Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum

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1 Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum Ao. Univ. Prof. Dr. Georg Weitzer Georg Weitzer, Ernst Müllner, Erwin Ivessa Department für Medizinische Biochemie Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Medizinische Universität Wien, Jan 2017 Informationen zur Lehrveranstaltung: Praktikumsskriptum: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle (Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.) Literatur dazu: Zellbiologie, Bruce Alberts, Wiley - Verlag Chemie ergänzend z.b. Chemie erleben (Abschnitt Analytische Chemie ), Facultas - UniversitätsTaschenbuch Verlag, Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 1

2 Biochemisches Praktikum / Seminar Das BIOCHEMIE PRAKTIKUM / SEMINAR besteht aus einem Seminaranteil und dem eigentlichen Praktikum. Lerngrundlage ist das Praktikumsskriptum. 2 Praktika zu je 4 akad. Stunden, 3 Seminare zu je 2 akad. Stunden Benötigte Materialien: 1. Arbeitsheft für Seminare und Praktikums-Protokolle, Anwesenheitsblatt eingelebt. Der Besuch der Veranstaltungen wird darin durch den jeweiligen Gruppenleiter bestätigt. 2. Arbeitsmantel Biochemisches Praktikum / Seminar SEMINAR 1: Notwendige Voraussetzungen, Allgemeines Verhalten im Labor. Verfassen des Protokolls. Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags. Hinwies auf Fehlerquellen, zufällige und systematische Fehler und Streuung; Vergabe der Referat Themen. PRAKTIKUM 1: Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren; Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen; Gelfiltration: Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe. 2

3 Biochemisches Praktikum / Seminar SEMINAR 2: Besprechung der Ergebnisse und Fehlerquellen des 1. Praktikums; Inhalt des zweiten Praktikumstags + Wiederholung theoretischer Grundlagen aus der Vorlesung. Gr. 30 Fr :30 pünktlich! PRAKTIKUM 2: Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (K M -Wert) der Lactatdehydrogenase (LDH) für Pyruvat, Ermittlung der Sättigungskonzentration und der maximalen Umsatzgeschwindigkeit, Statistische Auswertung der Ergebnisse der Gruppe. SEMINAR 3: Auswertung des 2. Praktikums; Präsentation der Kurzreferate über das Seminar/ Praktikum durch die Studierenden. Gr. 30 Do :30 pünktlich! Biochemisches Praktikum / Seminar Ort der Lehrveranstaltungen: PRAKTIKUM 1: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 3, Eingang auf Seite Türkenstraße, Parterre. PRAKTIKUM 2: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 1, Haupteingang, 1. Stock. Art der Leistungsüberprüfung: LV mit permanenten Prüfungscharakter = = Anwesenheitspflicht + Mitarbeit + Kurzreferat Anwesenheitsblatt: 3

4 PRAKTIKUM 1: Trennmethoden Dünnschichtchromatographie Ionenaustauschchromatographie Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) Gaschromatographie Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) Elektrophorese Affinitätschromatographie Allen Methoden ist gemeinsam, dass die Moleküle durch den unterschiedlich langen Aufenthalt in zwei nicht mischbaren Phasen getrennt werden. Phasen sind Lösungsmittel, Oberflächen, Antikörper,.) 4

5 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.b. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). [Br 2 ] Wasser Verteilungskoeffizient c = [Br2 ] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Affinitätschromatographie: z.b. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen 5

6 Praktikumsbeispiel 1 Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie (Trennung nach ihrer Polarität) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Auftragen der Proben Glasröhrchen Zellulose auf Alufolie, polare, stationäre Phase Standard = Referenzwert 6

7 Auftragen der Proben Dünschicht- Chromatographiefolie in Glastrog mit Laufmittel stellen Wanderungsrichtung der Proben Laufmittel, apolar, mobile Phase 35% Azeton / 35% n-butanol in Acetatpuffer 7

8 Dünnschichtchromatographie Trog Chemie erleben Wawra et al. gelber Farbstoff = Isatin Dünschichtchromatogramm nach der Färbung / Trocknung 8

9 nach circa 2 Stunden: Markieren der Front Start 9

10 Front Wanderungsstrecke der Aminosäure W(as) Wanderungsstrecke der mobilen Phase W(mp) Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.b. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). [Br 2 ] Wasser Verteilungskoeffizient c = [Br2 ] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/

11 Auswertung Wanderstrecke(as) Wanderstrecke (m) = Rf(as) Rf = Retentionsfaktor Chemie erleben, Wawra et al. Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizient c = [Aminosäure] stationäre Phase [Aminosäure] mobile Phase Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2013 Praktikumsbeispiel 2 Gelfiltration Trennung der Moleküle nach ihrer Größe 11

12 Gelfiltration Glasfritte Probe, z.b. Protein / Salz Gemisch Stationäre Phase Poren und Kapillaren kleine Moleküle können hinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen) und kommen daher später aus der Säule heraus. Mobile Phase große kleine Moleküle Fraktionen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert. 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen. Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen. Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt. Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/

13 Gelfiltrations - Chromatographie Säule Chemie erleben, Wawra et al. Reagenzien für die Gelfiltration Elutionspuffer in Dispenserflasche Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot 13

14 Gelfiltration Sammeln der Fraktionen Chemie erleben, Wawra et al. Fraktionen nach der Gelfiltration 14

15 Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Farbintensität Fraktionen Dextranblau: Methylrot: großes Molekül, eluiert zuerst kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2013 Praktikumsbeispiel 3 Elektrophorese Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/

16 Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine Voraussetzungen: Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. richtige Wahl des Puffers! Trägermaterial (analog zur stationären Phase) Gleichstromquelle Arbeitsplatz Elektrophorese 16

17 Elektrophorese Apparatur pipettieren kleiner Volumina mit automatische Pipetten 17

18 Elektrophorese - Probenvorbereitung + Anode Tröge mit Pufferlösung Cellogel, Trägermaterial Kathode Platin Elektroden Gleichstromquelle 18

19 Welchen ph-wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Welchen ph-wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pi der Serumproteine ist ~ 5. 19

20 Welchen ph-wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pi der Serumproteine ist ~ 5. Chemie erleben, Wawra et al. Daher muss der ph des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa ph = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/ Anode negativ geladene Proteine (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode Wanderungsrichtung Proben Kathode 250V 30 min Gleichstromquelle Standard Serum 20

21 Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na +, K +, Ca ++, Mg ++ als Anionen, wie Cl -, HCO 3-? Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na +, K +, Ca ++, Mg ++ als Anionen, wie Cl -, HCO 3-? Weil die Anionenlücke durch die negative Ladung der Proteine bei ph 7.4 ausgeglichen wird. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/

22 Gleichstromquelle: 250 V Nach der Elektrophorese Färben der Proteine Trägermaterial durchsichtig machen Photometrische (densitometrische) Auswertung Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials 22

23 aufgetrennte Serumproteine Das Prinzip der Auswertung... Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch der Proteinmenge Detektor Probe wird am Detektor vorbeigezogen Lichtquelle 23

24 ... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz E = x c x d E = Extinktion = spez. Molarer Extinktionskeoff. c = Konzentration d = Schichtdicke I 0 I E = log (1/T) = log (I 0 /I) Photozelle Lichtquelle Prisma Detektor Küvette d = 1 cm verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer) 24

25 Ausdruck der Ergebnisse Elektrophorese von Serumproteinen Chemie erleben Wawra et al. 25

26 diagnostische Aussagemöglichkeiten (Beispiele) aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen, H. Goldenberg, (Hg.) für eine ausführlichere Darstellung siehe z.b. laborbefunde/ lbef_ephorese_ eiweiss.htm Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Meßwerte Systematische Fehler Zufällige große Fehler Georg Weitzer,MUW 01/2017 Quelle: 26

27 Meßwerte Systematische Fehler Zufällige große Fehler Mittelwert Georg Weitzer,MUW 01/2017 Varianz Standartabweichung Quelle: Meßwerte Methode des kleinsten Fehlerquadrates Mittelwert Georg Weitzer,MUW 01/2017 Varianz Standartabweichung Quelle: 27

28 Verteilung der Messdaten > 95% der Daten Hohe Spezifität aber geringe Sensitivität Hohe Sensitivität aber geringe Spezifität Georg Weitzer,MUW 01/2017 Quellen: Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse 28

29 Vortrag im Rahmen des Biochemischen Seminars/Praktikum am 3. Seminartag: Freier Vortrag, Dauer: 5 Minuten, Karteikarten erlaubt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Vortragsthemen 1. Beschreiben sie die prinzipielle chemische Struktur von Aminosäuren. Was sind proteinogene und nichtproteinogene Aminosäuren? Was sind essentielle Aminosäuren? Geben sie an, wie man proteinogene Aminosäuren weiter unterteilen kann. Wie werden die unterschiedlichen Eigenschaften bewirkt? (Erklären Sie die Begriffe hydrophob/hydrophil, negativ/positiv, sauer/basisch, polar/apolar) 2. Was ist das Trennprinzip der Dünnschichtchromatographie (DC)? Wie kann man mit dieser Methode proteinogene Aminosäuren trennen? Was versteht man dabei unter dem Rf Wert? Wandern polare oder apolare Aminosäuren schneller auf einer DC warum? 3. Wie genau funktioniert die Gelchromatographie? Nach welchen Prinzipien erfolgt die Trennung von Stoffen? In welcher Reihenfolge erwarten wir das Erscheinen im Eluat, wenn wir eine Mischung dreier unterschiedlich großer Substanzen (MR=100, MR= 200, MR=1000) aufzutrennen versuchen? Was könnte man tun, wenn in einem Auffangröhrchen trotzdem zwei Substanzen (z.b. MR=100 und MR=200) zu finden sind? 29

30 4. Welches humane Ausgangsmaterial wird bei der Elektrophorese im Praktikum untersucht? In welche Fraktionen wird dieses Gemisch aufgetrennt? Nennen Sie Beispiele aus jeder Fraktion sowie deren Funktionen und überlegen Sie, in welchen Organen die meisten dieser Moleküle produziert werden. Welches Protein hat den größten Anteil im Serum und woher kommt es, und überlegen Sie, ob dieses im Krankheitsfall auch über andere Organe verloren gehen kann. Beschreiben sie, wie ein Normalbefund aussieht. Welche Erkrankungen führen zu signifikanten Veränderungen des Normalbefundes, und wo liegen diese Veränderungen? 5. Nach welchem Prinzip kann man die Serumproteine mittels Gelelektrophorese trennen? Wieso können Proteine überhaupt geladen sein? Was ist der isoelektrische Punkt eines Proteins? Welchen Einfluss hat der ph Wert auf die Ladung des Proteins? Gibt es einen phwert, bei dem Proteine generell negativ oder positiv geladen sind? Warum finden sich im Serum weniger Anionen als Kationen (Anionenlücke)? 6. Wie erfolgt die quantitative Auswertung eines Elektropherogramms und auf welchen Annahmen beruht sie? Wie kommt es zur Färbung der Serumproteine und wie zur quantitativen Analyse der aufgetrennten Gruppen? Vergleichen Sie Photometrie und Densitometrie und erklären Sie die Bedeutung des Lambert Beer schen Gesetzes! Welche Art von Molekülen sind Enzyme und was ist ihre prinzipielle Funktion/Aufgabe? Was sind Isoenzyme und welche Bedeutung haben die Isoenzyme der LDH? Was sind Co Enzyme? Was sind einfache und was sind regulatorische (allosterische) Enzyme? Welche Faktoren beeinflussen Struktur und/oder Funktion von Enzymen? 8. Beschreiben Sie, wie Sie vorgehen, um die Enzymaktivität (Enzymmenge) einer LDH Präparation zu bestimmen? Welche Reaktion katalysiert die Lactat Dehydrogenase (LDH) und welche Rolle spielt dabei NADH? 9. Was ist die Michaelis Konstante (KM) und was können wir daraus ableiten? Was sind die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der nicht linearen und der linearisierten Darstellung? Welche Bedeutungen hat der KM Wert? Was ist vmax? Beschreiben Sie, wie Sie vorgehen, um den KM Wert der LDH zu bestimmen. 10. Welche unterschiedlichen Arten der Enzymhemmung gibt es? Wie würden die Darstellungen (nicht linear und linearisiert) aussehen, wenn ein kompetitiver Hemmstoff zugesetzt würde? Beschreiben Sie die Auswirkungen von Enzymhemmungen auch im Hinblick aufmedikamente (z.b. was bewirken Statine?)! Welche Auswirkungen sind von derunregelmäßigen Einnahme von Medikamenten, die als Enzym Inhibitoren wirken, zu erwarten? 30

31 11. Was versteht man unter einem groben, einem zufälligen und einem systematischen Fehler? Welche statistischen Kenngrößen für zufällige Fehler werden häufig verwendet und wie sind diese definiert? Was versteht man bei der Labor Diagnostik unter Qualitätskontrolle welche Formen werden in Österreich angewandt? 12. Welche Anforderungen werden an einen diagnostischen Test gestellt und was versteht man dabei unter Sensitivität und was unter Spezifität? Was bedeuten die Begriffe falsch positiv und falsch negativ? Erklären Sie, warum eine Erhöhung der Sensitivität immer zu Lasten der Spezifität geht und umgekehrt! Anwesenheitsblatt: 31