus Saccharomyces cerevisiae GST-PEX14-Fusionskonstrukte zur Überexpression von Pex14p in E. coli Pex-Proteine sind essentiell für die Biosynthese von Peroxisomen. Über ihren Nachweis in der Zelle (intrazelluläre Lokalisation) können erste Hinweise auf die mögliche Funktion dieses untersuchten Proteins gewonnen werden. Ein hierzu unerlässliches Hilfsmittel sind spezifische Antikörper gegen das zu untersuchende Protein. Im Rahmen dieser Arbeit sollten spezifische Antikörper gegen Pex14p gewonnen werden. Um gereinigtes Protein für die Immunisierung zu erhalten, gibt es zwei alternative Wege. Die Aufreinigung aus dem Organismus in dem es vorkommt oder aber die heterologe Expression in einem möglichst einfachen Wirtsorganismus. Hierzu wird häufig das Bakterium Escherischia coli verwendet, das zwei Vorteile hat, die bakterielle Überexpression und die Affinitätsreinigung aufgrund eines Fusionsproteins mit tac-promotor. Da das Protein in nur sehr geringer Menge in der Zelle vorkommt und die Aufreinigung sich daher sehr aufwendig gestaltet, empfielt sich die heterologe Überexpression in E. coli- Zellen. Bei der bakteriellen Überexpression trat Proteolyse auf, so daß zusätzlich ein weiterer proteolysearmer E. coli-stamm benutzt wurde. Durch Affinitätsreinigung wurde das für die Immunisierung benötigte Antigen gewonnen. Zu Beginn dieser Arbeit lag das Plasmidkonstrukt vor, das den offenen Leserahmen (ORF) von ScPEX14 in dem Expressionsvektor pgex-4t enthielt (M. Albertini, 1997). Dieser Expressionsvektor enthält das Gen für GST und hatte es aufgrund seiner `multiple cloning site ermöglicht das PEX14-Gen unter Beibehaltung des ORF hinter das GST-Gen zu klonieren (Abb. 3.1.). Dadurch sollte bei Expression dieses Hybridgens das chimäre Fusionsprotein GST-Pex 14p mit einer errechneten Molekularmasse von 64 kda entstehen. 27

37 3. Ergebnisse tac GST PEX Bp Eco RI 1026 Bp Not I 1 aa 341 aa tac GST Pex14p GST- Gen 218 aa 341 aa 64 kda PEX14-Gen tac Promotor Abb Schematische Darstellung des GST-PEX14-Fusionskonstruktes und des von ihm kodierten Proteins Das Hybridgen GST-PEX 14 steht unter der Kontrolle des tac-promoters. Somit besteht die Möglichkeit einer Expressionsinduktion durch IPTG. Hierdurch sollte die Menge an exprimierten Fusionsprotein erhöht werden, damit anschließend eine Affinitätsreinigung an immobilisiertem Glutathion möglichst effektiv erfolgen kann. 28

38 3. Ergebnisse Überprüfung der Expression des GST-Pex14p -Fusionsproteins in E. coli Zunächst sollte die Expression des GST-Pex14p-Fusionsproteins in E. coli so wie die optimale Induktionszeit in Rahmen einer Expressionskinetik ermittelt werden. Das unter beschriebene Konstrukt wurde hierzu in dem E. coli- Stamm TG1 transformiert (2.2.). Es wurden Vorkulturen über Nacht angezogen. Die Hauptkulturen, mit transformierten und zur Kontrolle auch nicht transformierten Bakterienkulturen, wurden für 2 h bis zu einer OD 600 von 0,8 bei 37 C inkubiert. Anschließend erfogte die IPTG-Induktion durch eine weitere Inkubation für 3 h bei 37 C. Zum Zeitpunkt 0 ; 30 ; 60 ; 120 ; 180 (Abb. 3.2a und 3.2b) wurde je 1 ml aus den Hauptkulturen entnommen und die Zellen in der Eppendorf-Tischzentrifuge für 2 min sedimentiert. Das Zellsediment wurde in 50 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen und anschließend 10 min bei 100 C denaturiert. Im Anschluß wurde die Expression des Fusionsproteins in der SDS-Polyaryclamid- Gelelektrophorse untersucht. In Lysaten IPTG-induzierter Bakterienzellen, die mit dem Plasmid pgex-4t-1/pex14 transformiert worden waren, konnte im Coomassie-gefärbten Gel außer der erwarteten Bande mit einem Molekulargewicht von 64 kda eine zusätzliche verstärkte Polypeptidbande mit einer relativen molaren Masse von 26 kda identifiziert werden (Abb. 3.2a, Spuren 5; 8;11; 14). Die Ergebnisse ließen vermuten, daß es sich bei der 64 kda-bande um das Fusionsprotein GST-Pex14p und bei der 26 kda-bande um das GST alleine handelt. Letzteres müßte dann durch Proteolyse aus dem Fusionsprotein entstanden sein. Zur Überprüfung dieser Annahme erfolgte zusätzlich eine immunologische Analyse im Western-Blot (Abb. 3.2b). Unter Verwendung affinitätsgereinigter, spezifischer anti-gst-antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 (2.4) konnten auch hier die 26 kda- (Abb. 3.2b, Spuren 4; 7; 10) und 64 kda-bande (Abb.3.2b, Spuren 5; 8; 11; 14) detektiert werden. 29

39 3. Ergebnisse Aus diesen Ergebnissen läßt sich schließen, daß es sich bei der 64 kda-polypeptidbande um das erwartete Fusionsprotein aus Glutathion S-Transferase (Mr =26 kda) und dem PEX14-Protein handelt. Abb.3.2 a) SDS-Polyarcylamidgel mit Coomassie-Brilliant-Blue gefärbt Spur M: Marker Spur 1: TG1; Spur 2: TG1+pGEX-4T-2-PEX14; Induktionsdauer:0 Spur 3: TG1; Spur 4: TG1+pGEX-4T-2 (positiv Kontrolle); Spur 5: TG1+pGEX-4T-2-PEX14; Induktionsdauer:30 Spur 6: TG1; Spur 7: TG1+pGEX-4T-2 (positiv Kontrolle); Spur 8 : TG1+pGEX-4T-2-PEX14; Induktionsdauer:60 Spur 9: TG1; Spur 10: TG1+pGEX-4T-2 (positiv Kontrolle); Spur 11: TG1+pGEX-4T-2-PEX14; Induktionsdauer:120 Spur 12: TG1; Spur 13: TG1+pGEX-4T-2 (positiv Kontrolle); Spur 14: TG1+pGEX-4T-2-PEX14; Induktionsdauer:180 (Die Pfeile markieren das Glutathion S-Transferase-PEX14-Fusionsprotein, Mr = 64 kda bzw. die Glutathion S-Transferase, Mr = 26 kda) b) Western-Blot eines 10%-igen SDS- Polyacrylamid-Gel zum Nachweis der Überexpression von pgex-pex14p. Verwendet wurden gereinigte αgst-antikörper in einer Verdünnung von 1:1000. Auftrag siehe oben. 30

40 3. Ergebnisse Überprüfung der Löslichkeit des GST-PEX14 Um die Möglichkeit der Affinitätsreinigung, die das pgex-e.coli-expressionssystem bietet, auszunutzen, muß das Fusionsprotein in löslicher Form vorliegen. Aus diesem Grunde wurde überprüft, ob dies für das in E.coli überexprimierte Fusionsprotein zutraf. Hierzu wurde die mit dem Plasmid pgex-pex14 transformierten und mit IPTG induzierten Zellen nach einer Induktionszeit von 2 h bei 37 C geerntet (3.1.2). Nach der Zellernte wurden die Zellen mit Lysozym inkubiert und anschließend durch Ultraschall aufgeschlossen (2.8.2). Eine Zentrifugation der Proben bei x g für 10 führte zur Trennung unlöslicher (Sediment) und löslicher Proteine (Überstand). Zur Überprüfung der Löslichkeit des überexprimierten Fusionsproteins wurde das Sediment in einer dem Überstandsvolumen entsprechender Menge an Aufschlußpuffer aufgenommen. Abb. 3.3 Dargestellt sind das Sediment und der Überstand aufgeschlossener Zellen, nachdem das Zellysat bei x g zentrifugiert wurde. Für die Analyse im SDS- Gel wurde ein Aliquot des Sediments und des Überstands mit SDS-Probenpuffer versetzt und denaturiert. Das Ergebnis der Analyse ist in Abbildung 3.4 dargestellt. 31

41 3. Ergebnisse Abb. 3.4 Überprüfung der Löslichkeit eines GST-Pex14p-Fusionsproteins in E. coli-zellysaten. Im Protein-Immun-Blot eines 10%-igen SDS-Gels konnte die Bande des überexprimierten Fusionsprotein GST-Pex14p bzw. des GST alleine jeweils in den x g-überstand identifiziert werden (Abb. 3.3). Nur ein kleiner Anteil befand sich in unlöslicher Form im Sediment. Bei entsprechend transformierten, aber nicht-induzierten Bakterienzellen konnte keine entsprechende Polypeptidbande identifiziert werden. Spur 1: Sediment aufgeschlossener Zellen (Zellysat x g) Spur 2: Überstand aufgeschlossener Zellen (Zellysat x g) Sowohl im Coomassie-gefärbten SDS-Polyarcylamidgel (nicht gezeigt) als auch im Western-Blot ( Abb. 3.4) konnten die 64 kda-bande des Fusionsproteins bzw. die 26 kda- Glutathion S-Transferase-Bande überwiegend im x g-überstand und zu einem geringeren Anteil im Sediment identifiziert werden. Damit war gezeigt, daß der größte Teil des Fusionsproteins GST-Pex14p in löslicher Form vorlag. 32

42 3. Ergebnisse Präparative Aufreinigung des Fusionsproteins Aufgrund der in den vorher beschriebenen Versuchen (3.1.2 bzw ) ermittelten Daten zur Überexpression und Löslichkeit des Fusionsproteins GST-Pex14p konnte eine präparative Aufreinigung des Fusionsproteins erfolgen. Diese wurde mithilfe von Glutathion-Sepharose 4B nach Angaben des Herstellers (2.8.3; Pharmacia, Freiburg (BRD)) durchgeführt. Die Elution der Säule mit verdünntem Glutathion wurde photometrisch kontrolliert. Das Protein wurde in 1 ml-fraktionen aufgefangen. Die Überprüfung der Proteinaufreinigung ist in Abbildung 3.6 dargestellt. Elutionsprofil des GST-Fusionssystems zur Proteinaufreinigung des GST-Pex14p OD 280nm 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Frakti on Abb. 3.5 Elutionsprofil der GST-Säule Die Elution der GST-Affinitätschromatographie wurde unter photometrischer Kontrolle durchgeführt. Anhand des Elutionsprofils konnten von den 24 Elutionsfraktionen die Fraktionen 6-16 als Hauptfraktionen identifiziert werden. Anhand des Elutionsprofils (Abb. 3.5) konnten die Fraktionen 6-16 als Hauptfraktionen identifiziert werden. Die Überprüfung der Fraktionen auf GST-Pex14p erfolgte zusätzlich durch SDS-Gelelektrophorese (Abb. 3.6) sowie durch Western-Blot (Abb. 3.7). Dieser Versuch wurde ein zweites Mal wiederholt, und Abbildung 3.6 belegt die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses. 33

43 3. Ergebnisse Abb. 3.6 Überprüfung der Aufreinigung des Fusionsproteins GST-Pex14p. Dargestellt sind Elutionsfraktionen der GST-Affinitätsreinigung. Der Pfeil markiert das GST-Pex14p. 10%-iges SDS-Polyacrylamidgel mit Coomassie-Brilliant-Blue gefärbt. Spur M: Marker Spur 1-8: Elutionsfraktionen (Nr.1; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 20) Spur 9-14: Elutionsfraktionen einer weiteren Säule (Nr. 5; 7; 9; 11; 13; 20) Es wurden in den Elutionsfraktionen Nr neben Proteinbanden, mit einer dem Fusionsprotein entsprechenden Größe von 64 kda auch zahlreiche kleine Banden identifiziert (Abb. 3.6 und 3.7). Hierbei handelt es sich vermutlich um zahlreiche Degradationen des Glutathion STransferase-Pex14p- Fusionsproteins, da sie gegenüber den anti-gst-antikörper immunogen waren (Abb. 3.7). 34

44 3. Ergebnisse Abb.3.7 ZurÜberprüfung von Säulenfraktionen nach Elution wurde 1/1000 Volumen jeder Fraktionen elektrophoretisch (10%-iges Gel) aufgetrennt. Nach Proteintransfer auf Nitrozellulose erfolgte der Nachweis des Fusionsproteins GSTPex14p (64kDa) unter der Verwendung des gegen den GST-Anteil des Fusionsproteins gerichteten spezifischen polyklonalen anti- Glutathion S-Transferase-Antikörpers. Protein-Immun-Blot Spur M = Marker Spur 1-5 Elutionsfraktionen der ersten Säule (Nr.6; 7; 8; 9; 10) (Durch Pfeile sind entweder das GST-Protein oder das GST-Pex14pFusionsprotein markiert.) Zur Verminderung der Proteaseaktivität wurde eine erneute Aufreinigung durchgeführt, bei der allen verwendeten Puffern Protease-Inhibitoren-Mix (2.9.2) zugesetzt wurde. Die Überprüfung der erhaltenen Säulenfraktionen erfolgten wie zuvor beschrieben (Abb.3.8). In den untersuchten Säulenfraktionen traten jedoch zwar immer noch Degradationen des aufgereinigten Fusionsprotein auf, diese waren jedoch wesentlich schwächer als im Experiment ohne Protease-Inhibitoren. 35

45 3. Ergebnisse Abb %-iges SDS-Polyarcylamidgel mit Coomassie- Blue gefärbt Spur M: Marker Spur 1-7: Elutionsfraktionen der ersten Säulen (Nr.2; 4; 6; 8; 10; 12; 14) Da die Degradationsprodukte vermutlich ebenfalls GST-Anteile besitzen, war die Trennung vom Gesamt-GST-Pex14p über die GST-Affinitätssäule nicht möglich. Als nächstes galt es, das Fusionsprotein von der abgebauten Glutathion S-Transferase zu trennen. Denn das Fusionsprotein als Antigen sollte einen möglichst großen Anteil des Pex14p haben. Dieses erfolgte mithilfe eines präparativen SDS-Polyarylamid-Gels unter denaturierten Bedingungen. 36

46 3. Ergebnisse Trennung des Fusionsproteins von seinen Abbauprodukten durch präparative SDS- Gelelektrophorese Trotz Zugabe von Protease-Inhibitoren, traten Abbauprodukte des GST-Fusionsproteins auf, somit konnte die Degradation des Fusionsproteins nicht genügend vermindert werden. Durch präparative Gelelektrophorese (2.11.2) wurde die 64 kda-bande des GST-Pex14p von allen anderen Banden getrennt. Hierdurch wurde sichergestellt, daß das als Antigen verwendete Fusionsprotein frei von anderen Polypeptiden war (Abb. 3.9). Abb. 3.9 Präparatives SDS-Gel 10%-iges SDS-Polyacrylamidgel, 4 mm Dicke, mit Coomassie-Brilliant-Blue gefärbt. Spur M: Marker Spur 1 : Elutionsfraktionen von verschiedenen Aufreinigungen (jeweils Fraktionen 6-14). (Die Pfeile markieren die 64 kda-gst-pex14p- Fusionsbande und die 26 kda-gst-bande.) Die unter erhaltenen Hauptfraktionen der Glutathion-Sepharose-Säule wurden vereint, im SDS-Polyacrylamidgel im präparativen Maßstab getrennt, und die 64 kdapolypeptidbande wurde ausgeschnitten. Das so erhaltene Protein wurde aus dem Acrylamid elektroeluiert (2.11.2). Im Anschluß wurde das Eluat mittels SDSGelelektrophorese überprüft (Abb. 3.10). 37

47 3. Ergebnisse Abb Überprüfung der Proteinelution aus 4 mm SDS-Polyacrylamidgelen Marker Spur 1-5: BSA-Standardlösung in verschiedenen Konzentration zur Abschätzung der Proteinmenge Spur 6-7: Elutionsfraktionen aus den 4 mm SDS-Polyacrylamidgelen Zur Abschätzung des Proteingehalts wurde außerdem als Mengenstandard BSAStandardlösung (2 mg/ml) auf das Gel aufgetragen (Abb. 3.9). Zusätzlich wurde die Proteinmenge nach Pierce (2.6.2) bestimmt. Es konnten insgesamt ca. 5 mg Glutathion S-Transferase-Pex14p aufgereinigt werden, wovon 3,5 mg zu Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt wurden. Da das Glutathion S-Transferase-Pex14p-Fusionsprotein durch SDS-PolyarcylamidGel-Elektrophorese unter denaturierten Bedingungen aufgereinigt wurde, konnte die anschließende Immunisierung also nur gegen denaturiertes Proteinmaterial durchgeführt werden. 38

48 3. Ergebnisse Es sollten neben den Antikörpern gegen das denaturierte Fusionsprotein auch solche gegen natives Fusionsprotein gewonnen werden. In der Hoffnung, daß letztere auch zusätzliche Epitope in Material für die Elektronenmikroskopie erkennen würden. Um natives Fusionsprotein zu gewinnen durfte die Aufreinigung über SDS- Gelelektrophorese nicht durchgeführt werden. Letztere war jedoch erforderlich, aufgrund der durch Proteolyse entstandenen Abbauprodukte. Die Gewinnung von nativen Fusionsprotein war demnach nur durch Verhinderung der Proteolyse zu erreichen. Zu diesem Zwecke wurde der Proteasedefiziente E. coli-stamm BL21 getestet. Es war die Hoffnung, daß eine Aufreinigung über die Affinitätssäule ausreichen würde. 39

49 3. Ergebnisse 3.2 Überexpression und Aufreinigung des Glutathion S-Transferase-Pex14p im E. coli-stamm BL21 (DE3) Expression und Reinigung des Fusionsproteins GST-Pex14p Bei dem Stamm BL21 handelt es sich um einen Protease-defizienten E. coli-stamm (2.21), der eine verminderte Degradation eines überexprimierten Proteins erwarten läßt. Die Expression und Aufreinigung des Fusionsproteins GST-Pex14p erfolgten analog zu den Aufarbeitungen in den vorher benutzten E. coli-zellen TG1 (3.1.2 und 3.1.4). Die Expression des Fusionsproteins wurde über SDS-Gelektrophorese überprüft (Abb. 3.11). Anhand der Expressionskinetik im E. coli-stamm BL21 ist in Abb zu erkennen, daß breits bei einer Inkubationszeit von einer Stunde schwache Banden auf dem SDS- Polyacrylamidgel zu sehen sind, die den überexprimierten Proteinen zugeordnet werden können. Nach einer Induktionsdauer von 3h konnte keine weitere Expressionssteigerung beobachtet werden.(abb. 3.11, Spur 5). Abb Expressionskinetik im E. coli-stamm BL21 zur Bestimmung des Zeitpunktes der optimalen Zellernte. 10%-iges SDS-Polyacrylamidgel mit Coomassie-Blue gefärbt. Spur M : Marker Spur 1-5 : BL21+pGEX-4T-PEX14; Induktionsdauer: 0 ; 30 ; 60 ; 120 ;

50 3. Ergebnisse Auf dem SDS-Gel fällt die stark ausgeprägte 64 kda-bande des Fusionsproteins auf. Dies weist auf eine insgesamt stärkere Expression hin, als im E. coli- Stamm TG Präparative Aufreinigung des Glutathion S-Transferase-Pex14p- Fusionsproteins Dazu wurden die transformierten Bakterienzellen nach erfolgter IPTG-Induktion bei 37 C für die Dauer von 2 h angezogen. Die geernteten Zellen wurden mit Lysoszym behandelt und durch Ultraschall aufgeschlossen. Nach einer x g-zentrifugation wurde der Überstand mit dem löslichen Fusionsprotein chromatographisch aufgetrennt. Die Aufreinigung des GST-Pex14p mittels Glutathionsäule erfolgte nach Abb Coomassie-gefärbtes 10%-iges SDS-Polyacrylamidgel zur Proteinauftrennung der Fraktionen 6, 8, 10, 12 und 20. Zu sehen sind insgesamt stärker ausgeprägte Banden des Fusionsproteins als im E.coli-Stamm TG1. Neben eine stärkere Expression wurde unter der Verwendung des Stammes BL21 die Degradation vermindert. Auf der Abbildung 3.12 ist zu erkennen, daß die Degradation unter Verwendung des BL21-Bakterienstammes vermindert wurde. 41

51 3. Ergebnisse Bei einer weiteren Aufreinigung wurden die Zellen nicht bei -80 C (2.8.2) eingefroren, sondern zur nachfolgenden Bearbeitung 12 Stunden auf Eis gelagert, um zu überprüfen, in wie weit auch nach Ernten der Zellen noch intrazelluläre Proteolyse stattfindet. Es wurde festgestellt, daß wesentlich weniger Fusionsprotein erhalten wurde (Abb.3.13). Jedoch hatte der relative Anteil an zu identifizierenden Abbauprodukte nicht zugenommen. Daher wurde das native Protein aus -80 C gelagerten Zellen isoliert. Nach der Affinitätschromatographie an der GST wurden die erhaltenen Eluatfraktionen mit Centriprep-Membranen (2.9.4) eingeengt. Aufgrund der Porengröße dieser Membranen wurde außerdem Degradationsprodukte zwischen 30 und 50 kda eliminiert. Auch mit den so isolierten nativen Fusionsproteinen wurden Antikörper gewonnen. Abb Elutionsfraktionen der Proteinaufreinigung 10%-iges Polyarcylamidgel mit Coomassie-Blue gefärbt. Bei dieser Aufreinigung wurden die Zellen nicht bei -80 C eingefroren. Dadurch verringerte sich die Proteinmenge in einzelnen Fraktionen. Im Anschluß daran erfolgte eine Proteinbestimmung mittels Bradfort (2.6.1). In Rahmen dieser Untersuchung wurden 5 mg Fusionsprotein erhalten. Davon wurden 2,5 mg zur Immunisierung eingesetzt. 42

52 3. Ergebnisse Zum Abschluß werden beide Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern gegen a) denaturiertes b) natives Fusionsprotein in einem Fließdiagramm zusammengefaßt. Die Spezifität dieser Antikörper-Chargen wird im nächsten Abschnitt dokumentiert. E. coli-zellen E. coli-zellen TG1 (-80 C) BL21 (-80 C) Ultraschall Ultraschall Zellysat Glutathion- Säule Eluat präparative SDS-PAGE Zellysat Glutathion- Säule Eluat Centriprep- Konzentration denaturiertes natives 64 kda-polypeptid Fusionsprotein Antikörper gegen denaturiertes Fusionsprotein Antikörper gegen natives Fusionsprotein Abb Fließdiagramm: Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern gegen a) denaturiertes und b) natives Fusionsprotein 43

53 3. Ergebnisse Charakterisierung des gegen GST-Pex14p gewonnenen Antiserums Um das gegen das Fusionsprotein GST-Pex14p gewonnene Antiserum hinsichtlich des Titers und der Spezifität zu charakterisieren, wurde die Western-Blot-Technik gewählt. Im ersten Schritt, der SDS-PAGE, wurden neben dem Marker Gesamtzellextrakte vom Hefe Wildtyp-Stamm UTL, der Nullmutante von pex14, dem Überproduzenten von Pex14p pex14 [YEpPEX14] und einem Stamm, in dem das Wildtyp-Gen PEX14 durch PEX14-ProteinA ersetzt war, in unterschiedlichen Spuren aufgetrennt (Abb. 3.15A). Nachfolgend wurden die Polypeptide eines solchen Gels auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet und mit einer Verdünnung von 1:5.000 des Antiserums analysiert (Abb. 3.14B). Diese Abbildung zeigt einmal, daß im Wildtyp nur eine Polypeptidbande auf der erwarteten Höhe für Pex14p gefunden wurde, die in der Nullmutante als Negativkontrolle nicht auftrat. Dies belegt eindrücklich die Spezifität des Serums für die Erkennung von Pex14p. Im Gesamtzellextrakt des Überproduzenten war die Bande, wie erwartet, intensiver und darunter drei Abbaubanden mit geringer Intensität zu erkennen. Unerwartet traten aber auch drei Signale im höhermolekularen Bereich auf. Eine mögliche Interpretation ist, das Vorliegen eines Dimers mit entsprechenden Abbaubanden. In der vierten Spur wurde das Fusionsprotein Pex14p-Protein A als Einzelbande in erwarteter Höhe erkannt. 44

54 3. Ergebnisse Abb.3.15 Charakterisierung des gegen GST-Pex14p gewonnenen Antiserums A)SDS-Polyacylamidgel mit Coomassie-Brilliant-Blue gefärbt; Spur M: Marker Spur 1: Gesamtzellextrakte vom Hefe Wildtyp-Stamm UTL Spur 2: Nullmutante von pex14 Spur 3: Überproduzent von Pex14p pex14 [YEpPEX14] Spur 4: Stamm, in dem das Wildtyp-Gen PEX14 durch PEX14-Protein A ersetzt war B) Western Blott des in A) verwendeten Gels zum Nachweis der Spezifität des Serums zur Erkennung von Pex14p mit einer Verdünnung von 1:5.000 des Antiserums. In dieser Abbildung ist zu erkennen, daß im Wildtyp nur eine Polypeptidbande auf der erwarteten Höhe für Pex14p gefunden wurde, die in der Nullmutante als Negativkontrolle nicht zusehen ist. Dies zeigt die Spezifität des Serums für die Erkennung von Pex14p. 45