Analytische Chemie III: Strukturaufklärung

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1 Analytische Chemie III: Strukturaufklärung Verbindung Struktur Sinnesorgan der Chemiker 1

2 Bücher Horst Friebolin: Wiley, VCH, ISBN-10: , 49,90 Euro Hesse, Maier, Zeh Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, Thieme 80,00 Euro Classics in Spectroscopy: Isolation and Structure Elucidation of Natural Products Wiley VCH EUR 65,29 2

3 Geeignete Quellen z.b: Naturstoff aus Mikroorganismen Arbeitsaufwand Analytik Große Kultur Wissen über Produktionskinetik => Wachstumskurve Berücksichtigen Wissen über Lokalisierung: Zellen oder Kulturmedium aufarbeiten 3

4 Extraktion Ziel: Extrahiere die gesuchte Verbindung idealerweise quantitativ mit größtmöglicher Selektivität. GEGENLÄUFIGE ZIELE 4

5 Extraktion Oberflächenextraktion oder Probe zerstören (bei wasserhaltigen Stoffen oft unterstützt durch Flüssigstickstoff)

6 Exktraktionslösungsmittel

7 Anethol Isolation Bei Raumtemperatur in 35% EtOH löslich Fällt bei Verdünnung aus, nicht filtrierbar Bei -25 C in 35% EtOH unlöslich, filtrierbar 7

8 Extraktion Prostaglandine nur aus verwundeter Rotalge isolierbar 8

9 Rohextrakt Trockne über Natriumsulfat Einrotieren / Gefriertrocknen / Abblasen

10 Chromatography Column Chromatography Problems: Find the right stationary phase (often silica gel) Find the right solvents OFTEN: more than one column chromatography required. Pre-purification to remove most of the by-products Purification: Elute selectively the compound(s) in question Chromatogramm: Intensity plotted against time

11 Probenreinheit In Gemischen Signalzuordnung nur mit massivem Aufwand Verunreinigung erfordert erst mühsames Ausschließen von störenden Signalen Reine Probe kein Problem! 11

12 Spektrale Informationen NMR 3 Gruppen von Protonen 3 : 4.5 : 4.5 Als Zusammensetzung 2 : 3 : 3 4 : 6 : 6 etc Erfassung von genügend Punkten nötig Ethylacetat 12

13 Aufklärung komplexer Moleküle 13

14 NMR Grundlagen Im externen magnetischen Feld überwiegen die parallelen Spinzustände was zu einer makroskopischen Magnetisierung M 0 führt n L = B 0 g 2p 14

15 NMR Grundlagen Kreisel-Modell des Kernspins Kern Drehimpuls P = I(I+1) h Magnetisches Moment µ = g P g Gyromagnetisches Verhältnis rel. Sensitivität: Bei konst. B und gleicher Kernzahl abs. Sensitivität: rel. Sensitivität * Häufigkeit I = Spinquantenzahl 15

16 Spektren 1 H 13 C 13 C Klar definierte Signale über weiten Bereich der chemischen Verschiebung 16

17 Kern Overhauser Effekt (NOE) E bb ba ab aa (übertrieben) Besetzung im Gleichgewicht 17

18 Kern Overhauser Effekt (NOE) E bb ba ab aa Besetzung bei Einstrahlung von A Kern (aa und ba gleichverteilt, ab und bb gleichverteilt) 18

19 Kern Overhauser Effekt (NOE) E bb ba ab aa Besetzung bei Einstrahlung von A Kern Relevanter Unterschied für Detektion von X wird durch W2 Vergrössert 19

20 Kern Overhauser Effekt (NOE) 21

21 Kern Overhauser Effekt (NOE) 22

22 Der Pulswinkel Im äusseren Magnetfeld Nach 90 Puls Nach 90 Puls sind beide Energieniveaus gleichbesetzt, aber die Magnetisieungsdipole in Phasenkoärenz. 23

23 Der Pulswinkel Das Signal Die Magentisierung im rotierenden Koordinatensystem entspricht einem pulsierenden magnetischen Vektor in X und Y-Richtung Die resultierende elektromagenetische Welle kann mit Detektor nachgewiesen werden 24

24 Der Pulswinkel Signal von Wasser mit unterschiedlichen Pulslängen aufgenommen 25

25 Relaxation: Spin Gitter Wechselwirkungen Z-Komponente der Magnetisierung geht nach s wieder in Gleichgewichtszustand über 26

26 Relaxation: Spin Spin Wechselwirkungen XY-Komponente der Magnetisierung geht in ms verloren 27

27 Das klassische PFT-Experiment 28

28 Fourier Transformation Free Induction Decay FID 1 H-NMR von CHI 3 29

29 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Nomenklatur der Pulse im rotierenden Koordinatensystem 30

30 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einflußder Pulse auf einen magnetischen Vektor der in y' Richtung liegt 31

31 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einfluss von 180 Pulsen auf magnetische Vektoren A und B. 32

32 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment Beispiel: Zwei Kerne A und B im inhomogenen Magnetfeld t= h Signale unabhängig von B lokal refokussiert 33

33 J-moduliertes Spin Echo Experiment (APT) COOH H BB entkoppeltes 13 C NMR 34

34 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90 X' Puls 39

35 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90 X' Puls 40

36 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90 X' Puls 41

37 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90 X' Puls 42

38 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90 X' Puls z.b. CHCl 3 43

39 Gepulste Feldgradienten 46

40 Gepulste Feldgradienten a,c ) Nach 90 x' b,d) Im linearen Feldgradienten führt Auffächerung zu Abnahme der Quermagnetisierung 47

41 Spin-Echo Experiment mit gepulstem Feldgradienten y'! rotierendes Koordinatiensystem y'! 48

42 Spin-Echo Experiment mit gepulstem Feldgradienten Int. Oligoparabenzamid Diffusion in isotropischer / anisotropischer Phase von Flüssigkristallen Flüssigkristalle Gradient 49

43 Selective Population Inversion (SPI) Normal Dublett J(CH) = 209 Hz z.b. AX-Zweispinsystem ( 13 CHCl 3 ) A-Übergänge im 1 H beobachtbar, X-Übergänge im 13 C 15x Vergrössert Nach 180 A 2 Puls Nach 180 A 1 Puls 50

44 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 51

45 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 52

46 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 53

47 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 54

48 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 55

49 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 56

50 INEPT Experiment 1 H Ca Cb Ca CHCl 3 Cb Ca Ca Cb Cb Cb Cb Ca Ca Ca 13 C Cb 57

51 INEPT Experiment Besetzungszahlen nach 1 H 90 y' Puls Vergleich mit SPI ohne Einstrahlung A 2 Einstrahlung A 1 Einstrahlung identisch 58

52 Normal INEPT Experiment CH INEPT Verstärkte Signale mit positiver und negativer Amplitude CH 2 Ideal: Mittlere Linie wird 0 die anderen um Faktor 2g( 1 H)/g( 13 C) verstärkt CH 3 Ideal: Vier Signale um Faktor 3g( 1 H)/g( 13 C) verstärkt Quartäre C geben kein Signal 59

53 INEPT Experiment INEPT Mit CH Kopplungen 1 H-BB-Entkoppelt C2 C3 CH 3 COO 60

54 DEPT Experiment 1 H 90 x' 180 x' Q y' BB 90 x' 180 x' 13 C 63

55 DEPT Experiment 64

56 DEPT Experiment DEPT

57 DEPT Experiment Subspektrum Subspektrum Subspektrum BB entkoppeltes 13 C 66

58 Aufspaltungsmuster für CH, CH 2, CH 3 Intensität Spektren CH J CH 1 1 CH 2 J CH J CH CH 3 J CH J CH J CH

59 Breitbandentkopplung A) Normale Messung 68

60 Breitbandentkopplung B) Entkopplung der Methylgruppe A) Normale Messung 69

61 Breitbandentkopplung C) Breitband entkoppelt B) Entkopplung der Methylgruppe A) Normale Messung 70

62 Kern Overhauser Effekt (NOE) H3 /H6? 1 H Methoxygruppen eingestrahlt 71

63 Kern Overhauser Effekt (NOE) 72

64 Kern Overhauser Effekt (NOE) H23b eingestrahlt H12 eingestrahlt 1 H 73

65 Selektives TOCSY Experiment 74

66 TOCSY zur Identifizierung von Spuren in Mischungen 1H NMR von Honig (7x verdünnt) 200 fach vergrößert TOCSY nach Anregung von Signal bei 1.98 ppm TOCSY von Prolin nach Anregung von Signal bei 1.98 ppm 75

67 2D NMR ppm ppm 77

68 2D NMR 78

69 2D NMR 79

70 2D NMR Gestaffelt In den Alpen sind Höhenlinien wichtig Konturdiagramm In der NMR meist nicht, denn Signale sind meist symmetrisch. Querschnitt bei einer Ebene ist gutes Mass für Intensität 80

71 2D NMR d d d 81

72 Heteronukleares 2D J-aufgelöstes 13 C-NMR 82

73 Heteronukleares 2D J-aufgelöstes 13 C-NMR 83

74 Heteronukleares 2D J-aufgelöstes 13 C-NMR 84

75 Heteronukleares 2D J-aufgelöstes 13 C-NMR 85

76 Heteronukleares 2D J-aufgelöstes 13 C-NMR 86

77 Homonukleare zweidimensionale J-aufgelöste NMR 1 H-NMR d-dim. 2D NMR Querschnitte (wie Signale im 1 H NMR) 87

78 Homonukleare zweidimensionale J-aufgelöste NMR 1 H-NMR d-dim. 2D NMR Querschnitte (wie Signale im 1 H NMR) 88

79 Homonukleare zweidimensionale J-aufgelöste NMR 1 H-NMR d-dim. 2D NMR Querschnitte (wie Signale im 1 H NMR) 89

80 Homonukleare zweidimensionale J-aufgelöste NMR 1 H-NMR d-dim. 2D NMR Querschnitte (wie Signale im 1 H NMR) 90

81 C,H-COSY (HETCOR) a a a Signallage abhängig von d- Wert des Protons h h Intensitäten der 13 C Signale abhängig von d- Wert des Protons 92

82 C,H-COSY (HETCOR) Wartezeiten und BB-Entkopplung zur Spektrenvereinfachung 93

83 C,H-COSY (HETCOR) 94

84 C,H-COSY (HETCOR) 95

85 H,H-COSY 90 HH-COSY 96

86 H,H-COSY 45 HH COSY 97

87 H,H-COSY Artefakte im Spektrum: a) Axialsignale entlang der F2-Achse entstehen durch Spin-Gitter-Relaxation Signale parallel zu F1 werden durch das t1-rauschen verursacht (Instabilitäten während der Messung z.b. Senderleistung, Magnetfeld) Vermeidbar durch Symmetrisieren des Datenmaterials 98

88 H,H-COSY Normales H,H-COSY Long range H,H-COSY 99

89 H,C-COSY (HSQC)! INEPT EXPERIMENT INEPT = Insensitive Nuclei Enhancement by Polariastion Transfer 100

90 H,C-COSY (HSQC) INEPT Experiment Entwicklung der 13 C Kerne inverses INEPT Experiment 101

91 H,C-COSY (HSQC) Selbe Information wie C,H-COSY aber wesentlich weniger Messzeit nötig. 102

92 HMQC Pulsfolge (nicht mehr im Vektormodell darstellbar) 103

93 HMQC Selbe Information wie C,H-COSY aber Auswahl der Kohärenzwege mit Feldgradienten. Es enthält keine Signale von H die an 12 C gebunden sind. Dadurch keine Pulssequenz zur Unterdrückung nötig. Schneller! 104

94 HMQC 105

95 HMQC 106

96 HMBC Detektiert die Long-range- Kopplungen zwischen Protonen und Heteroatomen 107

97 HMBC Detektiert die Long-range- Kopplungen zwischen Protonen und Heteroatomen 108

98 HMBC Eine deutliche Zuordnung wählen. Welches Proton zeigt sonst noch Kreuzsignale mit diesem C? 109

99 HMBC Eine deutliche Zuordnung wählen. Welches Proton zeigt sonst noch Kreuzsignale mit diesem C? 110

100 HMBC Einfluss von Kopplung! 111

101 HMBC WW über Kopplung. Da vicinale Kopplung hier = 0 kein Signal.? 112

102 HMBC 113

103 HMBC 114

104 HMBC 115

105 2D-TOCSY 117

106 2D-TOCSY 118

107 1D-TOCSY zur Untersuchungen von Mischungen

108 2D-TOCSY zur Untersuchungen von Mischungen O H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 C O OH O H 2 N CH C OH CH 2 CH CH 3 CH 3 O H 2 N CH C OH CH CH 3 A) Glu Lys Val B) Glu Leu Lys Val C) Decapeptid CH 3 Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46,

109 2D-TOCSY zur Untersuchungen von Mischungen 2D-TOCSY eines E. coli lysats Anwendung in Metabolomics und Fluxomics Phytochem. 2007, 68,

110 Erinnerung: Kern Overhauser Effekt (NOE) eingestrahlt erhöht 122

111 Entwicklung wegen unterschiedlicher Larmorfrequenz NOESY 124

112 NOESY 125

113 NOESY H 126

114 NOESY H H H 127

115 NOESY H 128

116 ROESY 129

117 ROESY 130

118 ROESY 131

119 Spezialisierte Pulsfolgen für spezifische Probleme 200 and More NMR Experiments. A Practical Course (Taschenbuch) von Stefan Berger und Siegmar Braun Wiley-VCH ISBN-13: Euro 132

120 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Salinipyrones and Pacificanones, Mixed-Precursor Polyketides from the Marine Actinomycete Salinispora pacifica Dong-Chan Oh, Erin A. Gontang, Christopher A. Kauffman, Paul R. Jensen, and William Fenical J. Nat. Prod.; 2008; 71(4) pp

121 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 134

122 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 135

123 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 136

124 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 137

125 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Extraktion: Lösungsmittel (unpolar bis polar) Aufreinigung: Säulenchromatographie Tests auf Aktivität führt zu interessanter Fraktion ESIHRMS (obsd [M + H]+ at m/z , calcd [M + H] ) C 17 H 24 O 4 138

126 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 1 H NMR 3 olefinische Protonen 13 C NMR 9 sp 2 O sp 3 7 Aliphaten 139

127 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 140

128 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 141

129 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 142

130 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 143

131 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 144

132 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 145

133 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 146

134 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 147

135 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Geometrie der Doppelbindungen über 1D NOE 148

136 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Einleitung mit Motivation Extraktion und Aufreinigung "Salinispora strain CNS-237 was cultured at 27 C with shaking at 250 rpm in twelve 2.8 L Fernbach flasks each containing 1 L of the medium. After 6 days, the whole culture (12 L) was extracted twice with EtOAc, and the resulting extract was concentrated by rotary evaporation." The crude extract (1.9 g) was fractionated by C18 vacuum column chromatography... Grundlegende Eigenschaften: "Salinipyrone A (1) was obtained as a viscous oil that analyzed for the molecular formula C17H24O4 by ESIHRMS (obsd [M + H]+ at m/z , calcd [M + H] ). This molecular formula was supported by 1H and 13C NMR data (Table 1)" 149

137 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen 150

138 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Conclusion: The discovery of the salinipyrones and the pacificanones is the result of a comprehensive phylogenetic analysis approach. Finescale phylogenetic analyses of the 16S rdna sequences of Salinispora strains revealed subtle diversity within the S. pacifica clade, which prompted detailed chemical analyses of strain CNS This diversity-based approach led to the discovery of the salinipyrones with unusual chiroptical properties and the pacificanones, which appear to constitute a new example of module skipping in a PKS I biosynthetic pathway. Application of comprehensive 16S rdna phylogenetic analysis appears to be an effective method to define diverse actinomycete taxa from marine ecosystems, thus enhancing the rate of discovery of novel secondary metabolites. 151

139 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen "Complete Structure Elucidation of Shishididemniols, Complex Lipids with Tyramine-Derived Tether and Two Serinol Units, from a Marine Tunicate of the Family Didemnidae" Fusetani et al. J. Org. Chem. 72 (4), ,

140 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Fusetani et al. J. Org. Chem. 72 (4), ,

141 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Absolute Konfiguration: H + /H 2 O Fusetani et al. J. Org. Chem. 72 (4), ,

142 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Absolute Konfiguration: Fusetani et al. J. Org. Chem. 72 (4), ,

143 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Absolute Konfiguration: H + /H 2 O Vergleich mit synthetischen Verbindungen Fusetani et al. J. Org. Chem. 72 (4), ,

144 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Belegt mit Spektrenanhang S4 1H NMR spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S5 13C NMR spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S6 COSY spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S7 TOCSY spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S8 HSQC spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S9 HMBC spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S10 NOESY spectrum of shishididemniol A (DMSO-d6) S11 FAB-MS/MS data of shishididemniol A Fusetani et al. J. Org. Chem. 72 (4), ,

145 Strukturaufklärung von organischen Verbindungen Prymnesin Benötigt: 13C and 1H NMR 1H-1H COSY ESI mass spectra HMBC correlations and coupling constants partial NOESY spectrum and NOE data for the selection of linkage combination of rings L-N Yasumoto et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118,

146 Dicranum scoparium (Gabelmoos)

147 Dicranum scoparium (Gabelmoos) 2 kg gemörsert, mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet, eingeengt, Silicagelsäule, präparative HPLC >10 mg eines blassgelben Öls

148 % 100 Unbekannte Verbindung ESI Tof MS: m/z

149 Elemental Composition Report Single Mass Analysis Tolerance = PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0 Selected filters: None Monoisotopic Mass, Even Electron Ions 5237 formula(e) evaluated with 134 results within limits (up to 50 closest results for each mass) Elements Used: C: 0-20 H: 0-50 N: 0-10 O: 0-50 Si: 0-10 S: 0-10 Minimum: -1.5 Maximum: Mass Calc. Mass mda PPM DBE i-fit Formula C9 H27 N2 O6 Si C10 H27 N2 O5 S C18 H23 O C17 H27 Si C10 H23 N6 O2 Si C11 H23 N6 O S C14 H19 N6 O C5 H27 N8 Si2 S C14 H27 N2 S2

150 Elemental Composition Report Tolerance = 5.0 PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0 Selected filters: None C: 0-20 H: 0-50 N: 0-10 O: 0-50 Si: 0-10 S: 0-10 Minimum: Maximum: Mass RA Calc. Mass mda PPM DBE i-fit Formula C9 H24 N9 O Si C10 H24 N9 S C17 H24 N3 O C19 H26 O C9 H28 N5 O4 S C18 H30 Si C8 H28 N5 O5 Si C11 H26 N6 O2 Si

151 AU Lockmass von D.Scoparium BW LM (1.638) e-2 UV 3: Diode Array 4.761e-2 4.2e-2 4.0e-2 3.8e nm e-2 3.4e-2 3.2e-2 3.0e-2 2.8e-2 2.6e-2 2.4e-2 2.2e-2 2.0e-2 1.8e-2 1.6e-2 1.4e-2 1.2e-2 1.0e-2 8.0e-3 6.0e-3 4.0e-3 2.0e nm

152 1H NMR ppm ppm Hz (t1) ppm

153 1H NMR

154 C 210, , , , ,742 83,428 77,173 49,011 43,322 33,450 28,061 23,843 23,601 20,801 20,157 18,359 13, , ppm ppm Zwei Signal e ppm ppm

155 COS Y ppm ppm

156 COS Y ppm ppm

157 COS Y ppm ppm

158 COS Y ppm ppm

159 COS Y achtung, liegt nicht Exakt auf der Linie ppm ppm

160 COS Y achtung, liegt nicht exakt auf der Linie Hier geht es nicht mehr eindeutig weiter ppm ppm

161 HSQC ppm ppm

162 HSQC ppm ppm

163 HSQC ppm ppm

164 HSQC ppm ppm

165 HSQC ppm ppm

166 COS Y 1H ppm ppm

167 COS Y 1H ppm ppm

168 COS Y 1H Schlüssel: Letztes Signal vom Spinsystem ppm ppm

169 HMB C ppm ppm

170 HMB C ppm ppm

171 COS Y 1H Bestätigt HMBC ppm ppm

172 COS Y 1H Bestätigt HMBC ppm ppm

173 COS Y 1H ppm ppm

174 HMB C ppm ppm

175 CD-spectra of similar compound Δε wavelenght in nm Absolute stereochemistry elucidated by comparison of the CD-spectra and modell

176 Bioassays

177 Bioassays

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