PRAKTIKUM II: ENZYMREAKTIONEN UND STOFFWECHSEL

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1 91 PRAKTIKUM II: ENZYMREAKTIONEN UND TOFFWECHEL PLATZ 8: EIGENCHAFTEN VON DNA, DNA-REKOMBINATIONTECHNIK, POLYMERAE-KETTENREAKTION IN DER MEDIZINICHEN DIAGNOTIK In den folgenden Experimenten werden Eigenschaften von DNA (Exp. 8.10), Plasmiden (Exp. 8.7) und Restriktionsenzymen (Exp. 8.8) untersucht. Anhand des Exp. 8.9 wird eine Anwendung der strukturgetreuen DNA-Vermehrung durch Polymerase-Kettenreaktion in der medizinischen Diagnostik erläutert. Theoretische Grundlagen: Molekularbiologische Methoden ( ) UV-pektren von Nucleotiden (. 20) Bezug zu anderen Plätzen: ubstratspezifität von Enzymen Exp. 1.6, Exp Elektrophorese Exp. 4.2 EXPERIMENT 8.7: Antibiotikaresistenz von Bakterien Prinzip: Im Versuch wird die Wachstumshemmung von E. coli-bakterien in Flüssigkulturen durch die Antibiotika Ampicillin (ein Penicillinderivat) und Tetracyclin geprüft. Ausgehend von E. coli, die kein Plasmid enthalten, ist ein Teil der Bakterien mit Plasmid, welches ein Resistenzgen enthält, transfiziert worden (Aus zeitlichen Gründen kann die Transfektion am Kursnachmittag nicht durchgeführt werden). Resistenzgene sind spezifisch für bestimmte Antibiotika, d.h. gegen Penicilline oder Tetracycline, aber nicht gegen beide Antibiotika-Typen. Das Resistenzgen für Penicillin (Ampicillin) führt zur Bildung des Enzyms $-Lactamase, das Penicilline durch paltung des Lactamrings inaktiviert. Tetracyclinresistenz beruht auf der Bildung eines membranständigen Proteins, welches aufgenommenes Tetracyclin aus der Zelle transportiert. Material und Lösungen: 1) LB-Kulturmedium (=Luria-Bertani Nährlösung) 2) Ampicillin, 60 µg/ml, in LB-Kulturmedium 3) Tetracyclin, 15 µg/ml, in LB-Kulturmedium

2 92 4) 70% Alkohol 5) E. coli Kultur A, B, C Ausführung: 9 sterile Plastikröhrchen mit überstülpbarem chnappdeckel beschriften (A1, A2, A3; B1, B2, B3; C1, C3, C3) und beschicken. Röhrchen sogleich wieder bedecken (nicht einschnappen). Mit Pasteurpipette vorsichtig je 2 Tropfen E. coli A in alle Röhrchen A, E.coli B in alle Röhrchen B und E. coli C in alle Röhrchen C pipettieren (Plastikhandschuhe tragen). Gebrauchte Pasteurpipetten in bereitgestelltes ammelgefäss geben. Bei Verschmutzung Arbeitsfläche mit Papiertüchlein aufwischen und anschliessend mit 70% Alkohol reinigen! Röhrchen A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Lösung 1) LB (ml) ) LB-Amp (ml) ) LB-Tet. (ml) je 2 Tropfen E. coli A E. coli B E. coli C Resultat: Plasmid: Die Röhrchen gruppenweise den Assistierenden abgeben. ie werden für ca. 16 tunden bei 37 0 C inkubiert. Die Kulturlösungen müssen dabei mit kreisförmigen chüttelbewegungen (280 Umdreh./min) mit Luft durchmischt werden. Weshalb? Auswertung: Im Laufe des Nachmittags werden Ihnen die Röhrchen des vorangegangenen Kurstages zur Beurteilung abgegeben. Vermehrung der Bakterien ist durch Trübung und dichte chlierenbildung beim chwenken der Röhrchen sichtbar. Resultate (Trübung - bis +++) in Tabelle eintragen und beurteilen, welche E. coli (A,B,C) ein Resistenzplasmid enthalten. Bakterien können auch auf festem, Nährlösung enthaltendem Agar vermehrt werden. Wenn die auf einem Agarboden ausgesäten Zellen genügend verdünnt sind, wird jedes lebensfähige Bakterium eine sichtbare und abgegrenzte Kolonie bilden, d.h eine Ansammlung einer riesigen Anzahl von Tochterzellen. Eine solche Kolonie stellt einen Zellklon dar. Durch Zählen der Kolonien und Berücksichtigung der Verdünnung kann die Anzahl der Bakterien in einer uspension bestimmt

3 werden. Dieses Verfahren hat in der ärztlichen Praxis eine grosse Bedeutung. Es wird als sog. Urikult- Test häufig zur Abschätzung der Anzahl Bakterien im Urin verwendet. tark vermehrter Bakteriengehalt im Urin sichert die Diagnose eines bakteriellen Infekts der ableitenden Harnwege. Wo kann somit der Infekt anatomisch lokalisiert sein? Falls dem Agar ein Antibiotikum zugesetzt ist, werden Resistenzplasmid enthaltende Bakterien selektioniert. Dieser Vorgang bildet die Grundlage zur Klonierung von DNA, weil zu isolierende Fremd-DNA in ein Plasmid eingefügt und herausgeschnitten werden kann. Untersuchungen von Bakterienwachstum auf antibiotikahaltigem Agar spielt in der Medizin eine wichtige therapeutisch/diagnostische Rolle. Welche? 93 Wie kann man nachweisen, ob antibiotikaresistente Bakterien Plasmide enthalten? Wo greifen Penicillin(e) und Tetracyclin(e) in den bakteriellen toffwechsel ein? Welche Erklärungen gibt es, wenn z.b. die mit B bezeichneten E. coli in allen drei Kulturmedien (Lösungen 1-3) gewachsen wären. Wie kann man herausfinden, welche Möglichkeit zutrifft? Warum werden die Flüssigkulturen beim Inkubieren geschüttelt, d.h. mit Luft durchmischt? EXPERIMENT 8.8: pezifische paltung von DNA durch Restriktionsenzyme Prinzip: Das für die Penicillinresistenz verantwortliche Plasmid in Exp. 8.7 wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Bgl I oder mit beiden verdaut. Die Restriktionsfragmente werden mittels Elektrophorese aufgetrennt. Material und Lösungen: - 1.2% Agarose-Gel, enthält Ethidiumbromid (nicht mit blossen Händen anfassen. Carcinogen!) - Plasmid-DNA, Puffer H, Restriktionsenzyme Eco RI, Bgl I - Ladepuffer Ausführung: 4 verschliessbare Eppendorf-Röhrchen auf dem Deckel beschriften (1 bis 4) und mit folgenden Volumina beschicken (µl):

4 (unverdaut) (Eco) (Bgl) (Eco + Bgl) Wasser Plasmid-DNA Puffer H Restriktionsenzym EcoRI Bgl I Röhrchen dicht verschliessen, gut mischen und zur Verdauung für Minuten ins 37 0 C Wasserbad stellen. Nach der Verdauung zu allen 4 Röhrchen je 5 µl Ladepuffer zugeben. Röhrchen dicht verschliessen. Auswertung: Unverdaute DNA und DNA-paltprodukte unterscheiden sich in Länge und Form. Mit Hilfe der Agarose-Gel-Elektrophorese wird DNA auf Grund unterschiedlicher Länge und Form in Exp. 8.9 aufgetrennt (zusammen mit den Proben von Exp. 8.9, siehe dort; 1 Gel pro Gruppe). Weshalb erlauben die Resultate der Restriktionsverdauung zu entscheiden, ob die untersuchte Plasmid-DNA linear oder ringförmig ist. Weshalb zeigt die unverdaute DNA unterschiedlich weit wandernde DNA-Banden? Eine ungefähre Karte mit den Restriktionsstellen der beiden Enzyme erstellen. Das Plasmid besteht aus rund 3'000 Basenpaaren (3 kbp). Welche chemische Reaktion führen Restriktionsenzyme durch? Welche paltprodukte entstehen? (wo welche funktionellen Gruppen?) Die durch EcoRI, PstI und mai gebildeten DNA-Enden zeichnen (stumpfe, überhängende oder zurückversetzte Enden; Nucleotidsequenz). Welche Enden können durch DNA-Ligase miteinander verbunden werden? Wie könnte gezeigt werden, dass bei obiger Verdauung des Resistenzplasmids mit EcoRI und Bgl I das vollständige Gen für $-Lactamase im kleineren DNA-Fragment (ca. 1.4 kbp) enthalten ist? Falls das Gen für $-Lactamase im kleineren Fragment enthalten ist, muss das Enzym also kürzer/kleiner als... A sein.

5 95 Experiment 8.9: Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnitts durch Polymerase- Kettenreaktion Mukoviszidose ist eine autosomal rezessiv vererbte törung der exokrinen Körperdrüsen. ie gehört zu den häufigsten lebensbedrohlichen Erbkrankheiten des Menschen und kommt in der chweiz bei etwa 1:2'500 Neugeborenen vor. Die bei den meisten Mukoviszidosekranken auftretenden fibrotischen Veränderungen der Bauchspeicheldrüse (fibrotische Vermehrung des Bindegewebes) haben zur synonym gebräuchlichen Bezeichnung zystische Fibrose des Pankreas, kurz zystische Fibrose, geführt (CF = cystic fibrosis). Krankheitssymptome der Mukoviszidose manifestieren sich in den meisten Fällen bereits im Kindesalter und sind durch die ekretion eines dicken, zähflüssigen chleims bedingt (Mucus viszidus = zähflüssiger chleim, daher der Name "Mukoviszidose"). Dieser erleichtert die chronische Besiedlung der Lunge mit opportunistischen Erregern (meist taphylokokken und Pseudomonas aeruginosa). Die körpereigene Abwehr kann die Bakterien nur unzureichend bekämpfen und trägt stattdessen zu einer fortschreitenden Zerstörung der kleinen Bronchien bei. Die fibrotischen Veränderungen und Degeneration der Drüsengänge im Pankreas verhindern die ekretion von Verdauungsenzymen. Dies führt zu mangelhafter Nahrungsverwertung, Mangelerscheinungen und Gedeihstörungen. Mit zunehmender Fibrose kann es durch Ausfall des endokrinen Pankreas zu einem Diabetes mellitus kommen. Im Erwachsenenalter kann die Krankheit mit fibrotischen Leberschäden und Gallensteinen einhergehen. Fast alle männlichen Betroffenen sind unfruchtbar wegen fehlenden permien in der amenflüssigkeit (Azoospermie). Das CF-Gen überspannt einen Bereich von etwa 250 kbp, besitzt 27 kodierende Exons und bildet das CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transporter Protein), ein transmembranales ATP-abhängiges Transportprotein für Chlorid und Wasser (1480 Aminosäuren), das in allen Epithelzellen vorkommt. Fehlen oder mangelhafte Funktion des CFTR-Proteins führt zu ungenügendem Flüssigkeitstransport durch Epithelmembranen, was als primäre Ursache der Mukoviszidose angesehen wird. Eine grosse Anzahl verschiedenster Mutationen kann zu Mukoviszidose führen. Zu den zehn häufigsten gehört u.a. eine Punktmutation, die im folgenden Experiment nachgewiesen werden kann. Durch eine Basensubstitution entsteht eine im Wildtypgen nicht vorhandene Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuclease, deren Vorhandensein oder Fehlen leicht nachweisbar ist. Für diese Nachweismethode ist Voraussetzung, dass es gelingt, den betreffenden Genabschnitt, z.b. aus Leukozyten, zu amplifizieren. Prinzip: Mit 2 für das CF-Gen spezifischen Oliogonucleotid-Primern werden DNA-Proben aus menschlichen Leukozyten durch PCR amplifiziert (Aus praktischen Gründen liegt bei den verwendeten DNA-Proben ein Teil des CF-Gens bereits angereichert vor!). Durch anschliessende Restriktionsverdauung der amplifizierten DNA wird geprüft, ob bei den Proben die gesuchte Punktmutation vorliegt. Durch Basensubstitution entsteht eine in der Wildtyp-DNA nicht vorhandene Restriktionsstelle, wodurch bei der Verdauung zwei DNA-Fragmente (ca. 150 und 350 Bp) gebildet werden. Lösungen: 1) DNA-Proben A, B in speziellen PCR-Röhrchen (dünnwandig, besonders wärmeleitfähig) 2) CF1 (40 ng/µl) = Oligonucleotid 1 = 5'-Primer 3) CF2 (40 ng/µl) = Oligonucleotid 2 = 3'-Primer

6 4) Puffer/dNTP: Desoxy-Nucleotidtriphosphate, je 1.6 mm; MgCl mm; Pufferlösung ph 7.5 5) Taq Polymerase: Thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus 6) Puffer H 7) Restriktionslösung R1, enthält Restriktionsenzym 8) 1.2% Agarose-Gel, enthält Ethidiumbromid (nicht mit blossen Händen anfassen. Carcinogen!) 9) Ladepuffer; Elektrophoresepuffer 96 Ausführung: 1. Amplifikation mit PCR Zwei Eppendorf-Röhrchen mit A0, B0 beschriften. 1.1 Die beiden PCR-Röhrchen A und B, die bereits Probanden-DNA enthalten, wie folgt beschicken (Volumina µl): DNA-Proben (10 µl) A B in PCR-Röhrchen Oligonucl. Primer CF " " CF Puffer/dNTP Minuten 94 0 C (Trennen der DNA-tränge), dann Zugabe von Taq-Polymerase Deckel dicht verschliessen und mischen. 1.2 Röhrchen aller Kursteilnehmer zusammen in Lochhalterung des Thermal-Cyclers stellen. Deckel schliessen durch sanftes Drücken und Einrasten. tarttaste drücken, Temperaturanzeige verfolgen. Während 5 Minuten werden die DNA-tränge durch Hitzedenaturierung bei 94 0 C getrennt. Zehn ekunden vor Beendigung der Denaturierung (Zeitangabe des Anzeigefelds verfolgen) die Pause-Taste drücken und Deckel des Thermal-Cyclers öffnen. Achtung: Innenseite des Deckels ist heiss! 1.3 Allen Röhrchen Taq-Polymerase zugeben, Deckel dicht verschliessen, gut mischen und anschliessend je 10 µl entnehmen (=Proben vor Amplifikation; von PCR-Röhrchen A in A0, bzw. von PCR-Röhrchen B in B0 pipettieren) und für die Elektrophorese beiseite stellen. 1.4 PCR-Röhrchen in Thermal-Cycler zurückstellen. Zur Fortsetzung des Programms Pause-Taste erneut drücken. Der Thermal-Cycler führt nun 20 Zyklen mit folgendem Temperaturprogramm durch: 1 Minute 94 0 C, 1 Minute 57 0 C, 1 Minuten 72 0 C.

7 1.5 Verdauung der amplifizierten DNA (siehe unter 2.) bereits jetzt mit den Proben des vorangegangenen Kurstags ansetzen. Aus Zeitgründen kann damit nicht bis zur Beendigung der PCR gewartet werden. 1.6 Nach Beendigung der PCR je 10 µl in ein A20 bzw. B20 beschriftetes Eppendorf-Röhrchen pipettieren (=unverdaute Probe nach 20 PCR-Zyklen) und für die Elektrophorese beiseite stellen (Deckel beschriften). Den Rest der amplifizierten Proben A und B den Assistierenden abgeben; auf keinen Fall wegwerfen! Verdauung der amplifizierten DNA mit Restriktionsendonuclease: Die Proben A und B (Röhrchen AR und BR) für die Verdauung mit Restriktionsenzym werden vom Assistierenden ausgeteilt. 2.1 Zu AR und BR je 10 µl Restriktionsenzym-Lösung R1 geben. Röhrchen dicht verschliessen, gut mischen (Vortex-chüttler) und für Min ins 37 0 C Wasserbad stellen. 2.2 Nach der Verdauung 2 µl Ladepuffer zugeben. 3. Agarose-Gel-Elektrophorese: (ein Agarose-Gel pro Gruppe!) Die Proben dieses Experiments werden zusammen mit Proben von Exp. 8.8 auf demselben Gel aufgetrennt! 3.1 Elektrophoreseapparatur mit 600 ml Elektrophoresepuffer füllen, sodass das Gel vollständig mit Puffer bedeckt ist. 3.2 Die Proben vor (A0,B0; siehe oben, 1.3) und nach 20 PCR-Zyklen (A20,B20; siehe oben, 1.6) sowie die amplifizierten und mit Restriktionsenzym verdauten Proben (AR, BR; siehe oben, 2.3) werden elektrophoretisch aufgetrennt und miteinander verglichen. Zu den Proben A0, B0, A20, B20 je 10 µl Wasser und 2 µl Ladepuffer pipettieren. Alle Röhrchen verschliessen, auf dem Vortex-chüttler gut mischen und zusammen mit den Röhrchen AR und BR (diese Proben vom Vortag enthalten bereits 2 µl Ladepuffer) vor dem Auftragen auf das Agarose-Gel ca. 30 ekunden zentrifugieren. Deckel der Eppendorf-Röhrchen vorsichtig öffnen ohne die Proben aufzuwirbeln. 3.3 Durch den glycerolhaltigen Ladepuffer sind die Proben deutlich schwerer als Wasser und können vorsichtig in die Ladeschlitze des mit Pufferlösung überschichteten Agarose-Gels pipettiert werden. Pro Ladeschlitz wird je 10 µl Probe in der Reihenfolge A0, B0, A20, B20, AR, BR aufgetragen (Anleitung durch Assistierende). Die ersten 2 Ladeschlitze frei lassen! 3.4 Proben 1-4 von Exp. 8.8 (sollten bereits 5 µl Ladepuffer enthalten; siehe Exp. 8.8) werden vor dem Auftragen kurz zentrifugiert. Anschliessend an die bereits aufgetragenen Proben zwei Ladeschlitze frei lassen und vorsichtig je 10 µl der Proben 1-4 wie oben auftragen.

8 3.5 chutzdeckel auf Elektrophoreseapparatur aufsetzen und Kabel vom pannungsgerät anschliessen. Auf Polung achten (Wanderung in Richtung Anode). Die Elektrophorese wird bei 80 Volt für 25 Minuten durchgeführt (Falls die Elektrophorese länger durchgeführt wird, sind die DNA-Banden schlecht nachweisbar, da Ethidium gegenläufig aus dem Gel wandert). 3.6 Zur Auswertung wird das Agarose-Gel jeder Gruppe von den Co-Assistierenden photographiert. 98 Beurteilen, ob die Probanden-DNA die gesuchte Mutation aufweisen. ind die zwei untersuchten Individuen bezüglich dieser telle im Genom homo- oder heterozygot, gesund oder krank? Amplifizierten DNA-Doppelstrang mit den eingebauten Oligonucleotiden (Primer) und die beiden Möglichkeiten der ungefähren Position der Mutation schematisch aufzeichnen. Wie könnte man zwischen diesen beiden Möglichkeiten unterscheiden? Berechnen, wieviel Prozent der Bevölkerung Träger einer krankmachenden Mutation sind, wenn von 2'500 Neugeborenen durchschnittlich 1 Kind an Mukoviszidose erkrankt? EXPERIMENT 8.10: Denaturierung von DNA durch Hitze und Lauge Prinzip: Die Denaturierung der DNA, d.h. der Übergang der geordneten doppelhelicalen ekundärstruktur in "ungeordnete" Einzelstränge nach Lösen der Wasserstoffbrücken zwischen den gepaarten Basen, ist ein von physikalisch-chemischen Änderungen (Viskosität, optische Drehung, Extinktionskoeffizient usw.) begleiteter Phasenübergang, der sich mit dem chmelzvorgang kristalliner ubstanzen vergleichen lässt. Wärme, extrem basische oder saure ph-werte bewirken (wie bei Proteinen) eine Denaturierung der DNA. Die Hitzedenaturierung ist ein kooperatives und reversibles Phänomen, wobei die DNA gelöst bleibt. Eine stetige Erhöhung der Temperatur einer DNA-Lösung führt im UV- pektrum bei 260 nm zu einem messbaren Anstieg der Extinktion (Hyperchromieeffekt). Die Temperatur, welche der Hälfte des maximalen Extinktionsanstieges entspricht, wird als T m -Wert bezeichnet (temperature of "melting"). Der T m -Wert ist keine feste Grösse; er hängt von folgenden Faktoren ab: ph-wert, Ionenstärke, Bruttobasenzusammensetzung (Anteil von G + C), Grösse der DNA etc. Im folgenden Experiment wird die Extinktion einer DNA-Lösung vor und nach Denaturierung durch Hitze oder NaOH gemessen.

9 99 Lösungen: 1) DNA in Na-Phosphatpuffer (10 mm) ph 7.2, 1 mm EDTA. 2) NaOH 1 M Ausführung: In ein Glasröhrchen mit chliffdeckel 3 ml DNA-Lösung geben. Das Röhrchen dicht verschliessen, für 10 Minuten ins 95 0 C-Wasserbad stellen, anschliessend in einem mit raumtemperiertem Wasser gefüllten Becher stellen und 3-5 Minuten abkühlen lassen.. In der Zwischenzeit 3 RG numerieren und mit folgenden Volumina (ml) beschicken: I (nativ) II (95 0 C) III (NaOH) DNA-Lösung (1) 2-2 Hitzedenaturierte DNA-Lösung Wasser NaOH 1 M E 260 nm Proben gut mischen, die Extinktion bei 260 nm im Photometer gegen Wasser ablesen und in die Tabelle eintragen. Der Extinktionskoeffizient für Doppelstrang-DNA beträgt 0.02 (µg/ml) -1 cm -1. Berechne die Konzentration der DNA-Lösung und den Extinktionskoeffizienten für Einzelstrang-DNA. Bei stehen lassen bei Raumtemperatur nimmt die Extinktion im Ansatz II ab. Erklärung?

10 99 A Anhang zu Platz 8 Klinisch relevante Fragen für Interessierte (nicht Prüfungsstoff) zu Exp. 8.7 Antibiotikaresistenz von Bakterien (. 91): Wieso sind mehr und mehr Bakterien resistent gegen Antibiotika, vor allem Keime, welche Infektionen verursachen? Können in der Landwirtschaft eingesetzte Antibiotika und in die Umwelt abgegebene Antibiotika ein Gefährdung für den Mensch darstellen? Antwort in: Vom egen zum Alptraum, M. Teuber, Unimagazin 1/02, 31-34, 2001 ( > Platz 8, Anhang zu Exp. 8.7: Unimag02-Antibiotika.pdf) Antibiotikumresistente Bakteriem: eine neue Dimension in der Lebensmittelmikrobiologie ( Medical consequences of antibiotic use in agriculture, Witte, W., cience 279, (1998), ( > Recherche ----> Zeitschriften (freier Zugang zu Online-Zeitschriften von öffentlich zugänglichen Computern an der Universität) Resistenz gegen Antibiotika und andere antiinfektiöse ubstanzen - eine weltweit wachsende Bedrohung? Kann die Pharmaindustrie rechtzeitig neue Antibiotika zur Anwendung bringen? Antwort in: (freier Zugang von Uni- Computern) Wie werden Bakterien resistent gegen Antibiotika? Antwort in: The challenge of antibiotic resistance, Levy,. B., cientific American (International Edition) 278, 46-53, 1998 ( freier Zugang von Uni-Computern) Tuberkulose erneut im Vormarsch - Ist eine Behandlung in Zukunft noch möglich? Antwort in: Evolution of drug-resistant tuberculosis: a tale of two species; M. D. Iseman, Proceedings of the National Academy of ciences of the United tates of America 91, (1994)

11 100 PLATZ 9: ENZYMKINETIK, ENZYMIMMUNTET EINE HORMON Die Messung der Enzymaktivität, wie sie im Experiment 1.6 und 1.8 vorgenommen wird, liefert Information über die Geschwindigkeit einer Enzymreaktion unter standardisierten, optimalen Bedingungen mit ubstrat in sättigender Konzentration. Einen besseren Einblick in den Mechanismus einer Enzymreaktion gewinnt man aus der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v von der ubstratkonzentration [] (Exp. 9.1), vom ph-wert (Exp. 9.2), von Temperatur, Ionenstärke usw. Unsere heutigen Kenntnisse über den Reaktionsmechanismus von Enzymen (vgl. Chymotrypsin, Exp. 10.1) basieren auf solchen kinetischen Untersuchungen und auf Daten über die truktur der Enzyme (Aminosäurensequenz und Kristallstruktur-Aanalyse). Die hier untersuchten Phosphatasen zeigen geringe ubstratspezifität. Ihre natürlichen ubstrate sind Phosphatester wie AMP, Zuckerphosphate usw. Für kinetische Untersuchungen eignen sich auch künstliche ubstrate, so der hier verwendete synthetische p-nitrophenylphosphatester. Das bei der Hydrolyse dieses Esters freiwerdende p-nitrophenol kann im alkalischen ph-bereich als gelbes p- Nitrophenolat-Anion bei 405 nm photometrisch bestimmt werden. aure Phosphatasen kommen in Leukozyten, in der Prostata und in Osteoklasten vor. Alkalische Phosphatasen findet man im Darm, in der Leber, in Nierentubulus-Zellen und in Osteoblasten. Beim Mensch sind mehrere Isoenzyme der alkalischen Phosphatase als auch der sauren Phosphatase bekannt. Die Isoenzyme kommen teilweise in unterschiedlichen Zellen vor. Einige der Isoenzyme können getrennt nachgewiesen werden. Aktivitätsmessung dieser Enzyme im Blut hat eine grosse diagnostische Bedeutung und gehört zu den häufig durchgeführten Laboruntersuchungen in der Medizin. Immunologische Bestimmungsmethoden werden zum Nachweis von toffen verwendet, die nur in sehr geringen Mengen in biologischem Material vorkommen (z.b. Hormone). Radioimmunoassay und Enzymimmunoassay sind ebenfalls zu Routineverfahren im biochemischen und klinischchemischen Labor geworden. Als Beispiel für einen Enzymimmunoassay wird in Exp. 9.5 die Thyroxinkonzentration im erum "in silico" bestimmt. Theoretische Grundlagen: Enzymreaktionen Photometrie. 31 Immunologische Bestimmungsmethoden (. 56) Bezug zu anderen Plätzen: Aktivität und ubstratspezifität von Alkoholdehydrogenase, Exp. 1.7 Aktivität von Kreatinkinase, Exp. 1.8 Titrationskurven von Aminosäuren, Exp. 2.2

12 101 EXPERIMENT 9.1: Bestimmung von K m und V max der sauren Phosphatase Prinzip: Für die Bestimmung von K m und V max wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen ubstratkonzentrationen gemessen. Temperatur, ph und Enzymkonzentration werden konstant gehalten. Die ubstratkonzentration wählt man gewöhnlich zwischen dem 0.1-fachen und 10-fachen des mutmasslichen K m -Wertes. Die in diesem Versuch verwendeten Konzentrationen sind so gewählt, dass ihre reziproken Werte in der 1/v gegen 1/[]-Darstellung vernünftig verteilt sind. Lösungen: Na-Acetatpuffer (0.2 M), ph 5.0; saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml); p-nitrophenylphosphat (30 mm); p-nitrophenylphosphat (3 mm); p-nitrophenylphosphat (0.5 mm); NaOH (0.25 M). Ausführung: Folgende Inkubationsansätze vorbereiten: A B C D E F G H I Puffer ml ubstrat, 30 mm ml ubstrat, 3 mm ml ubstrat, 0.5 mm ml Wasser ml RG A bis I mischen und ins 37EC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml des Enzyms ebenfalls ins 37EC-Wasserbad stellen. Nach 5 min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml des vorgewärmten Enzyms zu den Proben A - I geben. Nach 15 min bei 37EC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym zu Probe A) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5- minütigen Abständen zu den Proben A - I geben. Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (Blindwert) ablesen und Werte in untenstehende Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P], in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml). Der Extinktionskoeffizient des p-nitrophenolat-anions, ε 405, beträgt 18.4 mm -1 cm -1. Unter Annahme, dass die Reaktionsgeschwindigkeit v während der 15-minütigen Inkubationsdauer konstant geblieben ist, Werte für den Umsatz pro Minute (= v) und reziproke Werte (l/v) berechnen.

13 102 Probe [] (mm) 1/[] (mm -1 ) E 405 [P] (mm) v (mm min -1 ) 1/v (mm -1 min) A *) *) *) B C 1 1 D E F G H *) Es steht eine Auswertungsvorlage zu Exp. 9.1 im Bipweb zur Verfügung. Werte berechnen und in der Tabelle festhalten, falls Ihnen kein Zugang zu Bipweb möglich ist! Resultate in die Auswertungsvorlage Exp.9.1 im Bipweb eingeben. Aus der Darstellung 1/v gegen 1/[] wird V max und K m bestimmt (bzw. falls nicht möglich, manuell 1/v gegen 1/[] auf Millimeterpapier auftragen und daraus V max und K m bestimmen; Theorie.38). Das in der Auswertungsvorlage verwendete Programm kann auch die den Messwerten am besten angepasste Michaelis-Menten-Kurve berechnen (Hyperbolische Anpassung). Die mit den beiden Methoden bestimmten Werte für V max und K m miteinander vergleichen. Die molekulare Aktivität (min -l ) des Enzyms bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen. Wie gross ist die Dissoziationskonstante K d des Enzymsubstrat-Komplexes im Vergleich zu K m (siehe Theorieteil)? EXPERIMENT 9.2 ph-abhängigkeit der sauren und alkalischen Phosphatase Prinzip: aure und alkalische Phosphatasen katalysieren beide die hydrolytische paltung von Phosphatestern, unterscheiden sich aber durch ihr ph-optimum und den Mechanismus der paltung. Im folgenden Experiment wird die ph-abhängigkeit der durch die beiden Enzyme katalysierten Hydrolyse von p-nitrophenylphosphat verglichen. Der Phosphatester wird bei verschiedenen ph-werten mit saurer bzw. alkalischer Phosphatase inkubiert. Die Reaktion wird am Ende der Inkubationszeit durch Zugabe von NaOH abgebrochen. Die enzymatische Aktivität wird durch photometrische Bestimmung des freigesetzten p-nitrophenols ermittelt. Lösungen: - aure Phosphatase (aus Kartoffeln, 30 µg/ml); alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm, 0.02 mg/ml); ubstrat = p-nitrophenylphosphat (10 mm); NaOH, 0.25 M.

14 - Pufferlösungen (0.1 M): ph 2, HCl-Glycin; ph 4 und ph 5, Essigsäure-Natriumacetat; ph 6, HCl- Histidin; ph 8, HCl-Tris; ph 10, Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat; ph 12, Arginin-KOH. 103 Ausführung: 3 Reihen von je 6 RG für saure Phosphatase (A), alkalische Phosphatase (B) und Blindwert (C) vorbereiten und nach folgendem chema beschriften: ph 2 ph 4 ph 5 ph 6 ph 8 ph 10 ph 12 Reihe A Reihe B (saure Phosphatase) (alkalische Phosphatase) Reihe C (Blindwert) In jedes RG 0.2 ml ubstrat pipettieren. Nach obenstehendem chema je 0.2 ml der entsprechenden Pufferlösung zugeben. Alle Röhrchen zum Vorwärmen ins 40EC-Wasserbad stellen. Daneben in 3 entsprechend markierten Röhrchen 2 ml saure Phosphatase, 2 ml alkalische Phosphatase sowie 2 ml bidestilliertes Wasser (für Blindwerte) ebenfalls vorwärmen. Nach 5 Minuten der Reihe nach in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml vorgewärmte saure Phosphatase zu den Proben der Reihe A geben. Anfangszeit registrieren. In gleicher Weise in 0.5-minütigen Abständen zu den Proben der Reihe B je 0.2 ml vorgewärmte alkalische Phosphatase und zu den Proben der Reihe C (Blindwerte) je 0.2 ml vorgewärmtes Wasser zugeben. Jede Probe genau 15 Minuten ins 40EC-Wasserbad stellen. Reaktion durch Zugabe von 3.4 ml NaOH (automatische Pipette) zu jedem RG in der gleichen Reihenfolge wie oben in genau 0.5-minütigen Abständen abbrechen. Extinktionen aller Proben von Reihe A und B gegen C als Blindwert bei 405 nm ablesen, in Tabelle festhalten und in die Auswertungsvorlage im Bipweb eingeben( bzw. auf Millimeterpapier graphisch darstellen, falls Zugang zu Bipweb nicht verfügbar ist). Die experimentell erhaltene Kurve hat eine Form, die an zwei äure-basen-titrationskurven von Aminosäureseitenketten erinnert (vgl. Exp. 2.2). Man kann deshalb aus der ph-abhängigkeit der Enzymaktivität Rückschlüsse ziehen auf funktionelle Aminosäureseitenketten, die für die Enzymaktivität notwendig sind. Welche eitenketten könnten für die ph-optima der beiden Phosphatasen verantwortlich sein? Welche Ladung tragen diese eitenketten im aktiven Enzymmolekül?

15 104 EXPERIMENT 9.5: Enzymimmuntest zur Thyroxin-Bestimmung im erum (in silico) Prinzip: Thyroxin im erum wird mittels eines Enzymimmunoassays vom Typ ELIA (Enzyme-Linked- Immuno-orbent-Assay) bestimmt. Der Antikörper (AK) ist kovalent an die Innenwand von Plastikröhrchen (coated tubes) gebunden. Freies und gebundenes Antigen (AG) können somit einfach voneinander getrennt werden. Durch Ausgiessen oder Absaugen der Flüssigkeit werden die freien Antigenmoleküle entfernt, während die an die Röhrchenwandung gebundenen Antigen-Antikörper- Komplexe zurückbleiben. Gemäss dem Massenwirkungsgesetz stellt sich folgendes Gleichgewicht ein: Die enzymmarkierten Antigenmoleküle (AG* = T4-Enzym), die in konstanter Konzentration vorliegen, konkurrieren mit den zu bestimmenden unmarkierten Antigenmolekülen (AG = T4) um die in konstanter Menge vorliegenden Bindungsstellen des Antikörpers. Die Menge des unmarkierten Antigens bestimmt, wieviel enzymmarkiertes Antigen gebunden wird. Je mehr unmarkiertes Antigen in der untersuchten Probe vorhanden ist, desto weniger enzymmarkiertes Antigen kann gebunden werden. Das bei diesem Test zur Markierung des Antigens verwendete Enzym ist eine Peroxidase (POD) ähnlicher Art, wie sie bei der Glucose-Bestimmung (Exp. 1.3) verwendet wird. Der immunologischen Reaktion folgt eine Indikatorreaktion, mit der die gebundene Enzymaktivität erfasst wird. Dabei wird die Peroxidase-Aktivität im wandfixierten Enzym-Antigen-Antikörperkomplex (AG*-AK-Komplex) nach Zugabe der ubstrate (Wasserstoffperoxid und Chromogen) photometrisch bestimmt.

16 Der bisher verwendete T4-ELIA der Firma Boehringer Mannhein wird leider nur noch für ein vollautomatisch arbeitendes Analysegerät hergestellt. Ein Ersatz-ELIA steht nicht zur Verfügung. Der T4-Immuntest wird deshalb mit einer Animation im Bipweb in silico, d.h. virtuell, dargestellt (siehe Bipweb, Exp. 9.5). Der Tests wird "in silico" durchgeführt (Auswertung von Versuchsergebnissen, wie in Exp. 10.3!). Im virtuellen Test werden die selben Arbeitsschritte durchgeführt und die gleichen Materialien eingesetzt wie im realen Testverfahren. Material/Reagenzien: - Plastikröhrchen mit Thyroxin-Antikörpern (aus Kaninchen) beschichtet (coated tubes) - Inkubationslösung (Thyroxin-POD-Konjugat in Pufferlösung, ph 8.6) - ubstratlösung (H 2 O 2 und Chromogen in Pufferlösung, ph 5.0) - tandard- und Probenlösungen Die Konzentration der tandardlösungen ist auf den Originalfläschchen angegeben. ie ist je nach Lieferung der Vertreiberfirma etwas verschieden. a: 0 µg/dl b: 3-4 µg/dl c: 7-8 µg/dl d: µg/dl e: µg/dl 105 Ausführung:

17 Pipettieren tandard Probe tandardlösung a 0.02 ml tandardlösung b 0.02 ml tandardlösung c 0.02 ml tandardlösung d 0.02 ml tandardlösung e 0.02 ml Patientenprobe 0.02 ml Inkubationslösung 1a 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Bei rascher Zugabe der Inkubationslösung zu den Röhrchen erfolgt ausreichende Vermischung mit dem Probematerial. 2. Inkubieren 30 min bei Raumtemperatur. 3. Aussaugen des Röhrcheninhalts (Pasteurpipette an Wasserstrahlpumpe verwenden). 4. Waschen des Röhrchens mit Leitungswasser aus der pritzflasche: bis zum Rand füllen und ca. 10 min stehen lassen, aussaugen (Pasteurpipette an Wasserstrahlpumpe verwenden). 5. Pipettieren von 1 ml ubstratlösung in konstanten Zeitintervallen (30 s) in die 6 Röhrchen, anschliessend mit Parafilm verschliessen. Mischen durch Kippen der Röhrchen. Nicht schütteln, wegen chaumbildung! 6. Exakt 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. 7. Pipettieren von 0.1 ml toppreagens in gleichen Zeitintervallen (30 ekunden) wie ubstratlösung, sofort mischen durch Kippen der Röhrchen. Messung: Photometer bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen Luft auf Null abgleichen. Inhalt der Teströhrchen vor der Messung durch Kippen gut mischen. Extinktionsbestimmung der tandards a-e sowie der Probe (Werte in umstehende Tabelle eintragen).

18 107 Auswertung: Graphische Ermittlung einer Eichkurve durch Auftragen der gemessenen tandard-extinktionen (E a-e ) gegen die entsprechenden tandard-konzentrationen (a-e): x-achse = Konzentration y-achse = Extinktion Probenkonzentration aus der experimentell ermittelten Eichkurve ablesen. Umrechnungsfaktor: µg/dl x = nmol/l Konzentration µg/dl Extinktion 405 nm a b c d e Probe Pat.1... Probe Pat.2... Wie kann gezeigt werden, dass die AG-AK-Bindung reversibel ist? Worin unterscheidet sich der Enzymimmuntest vom Radioimmuntest?

19 108 PLATZ 10: WIRKUNGMECHANIMU UND PEZIFITÄT VON ENZYMEN Reaktionsmechanismus von Chymotrypsin: Chymotrypsin ist eine Protease, die unter der Einwirkung von Trypsin aus der im exokrinen Pankreas synthetisierten Vorstufe Chymotrypsinogen entsteht. Chymotrypsin hat eine Molekularmasse um 25'000; die equenz der 241 Aminosäuren und die räumliche truktur des Enzyms sind bekannt. Der molekulare Wirkungsmechanismus von Chymotrypsin ist im Detail untersucht worden. Chymotrypsin gehört mit Trypsin, Elastase, Thrombin etc. zu den sogenannten erinproteasen. Diese sind gekennzeichnet durch einen reaktiven erinrest an der aktiven telle, dessen Hydroxygruppe während des katalytischen Vorgangs vorübergehend eine Esterbindung (= Acylenzymbindung) mit der bei der Hydrolyse des ubstrats freiwerdenden Carboxylgruppe eingeht. In der Aminosäurensequenz von Chymotrypsin ist dieser erinrest in Position 195. Ein hypothetisches chema der Hydrolyse eines Peptidsubstrats ist auf der nächsten eite wiedergegeben. Der im katalytischen Vorgang sich abspielende Zyklus von Acylierung und Deacylierung der erinhydroxygruppe lässt sich durch Verschiebung von Ladungen zwischen er-195 und den räumlich benachbarten His-57 und Asp-102 erklären. In Exp und 10.2 wird gezeigt, dass Chymotrypsin mit dem ubstratmolekül eine kovalente Bindung eingeht. Messung der Radioaktivität: Die experimentell in "counts per minute" (cpm) gemessene Radioaktivität ist immer kleiner als die effektive Zahl der Zerfallsakte "disintegrations per minute" (dpm) des in der Probe enthaltenen Radioisotops. Um aus den cpm-werten die dpm-werte zu erhalten, muss die Zählausbeute unter den herrschenden Versuchsbedingungen gemessen werden (Exp. 10.4). Die dpm-werte werden benötigt, um mit Hilfe der spezifischen Radioaktivität (dpm/mol, bzw. Becquerel/Mol) die Konzentration einer radioaktiven ubstanz zu berechnen. Eine solche Berechnung wird in Exp ausgeführt. ubstratspezifität von Enzymen: Enzyme sind mehr oder weniger substratspezifisch. Extrem hohe pezifität zeigen die an Transkription und Translation von DNA und mrna beteiligten Enzyme. Proteasen weisen sehr unterschiedliche ubstratspezifität auf. Hochspezifisch sind die Proteasen der Blutgerinnung (Thrombin u.a.). Chymotrypsin spaltet vorwiegend nach Trp, Tyr und Phe, Trypsin nach Lys und Arg. Wenig spezifisch spalten dagegen Pepsin und die meisten Exopeptidasen. Die pezifität von Chymotrypsin und Trypsin wird in Exp nachgewiesen. Beide Enzyme hydrolysieren ausser Peptidbindungen auch Esterbindungen zwischen Aminosäuren und Alkoholen, wobei die für Peptide gültige ubstratspezifität gewahrt bleibt. Als ubstrate werden deshalb in Exp synthetische Ester benutzt, deren paltung eine freie Carbonsäure liefert (vgl. Exp. 3.2). Dank der ubstratspezifität von Enzymreaktionen gelingt es häufig, eine ganz bestimmte Verbindung in Gegenwart ähnlicher Verbindungen selektiv nachzuweisen. Als Beispiel wird in Exp. 5.6 die klinisch-chemisch wichtige Analyse von Glucose im Blutserum ausgeführt, ohne dass dazu die Glucose aus dem erum isoliert und gereinigt zu werden braucht.

20 Hypothetischer Mechanismus der Hydrolyse von Peptidbindungen durch Chymotrypsin ))) kovalente Bindung... nicht-kovalente Bindung 109 Anlagerung des Peptidsubstrats (Adsorptionskomplex) Enzymacylierung: Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Acylrest des Peptidsubstrats und der OH-Gruppe von er-195 Dissoziation des abgespaltenen Aminrestes (Produkt I) Anlagerung von Wasser und hydrolytische paltung des Acylenzyms Dissoziation des abgespaltenen Carbonsäurerestes (= Produkt II); Herstellung des tatus quo der aktiven telle

21 110 Theoretische Grundlagen: Radioaktive Isotope ( ) Gelchromatographie (. 30) Bezug zu anderen Plätzen: Aktivität und ubstratspezifität der Alkoholdehydrogenase, Exp. 1.7 Gelchromatographie, Exp Affinitätschromatographie von Trypsin Exp. 5.5 EXPERIMENT 10.1: Acylierung von Chymotrypsin mit p-nitrophenyl-[ 3 H]acetat Prinzip: In diesem Versuch wird die Bildung des Acylzwischenproduktes bei der Reaktion von Chymotrypsin mit dem synthetischen Estersubstrat p-nitrophenyl-[ 3 H]acetat nachgewiesen. Dies ist möglich, weil bei ph 5 diese Zwischenstufe (tufe 2 im chema) gebildet, aber nicht wieder gespalten wird. Der volle katalytische Zyklus findet nicht statt. Der Übergang von tufe 3 zu tufe 5 des chemas erfolgt nur bei neutralem oder schwach alkalischem ph. Bei saurem ph bleibt His-57 protoniert, und H 2 O kann nicht angreifen (tufe 4). Es kommt somit nur zum Umsatz einer mit dem Enzym äquimolaren Menge von Ester, d.h. pro Mol Acylenzym wird 1 Mol p-nitrophenol (= Produkt I) freigesetzt (tufe 3 im chema). Zum Nachweis der Bindung von [ 3 H]Acetat an das Enzym wird die bei ph 5 inkubierte Mischung durch Gelfiltration auf ephadex G-25 nach der molekularen Grösse der Komponenten aufgetrennt. An den aufgefangenen Fraktionen werden Nachweisreaktionen für Protein und p-nitrophenol sowie Radioaktivitätsmessungen ausgeführt. Bei der Ausführung des Versuches müssen die für Arbeiten mit radioaktiven Materialien gültigen Richtlinien befolgt werden (.53). Lösungen: Chymotrypsin (12.5 mg/ml) in Natriumacetat (0.01 M), ph 5.0 p-nitrophenyl-[ 3 H]acetat (19 mm) in Aceton, spezifische Aktivität 4.8 x 10 9 Bq/Mol Elutionspuffer, Natriumacetat (0.01 M), ph 3.5; Tris-HCl (1 M), ph 9 Trichloressigsäure, 50 %; NaOH (l N); zintillationslösung (feuergefährlich). äule: 30 x 0.9 cm, gefüllt mit ephadex G-25, in Elutionspuffer.

22 111 Ausführung (nur unter Anleitung der Assistierenden): 5. Inkubation: Zu 0.1 ml p-nitrophenyl-[ 3 H]acetat in Plastikröhrchen 1.0 ml Chymotrypsinlösung zugeben, mischen und 10 min bei Zimmertemperatur stehenlassen. 2. Gelfiltration: Elutionspuffer an bereitstehender äule bis zum Gel-Niveau mit Pasteurpipette sorgfältig entfernen und Probe auf das Gel auftragen. Pumpe starten und Probe einsickern lassen. obald die Probe vollständig eingesickert ist, zweimal mit etwas Elutionspuffer nachwaschen (Aufschlämmen der ephadexschicht vermeiden), dann äule mit Elutionspuffer auffüllen und Vorratgefäss anschliessen. Fraktionensammler in Gang setzen. Total 30 Fraktionen von etwa 2 ml in nummerierte RG sammeln. Die zwei Fraktionen mit acyliertem Chymotrypsin, welche die meiste Radioaktivität enthalten, werden auch in Exp verwendet. 3. Bestimmung der Radioaktivität: In der Kapelle von jeder Fraktion 0.1 ml in ein Zählfläschchen geben (numeriert 1-30), mit 3 ml zintillationslösung versetzen, schliessen und mischen. Jede Probe während 1 min im zintillationszähler zählen. Probe aus Röhrchen Nr. 1 als Blindwert verwenden. Werte in graphische Darstellung eintragen. Blindwert abziehen. Radioaktivität pro ml (cpm/ml) berechnen. 4. Identifizierung der p-nitrophenol und Protein enthaltenden Fraktionen: Zu 30 beschrifteten RG mit Pasteurpipette ungefähr 0.5 ml NaOH vorlegen und von den Fraktionen 1 bis 30 je 0.3 ml mit jeweils derselben 0.5 ml-glaspipette zugeben und mischen. Den Rest der Fraktionen 1 bis 9 beiseite stellen (wird in Exp benötigt). Gelbfärbung zeigt p-nitrophenolationen an. Relative Farbintensität abschätzen und Werte (0 bis ++++) ebenfalls in graphische Darstellung eintragen. Anschliessend zu jedem RG mit Pasteurpipette ca. 0.5 ml Trichloressigsäure (50 %) zugeben. Ausmass der Fällung von Chymotrypsin abschätzen und Werte (0 bis ++++) für jedes Röhrchen vermerken. 5. Graphische Darstellung des Elutionsprofils: Radioaktivität (cpm/ml) sowie Nitrophenolat- und Proteinkonzentration gegen RG-Nummer auf Millimeterpapier auftragen. Abszisse: RG-Nummer; linke Ordinate: Radioaktivität; rechte Ordinate: relative Intensität von Proteinfällung und p-nitrophenolatfärbung. EXPERIMENT 10.2 Deacylierung des markierten Chymotrypsins Es wird nachgewiesen, dass der vollständige katalytische Zyklus, d.h. die hydrolytische paltung des Acylenzyms, nur bei leicht alkalischem ph-wert stattfindet (siehe unter Prinzip und hypothetischer Mechanismus). Ausserdem wird gezeigt, dass die native truktur des Chymotrypsins dazu notwendig

23 112 ist. Die Hydrolyse ist nicht durch blosses Anheben des ph-wertes bedingt. Die zwei Acylchymotrypsin enthaltenden Fraktionen mit der höchsten Radioaktivität (meistens sind dies Nr. 5 und 6) vereinen. Pasteurpipette verwenden, gut mischen. Davon je 0.8 ml in drei Glasröhrchen A,B,C pipettieren. Mit Glaspipetten zu allen Röhrchen 1 ml Wasser zugeben. Zu Röhrchen B zwei Tropfen DTT mit Pasteurpipette geben (DTT = Dithiothreitol; reduziert Disulfidbrücken im neutralen ph-bereich). Röhrchen B mit Glaskugel bedecken und für 5 Minuten ins 95EC-Wasserbad stellen. Anschliessend 0.25 ml Trispuffer (ph 9) zugeben, Trübung beobachten. Zu den Röhrchen A und C gemäss umstehender Tabelle Wasser bzw. Trispuffer zugeben. Alle Proben 2-3 Minuten stehen lassen und durch Zugabe von 0.15 ml 50 %iger Trichloressigsäure das Chymotrypsin ausfällen. Für 10 Minuten in Eis stellen. Anschliessend Röhrchen A-C für 5 Minuten bei max. Geschwindigkeit in Tischzentrifuge zentrifugieren. Achtung: ein viertes Röhrchen mit 2.2 ml Wasser als Gegengewicht verwenden oder die 3 Röhrchen in der Zentrifuge symmetrisch verteilen! Die Überstände mit Pasteurpipetten vorsichtig in Zählfläschchen pipettieren, 6 ml zintillationslösung zugeben. Fläschchen dicht verschliessen, gut mischen und während 1 Minute im zintillationszähler zählen. Resultate in Tabelle eintragen. A ph 3.5 B Denat. ph 9 C ph 9 Wasser 0.25 ml - - Tris-HCl Puffer ml 0.25 ml 1 M, ph 9 Trichloressigsäure 0.15 ml 0.15 ml 0.15 ml 50 % Überstand... cpm... cpm... cpm EXPERIMENT 10.3: Acylierung von Chymotrypsin, Auswertung von Versuchsergebnissen In einem analog zu Exp durchgeführten Versuch wurde Chymotrypsin mit p-nitrophenylacetat acyliert und das entstandene Acylenzym vom restlichen radioaktiven p-nitrophenylacetat und vom freigesetzten p-nitrophenol durch Gelfiltration abgetrennt. In den aufgefangenen 2 ml-fraktionen wurde der Gehalt an Radioaktivität (cpm/ml) und als Mass der Proteinkonzentration die Extinktion bei 280 nm (E 280 nm, chichtdicke 1 cm) gemessen.

24 Nach Zugabe von 0.5 ml 1 M NaOH zu jeder Fraktion wurde ferner die Extinktion bei 405 nm (E 405 nm, 1 cm ) bestimmt. ie ist ein Mass sowohl für das bei der Acylierungsreaktion freigesetzte p- Nitrophenol wie auch für das nicht umgesetzte p-nitrophenylacetat, da das letztere in Gegenwart der starken Base sofort hydrolytisch gespalten wird. Im basischen Milieu liegt das gelbe p-nitrophenolat- Anion vor, das bei 405 nm ein Extinktinsmaximum (ε 405 nm = 18'400 M -1 cm -1 ) aufweist. 113 Tabelle I: Messergebnisse RG cpm/ml E 280 nm E 405 nm * RG cpm/ml E 280 nm E 405 nm * ** * Bestimmung nach Zugabe von 0.5 ml 1 M NaOH ** E 280,1cm wurde in Röhrchen 14 bis 26 nicht gemessen 1. Graphische Darstellung des Elutionsprofils: Den Gehalt an Radioaktivität (cpm/ml) sowie E 280 nm und E 405 nm gegen RG-Nummer auf Millimeterpapier auftragen. Abszisse: RG-Nummer; linke Ordinate: Radioaktivitätsgehalt; rechte Ordinate: (a) Proteinextinktion, E 280 nm, (b) p-nitrophenolatextinktion, E 405 nm. 2. Molare Konzentration von Acylchymotrypsin: Chymotrypsin hat einen molaren Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 5 x 10 4 M -1 cm -1. Berechnen ie die molare Enzymkonzentration in RG Nr. 6, 7 und 8 und tragen ie das Ergebnis in Tabelle II ein. 3. pezifische Radioaktivität des markierten Chymotrypsins: Tragen ie den für "background" (cpm aus RG 1) korrigierten Radioaktivitätsgehalt von RG Nr. 6, 7 und 8 ebenfalls in Tabelle II ein und berechnen ie die spezifische Radioaktivität des markierten Enzyms in cpm/mmol.

25 Berechnung des Verhältnisses von kovalent gebundenem Acetat zu Enzym: Das verwendete p-nitrophenylacetat hatte eine spezifische Radioaktivität von 2 x 10 6 Bq/mmol. Berechnen ie daraus und aus den gemessenen Werten für spezifische Radioaktivität des markierten Acylchymotrypsins das Verhältnis von Acetat zu Enzym und tragen ie die Ergebnisse ebenfalls in Tabelle II ein. Hinweis: Die spezifische Radioaktivität von p-nitrophenylacetat muss von Bq/mmol in cpm/mmol umgerechnet werden, denn aus dem Experiment erhält man die spezifische Radioaktivität für acyliertes Chymotrypsin in cpm/mmol. Die Zählausbeute betrug 75%, 1 Bq = 1 Zerfall pro ekunde. Tabelle II RG Radioaktivi- Chymotrypsin- pezifische Gebundenes tätsgehalt konzentration Radioaktivität Acetat pro des Acylchymo- Chymotrypsin trypsins cpm/ml M (= mmol/ml) cpm/mol mol/mol Wieviele aktive tellen besitzt Chymotrypsin? Wie könnte gezeigt werden, dass die Acetylgruppe kovalent an er-195 gebunden ist?

26 115 EXPERIMENT 10.4: Zählausbeute für 14 C im Flüssigkeits-zintillationszähler Proben: 367 Bq 14 C-markierte Essigsäure; 73 Bq 14 C-markierte Essigsäure; 367 Bq 14 C-markierte Essigsäure mit Aceton; Blindprobe. Alle Proben sind in 10 ml zintillationsflüssigkeit gelöst. Probe 4 dient zur Messung des "backgrounds". Proben nach folgendem chema zählen und Zählausbeute berechnen. Probe Bq dpm Zähldauer (min) counts cpm cpm-background Zählausbeute % Weshalb zeigt Probe 3 eine geringere Zählausbeute? EXPERIMENT 10.5: ubstratspezifität von Trypsin und Chymotrypsin Prinzip: Die spezifische Hydrolyse von N-Benzoyl-L-argininethylester und N-Benzoyl-L-tyrosinethylester durch die beiden Proteasen wird verfolgt, indem man die entstehenden Carbonsäuren N-Benzoyl- L-arginin und N-Benzoyl-L-tyrosin mit Hilfe eines ph-indikators nachweist. Lösungen: Tris-HCl 4 mm, ph 9.0 N-Benzoyl-L-argininethylester, 8 mm in 50 % Methanol N-Benzoyl-L-tyrosinethylester, 8 mm in 50 % Methanol Phenolrot (sauer: gelb; alkalisch: rot; pk a = 7.7) Protease-Lösung I (20 µg/ml) Protease-Lösung II (20 µg/ml)

27 116 Ausführung: 4 RG vorbereiten und mit folgenden Volumina (ml) beschicken: Lösung A B C D Tris-HCl Argininester Tyrosinester Phenolrot Je 2 Tropfen zugeben und mischen Protease I Protease II Mischen, ins 40E-Wasserbad stellen und Farbänderung beobachten. (Proben müssen am Anfang rötlich gefärbt sein, andernfalls muss der Versuch mit frisch hergestelltem Tris-HCl wiederholt werden.) Farbe nach Ablauf von 5 min feststellen und Ergebnisse in Tabelle eintrag Protease I Protease II Argininester (A)... (C)... Tyrosinester (B)... (D)... Protease I =... Protease II =...

28 117 PLATZ 11: BIOLOGICHE MEMBRANEN, BLUTLIPIDE Mit den beiden Experimenten dieses Platzes werden Lipidkomponenten der Erythrozyten-Zellmembran und des Plasmas untersucht. Theoretische Grundlagen: Lipide (. 16) Biologische Membranen (. 18) Chromatographie ( ) Photometrie (. 31) Bezug zu anderen Plätzen: Löslichkeit der Lipide (Exp. 3.3) Ionentransport durch Erythrozytenmembran (Exp. 12.6, Exp und Physiologie-Praktikum) Enzymatische Bestimmung von Glucose mittels Glucoseoxidase und Peroxidase (Exp. 5.6) Experiment 11.1: Lipidzusammensetzung der Erythrozyten-Zellmembran und der Plasmalipide Lösungen/Material: 1. Pferdeblut, bereits in Plasma und Erythrozyten getrennt. Die EC sind bereits durch dreimaliges Waschen mit isotoner NaCl-Lösung von Plasmaresten befreit worden. 2. Chloroform; Essigsäure 2% in Methanol. 3. Lösungsmittel: Chloroform/Methanol 2:1 (vol/vol) 4. Laufmittel für Dünnschichtchromatographie A: Petrolether/Aethylether/Ameisensäure (60/40/1) Laufmittel für Dünnschichtchromatographie B: Chloroform/Methanol/Wasser: 65/25/4. Die Mischungen sind bereits in verschliessbare Chromatographiegefässe eingefüllt. 5. Gelöste Referenzsubstanzen: (je 2 mg/ml Chloroform/Methanol, 2:1) Phosphatidylcholin=PC, Phosphatidyläthanolamin=PE, phingomyelin=l, Cholesterin=Ch, Cholesterinester(Oleat)=ChE, Triacylglycerin=TG, Ölsäure=F. 6. Jodkristalle in verschlossenem Tank (Jodgas-Atmosphäre) 7. Färbespray (Phosphormolybdänsäure)

29 118 Lipidextraktion: Die gepackten Erythrozyten (EC) und das Plasma werden parallel verarbeitet. Es ist wichtig, dass alle Zugaben und Handhabungen in der angegebenen Reihenfolge erfolgen. Gläschen mit chraubverschluss EC Plasma enthaltend: 1.0 ml 2.0 ml Methanol-2% Essigsäure Gemisch zugeben 3.6 ml 3.6 ml dicht verschliessen und auf Vortex 10 ekunden gut mischen Chloroform zugeben (Gummiballon benützen) 3.6 ml 3.6 ml dicht verschliessen und auf Vortex 10 ekunden schütteln. dest. Wasser zugeben 2.0 ml 1.0 ml dicht verschliessen und auf Vortex mind. 30 ekunden schütteln. Durch dieses Vorgehen werden alle Lipide extrahiert und müssen noch von den im organischen Lösungsmittel unlöslichen ubstanzen abgetrennt werden. Dies geschieht durch Zugabe von Wasser, wobei zwei Flüssigkeitsphasen entstehen, die nicht miteinander mischbar sind. Nur Lipide bleiben in der organischen Phase und lassen sich von Proteinen, die ausfallen und sich in der Grenzschicht zwischen den beiden Flüssigkeitsphasen ansammeln, und von wasserlöslichen ubstanzen abtrennen. Nach Zugabe von destilliertem Wasser mindestens 30 ekunden auf Vortex schütteln. Anschliessend 5 Minuten bei 1800 Umdrehungen/min zentrifugieren (ME Zentrifuge). Die untere, organische Flüssigkeitsphase von EC und Plasma mit Hilfe einer Pasteurpipette abtrennen (Chloroform ist schwerer als Wasser). Für jeden organischen Extrakt eine separate Pasteurpipette benützen! Gummihütchen auf Pasteurpipette aufsetzen, pressen und vorsichtig entlang der Gläschenwandung (leicht schief halten) durch das Material an der Interphase durchstechen, auf den Boden des Gläschens vordringen und die untere Flüssigkeitsphase möglichst vollständig aufsaugen und in ein neues, beschriftetes Gläschen überführen. Das organische Lösungsmittel in der Kapelle im Luftstrom verdampfen lassen (Anleitung durch die Assistierenden). obald die Proben eingedampft sind, in jedes Gläschen 0.5 ml ChloroformMethanol 2:1 geben, mit Deckel verschliessen und auf Vortex schütteln. Lösungsmittel erneut im Luftstrom verdampfen lassen.