Ringversuch Pränataler Schnelltest 2015, Ergebnisse. Sehr geehrte Teilnehmer des Ringversuches Pränataler Schnelltest 2015,

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1 Berufsverband Deutscher Humangenetiker (BVDH) e.v. BVDH e. V. Koordinationsstelle QS c/o Die Tastatur Feldstr Eschweiler/Germany Kommission Qualitätssicherung Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Kunz (Vorsitzender) Prof. Dr. rer. nat. Bernd Eiben Dr. rer. nat. Eveline Fiedler PD Dr. rer. nat. Barbara Fritz Prof. Dr. med. Claudia Haferlach Dr. med. Annelore Junge PD Dr. rer. nat./med. habil. Thomas Liehr Prof. Dr. med. Harald Rieder Dr. rer. nat. Anja Weise Koordinationsstelle Qualitätssicherung 15, Ergebnisse Sehr geehrte Teilnehmer des Ringversuches Pränataler Schnelltest 15, wir bedanken uns bei allen Teilnehmern für den großen Zuspruch zu unserem Ringversuch, der zum dritten Mal online auf der Ringversuchsplattform des BVDH stattgefunden hat. Ein besonders herzlicher Dank geht an die Gutachter, Herrn Dr. Gotthold Barbi (Universitätsklinikum Ulm), Frau Dr. Ilona Dietze-Armana (Genetikum, Neu-Ulm), Frau M. sc. biol. Sarah Matos (Institut für klinische Genetik, Bonn), Frau Dipl.-Biol. Barbara Seipel (Bioscientia, Ingelheim) und Frau Dr. Gisela Raabe-Meyer (Praxis für Humangenetik, Hannover), die mit großem Engagement und hoher Sorgfalt die eingegangenen Befunde begutachteten. Am haben wir Material eines Feten aus der 23+3 SSW zur pränatalen Schnelldiagnostik versandt. Die Labore, die einen - Schnelltest durchführen, erhielten eine in Alkohol/Eisessig fixierte Zellsuspension kultivierter Fruchtwasserzellen, Labore mit molekulargenetischer Diagnostik erhielten ein Aliquot von nativen, ebenso kultivierten Fruchtwasserzellen in Pufferlösung. Sonografisch wurden bei dem Feten relativ kurze Extremitäten, eine vertebrale Ventrikulomegalie, ein Hydrothorax links und eine fibrotische rechte Lunge (V. a. Lungensequester/kleincystische CAML) festgestellt. Zudem bestand Verdacht auf einen Zwerchfelldefekt. Die fetale Echokardiografie zeigte einen Reverse Flow im Ductus venosus bei ansonsten normalen fetalen Dopplerprofilen. c/o Die Tastatur Susanne Brandt & Rainer Göbbels GbR Feldstr Eschweiler Tel.: +49 () Fax: +49 () brandt@bvdh.de April 16 RV-Leiterin Pränataler Schnelltest Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Barbara Fritz Zentrum für Humangenetik UKGM Standort Marburg Baldingerstr Marburg Tel.: +49 () barbara.fritz@uk-gm.de Geschäftsstelle Linienstraße Berlin Tel.: +49 () Fax: +49 () info@bvdh.de Bankverbindung Deutsche Apotheker- und Ärztebank eg BLZ Konto IBAN DE BIC DAAEDEDD USt.-IdNr.: DE St.Nr. 27/6/5395 VR 2847 B Amtsgericht Charlottenburg Seite 1 von 7

2 Schreiben vom Seite 2 von 7 Die Karyotypisierung des weiblichen Feten ergab zwei unterschiedliche Strukturveränderungen an einem Chromosom 18 in einer Mosaikkonstellation. In ca. 6 % der analysierten Zellen lag eine Deletion des kurzen Arms von Chromosom 18 vor, in 35 % der analysierten Zellen war ein Isochromosom für den langen Arm von Chromosom 18 nachzuweisen (s. Karyogramme). Zellen mit einem unauffälligen Chromosomensatz fanden sich nicht. Zelllinie 1: Unbalancierte Situation infolge einer Deletion 18p (Pfeil) Monosomie 18p Zelllinie 2: Unbalancierte Situation infolge Isochromosom 18q (Pfeil) partielle Trisomie 18q und partielle Monosomie 18p Aufgabe war es, an dem ausgesandten Material einen Pränatalen Schnelltest gemäß den Routineverfahren vorzunehmen und das Ergebnis in der Form eines Befundbriefs einzureichen. Gleichzeitig sollte das zugehörige Laborprotokoll auf die Ringversuchsplattform des BVDH hochgeladen werden. Zusätzlich bestand die Möglichkeit, zur weiteren Dokumentation zwei Abbildungen hochzuladen. Die Bewertung erfolgte auf der Basis der übersandten Befunde. Es konnten maximal 7 Punkte erreicht werden. Mit jeweils einem Punkt wurden der korrekte Karyotyp, die Benennung der unauffälligen Chromosomen, das Geschlecht des Feten, die Bezugnahme zur Indikation, die Empfehlung zur genetischen Beratung, die Bearbeitungszeit (< 8 Tage bis zur Befunderstellung) sowie verwaltungstechnische Daten (Name, Geb.-Datum, Einsender) bewertet. Als korrekter Karyotyp wurden alle unauffälligen Befunde mit weiblicher Gonosomenkonstellation gewertet, da die Aberration durch die eingesetzten Sonden/Systeme nicht sicher erkannt werden konnte, sowie die Befunde, die einen Hinweis auf eine Strukturveränderung von Chromosom 18 erhielten. An diesem Ringversuch haben insgesamt 69 Labore teilgenommen, davon vier Labore aus der Schweiz, ein Labor aus Österreich. Erstmalig erfolgte der Versand aller Proben über einen Kurierdienst, so dass mehr als 9 % der Labore die Probe am nächsten Tag erhielten. Die Versanddauer konnte besonders für die ausländischen Labore verkürzt werden. Zwei Labore dokumentierten den Eingang der Probe am zweiten Tag nach Versand und weitere drei Labore nach 7 Tagen. Für diesen verzögerten Eingang war aber offensichtlich nicht der weitere Weg ins Ausland verantwortlich, da unter diesen Teilnehmern sich zwei deutsche Labore befanden. Wir würden daher bitten, gerade

3 Teilnehmer in % Schreiben vom Seite 3 von 7 im Falle eines deutlich verzögerten Eingangsdatums die internen Postwege und die in der Datenbank angegebene (Liefer-)Adresse zu kontrollieren. 8, 7, 6, 5, 4, 3,, 1,, Abb. 1: Bearbeitungsdauer STR Tage 1 Tag 2 Tage3 Tage 5 Tage Abb. 2: Pränataler Schnelltest verwendete Verfahren PCR PCR Etwa 85 % der Befunde wurden innerhalb von zwei Tagen erhoben, zwei Labore reichten die Befunde noch an dem Tag des Probeneingangs ein. Tendenziell wurden die Befunde nach STR- Analyse etwas schneller eingereicht (vgl. Abb. 1). Vergleichbar den Jahren zuvor nutzen ca. 72 % der Labore die -Analyse, 22 % STR- Diagnostik und 6 % der Labore sowohl - als auch STR-Analysen (Abb. 2). Für die Analysen wurden überwiegend Sonden der Firma Abbott und Metasystems verwendet (Abb. 3). Mehrheitlich wurde Chromosom 18 mit der Zentromersonde D18Z1 untersucht, nur % verwendeten die locusspezifische Sonde MALT 1 in 18q21. Für die STR-Analyse wurden überwiegend (47 %) Inhouse-Testsysteme verwendet (Abb. 4) Abb. 3: Verwendete -Sonden Vergleich RV 13 bis RV (n = 55) 14 (n = 55) 15 (n = 54) Firma Abb. 4: Verwendete STR-Systeme Vergleich RV 13 bis RV (n = 19) 14 (n = ) 15 (n = 19) 65 Teilnehmer beschrieben ein unauffälliges Ergebnis ohne Hinweis auf das Vorliegen einer numerischen Chromosomenstörung der Chromosomen 13, 18 und 21 oder der Gonosomen. Das Geschlecht (XX) wurde von allen Teilnehmern richtig erkannt. Zwei Labore vermuteten eine nicht korrekte pathologische Zelllinie. Bei einem Labor lag ein kontrollbedürftiger Befund für Chromosom 21 vor. Ein Labor beschrieb eine Monosomie 18 im Mosaikzustand. Zwar wurde hier das betroffene

4 Schreiben vom Seite 4 von 7 Chromosom richtig erkannt, dennoch wurde das Ergebnis als nicht korrekt bewertet, da bei Verwendung einer Zentromerprobe für Chromosom 18 dieses nicht nachvollziehbar war. Der Anteil der Zellen mit nur einem Signal lag weit über dem Durchschnitt aller anderen Labore (< 5%). Diese Fehlinterpretationen lassen sich vermutlich auf eine nicht optimale Hybridisierung zurückführen. Da ausnahmslos alle anderen Labore eine gute Hybridisierungsqualität und eine gute Materialqualität für das ausgesandte Material angaben, sollte das Hybridisierungsprotokoll in diesen Fällen überprüft werden. Die Hybridisierungseffizienz wurde von 37 Laboren angegeben und lag für fast alle Labore zwischen > 9 % und 1 % (s. Abb. 5). Wir möchten nochmals darauf hinweisen, dass nach RiLiBäk (s. Tabelle B 5-2 b) für die Interphase- die Hybridisierungseffizienz eine Prüfgröße ist, die dokumentiert werden muss Abb. 5: Hybridisierungseffizienz Zwei Labore beschrieben ein 18p-Syndrom. Bei einem Labor ergab sich im PCR-Schnelltest eine Homozygotie für alle drei Marker vom kurzen Arm von Chromosom 18, dagegen zeigten sich die Marker für den langen Arm heterozygot mit unauffälliger Dosis. Somit konnte eine Deletion des kurzen Arms nicht ausgeschlossen werden. Zur weiteren Abklärung wurde eine mit eine Subtelomersonde für den kurzen Arm von Chromosom 18 durchgeführt, die auf eine Deletion hinwies. Glückwunsch zu dieser hervorragenden Abklärung! Zwei weitere Labore erkannten die Deletion 18p anhand von Metaphasen, die sich in der Zellsuspension befanden. In einem Fall wurde die Monosomie 18p retrospektiv durch Hybridisierung mit einer 18p-Subtelomersonde in den Interphasenzellen bestätigt, in dem anderen Fall wurden diese Mitosen nicht im Befund berücksichtigt, da die Aberration nicht durch die eingesetzten Sonden hätte erkannt werden können. Auch an diese beiden Labore Dank und Anerkennung für den hervorragenden Umgang mit den Zufallsbefunden Abb. 6: Gesamtpunktzahl Vergleich RV 12 bis Punkte Abb. 7: Gesamtpunktzahl nach Methode (n = 5) 4 + STR (n = 4) 3 STR (n = 15) Punkte

5 Anteil der Teilnehmer in % Schreiben vom Seite 5 von 7 Die Höchstpunktzahl von 7 Punkten haben aber erstaunlicherweise nur 5 % der Labore erreicht. Dies ist im Vergleich zum Vorjahr ein deutlicher Rückgang (vgl. Abb. 6 und 7). Am häufigsten führte zu einem Punktabzug, dass nicht Bezug auf die Indikation genommen wurde Abb. 8: Pränataler Schnelltest RV 15 Häufigste Fehler kein Bezug zur Indikation PCR (n=15) (n=5) und PCR (n=4) Gesamt (n = 69) kein Hinweis auf genetische Beratung Formalia Abb. 9: Angebot einer genetischen Beratung STR Nach unserer Meinung ist es unerlässlich, gerade bei einem unauffälligen Befund das Ergebnis im Hinblick auf die Indikation der Untersuchung zu bewerten. Häufiger fehlte auch der Hinweis auf eine Beratung. Immer noch verzichten die Labore, die einen STR-Schnelltest verwenden, prozentual häufiger auf den Hinweis zur genetischen Beratung als die Labore mit -Schnelltest (vgl. Abb. 8). Wir möchten daher an dieser Stelle erneut darauf hinweisen, dass anders als bei sonstigen genetischen Untersuchungen vor und nach einer pränatalen Diagnostik eine genetische Beratung nicht nur nach einem auffälligen Ergebnis angeboten werden muss, sondern unabhängig vom Ergebnis tatsächlich erfolgen sollte. Dieses verpflichtende Angebot sollte auch aus der eigenen Empfehlung zur genetischen Beratung heraus kommen (vgl. Abb. 9). Bei zehn Laboren mit mehr als einem Punkt Abzug traten die oben genannten Kriterien in Kombination auf. Nur vereinzelt traten formale Fehler auf. Die Auswertung der Karyotypformel erwies sich immer noch als komplex. Eine Vielzahl der Formeln war offensichtlich nicht korrekt. Nur etwa 35 % der Labore formulierten entsprechend der aktuellen Nomenklatur korrekte Karyotypformeln, 11 % der teilnehmenden Labore gaben keine Karyotypformeln an. Nach S2LL-Modul für molekularzytogenetische Labordiagnostik (Punkt 8.2.2) ist allerdings der Karyotyp nach einer In-situ-Hybridisierung in der gültigen ISCN-Fassung (derzeit 13) anzugeben. Nur sofern dies nicht praktikabel ist, kann ergänzend eine andere Darstellungsform (z. B. Tabelle) gewählt werden. Hinweise für die Erstellung korrekter Karyotypformeln für pränatalen Schnell- finden sich in der ISCN 13 in Kapitel , S. 111 ff. Grundsätzlich ergibt sich die Möglichkeit zu einer kurzen Schreibweise ohne die Bandenzuordnung, da man diese im Interphasekern nicht überprüfen kann. Diese vereinfachte Schreibweise wendeten 7 % der Labore an, knapp die Hälfte dieser Formeln ist fehlerfrei. 3 % gaben die Karyotypformeln in der ausführlichen Schreibweise mit Beschreibung der chromosomalen Lokalisation der Sonde an. Die Fehlerquote in diesen Formeln war höher (s. Abb. 1). Die meisten Fehler beruhen auf dem Versuch, alle Informationen, wie z. B. Anzahl der untersuchten Zellen, Sonden-Hersteller, in der Karyotypformel abzubilden. Dies

6 Anzahl teilnehmende Labore Schreiben vom Seite 6 von 7 ist in der ISCN so nicht abgebildet und sollte stattdessen in der Beschreibung des Hybridisierungsergebnisses im Befund erfolgen. In den europäischen Ringversuchen (z. B. online EQA von Eurogentest) gelten schwere Fehler in der Karyotypformel, bei denen das technisch richtige Ergebnis fehlerhaft mitgeteilt wurde, als K.o. - Kriterium und führen automatisch zu einer Gesamtbewertung poor performance. Im Sinne des edukativen Charakters des Ringversuches bitten wir Sie daher, Ihre Karyotypformeln sorgfältig zu überprüfen. Anmerkungen und ggfls. Verbesserungsvorschläge bietet die beigefügte Tabelle, wobei sicherlich in einigen Punkten je nach Auslegung der ISCN Diskussionsbedarf besteht Abb. 1: Karyotypformel Karyotyp Formel korrekt 1 Mit wenig Aufwand lassen sich erhebliche Verbesserungen erzielen: Tipps für die korrekte Schreibweise: 1. Reihenfolge der Sonden beachten: zuerst Benennung der Geschlechtschromosomen, dann Autosomen, vgl. ISCN 13, Kap Eckige Klammer in der Karyotypformel [xx] zur Benennung der Anzahl der untersuchten Zellen ist in der ISCN so nicht abgebildet. Wird nur bei konstitutionellen Mosaiken (ISCN 13, Kap. 4.1, S. 4) oder in der Tumorzytogenetik zur Spezifizierung von Klonen (ISCN 13, Kap. 11, S. 89 und Kapitel , S. 112) verwendet. 3. Auf die gemeinsame Hybridisierung der Sonden achten (s. ISCN 13, Kap , S. 112). 4. Die Begriffe cen, cep, LSI, XA sind in der ISCN nicht abgebildet. Die entsprechenden Loci sind zu nennen (ISCN 13, Kap , S 112). 5. DYZ3x" bei weiblicher Gonosomenkonstellation ist überflüssig. Nach ISCN wird damit nicht der Verlust oder die Darstellbarkeit eines ganzen Chromosoms in der Interphase umschrieben. 6. Die Karyotypformeln können wesentlich vereinfacht werden, wenn man bei den Contig-Sonden nur einen Locus benennt. Dies ist möglich, wenn die Zusammensetzung des Contigs im Befund beschrieben ist (vgl. ISCN 13, Kap. 13.3, S. 112). 7. Bei Formulierung eines Mosaik-Karyotyps die methodischen Grenzen beachten.

7 Schreiben vom Seite 7 von 7 Fazit: Dieser Fall zeigte sehr deutlich die Grenzen des Pränatalen Schnelltests auf. Wir hatten erwartet, dass mit der locusspezifischen Sonde 18q21 sowie mit den molekularen Verfahren die Mosaiktrisomie 18q sich eventuell nachweisen lässt. Alle in der molekularen Diagnostik verwendeteten Systeme (s. Abb. 4) deckten den langen Arm von Chromosom 18 mit mindestens vier unterschiedlichen Markern ab. Aber vermutlich lag der Anteil der Zellen mit Isochromosom 18q unterhalb des Grenzwertes. In unseren Testhybridisierungen vor Aussendung hatte der Anteil noch ca. 1 % betragen (ursprünglich waren es 3 %). Der Verlust der Zelllinie mit i(18q) dürfte sich durch einen Proliferationsnachteil erklären und ist vermutlich auf die für den Ringversuch erforderliche starke Expansion der Zellen zurückzuführen. Dass die Monosomie 18p nicht mit den molekularen Verfahren erfasst wurde, liegt daran, dass dieser Chromosomenbereich überwiegend nur mit einem Marker abgedeckt ist. Alle 18p-Marker waren homozygot, aber Hinweise auf Monosomie 18p kamen von Laboren, die zwei oder drei homozygote Marker detektierten. Zusammenfassend kann man sagen, dass der Pränatale Schnelltest sich insgesamt auf einem hohen Niveau befindet. Weitere Schritte für eine konsequente Verbesserung der Befundqualität sehen wir vornehmlich im Bereich der Befundstruktur. Vielleicht ergibt sich in Köln (BVDH Qualitätsworkshop am ) die Gelegenheit, einige Kriterien hierfür zu entwickeln. Auf der Ringversuchsplattform finden Sie die Ergebnistabelle, in der Sie unter Ihrer Fall-ID Ihre Ergebnisse einsehen können. Um Ihre Fall-ID zu finden, gehen Sie bitte nach dem Login auf Ringversuche abgeschlossen. In der erscheinenden Tabelle finden Sie eine Spalte Fall-ID ; im Kreuzungspunkt dieser Spalte mit der Zeile 15 Pränataler Schnelltest steht die Fall-ID Ihrer Teilnahme für diesen RV. Eine Anmerkung noch zum Schluss: Aufgrund Ihrer Rückmeldungen und unserer bisherigen Erfahrungen werden wir die Eingabemasken in der Datenbank benutzerfreundlicher gestalten und den unterschiedlichen Anforderungen für - bzw. STR-Analysen anpassen. Die Ringversuchsleitung wird ab dem RV 16 Frau M. sc. Sarah Matos, Institut für Klinische Genetik in Bonn, übernehmen. Ich bedanke mich für Ihr Vertrauen und für Ihre Geduld, die verspätete Auswertung bitte ich erneut zu entschuldigen! Abschließend möchten wir Ihnen an dieser Stelle für Ihre freundliche Teilnahme vielmals danken. Schon jetzt dürfen wir Sie herzlich einladen, sich als Interessierte für die nächste Auswertungskommission zu melden. Es bedarf zwar einiger Zeit, aber die Begutachtung ist immer interessant und fachlich lohnend! Für Anregungen und Kritik sind wir immer offen! Für Rückfragen stehen Frau Brandt und ich Ihnen gern zur Verfügung. Mit freundlichen Grüßen PD Dr. Barbara Fritz Ringversuchsleiterin Susanne Brandt Koordinationsstelle