Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung. DLA 02/2015 Allergene II. Soja und Weizen in. gluten-freier Backware

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1 DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung 02/2015 Allergene II: Soja und Weizen in gluten-freier Backware Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Waldemar-Bonsels-Weg Ahrensburg, Germany Koordinator der LVU: Dr. Matthias Besler Seite 1 von 38

2 Inhalt 1. Einleitung Durchführung Untersuchungsmaterial Homogenität Untersuchung Ergebnisübermittlung Auswertung Bezugswert (zugewiesener Wert) Standardabweichung Ausreißer Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Allgemeines Modell nach Horwitz Auswertung eines Versuchs zur Präzision Werte aus Erkenntnissen z-score Quotient Standardunsicherheit Graphische Darstellung der Bezugswerte Wiederfindungsraten: Dotierung Ergebnisse Vergleichsuntersuchung Soja ELISA-Ergebnisse: Soja (als Sojaprotein) PCR-Ergebnisse: Soja Vergleichsuntersuchung Gluten ELISA-Ergebnisse: Gluten PCR-Ergebnisse: Weizen...28 PCR-Ergebnisse: Weizen Dokumentation ELISA: Soja ELISA: Gluten PCR: Soja PCR: Weizen Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Verzeichnis relevanter Literatur...37 Seite 2 von 38

3 1. Einleitung Die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen (LVU) ist ein unverzichtbarer Baustein für das Qualitäts-Management-System eines jeden, mit der Untersuchung von Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetik und Bedarfsgegenständen befassten Labors. Die Durchführung von Laborvergleichsuntersuchungen ermöglicht den teilnehmenden Instituten die eigene analytische Kompetenz unter realen Bedingungen nachzuweisen. Gleichzeitig erhalten sie wertvolle Daten zur Validität der durchgeführten Untersuchungsmethode. Das Ziel von DLA ist es, LVU für ausgesuchte Parameter in praxisrelevanten Konzentrationen anzubieten. Durchführung und Auswertung der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung erfolgten nach den technischen Anforderungen der DIN EN ISO/IEC (2010) und DIN ISO Durchführung 2.1 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung wurden zwei LVU-Proben für den Nachweis von Allergenen im mg/kg-bereich und eine Dotierungsmaterialprobe zur Verfügung gestellt. Die Dotierungsmaterialprobe enthält die betreffenden allergenen Zutaten im Bereich von 1-10 % und wurde der dotierten LVU-Probe zugesetzt. Die Untersuchungsergebnisse der Dotierungsmaterialprobe sollen im Vergleich zur dotierten LVU-Probe die Möglichkeit geben, die Nachweisbarkeit der Allergene ohne und mit Einfluss der Lebensmittelmatrix bzw. -prozessierung zu charakterisieren. Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um handelsübliche glutenfreie Kekse. Die Grundzusammensetzung war für beide Proben A und B gleich (s. Tabelle 1). Probe B wurde als weitere Zutat ein mit dem Dotierungsmaterial, das die allergenen Zutaten Sojamehl und Weizenmehl enthält, gebackener Keks zugesetzt. Dieser dotierte Keks wurde 15 min. bei ca. 175 C gebacken. Diese Teilprobe wurde nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur zerkleinert und Probe B zugesetzt. Die Zusammensetzung der Dotierungsmaterialprobe und die Gehalte der allergenen Zutaten in Probe B sind Tabelle 2 zu entnehmen. Die Proben wurden nach dem Homogenisieren zu Portionen von ca. 25 g abgefüllt. Seite 3 von 38

4 Tabelle 1: Zusammensetzung der DLA-Proben Zutaten Probe A Probe B Kekse, glutenfrei Zutaten: Zucker, Reismehl, Kochbananenmehl, Palmfett, Kartoffelstärke, Maismehl, Glucose, Maismehlgel, modifizierte Kartoffelstärke, Inulin, lactosearmes Magermilchpulver, Salz, Volleipulver, Aromen, Eiklarpulver, Zitrone, Backtriebmittel: Ammoniumhydrogencarbonat und Natriumhydrogencarbonat, Emulgator: Sojalecithine Nährwerte pro 100 g: Fett 16 g, Kohlenhydrate 77 g, Protein 3,1 g Kekse (gebacken 175 C, 15 min) Zutaten: Glutenfreies Mehl (Maisstärke, Maismehl, Verdickungsmittel: Guarkernmehl, Glucose), Butter, Zucker, Eier, Backpulver und 100 g/100g 91 g/100g 16 g/100g * Dotierungsmaterialprobe * Bezogen auf Gesamtgewicht der gebackenen Teilprobe 2,8 g/100g * Tabelle 2: Zugesetzte Mengen allergener Zutaten Zutaten Dotierungsmaterialprobe Probe B Kartoffelmehl 83 % 2,3 % Soja: als Sojamehl davon Sojaproteine mg/kg (6,21 %) mg/kg 1760 mg/kg 700 mg/kg Volleipulver 3,41 % 0,097 % Magermilchpulver 4,84 % 0,14 % Weizen: als Weizenmehl Typ 550 davon Gesamtprotein* davon Gluten** mg/kg (2,65 %) 2809 mg/kg 2528 mg/kg 750 mg/kg 79,5 mg/kg 71,6 mg/kg * gemäß Deklaration ** Definition für "Gluten" der Glutenunverträglichkeit-Kennzeichnungs-Verordnung (EU/41/2009) entspricht laut Literaturdaten ca % des Weizenproteins Seite 4 von 38

5 2.1.1 Homogenität Die Homogenität der dotierten Probe B wurde mittels ELISA-Tests als 5fach-Bestimmung geprüft (s. Abb. 1) und mit einer Standardabweichung zwischen den Proben von < 15% für das verwendete Verfahren als hinreichend gesichert angesehen (13, 14, 17, 18). Homogenität / Homogeneity Test - ELISA Ergebnisse in % des MW results in % of mean Soya, SD=11% Gluten, SD=5,8% Unabhängige Proben, independant samples n = 5 Abb. 1: Homogenitätsprüfung der DLA-Probe B Darstellung der Ergebnisse relativ in Prozent des arithmetischen Mittelwerts 2.2 Untersuchung An jedes teilnehmende Institut wurden in der 8. Kalenderwoche 2015 je eine Portion der Untersuchungsmaterialien A und B sowie eine Dotierungsmaterialprobe verschickt. Die Untersuchungsverfahren wurden freigestellt. Die Untersuchungen waren durchzuführen bis spätestens 7. April Ergebnisübermittlung Die Ergebnisabgabe erfolgte einheitlich auf, an die teilnehmenden Institute versandten Übermittlungsbögen bzw. -dateien. Zur Auswertung kamen einerseits die Ergebnisse als positiv/negativ Angaben und andererseits angegebene Gehalte an allergenen Zutaten in mg/kg z.b. als Sojaprotein bzw. Gluten. Abgefragt und dokumentiert wurden die o.g. Ergebnisse sowie Angaben zu den Testmethoden wie Spezifitäten, Testkit-Hersteller und Stichpunkte zur Durchführung der Methoden. Falls Teilnehmer mehrere Ergebnisse für denselben Parameter abgegeben haben, die mit unterschiedlichen Methoden erhalten wurden, wurden diese Ergebnisse mit derselben Auswertenummer mit einem Buchstaben als Suffix unter Angabe der jeweiligen Methode ausgewertet. Ein Teilnehmer hat keine und ein Teilnehmer verspätet Ergebnisse eingereicht. Alle anderen Teilnehmer haben fristgerecht ihre Ergebnisse abgegeben. Seite 5 von 38

6 3. Auswertung Verschiedene ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln können verschiedene Antikörper-Spezifitäten aufweisen, mit unterschiedlichem Referenzmaterial kalibriert worden sein und sich unterschiedlicher Extraktionsverfahren bedienen. Die verschiedenen ELISA- Methoden können daher zu einer unterschiedlichen Bewertung des Gehalts eines Analyten führen (20, 21, 22, 23). Aus diesem Grund werden die Ergebnisse, wenn möglich in der Auswertung verschiedenen Bezugswerten gegenübergestellt. Dadurch soll jedes einzelne Ergebnis im Vergleich mit dem Mittelwert aller eingesandten Ergebnisse und/oder im Vergleich mit dem Mittelwert aller Ergebnisse derselben Methode bewertet werden können. Zum Vergleich mit der rechnerisch zugesetzten Menge wurde diese in den graphischen Darstellungen der Ergebnisse mit angegeben. Für die ELISA-Ergebnisse der Dotierungsmaterialprobe und der dotierten Probe wurden anhand der bekannten Zusammensetzung Wiederfindungsraten berechnet und zur Information angegeben. Hierbei erfolgte keine statistische Auswertung. Die angegebenen Wiederfindungsraten dienen ausschließlich einer Einschätzung von Matrix- und/oder Prozessierungseinflüssen. Die PCR-Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. 3.1 Bezugswert (zugewiesener Wert) Da es sich bei dem untersuchten Material nicht um zertifiziertes Referenzmaterial handelt wird als Bezugswert (X) für die Auswertung der robuste Mittelwert der eingesandten Ergebnisse verwendet (6). Sofern eine Prüfung der Verteilung der eingesandten Ergebnisse Hinweise für Quellen von höherer Variabilität, wie z.b. eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, ergibt, werden zusätzlich als Bezugswerte die robusten Mittelwerte von Einzelmethoden herangezogen. Bei den ELISA-Methoden zur Bestimmung von Allergenen wird, wenn möglich, stets so vorgegangen: i) Robuster Mittelwert aller Ergebnisse - X ALL ii) Robuster Mittelwert von Einzelmethoden - X METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. Einzelergebnisse die außerhalb des angegebenen Messbereiches eines teilnehmenden Labors liegen (z.b. mit der Angabe > 25 mg/kg oder < 2,5 mg/kg) werden für die statistische Auswertung berücksichtigt, sofern eine Angabe mit > oberhalb und eine Angabe mit < unterhalb des Zielbereichs liegt. Seite 6 von 38

7 3.2 Standardabweichung Zum Vergleich mit der Zielstandardabweichung wird ebenfalls die robuste Standardabweichung (S x ) berechnet (6). Folgende robuste Standardabweichungen werden herangezogen: i) Robuste Standardabweichung aller Ergebnisse - S x ALL ii) Robuste Standardabweichung von Einzelmethoden - S x METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. 3.3 Ausreißer Auf Ausreißer wird mittels Mandel s-h-statistik Signifikanz-Niveau 95% geprüft (5). Ermittelte Ausreißer werden informativ genannt sofern gleichzeitig der z-score des Instituts < -2 oder > 2 ist. 3.4 Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Die Zielstandardabweichung des Bezugswertes wird nach unten dargestellten, unterschiedlichen Verfahren bestimmt Allgemeines Modell nach Horwitz Die relative Zielstandardabweichung in % des Bezugswertes wird i.d.r. nach folgender Gleichung (Horwitz ) berechnet σ (%) = 2 (1-0,5logX) hieraus wird die Zielstandardabweichung in mg/kg berechnet σ = X * σ (%) / 100. Die Zielstandardabweichung nach Horwitz wird z.z. in der Praxis von ELISA-Verfahren mit Messwerten im mg/kg Bereich nur in Ausnahmefällen erreicht Auswertung eines Versuchs zur Präzision Aus der Vergleichstandardabweichung σ R und der Wiederholstandardabweichung σ r eines Versuchs zur Präzision einer Methode (z.b. aus Ringversuchen nach ASU 64 LFGB) wird die Standardabweichung zwischen Laboratorien σ L berechnet: L = R 2 r 2. Aus den obigen Größen und der Anzahl der Wiederholmessungen n der laufenden Vergleichsuntersuchung wird nun die Zielstandardabweichung berechnet: = L 2 r 2 /n. Da in der vorliegenden Vergleichsuntersuchung die Anzahl der Seite 7 von 38

8 Wiederholmessungen n = 1 ist, ist die Vergleichsstandardabweichung σ R gleich der Zielstandardabweichung σ. Nachstehend sind die relativen Vergleichsstandardabweichungen aus Ringversuchen einiger ELISA-Methoden nach ASU 64 angegeben (24, 25, 26): Methode Parameter Matrix Mittelwerte Relative σ R Literatur ELISA Sojaprotein Brühwurst 0,36-4,07% 14-28% L ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. B) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) Erdnuss Erdnuss Erdnuss Haselnuss Haselnuss Vollmilchschokolade Vollmilchschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade 5,9-174 mg/kg 20-31% L ,1-216 mg/kg 14-32% L ,7-148 mg/kg 22-33% L ,6-16,3 mg/kg 12-33% L ,4-21,3 mg/kg 14-19% L Aus den o.g. Präzisionsdaten der ASU 64 Methoden ergeben sich relative Zielstandardabweichungen im Bereich von 12-33%. Für den auch in der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung bestimmten Analyten Soja lagen die relativen Vergleichsstandardabweichungen im Bereich von 14-28% in der Matrix Brühwurst (26). Das IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) hat in einem Ringversuch die Eignung fünf verschiedener ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Erdnuss getestet (22). Die Mittelwerte lagen im Konzentrationsbereich von 0,3-16,1 mg/kg bzw. 1,2-20,4 mg/kg. Die jeweils niedrigsten relativen Vergleichsstandardabweichungen der fünf Test-Kits lagen für die Matrix Bitterschokolade bei 20-42% und für Kekse bei 23-61%. Die Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT) hat Ringversuche zur Validierung von zwei kommerziellen ELISA-Test-Kits zur Gluten- Bestimmung mittels monoklonalem R5 Antikörper durchgeführt (19). Es wurden 12 Lebensmittelproben mit Gliadingehalten im Bereich von mg/kg von 20 Laboratorien untersucht. Die Wiederfindungsraten lagen zwischen 65 und 110%, die relativen Wiederholstandardabweichungen lagen bei 13-25% (1. Methode) bzw % (2. Methode) und die relativen Vergleichsstandardabweichungen bei 23-47% (1. Methode) bzw % (2. Methode). Laut den Autoren erfüllten beide ELISA-Test-Kits damit die Validierungskriterien für ELISA Methoden (19). Seite 8 von 38

9 3.4.3 Werte aus Erkenntnissen Die Zielstandardabweichung kann für die Eignungsbeurteilung auf einen Wert festgesetzt werden, der dem Leistungsfähigkeitsniveau entspricht, das der Koordinator für ein wünschenswertes Ziel für die teilnehmenden Laboratorien hält (6). Anforderungen an die Leistungsfähigkeit der Analysenmethoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln sind u.a. vom Ministry of Health and Welfare (MHLW) in Japan (17), von der Arbeitsgruppe 12 Lebensmittelallergene des Technischen Komitees CEN/TC 275 (14-16), von einer internationalen "Food Allergen Working Group" unter der Leitung der AOAC Presidential Task Force on Food Allergens (18) und vom Codex Alimentarius Commitee (CAC/GL ) (13) erarbeitet worden. Die hier relevanten ELISA- bzw. PCR-Validierungskriterien der Gremien sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben. Tabelle 3: ELISA-Validierungskriterien Literatur (17, 18, 20) Wiederfindungsrate MHLW % 25% CEN % AOAC % 6,9-34,4% (a) 19,5-57,2 (a) CAC % 25% 35% (a) = Beispiel aus hypothetischem Ringversuch im Konzentrationsbereich von 0,5-5 mg/kg Tabelle 4: PCR-Validierungskriterien Literatur (21) Wiederfindungsrate Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung CAC 2010 ± 25% (a) 25% 35% (a) = Trueness / Richtigkeit Aufgrund der derzeitigen Leistungsfähigkeiten von ELISA- bzw. PCR-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln, die sich aus den Präzisionsdaten von Versuchen und aus den o.g. Validierungsanforderungen ableiten lassen, legen wir für die relative Zielstandardabweichung σ einen Wert von 25% fest. Diese Zielstandardabweichung wurde zur statistischen Bewertung der Ergebnisse mittels z-score herangezogen und auf alle unter 3.1 angegebenen Bezugswerte angewandt. Seite 9 von 38

10 3.5 z-score Der z-score wird herangezogen zur Beurteilung der Ergebnisse der teilnehmenden Institute. Er besagt um welches Vielfache der Zielstandardabweichung ( σ ) das Ergebnis (x) des betreffenden teilnehmenden Instituts vom Bezugswert (X) abweicht (6). Die Berechnung erfolgt nach z = (x X) / σ ; die Anforderungen an die Analytik gelten im Allgemeinen als erfüllt, wenn -2 z 2. Zur Bewertung wurden nachstehende z-scores mit einer Zielstandardabweichung von 25% in der Auswertung angegeben: i) z-score - z ALL (bezogen auf alle Ergebnisse) ii) z-score - z METHOD i (bezogen auf Einzelmethoden) 3.6 Quotient S x / In Anlehnung an den Horrat-Wert kann die Bewertung einer Laborvergleichsuntersuchung als aussagekräftig gelten, wenn der Quotient von robuster Standardabweichung und Zielstandardabweichung nicht über 2 liegt. Ein über 2 liegender Wert bedeutet, dass die Präzision nicht zufriedenstellend ist, d.h., dass die Präzision aus analytischen Gründen zu variabel ist oder die festgestellte Variation höher ist als für die angewandte Methode geschätzt wurde. Somit ist eine Vergleichbarkeit der Messergebnisse nicht gewährleistet (11). 3.7 Standardunsicherheit Jeder Bezugswert ist mit einer Standardunsicherheit behaftet, die von der Analysenmethode, Unterschieden der eingesetzten Analysenmethoden, dem Probenmaterial und der Anzahl der Teilnehmer (P) einer LVU beeinflußt wird. Die Standardunsicherheit (U x ) wird für die vorliegende LVU wie folgt berechnet (6). u X =1,25 S x / p Ist u X 0,3 muss die Standardunsicherheit des Bezugswertes nicht berücksichtigt werden (6). Seite 10 von 38

11 3.8 Graphische Darstellung der Bezugswerte Die Bezugswerte werden als farbige Linien in den Abbildungen der Ergebnisse dargestellt. Dies ermöglicht einen optischen Vergleich der Einzelergebnisse mit den verschiedenen Bezugswerten für das Zusatzniveau eines Analyten einerseits und die robusten Mittelwerte über alle Methoden bzw. über Einzelmethoden andererseits. 3.9 Wiederfindungsraten: Dotierung Für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe werden Wiederfindungsraten in Bezug auf die zugesetzten Allergene berechnet. Die Bezugswerte ergeben sich aus den unter 2.1 Untersuchungsmaterial in Tabelle 1 angegebenen Gehalten. Als Akzeptanzbereich AB für die Bewertung der Teilnehmerergebnisse wird der von der AOAC vorgeschlagene Bereich von % für die Wiederfindungsraten von Allergen-ELISAs herangezogen (18). Für quantitative PCR-Bestimmungen wird ebenfalls dieser Akzeptanzbereich herangezogen. Seite 11 von 38

12 4. Ergebnisse Alle folgenden Tabellen sind anonymisiert. Den teilnehmenden Instituten wird mit dem Versand dieser Auswertung ihre individuelle Auswertenummer mitgeteilt. Die folgenden Ergebnisseiten sind für die allergenen Bestandteile jeweils gleich aufgebaut. Es werden zunächst die Ergebnisse aller Methoden zu einem Parameter für die Probe A und dann für die Probe B angegeben. ELISA-Ergebnisse, die als Sojamehl angegeben wurden, sind in Gesamt-Sojaprotein, sofern angegeben unter Berücksichtigung der Angaben des betreffenden Testkit-Herstellers, umgerechnet worden. Dabei wurde ein Protein- Gehalt von 40% für Sojamehl zugrunde gelegt. Die Auswertung erfolgte getrennt nach ELISA und PCR-Ergebnissen. Die Ergebnisse wurden nach durchgeführten Methoden zusammengefasst und die Auswertenummern innerhalb der Gruppen aufsteigend sortiert. Die Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. Für jeden Teilnehmer wird in Bezug auf die Konsens-Ergebnisse eine qualitative Bewertung vorgenommen. Hier wurde die Übereinstimmung mit den Konsens-Werten in Prozent angegeben. Gegebenenfalls werden anschließend die Ergebnisse aller Methoden und von Einzelmethoden mit mindestens 5 quantitativen Ergebnissen statistisch ausgewertet. In den Fällen, in denen eine statistische Auswertung der quantitativen Messergebnisse durchgeführt wurde, werden die Ergebnisse tabellarisch folgendermaßen aufgeführt : Auswertenummer Ergebnis Ergebnis z-score z-score Methode Hinweis X ALL X M i pos/neg [m g/kg] X All X Method i Seite 12 von 38

13 Die Kenndaten der jeweiligen Vergleichsuntersuchung werden aufgeführt, falls wenigstens 50% positive Ergebnisangaben und mindestens 5 quantitative Messergebnisse vorliegen: Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode i [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Method i Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse Robuster Mittelwert (X) Robuste Standardabweichung (S x ) Median Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) untere Grenze des Zielbereichs (X - 2 σ ) obere Grenze des Zielbereichs (X + 2 σ ) Quotient S x / σ Standardunsicherheit u X Quotient u X / Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Im Anschluss erfolgt die Darstellung der Wiederfindungsraten für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe. Die Anzahl der Ergebnisse im Akzeptanzbereich von % wird aufsummiert. Seite 13 von 38

14 4.1 Vergleichsuntersuchung Soja ELISA-Ergebnisse: Soja (als Sojaprotein) Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] 5 negativ < 7,6 negativ < 7,6 1/2 (50%) AQ 7 negativ negativ 1/2 (50%) ES 2a negativ < 2,5 positiv 48,58 2/2 (100%) RS2 3 negativ positiv 36,3 2/2 (100%) RS2 4 negativ < 2,5 positiv 71,2 2/2 (100%) RS2 9 negativ < 2,5 positiv 64,8 2/2 (100%) RS2 10 negativ < 2,5 positiv 47,13 2/2 (100%) RS2 11 negativ < 0,31 positiv 64 2/2 (100%) RS2 12 negativ < 2,5 positiv 375 2/2 (100%) RS2 Ausreißer Xalle u. XRS 14 negativ < 2,5 positiv 84 2/2 (100%) RS2 15 negativ < 2,5 positiv 82,03 2/2 (100%) RS2 16 negativ < 2,5 positiv 81,26 2/2 (100%) RS2 6 negativ < 0,4 positiv 28,67 2/2 (100%) TC 1 negativ < 1 negativ < 1 1/2 (50%) VT Ergebnis umgerechnet 2b negativ < 1 negativ < 1 1/2 (50%) VT Ergebnis umgerechnet 8 negativ positiv 0,6 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet Probe A Probe B Anzahl positiv 0 12 Anzahl negativ 16 4 Prozent positiv 0 75 Prozent negativ Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Fast TC = l'screen SOYA, TECNA VT = Veratox, Neogen Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Soja mittels ELISA zu 100% negative Ergebnisse für Probe A und 75% positive für Probe B erhalten. Mit der Methode RS (und Methode TC ein Ergebnis) wurden zu 100% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Seite 14 von 38

15 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Sojaprotein z-score z-score Methode Hinweis [mg/kg] X ALL Bezug X ALL 5 < 7,6 AQ 7 ES 2a 48,58-0,8-1,2 RS2 3 36,3-1,6-1,9 RS2 4 71,2 0,7 0,2 RS2 9 64,8 0,3-0,2 RS ,13-0,9-1,2 RS ,2-0,2 RS ,7 18,0 RS ,5 0,9 RS ,03 1,4 0,8 RS ,26 1,3 0,8 RS2 6 28,67-2,1 TC 1 < 1 VT Ergebnis umgerechnet 2b < 1 VT Ergebnis umgerechnet 8 0,6-4,0 VT Ergebnis umgerechnet X RS X Methode RS Ausreißer Xalle u. XRS Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Fast TC = l'screen SOYA, TECNA VT = Veratox, Neogen Seite 15 von 38

16 Kenndaten: Quantitative Auswertung Sojaprotein Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS2 [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS2 Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse Robuster Mittelwert (X) 60,8 68,2 Robuste Standardabweichung (S x ) 29,4 22,9 Median 64,4 68,0 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 15,2 17,1 untere Grenze des Zielbereichs 30,4 34,1 obere Grenze des Zielbereichs 91,2 102 Quotient S x / σ 1,9 1,3 Standardunsicherheit u X 10,6 9,05 Quotient u X / σ 0,70 0,53 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Fast 9 (75%) 9 (90%) Anmerkung: Die Auswertung der Ergebnisse aller Methoden zeigte anhand des Quotienten S x / σ zwar eine akzeptable Variabilität der Ergebnisse, bezüglich der eingesetzten ELISA-Methoden lagen jedoch deutliche Unterschiede vor. Die Ergebnisse der Methode RS lagen alle im Zielbereich oder darüber, während die Ergebnisse der anderen Methoden alle unterhalb des Zielbereichs lagen. Die methoden-übergreifende Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist daher nicht gegeben. Die Auswertung von Methode RS2 zeigte eine akzeptable Variabilität der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ lag deutlich unter 2,0. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist gegeben. Die Mittelwerte der Auswertungen lagen überwiegend bei ca. 4-12% vom Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für Sojaprotein" S.19). Seite 16 von 38

17 mg/kg < Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results > 5 7 2a b 8 Auswertenummer / Evaluation number < < Abb. 2: ELISA-Ergebnisse Soja (als Sojaprotein) Zusatzniveau (nicht dargestellt, außerhalb des skalierten Bereichs) rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All > -4, a Auswertenummer / Evaluation number Abb. 3: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Sojaprotein) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 17 von 38

18 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS > 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, a Auswertenummer / Evaluation number Abb. 4: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Sojaprotein) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS1 (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 18 von 38

19 Wiederfindungsraten für Sojaprotein: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis < 7,6 AQ 7 > 25 ES 2a ,58 7 RS2 3 > ,3 5 RS ,2 10 RS ,8 9 RS ,13 7 RS RS RS2 14 > RS2 15 > ,03 12 RS , ,26 12 RS ,67 4 TC Ausreißer Xalle u. XRS < 1 VT Ergebnis umgerechnet 2b 914,4 4 < 1 VT Ergebnis umgerechnet ,6 0,1 VT Ergebnis umgerechnet AB* % AB* % Anzahl im AB 6 Anzahl im AB 1 Prozent im AB 50 Prozent im AB 8 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Fast TC = l'screen SOYA, TECNA VT = Veratox, Neogen Anmerkung: 50% der Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backwaren- Probe B lag nur eine Wiederfindungsrate in diesem Akzeptanzbereich. Es zeigten sich somit deutliche Unterschiede bezüglich der Nachweisbarkeit und Quantifizierung von Sojaprotein im Dotierungsmaterial (mit Sojamehl) und in der gebackenen Probe B (erhitztes Sojamehl). Seite 19 von 38

20 4.1.2 PCR-Ergebnisse: Soja Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 16 negativ positiv 2/2 (100%) ASU 11 negativ positiv 2/2 (100%) QG 19 positiv < 1 positiv > 400 1/2 (50%) SFA QUANT als Sojabohne 1 negativ positiv 2/2 (100%) div 3 positiv 1/2 (50%) div 13 negativ positiv 2/2 (100%) div 17 negativ positiv 2/2 (100%) div 20 negativ positiv 2/2 (100%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 1 8 Anzahl negativ 6 0 Prozent positiv Prozent negativ 86 0 Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten Methoden: ASU = ASU 64 LFGB L , Anhang C.2 QG = Qiagen SFA QUANT = Sure Food Allergen S3201, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Soja mittels PCR wurden 86% negative Ergebnisse für Probe A und 100% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Eine quantitative Auswertung erfolgte nicht, da weniger als 5 Ergebnisse vorlagen. Seite 20 von 38

21 Wiederfindungsraten für Soja: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis 16 ASU 11 QG > 400 SFA QUANT als Sojabohne 1 div 3 div 13 div 17 div 20 div AB* % AB* % Anzahl im AB 1 Anzahl im AB 0 Prozent im AB 100 Prozent im AB 0 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: ASU = ASU 64 LFGB L , Anhang C.2 QG = Qiagen SFA QUANT = Sure Food Allergen S3201, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Ein Teilnehmer hat ein quantitatives PCR-Ergebnis für Soja in der Dotierungsmaterialprobe abgegeben. Die Wiederfindungsrate lag im Bereich der AOAC-Anforderung von % (für ELISA-Methoden). Seite 21 von 38

22 4.2 Vergleichsuntersuchung Gluten ELISA-Ergebnisse: Gluten Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 2 negativ < 5 positiv 58,4 2/2 (100%) RS1 3 negativ positiv 67,5 2/2 (100%) RS1 4 negativ < 2,5 positiv 74,5 2/2 (100%) RS1 5 negativ < 5,0 positiv 51 2/2 (100%) RS1 7 negativ positiv 68 2/2 (100%) RS1 8 negativ positiv 68 2/2 (100%) RS1 9 negativ < 5 positiv 70,2 2/2 (100%) RS1 10 negativ <5 positiv 107,9 2/2 (100%) RS1 11 negativ < 3 positiv 72 2/2 (100%) RS1 12 negativ < 5 positiv 55 2/2 (100%) RS1 13 negativ < 10 positiv 70,13 2/2 (100%) RS1 14 negativ < 5,00 positiv 95 2/2 (100%) RS1 16 negativ < 5,0 positiv 61,65 2/2 (100%) RS1 19 negativ < 3 positiv 75 2/2 (100%) RS1 20 negativ < 5 positiv 72 2/2 (100%) RS1 1 negativ < 5 positiv 70 2/2 (100%) VT 18 negativ < 3 positiv 49 2/2 (100%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 0 17 Anzahl negativ 17 0 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten Ausreißer Xalle u. XRS Methoden: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe/ andere Methoden Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Gluten mittels ELISA zu je 100% negative Ergebnisse für Probe A und positive für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Seite 22 von 38

23 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Gluten z-score z-score Methode Hinweis [mg/kg] X ALL Bezug X ALL X RS X Methode RS 2 58,4-0,6-0,6 RS1 3 67,5 0,0-0,1 RS1 4 74,5 0,4 0,3 RS ,0-1,0 RS ,0-0,1 RS ,0-0,1 RS1 9 70,2 0,1 0,1 RS ,9 2,4 2,3 RS ,2 0,2 RS ,8-0,8 RS ,13 0,1 0,1 RS ,6 1,5 RS ,65-0,4-0,4 RS ,4 0,3 RS ,2 0,2 RS ,1 VT ,1 div Ausreißer Xalle u. XRS Methoden: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe/ andere Methoden Seite 23 von 38

24 Kenndaten: Quantitative Auswertung Gluten Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS1 [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS1 Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse Robuster Mittelwert (X) 67,9 69,0 Robuste Standardabweichung (S x ) 11,3 10,5 Median 70,0 70,1 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 17,0 17,3 untere Grenze des Zielbereichs 34,0 34,5 obere Grenze des Zielbereichs Quotient S x / σ 0,67 0,61 Standardunsicherheit u X 3,4 3,4 Quotient u X / σ 0,20 0,20 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen 16 (94%) 14 (93%) Anmerkung: Die Auswertungen der Ergebnisse aller Methoden und von Methode RS1 zeigten eine geringe Variabilität der Ergebnisse. Die Quotienten S x / σ lagen unter 1,0. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist gegeben. Die Mittelwerte der Auswertungen lagen bei ca. 95% bzw. 96% vom Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für Gluten" S.27). Seite 24 von 38

25 120 Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results mg/kg Auswertenummer / Evaluation number Abb. 5: ELISA-Ergebnisse Gluten grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 6: z-scores (ELISA-Ergebnisse Gluten) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 25 von 38

26 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 7: z-scores (ELISA-Ergebnisse Gluten) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS1 (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 26 von 38

27 Wiederfindungsraten für Gluten: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis ,4 82 RS ,5 94 RS ,5 104 RS RS1 7 > RS RS ,2 98 RS ,9 151 RS RS RS1 13 > 80 70,13 98 RS1 14 > RS , ,65 86 RS RS RS VT div Ausreißer Xalle u. XRS AB* % AB* % Anzahl im AB 12 Anzahl im AB 16 Prozent im AB 86 Prozent im AB 94 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe/ andere Methoden Anmerkung: 86% der Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backwaren- Probe B lagen 94% der Wiederfindungsraten in diesem Akzeptanzbereich. Seite 27 von 38

28 4.2.2 PCR-Ergebnisse: Weizen Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 3b - positiv 1/2 (50%) SFA ID 19 positiv < 1 positiv 16 1/2 (50%) SFA QUANT 1 negativ positiv 2/2 (100%) div div 17 negativ positiv 2/2 (100%) div 20a negativ positiv 2/2 (100%) div 20b negativ positiv 2/2 (100%) div 3a - negativ 0/2 (0%) div als glutenhaltige Getreide Probe A Probe B Anzahl positiv 1 6 Anzahl negativ 4 1 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert negativ positiv Methoden: SFA ID = Sure Food Allergen S3106, R-Biopharm / Congen SFA QUANT = Sure Food Allergen S3206, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Weizen mittels PCR wurden 80% negative Ergebnisse für Probe A und 86% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Eine quantitative Auswertung erfolgte nicht, da nicht genügend Ergebnisse vorlagen. Seite 28 von 38

29 Wiederfindungsraten für Weizen: Dotierungsmaterialprobe und Probe B 3b [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis SFA ID ,1 SFA QUANT als glutenhaltige Getreide 1 div 16 div 17 div 20a 20b 3a Auswertenummer Dotierungsmaterial div div div AB* % AB* % Anzahl positiv Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 0 Anzahl negativ Prozent positiv Prozent im AB 0 Prozent im AB 0 Prozent negativ Konsenswert * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: SFA ID = Sure Food Allergen S3106, R-Biopharm / Congen SFA QUANT = Sure Food Allergen S3206, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Ein Teilnehmer hat ein quantitatives PCR-Ergebnis für Weizen in der Dotierungsmaterialprobe und in der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backwaren-Probe B abgegeben. Die Wiederfindungsraten lagen unterhalb des Bereichs der AOAC-Anforderung von % (für ELISA-Methoden). Seite 29 von 38

30 5. Dokumentation Angaben der Teilnehmer 5.1 ELISA: Soja Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 5 - < 7,6 - < 7, Sojaprotein AQ AgraQuant Soja / Soy, RomerLabs 7 negativ negativ positiv > 25 Sojaprotein ES ELISA-Systems Soy (ESSOYPRD-48) 2a negativ < 2,5 positiv 48,58 positiv 8147 Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 3 negativ positiv 36,3 positiv > 200 Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 4 - < 2,5-71, Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 9 negativ < 2,5 positiv 64,8 positiv Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soya (R7102), r-biopharm 10 negativ < 2,5 positiv 47,13 positiv Sojaprotein RS2 RIDASCREEN FAST Soya (R7102) von r-biopharm 11 - < 0, Sojaprotein RS2 RIDASCREEN R Fast Soya (R7102), r-biopharm 12 negativ < 2,5 positiv 375 positiv Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 14 negativ < 2,5 positiv 84 positiv > 200 RS2 Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 15 - < 2,5-82,03 - > 2000 Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 16 negativ < 2,5 positiv 81,26 positiv 13998,19 Sojaprotein RS2 Ridascreen Fast Soja (R7102), r-biopharm 6 negativ < 0,4 positiv 28,67 positiv 994 Sojaprotein TC I'Screen SOYA -TECNA 1 negativ < 2,5 negativ < 2,5 positiv 4000 Sojamehl VT Veratox Soy, Neogen 2b negativ < 2,5 negativ < 2,5 positiv 2286 Sojamehl VT Veratox Soyflour, Neogen 8 negativ positiv 1,55 positiv 3500 Sojamehl VT Veratox Soy, Neogen Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Fast TC = l'screen SOYA, TECNA VT = Veratox, Neogen Seite 30 von 38

31 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Sonstige Hinweise Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 5 AQ 7 ES nach Herstellerangaben in Probe B wurden Spuren von Soja nachgewiesen, aber unter der Test-Kit BG (2,5 ppm) 2a RS2 erhitzte Sojaproteine nach Herstellerangaben 3 RS2 4 RS2 Sojaprotein Verdünnung :Probe B 1:10, Dotierungsprobe 1: RS2 Nach Hersteller Angaben in der Testkitanleitung nach RS2 Antikörper erkennen spezifisch natives und/oder thermisch prozessiertes Sojaprotein siehe Anleitung des Herstellers 11 RS2 Antikörper erkennen spezifisch erhitzte Sojaproteine nach Testanleitung 12 RS2 2.5 ml Extraktor 3 und 17.5 ml vorgewärmt 14 RS2 spezifisch gegen erhitzte Sojaproteine (60 C / 140 F) AEP-10 min bei 100 C, zentrifugieren 10 min, verdünnen des Extrakts 1:5 (1+4) 15 RS2 10min / 100ºC 16 RS2 Sojaprotein lt. Testkitanweisung 6 TC ANTI-SOJA Extraktionslösung TECNA/15'/40 C Ergebnis umgerechnet 1 VT Sojaprotein alle Messwerte für Probe B: 0.5 ppm Sojamehl (< BG Kit von 2.5 ppm) 2b VT keine Angaben nach Herstellerangaben 8 Extraktion mit PBS, schütteln in erwärmtem Sojamehl VT Wasserbad 15 min./60 C BG 2,5mg/kg Seite 31 von 38

32 5.2 ELISA: Gluten Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 2 negativ < 5 positiv 58,4 positiv 3531 Gliadin RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 3 negativ positiv 67,5 positiv 1486 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 4 - < 2,5-74, Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 5 - < 5, Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 7 negativ positiv 68 positiv > 200 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 8 negativ positiv 68 positiv 2000 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 9 negativ < 5 positiv 70,2 positiv 2061 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 10 negativ <5 positiv 107,9 positiv 2628 Protein (Gluten) RS1 RIDASCREEN Gliadin (R7001) von r-biopharm 11 - < Gluten RS1 RIDASCREEN R Gliadin (R7001), r-biopharm 12 negativ < 5 positiv 55 positiv 3700 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 13 - < 10-70,13 - > 80 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 14 negativ < 5,00 positiv 95 positiv > 200 RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 16 negativ < 5,0 positiv 61,65 positiv 3663,89 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 19 negativ < 3 positiv 75 positiv 1550 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 20 negativ < 5 positiv 72 positiv 1800 Gluten RS1 Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 1 negativ < 5 positiv 70 positiv 1000 Gluten VT Veratox Gliadin R5, Neogen 18 - < Gluten div Methoden: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe/ andere Methoden Seite 32 von 38

33 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Sonstige Hinweise Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 2 RS1 Gliadine aus Weizen, Gerste und Roggen nach Herstellerangaben 3 RS1 R5 4 RS1 Gliadin Vedünnnung: Probe B 1:5, Dotierungsprobe 1:100 5 RS1 7 RS1 nach Herstellerangaben keine Extraktion mit Cocktail-Lösung in erwärmtem 8 RS1 Gliadin BG 5,0mg/kg Wasserbad 40 min./50 C, zentrifugieren 9 RS1 Cocktail-Lösung (patentiert) (R7016), r- Biopharm 10 RS1 monoklonaler Antikörper R5 erkennt Gliadinfraktion siehe Anleitung des Herstellers 11 RS1 Monoklonaler Antikörper R 5 nach Testanleitung (Extraktion mit Cocktaillösung, R 7006) 12 RS1 R5 13 RS1 R5 Cocktail/40 min/50ºc 14 RS1 R5- Mendez. Cocktail-Lösung 40min(50ºC) Etanol 80%-1h (Raumtemperatur). 16 RS1 Gliadin lt. Testkitanweisung 19 RS1 - - Messbereich 5-80 mg/kg 20 RS1 Gliadin 1 VT Gliadin 18 div Ethanol Extraktion Seite 33 von 38

34 5.3 PCR: Soja Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 16 negativ positiv positiv DNA-Soja ASU-1 ASU 64 LFGB L , Anhang C.2 (modifiziert) 11 negativ positiv positiv Soja QG 5x QuantiFast Pathogen PCR Fa.Qiagen (211354) Primer/Sonde:eurofins/mwg/ operon, 64 LFGB L SFA 19 positiv < 1 positiv > 400 positiv Sojabohne, gesamt Sure Food Allergen, Congen / r-biopharm QUANT 1 negativ n.n. positiv * nachweisbar DNA-Soja div 3 - positiv positiv DNA-Soja div interne Methode 13 negativ positiv positiv DNA-Soja div 17 negativ positiv positiv DNA-Soja div Hausmethode 20 negativ positiv positiv DNA-Soja div interne Methode * nachweisbar in Spuren Methoden: ASU-1 = ASU 64 LFGB L , Anhang C.2 QG = Qiagen SFA QUANT = Sure Food Allergen S3201, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Sonstige Hinweise Bestimmung) Target-Sequenz / -DNA 16 ASU-1 Lektin Gen (74 bp) 11 QG 81 bp langer Sequenzabschnitt des Soja- Lectin-Gens 19 SFA QUANT Sojabohne SureFood ALLERGEN QUANT Soya S3201 Messbereich mg/kg 1 div 3 div interne Methode 13 div gen lectin le1 CTAB Methode/real time PCR/45 Zyklen 17 div < 100bp z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen 1. nach ASU 64 LFGB L (SDS/Guanidiniumchlorid-Puffer mit Proteinase K, Aufarbeitung mittels Wizard-Kit der Fa. Promega) 2. nach Holzhauser et al, 2000 (CTAB basiertes Extrationsverfahren mit anschließender Aufreinigung über Wizard-Kit der Fa. Promega) Real-time PCR mit 45 Zyklen Dneasy R mericon Food Kit/ Proteinase K/ Real Time PCR/ 45 Zyklen 2g Probe, Macherey-Nagel Food / Real-Time PCR/ 45 Zyklen Probe B: < haploide Genomkopien; Dotierungsprobe: < haploide Genomkopien 20 div CTAB / Protease K / Chloroform + Promega Wizard/ Realtime PCR/ - / 45 Zyklen Seite 34 von 38

35 5.4 PCR: Weizen Primärdaten Auswertenummer Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 3b - positiv positiv Gluten SFA ID 19 positiv < 1 positiv 16 positiv 4779 glutenhaltige Getreide FA QUAN 1 negativ n.n. positiv * nachweisbar DNA-Weizen div positiv DNA-Weizen/Dinkel div 17 negativ positiv positiv Weizen div Hausmethode 20a negativ positiv positiv DNA-Weizen div interne Methode 20b negativ positiv positiv DNA-Weizen, DNA- Gerste, DNA-Roggen div interne Methode 3a - negativ positiv DNA-Weizen div interne Methode * nachweisbar Methoden: SFA ID = Sure Food Allergen S3106, R-Biopharm / Congen SFA QUANT = Sure Food Allergen S3206, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Sure Food Allergen, Congen/ r-biopharm Sure Food Allergen, Congen/ r-biopharm nach Iida et al.(2005) J Agric. Food Chem 53: Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Sonstige Hinweise Bestimmung) Target-Sequenz / -DNA z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen 3b SFA ID interne Methode 19 SFA QUANT glutenhaltige Getreide SureFood ALLERGEN QUANT Gluten S3206 Messbereich mg/kg 1 div 1. nach ASU 64 LFGB L (SDS/Guanidiniumchlorid-Puffer mit Proteinase Anwendungsbereich des PCR-Nachweises K, Aufarbeitung mittels Wizard-Kit der Fa. nicht geeignet für Allergennachweis von Gluten, Promega) daher Ergebnisangabe ausschließlich für 16 div waxy-d1 Gen (102 bp) 2. nach Holzhauser et al, 2000 (CTAB basiertes Dotierungsprobe und keine Ergebnisangaben Extrationsverfahren mit anschließender zu Proben A und B; Aufreinigung über Wizard-Kit der Fa. Dotierungsprobe: < haploide Promega) Genomkopien Real-time PCR mit 45 Zyklen 17 div < 100bp 2 g Probe, Macherey-Nagel Food / Real-Time PCR/ 45 Zyklen 20a div CTAB / Protease K / Chloroform + Promega Wizard/ Realtime PCR/ - / 45 Zyklen CTAB / Protease K / Chloroform + Promega 20b div Wizard/ Standard PCR/ 4% Agarosegel / 45 Zyklen 3a div interne Methode Seite 35 von 38

36 6. Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Teilnehmer / Participant Ort / Town Land / Country SPANIEN Deutschland FRANKREICH SCHWEIZ Deutschland BELGIEN Deutschland SPANIEN NIEDERLANDE Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland ÖSTERREICH SPANIEN ITALIEN Belgien ENGLAND BELGIEN SLOWAKEI [Die Adressdaten der Teilnehmer wurden für die allgemeine Veröffentlichung des Auswerte-Berichts nicht angegeben.] Seite 36 von 38

37 7. Verzeichnis relevanter Literatur 1. DIN EN ISO/IEC 17043:2010; Konformitätsbewertung Allgemeine Anforderungen an Eignungsprüfungen / Conformity assessment General requirements for proficiency testing 2. Verordnung / Regulation 882/2004/EU; Verordnung über amtliche Kontrollen / Regulation on official controls 3. DIN EN ISO/IEC 17025:2005; Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien / General requirements for the competence of testing and calibration laboratories 4. Richtlinie / Directive 1993/99/EU; über zusätzliche Maßnahmen im Bereich der amtlichen Lebensmittelüberwachung / on additional measures concerning the official control of foodstuffs 5. ASU 64 LFGB : Planung und statistische Auswertung von Ringversuchen zur Methodenvalidierung 6. DIN ISO 13528:2009; Statistische Verfahren für Eignungsprüfungen durch Ringversuche / Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons 7. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Laboratories ; J.AOAC Int., 76(4), (1993) 8. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Chemistry Laboratories ; Pure Appl Chem, 78, (2006) 9. Evaluation of analytical methods used for regulation of food and drugs;w. Horwitz; Analytical Chemistry, 54, (1982) 10.A Horwitz-like funktion describes precision in proficiency test; M. Thompson, P.J. Lowthian; Analyst, 120, (1995) 11.Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies; W. Horwitz; Pure & Applied Chemistry, 67, (1995) 12.Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing; M. Thompson; Analyst, 125, (2000) 13.Codex Alimentarius Commission (2010) - Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection, identification and quantification of specific DNA sequences and specific protiens in foods, CAC/GL DIN EN ISO :2009; Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren - Teil 1: Allgemeine Betrachtungen / Foodstuffs - Detection of food allergens by immunological methods - Part 1: General considerations 15.DIN EN ISO :2009; Nachweis von Lebensmittelallergenen mit molekularbiologischen Verfahren - Teil 1: Allgemeine Betrachtungen / Foodstuffs - Detection of food allergens by molecular biological methods - Part 1: General considerations 16.DIN EN ISO 15842:2010 Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen Allgemeine Betrachtungen und Validierung von Verfahren / Foodstuffs - Detection of food allergens - General considerations and validation of methods 17.Ministry of Health and Welfare, JSM, Japan Working Group Food Allergens, Abbott et al., Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods: Community Guidance and Best Practices JAOAC Int. 93: (2010) 19.Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT): Méndez et al. Report of a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked immunoassay to determine gliadin in gluten-free food. Eur J Gastroenterol Hepatol. 17: (2005) 20.DLA Publikation: Performance of ELISA and PCR methods for the determination of allergens in food: an evaluation of six years of proficiency testing for soy (Glycine max L.) and wheat gluten (Triticum aestivum L.); Scharf et al.; J Agric Food Chem. 61(43): (2013) 21.EFSA (2014) Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and Seite 37 von 38

38 food ingredients for labelling purposes1, EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy, EFSA Journal 2014;12(11): IRMM, Poms et al.; Inter-laboratory validation study of five different commercial ELISA test kits for determination of peanut residues in cookie and dark chocolate; European Commission, Joint Research Centre, Belgium; GE/R/FSQ/D08/05/ Jayasena et al. (2015) Comparison of six commercial ELISA kits for their specificity and sensitivity in detecting different major peanut allergens. J Agric Food Chem Feb 18;63(6): ASU 64 LFGB L Bestimmung von Erdnuss-Kontaminationen in Lebensmitteln mittels ELISA im Mikrotiterplattensystem (2003) 25.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Haselnuss-Kontaminationen in Schokolade und Schokoladenwaren mittels ELISA im Mikrotiterplattensystem (2006) 26.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Sojaprotein in Fleisch und Fleischerzeugnissen Enzymimmunologisches Verfahren (2007) DLA-02/2015-Allergene II 20 von 21 Teilnehmern haben mindestens ein Ergebnis eingereicht. Die Auswertung erfolgte hinsichtlich der Parameter Sojaprotein und Gluten für ELISA-Methoden und Soja und Weizen für PCR-Methoden. Zusätzlich wurden Wiederfindungsraten für die Dotierungsmaterialprobe und die dotierte Probe ermittelt. Details zu den einzelnen Parametern inklusive separater Auswertung nach Testkit-Herstellern sind dem Auswertebericht zu entnehmen. 13 Teilnehmer hatten ihren Sitz im Europäischen Ausland (Belgien, England, Frankreich, Italien, Österreich, Niederlande, Schweden, Schweiz, Slowakei, Spanien). Seite 38 von 38