Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung. DLA 01/2015 Allergene I. Milch und Fisch. in Trockensuppe

Transkript

1 DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung 01/2015 Allergene I: Milch und Fisch in Trockensuppe Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Waldemar-Bonsels-Weg Ahrensburg, Germany Koordinator der LVU: Dr. Matthias Besler Seite 1 von 41

2 Inhalt 1. Einleitung Durchführung Untersuchungsmaterial Homogenität Untersuchung Ergebnisübermittlung Auswertung Bezugswert (zugewiesener Wert) Standardabweichung Ausreißer Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Allgemeines Modell nach Horwitz Auswertung eines Versuchs zur Präzision Werte aus Erkenntnissen z-score Quotient Standardunsicherheit Graphische Darstellung der Bezugswerte Wiederfindungsraten: Dotierung Ergebnisse Vergleichsuntersuchung Fisch ELISA-Ergebnisse: Fisch PCR-Ergebnisse: Fisch Vergleichsuntersuchung Milch ELISA-Ergebnisse: Milchprotein ELISA-Ergebnisse: Casein ELISA-Ergebnisse: beta-lactoglobulin Dokumentation ELISA: Fisch ELISA: Milchprotein ELISA: Casein ELISA: beta-lactoglobulin PCR: Fisch Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Verzeichnis relevanter Literatur...40 Seite 2 von 41

3 1. Einleitung Die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen (LVU) ist ein unverzichtbarer Baustein für das Qualitäts-Management-System eines jeden, mit der Untersuchung von Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetik und Bedarfsgegenständen befassten Labors. Die Durchführung von Laborvergleichsuntersuchungen ermöglicht den teilnehmenden Instituten die eigene analytische Kompetenz unter realen Bedingungen nachzuweisen. Gleichzeitig erhalten sie wertvolle Daten zur Validität der durchgeführten Untersuchungsmethode. Das Ziel von DLA ist es, LVU für ausgesuchte Parameter in praxisrelevanten Konzentrationen anzubieten. Durchführung und Auswertung der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung erfolgten nach den technischen Anforderungen der DIN EN ISO/IEC (2010) und DIN ISO Durchführung 2.1 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung wurden zwei LVU-Proben für den Nachweis von Allergenen im mg/kg-bereich und eine Dotierungsmaterialprobe zur Verfügung gestellt. Die Dotierungsmaterialprobe enthält die betreffenden allergenen Zutaten im Bereich von 1-10 % und wurde der dotierten LVU-Probe zugesetzt. Die Untersuchungsergebnisse der Dotierungsmaterialprobe sollen im Vergleich zur dotierten LVU-Probe die Möglichkeit geben, die Nachweisbarkeit der Allergene ohne und mit Einfluss der Lebensmittelmatrix bzw. -prozessierung zu charakterisieren. Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um eine Trockensuppen-Zubereitung mit handelsüblichen Lebensmittelzutaten. Die Grundzusammensetzung war für beide Proben A und B gleich (s. Tabelle 1). Probe A wurde das Dotierungsmaterial mit den allergenen Zutaten Vollmilchpulver und Fischpulver zugesetzt. Die Zusammensetzung der Dotierungsmaterialprobe und die Gehalte der allergenen Zutaten in Probe A sind Tabelle 2 zu entnehmen. Die Proben wurden nach dem Homogenisieren zu Portionen von ca. 25 g abgefüllt. Seite 3 von 41

4 Tabelle 1: Zusammensetzung der DLA-Proben Zutaten Probe A Probe B Instant-Suppenpulver Zutaten: Instant-Weizenmehl, Salz, Gewürz-Mischung (Paprika, Zwiebeln, Majoran, Kümmel, Chillies, Knoblauch), Glucose 98,8 g/100 g 100 g/100 g Dotierungsmaterialprobe 1,2 g/100g - Tabelle 2: Zugesetzte Mengen allergener Zutaten Zutaten Dotierungsmaterialprobe Gehalt in Probe A Kartoffelmehl 81,5 % 0,99 % Milch: als Vollmilchpulver davon Gesamtprotein davon Casein* davon β-lactoglobulin* mg/kg (2,1 %) 5500 mg/kg 4400 mg/kg 550 mg/kg 256 mg/kg 67 mg/kg 54 mg/kg 6,7 mg/kg Fischwürz-Pulver Zutaten: Geschmacksverstärker E621 und E631, Salz, Glucose, Zucker, Bonito- Fischpulver 9%, Algenpulver Nährwertangaben pro 100g: Protein 23 g als Fischpulver mg/kg (16,4 %) mg/kg (1,47 %) 2000 mg/kg 180 mg/kg * aufgrund von Literaturdaten berechnet Seite 4 von 41

5 2.1.1 Homogenität Die Homogenität der dotierten Probe A wurde mittels ELISA-Tests als 5fach-Bestimmung geprüft (s. Abb. 1) und mit einer Standardabweichung zwischen den Proben von < 15% für das verwendete Verfahren als hinreichend gesichert angesehen (13, 14, 17, 18). Homogenitätsprüfung / Homogeneity Test - ELISA Ergebnisse in % des MW results in % of mean Milch / Milk, SD=4,6 Unabhängige Proben / independat samples, n = 5 Abb. 1: Homogenitätsprüfung der DLA-Probe A Darstellung der Ergebnisse relativ in Prozent des arithmetischen Mittelwerts 2.2 Untersuchung An jedes teilnehmende Institut wurden in der 4. Kalenderwoche 2015 je eine Portion der Untersuchungsmaterialien A und B sowie eine Dotierungsmaterialprobe verschickt. Die Untersuchungsverfahren wurden freigestellt. Die Untersuchungen waren durchzuführen bis spätestens 6. März Ergebnisübermittlung Die Ergebnisabgabe erfolgte einheitlich auf, an die teilnehmenden Institute versandten Übermittlungsbögen bzw. -dateien. Zur Auswertung kamen einerseits die Ergebnisse als positiv/negativ Angaben und andererseits angegebene Gehalte an allergenen Zutaten in mg/kg z.b. als Milchprotein / Casein / beta-lactoglobulin bzw. Fisch / Fischpulver. Abgefragt und dokumentiert wurden die o.g. Ergebnisse sowie Angaben zu den Testmethoden wie Spezifitäten, Testkit-Hersteller und Stichpunkte zur Durchführung der Methoden. Falls Teilnehmer mehrere Ergebnisse für denselben Parameter abgegeben haben, die mit unterschiedlichen Methoden erhalten wurden, wurden diese Ergebnisse mit derselben mit einem Buchstaben als Suffix unter Angabe der jeweiligen Methode ausgewertet. Alle Teilnehmer haben fristgerecht Ergebnisse abgegeben. Seite 5 von 41

6 3. Auswertung Verschiedene ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln können verschiedene Antikörper-Spezifitäten aufweisen, mit unterschiedlichem Referenzmaterial kalibriert worden sein und sich unterschiedlicher Extraktionsverfahren bedienen. Die verschiedenen ELISA- Methoden können daher zu einer unterschiedlichen Bewertung des Gehalts eines Analyten führen (20, 21, 22, 23). Aus diesem Grund werden die Ergebnisse, wenn möglich in der Auswertung verschiedenen Bezugswerten gegenübergestellt. Dadurch soll jedes einzelne Ergebnis im Vergleich mit dem Mittelwert aller eingesandten Ergebnisse und/oder im Vergleich mit dem Mittelwert aller Ergebnisse derselben Methode bewertet werden können. Zum Vergleich mit der rechnerisch zugesetzten Menge wurde diese in den graphischen Darstellungen der Ergebnisse mit angegeben. Für die ELISA-Ergebnisse der Dotierungsmaterialprobe und der dotierten Probe wurden anhand der bekannten Zusammensetzung Wiederfindungsraten berechnet und zur Information angegeben. Hierbei erfolgte keine statistische Auswertung. Die angegebenen Wiederfindungsraten dienen ausschließlich einer Einschätzung von Matrix- und/oder Prozessierungseinflüssen. Die PCR-Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. 3.1 Bezugswert (zugewiesener Wert) Da es sich bei dem untersuchten Material nicht um zertifiziertes Referenzmaterial handelt wird als Bezugswert (X) für die Auswertung der robuste Mittelwert der eingesandten Ergebnisse verwendet (6). Sofern eine Prüfung der Verteilung der eingesandten Ergebnisse Hinweise für Quellen von höherer Variabilität, wie z.b. eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, ergibt, werden zusätzlich als Bezugswerte die robusten Mittelwerte von Einzelmethoden herangezogen. Bei den ELISA-Methoden zur Bestimmung von Allergenen wird, wenn möglich, stets so vorgegangen: i) Robuster Mittelwert aller Ergebnisse - X ALL ii) Robuster Mittelwert von Einzelmethoden - X METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. Einzelergebnisse die außerhalb des angegebenen Messbereiches eines teilnehmenden Labors liegen (z.b. mit der Angabe > 25 mg/kg oder < 2,5 mg/kg) werden für die statistische Auswertung berücksichtigt, sofern eine Angabe mit > oberhalb und eine Angabe mit < unterhalb des Zielbereichs liegt. Seite 6 von 41

7 3.2 Standardabweichung Zum Vergleich mit der Zielstandardabweichung wird ebenfalls die robuste Standardabweichung (S x ) berechnet (6). Folgende robuste Standardabweichungen werden herangezogen: i) Robuste Standardabweichung aller Ergebnisse - S x ALL ii) Robuste Standardabweichung von Einzelmethoden - S x METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. 3.3 Ausreißer Auf Ausreißer wird mittels Mandel s-h-statistik Signifikanz-Niveau 95% geprüft (5). Ermittelte Ausreißer werden informativ genannt sofern gleichzeitig der z-score des Instituts < -2 oder > 2 ist. 3.4 Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Die Zielstandardabweichung des Bezugswertes wird nach unten dargestellten, unterschiedlichen Verfahren bestimmt Allgemeines Modell nach Horwitz Die relative Zielstandardabweichung in % des Bezugswertes wird i.d.r. nach folgender Gleichung (Horwitz ) berechnet σ (%) = 2 (1-0,5logX) hieraus wird die Zielstandardabweichung in mg/kg berechnet σ = X * σ (%) / 100. Die Zielstandardabweichung nach Horwitz wird z.z. in der Praxis von ELISA-Verfahren mit Messwerten im mg/kg Bereich nur in Ausnahmefällen erreicht Auswertung eines Versuchs zur Präzision Aus der Vergleichstandardabweichung σ R und der Wiederholstandardabweichung σ r eines Versuchs zur Präzision einer Methode (z.b. aus Ringversuchen nach ASU 64 LFGB) wird die Standardabweichung zwischen Laboratorien σ L berechnet: L = R 2 r 2. Aus den obigen Größen und der Anzahl der Wiederholmessungen n der laufenden Vergleichsuntersuchung wird nun die Zielstandardabweichung berechnet: = L 2 r 2 /n. Da in der vorliegenden Vergleichsuntersuchung die Anzahl der Seite 7 von 41

8 Wiederholmessungen n = 1 ist, ist die Vergleichsstandardabweichung σ R gleich der Zielstandardabweichung σ. Nachstehend sind die relativen Vergleichsstandardabweichungen aus Ringversuchen einiger ELISA-Methoden nach ASU 64 angegeben (24, 25, 26): Methode Parameter Matrix Mittelwerte Relative σ R Literatur ELISA Sojaprotein Brühwurst 0,36-4,07% 14-28% L ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. B) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) Erdnuss Erdnuss Erdnuss Haselnuss Haselnuss Vollmilchschokolade Vollmilchschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade 5,9-174 mg/kg 20-31% L ,1-216 mg/kg 14-32% L ,7-148 mg/kg 22-33% L ,6-16,3 mg/kg 12-33% L ,4-21,3 mg/kg 14-19% L Aus den o.g. Präzisionsdaten der ASU 64 Methoden ergeben sich relative Zielstandardabweichungen im Bereich von 12-33%. Das IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) hat in einem Ringversuch die Eignung fünf verschiedener ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Erdnuss getestet (22). Die Mittelwerte lagen im Konzentrationsbereich von 0,3-16,1 mg/kg bzw. 1,2-20,4 mg/kg. Die jeweils niedrigsten relativen Vergleichsstandardabweichungen der fünf Test-Kits lagen für die Matrix Bitterschokolade bei 20-42% und für Kekse bei 23-61%. Štumr et al. haben je einen Ringversuch zur Validierung eines kommerziellen ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von β-lactoglobulin und zur Bestimmung von Casein durchgeführt (27, 28). Es wurden 20 Lebensmittelproben mit β-lactoglobulin im Bereich von 0-33 mg/kg von 6 Laboratorien untersucht. Die Wiederfindungsraten lagen bei %. Die relativen Wiederholstandardabweichungen lagen bei 5,8-13% und die relativen Vergleichsstandardabweichungen bei 26-49% (27). Casein wurde von 8 Laboratorien in 10 Lebensmittelproben im Bereich von 0-30 mg/kg und in 3 Lebensmitteln mit >30 mg/kg bestimmt. Die Wiederfindungsraten lagen bei 67-81%. Die relativen Wiederholstandardabweichungen lagen bei 11-52% und für eine Probe bei 99% und die relativen Vergleichsstandardabweichungen bei 13-61% und für zwei Proben bei 96% bzw. 111% (28). Laut der Autoren lieferten beide ELISA-Test-Kits akzeptable Validierungsergebnisse für die Routinekontrollen von Lebensmitteln (27, 28). Seite 8 von 41

9 3.4.3 Werte aus Erkenntnissen Die Zielstandardabweichung kann für die Eignungsbeurteilung auf einen Wert festgesetzt werden, der dem Leistungsfähigkeitsniveau entspricht, das der Koordinator für ein wünschenswertes Ziel für die teilnehmenden Laboratorien hält (6). Anforderungen an die Leistungsfähigkeit der Analysenmethoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln sind u.a. vom Ministry of Health and Welfare (MHLW) in Japan (17), von der Arbeitsgruppe 12 Lebensmittelallergene des Technischen Komitees CEN/TC 275 (14-16), von einer internationalen "Food Allergen Working Group" unter der Leitung der AOAC Presidential Task Force on Food Allergens (18) und vom Codex Alimentarius Commitee (CAC/GL ) (13) erarbeitet worden. Die hier relevanten ELISA- bzw. PCR-Validierungskriterien der Gremien sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben. Tabelle 3: ELISA-Validierungskriterien Literatur (14, 17, 18, 13) Wiederfindungsrate MHLW % 25% CEN % AOAC % 6,9-34,4% (a) 19,5-57,2 (a) CAC % 25% 35% (a) = Beispiel aus hypothetischem Ringversuch im Konzentrationsbereich von 0,5-5 mg/kg Tabelle 4: PCR-Validierungskriterien Literatur (13) Wiederfindungsrate Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung CAC 2010 ± 25% (a) 25% 35% (a) = Trueness / Richtigkeit Aufgrund der derzeitigen Leistungsfähigkeiten von ELISA- bzw. PCR-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln, die sich aus den Präzisionsdaten von Versuchen und aus den o.g. Validierungsanforderungen ableiten lassen, legen wir für die relative Zielstandardabweichung σ einen Wert von 25% fest. Diese Zielstandardabweichung wurde zur statistischen Bewertung der Ergebnisse mittels z-score herangezogen und auf alle unter 3.1 angegebenen Bezugswerte angewandt. Seite 9 von 41

10 3.5 z-score Der z-score wird herangezogen zur Beurteilung der Ergebnisse der teilnehmenden Institute. Er besagt um welches Vielfache der Zielstandardabweichung ( σ ) das Ergebnis (x) des betreffenden teilnehmenden Instituts vom Bezugswert (X) abweicht (6). Die Berechnung erfolgt nach z = (x X) / σ ; die Anforderungen an die Analytik gelten im Allgemeinen als erfüllt, wenn -2 z 2. Zur Bewertung wurden nachstehende z-scores mit einer Zielstandardabweichung von 25% in der Auswertung angegeben: i) z-score - z ALL (bezogen auf alle Ergebnisse) ii) z-score - z METHOD i (bezogen auf Einzelmethoden) 3.6 Quotient S x / In Anlehnung an den Horrat-Wert kann die Bewertung einer Laborvergleichsuntersuchung als aussagekräftig gelten, wenn der Quotient von robuster Standardabweichung und Zielstandardabweichung nicht über 2 liegt. Ein über 2 liegender Wert bedeutet, dass die Präzision nicht zufriedenstellend ist, d.h., dass die Präzision aus analytischen Gründen zu variabel ist oder die festgestellte Variation höher ist als für die angewandte Methode geschätzt wurde. Somit ist eine Vergleichbarkeit der Messergebnisse nicht gewährleistet (11). 3.7 Standardunsicherheit Jeder Bezugswert ist mit einer Standardunsicherheit behaftet, die von der Analysenmethode, Unterschieden der eingesetzten Analysenmethoden, dem Probenmaterial und der Anzahl der Teilnehmer (P) einer LVU beeinflußt wird. Die Standardunsicherheit (U x ) wird für die vorliegende LVU wie folgt berechnet (6). u X =1,25 S x / p Ist u X 0,3 muss die Standardunsicherheit des Bezugswertes nicht berücksichtigt werden (6). Seite 10 von 41

11 3.8 Graphische Darstellung der Bezugswerte Die Bezugswerte werden als farbige Linien in den Abbildungen der Ergebnisse dargestellt. Dies ermöglicht einen optischen Vergleich der Einzelergebnisse mit den verschiedenen Bezugswerten für das Zusatzniveau eines Analyten einerseits und die robusten Mittelwerte über alle Methoden bzw. über Einzelmethoden andererseits. 3.9 Wiederfindungsraten: Dotierung Für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe werden Wiederfindungsraten in Bezug auf die zugesetzten Allergene berechnet. Die Bezugswerte ergeben sich aus den unter 2.1 Untersuchungsmaterial in Tabelle 1 angegebenen Gehalten. Als Akzeptanzbereich AB für die Bewertung der Teilnehmerergebnisse wird der von der AOAC vorgeschlagene Bereich von % für die Wiederfindungsraten von Allergen-ELISAs herangezogen (18). Für quantitative PCR-Bestimmungen wird ebenfalls dieser Akzeptanzbereich herangezogen. Seite 11 von 41

12 4. Ergebnisse Alle folgenden Tabellen sind anonymisiert. Den teilnehmenden Instituten wird mit dem Versand dieser Auswertung ihre individuelle mitgeteilt. Die folgenden Ergebnisseiten sind für die allergenen Bestandteile jeweils gleich aufgebaut. Es werden zunächst die Ergebnisse aller Methoden zu einem Parameter für die Probe A und dann für die Probe B angegeben. ELISA-Ergebnisse, die als Magermilchpulver angegeben wurden, sind in Gesamt-Milchprotein, sofern angegeben unter Berücksichtigung der Angaben des betreffenden Testkit-Herstellers, umgerechnet worden. Dabei wurde ein Protein-Gehalt von 36% für Magermilchpulver zugrunde gelegt. Bei Fisch wurde eine Trockenmasse von 20% und ein Proteingehalt von 18% zur Umrechnung von Frischfisch, Fischpulver und Fischprotein stark verallgemeinernd angenommen (angelehnt an Literaturangaben für Kabeljau, Souci Nährwerttabellen). Die Auswertung erfolgte getrennt nach ELISA und PCR-Ergebnissen. Die Ergebnisse wurden nach durchgeführten Methoden zusammengefasst und die n innerhalb der Gruppen aufsteigend sortiert. Die Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. Für jeden Teilnehmer wird in Bezug auf die Konsens-Ergebnisse eine qualitative Bewertung vorgenommen. Hier wurde die Übereinstimmung mit den Konsens-Werten in Prozent angegeben. Gegebenenfalls werden anschließend die Ergebnisse aller Methoden und von Einzelmethoden mit mindestens 5 quantitativen Ergebnissen statistisch ausgewertet. In den Fällen, in denen eine statistische Auswertung der quantitativen Messergebnisse durchgeführt wurde, werden die Ergebnisse tabellarisch folgendermaßen aufgeführt : Ergebnis Ergebnis z-score z-score Methode Hinweis X ALL X M i pos/neg [m g/kg] X All X Method i Seite 12 von 41

13 Die Kenndaten der jeweiligen Vergleichsuntersuchung werden aufgeführt, falls wenigstens 50% positive Ergebnisangaben und mindestens 5 quantitative Messergebnisse vorliegen: Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode i [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Method i Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse Robuster Mittelwert (X) Robuste Standardabweichung (S x ) Median Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) untere Grenze des Zielbereichs (X - 2 σ ) obere Grenze des Zielbereichs (X + 2 σ ) Quotient S x / σ Standardunsicherheit u X Quotient u X / Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Im Anschluss erfolgt die Darstellung der Wiederfindungsraten für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe. Die Anzahl der Ergebnisse im Akzeptanzbereich von % wird aufsummiert. Seite 13 von 41

14 4.1 Vergleichsuntersuchung Fisch ELISA-Ergebnisse: Fisch Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 4a negativ < 50 negativ < 50 - AQ als Thunfisch 4b negativ < 4 negativ < 4 - AQ als Kabeljau 8 negativ < 5 negativ < 5 - BC als Fisch, frisch 12 positiv negativ - IL als Fisch, frisch 5 negativ < 4 negativ < 4 - NL als Fischprotein Probe A Probe B Anzahl positiv 1 0 Anzahl negativ 4 5 Prozent positiv 20 0 Prozent negativ Konsenswert negativ negativ Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BC = Bio-Check IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Fisch mittels ELISA zu 80% negative Ergebnisse für Probe A und 100% negative für Probe B erhalten. Nur ein Teilnehmer hat mittels ELISA ein positives Ergebnis für Probe A erhalten. Die Mehrzahl der Ergebnisse steht somit nicht in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe A. Eine qualitative Bewertung anhand der Konsenswerte wurde daher nicht vorgenommen. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe A Aufgrund nicht ausreichender Angaben erfolgte keine quantitative Auswertung der Ergebnisse. Seite 14 von 41

15 Wiederfindungsraten für Fisch: Dotierungsmaterialprobe und Probe A Dotierungsmaterial [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Wiederfindungsrate Probe A Wiederfindungsrate Methode Hinweis 4a 1991,86 3 < 50 AQ als Thunfisch 4b 16,03 0 < 4 AQ als Kabeljau 8 < 5 < 5 BC als Fisch, frisch 12 IL als Fisch, frisch 5 33,0 0 < 22 NL als Fisch. frisch (Ergebnis umgerechnet) AB* % AB* % Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 0 Prozent im AB 0 Prozent im AB 0 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BC = Bio-Check IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia Anmerkung: Aufgrund der geringen Anzahl von quantitativen Ergebnissen und da seitens der Testkit-Hersteller teilweise darauf hingewiesen wird, dass Fisch-Spezies spezifische Unterschiede bestehen und eine Verarbeitung / Prozessierung von Fisch zu einer geringeren Sensitivität der ELISA-Methode führen kann (z.b. Faktor 100 für Fischkonserven gegenüber Frischfisch) lassen sich keine belastbaren Aussagen aus den vorliegenden ELI- SA-Ergebnissen ableiten. Keiner der Teilnehmer hat Ergebnisse als "Fischpulver" angegeben, obwohl die Proben in Pulverform vorlagen. Daher wurde für den Fisch-Gehalt in der Dotierungsmaterialprobe und der dotierten Probe von DLA der Fischpulvergehalt in Frischfisch umgerechnet (mit 20% Trockenmasse). Keiner der Teilnehmer hat in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Für die mit dem Dotierungsmaterial hergestellte Trockensuppen-Probe A wurden keine quantitativen Ergebnisse angegeben. Seite 15 von 41

16 4.1.2 PCR-Ergebnisse: Fisch Probe A Probe A Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg Übereinstimmungen mit Konsenswerten 2 positiv negativ 2/2 (100%) SFA ID 3 positiv negativ 2/2 (100%) SFA ID 6 positiv negativ 2/2 (100%) SFA ID 14 positiv negativ 2/2 (100%) SFA ID 7 positiv negativ 2/2 (100%) div 11 negativ negativ 1/2 (50%) div 15 positiv negativ 2/2 (100%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 6 0 Anzahl negativ 1 7 Prozent positiv 86 0 Prozent negativ Konsenswert positiv negativ Methoden: SFA ID = Sure Food Allergen S3110, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Fisch mittels PCR wurden 86% positive Ergebnisse für Probe A und 100% negative Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe A. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe A Eine quantitative Auswertung erfolgte nicht, weil nur qualitative Ergebnisse vorlagen. Wiederfindungsraten für Fisch: Dotierungsmaterialprobe und Probe A Eine Bestimmung der Wiederfindungsraten erfolgte nicht, weil nur qualitative Ergebnisse vorlagen. Es wurden für die Dotierungsmaterialprobe 100% positive Ergebnisse angegeben (s. Dokumentation). Seite 16 von 41

17 4.2 Vergleichsuntersuchung Milch ELISA-Ergebnisse: Milchprotein Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 12a positiv 52,9 negativ < 0,26 2/2 (100%) IL Ergebnis umgerechnet 12b positiv 55,8 negativ < 0,4 2/2 (100%) IL Ergebnis umgerechnet 5 positiv 83,2 negativ < 0,32 2/2 (100%) NL Ergebnis umgerechnet 1 positiv 41,6 negativ 2/2 (100%) RS1 2 positiv 49,3 negativ < 2,5 2/2 (100%) RS1 3 positiv 17,2 negativ 2/2 (100%) RS1 4 positiv 16,55 negativ < 2,5 2/2 (100%) RS1 7 positiv 37 negativ < 2,5 2/2 (100%) RS1 11 positiv 36 negativ 2/2 (100%) RS1 13 positiv negativ 2/2 (100%) RS1 9 positiv 62 negativ < 0,9 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet 14 positiv 65,5 negativ < 0,9 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet 15 positiv 64,8 negativ < 0,9 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet Probe A Probe B Anzahl positiv 13 0 Anzahl negativ 0 13 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert positiv negativ Methoden: IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast VT = Veratox, Neogen Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Gesamt-Milchprotein mittels ELISA zu je 100% positive Ergebnisse für Probe A und negative für Probe B erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe A. Seite 17 von 41

18 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe A Milchprotein [m g/kg] z-score X ALL Bezug X ALL z-score X RS X Methode RS Methode Hinweis 12a 52,9 0,4 IL Ergebnis umgerechnet 12b 55,8 0,6 IL Ergebnis umgerechnet 5 83,2 2,9 NL Ergebnis umgerechnet 1 41,6-0,6 1,1 RS1 2 49,3 0,1 2,0 RS1 3 17,2-2,6-1,9 RS1 4 16,55-2,6-2,0 RS ,9 0,5 RS ,0 0,4 RS ,1 VT Ergebnis umgerechnet 14 65,5 1,4 VT Ergebnis umgerechnet 15 64,8 1,4 VT Ergebnis umgerechnet Methoden: IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast VT = Veratox, Neogen Seite 18 von 41

19 Kenndaten: Quantitative Auswertung Milchprotein Probe A Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 12 6 Robuster Mittelwert (X) 48,4 32,9 Robuste Standardabweichung (S x ) 22,3 15,1 Median 51,1 36,5 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 12,1 8,23 untere Grenze des Zielbereichs 24,2 16,5 obere Grenze des Zielbereichs 72,6 49,4 Quotient S x / σ 1,8 1,8 Standardunsicherheit u X 8,1 7,7 Quotient u X / σ 0,67 0,94 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast 9 (75%) 6 (100%) Anmerkung: Die Auswertungen der Ergebnisse aller Methoden und von Methode RS1 zeigten eine akzeptable Variabilität der Ergebnisse. Die Quotienten S x / σ lagen unter 2,0. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist gegeben. Die Mittelwerte der Auswertungen lagen bei ca. 70% bzw. 50% vom Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für Milchprotein" S.22). Seite 19 von 41

20 120 Probe A: Ergebnisse / Sample A: Results mg/kg a 12b / Evaluation number Abb. 2: ELISA-Ergebnisse Milch (als Milchprotein) grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe A / Sample A z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, a 12b Ausw ertenummer / Evaluation number Abb. 3: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Milchprotein) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 20 von 41

21 3,0 Probe A / Sample A z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, / Evaluation number Abb. 4: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Milchprotein) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS1 (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 21 von 41

22 Wiederfindungsraten für Milchprotein: Dotierungsmaterialprobe und Probe A [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe A Wiederfindungsrate Methode Hinweis 12a ,9 79 IL Ergebnis umgerechnet 12b 6544, ,8 83 IL Ergebnis umgerechnet , ,2 124 NL Ergebnis umgerechnet ,6 62 RS ,3 74 RS1 3 > 67,5 17,2 26 RS , ,55 25 RS RS RS VT Ergebnis umgerechnet 14 > ,5 98 VT Ergebnis umgerechnet ,8 97 VT Ergebnis umgerechnet AB* % AB* % Anzahl im AB 8 Anzahl im AB 10 Prozent im AB 80 Prozent im AB 83 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast VT = Veratox, Neogen Anmerkung: 80% der Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Trockensuppen-Probe A lagen 83% der Wiederfindungsraten in diesem Akzeptanzbereich. Seite 22 von 41

23 4.2.2 ELISA-Ergebnisse: Casein Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 10 positiv 65 negativ < 0,2 2/2 (100%) AQ 5 positiv 64,2 negativ < 0,25 2/2 (100%) NL 2 positiv 58 negativ < 2,5 2/2 (100%) RS1 3 positiv 30,3 negativ 2/2 (100%) RS1 4 positiv 36,4 negativ < 2,5 2/2 (100%) RS1 6 positiv 42 negativ < 2,5 2/2 (100%) RS1 8 positiv 57 negativ < 0,5 2/2 (100%) RS1 Probe A Probe B Anzahl positiv 7 0 Anzahl negativ 0 7 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert positiv negativ Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Casein mittels ELISA zu je 100% positive Ergebnisse für Probe A und negative für Probe B erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe A. Seite 23 von 41

24 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe A Casein z-score z-score Methode Hinweis X ALL X RS [m g/kg] Bezug X ALL X Methode RS ,2 AQ 5 64,2 1,1 NL ,6 1,2 RS1 3 30,3-1,6-1,3 RS1 4 36,4-1,1-0,7 RS ,7-0,2 RS ,5 1,1 RS1 Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast Seite 24 von 41

25 Kenndaten: Quantitative Auswertung Casein Probe A Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 7 5 Robuster Mittelwert (X) 50,4 44,7 Robuste Standardabweichung (S x ) 15,9 14,0 Median 57,0 42,0 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 12,6 11,2 untere Grenze des Zielbereichs 25,2 22,4 obere Grenze des Zielbereichs 75,6 67,1 Quotient S x / σ 1,3 1,3 Standardunsicherheit u X 7,5 7,8 Quotient u X / σ 0,60 0,70 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast 7 (100%) 5 (100%) Anmerkung: Die Auswertungen der Ergebnisse aller Methoden und von Methode RS zeigten eine geringe Variabilität der Ergebnisse. Die Quotienten S x / σ lagen deutlich unter 2,0. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist gegeben. Die Mittelwerte der Auswertungen lagen bei 93% bzw. 83% vom Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für Casein" S.28). Seite 25 von 41

26 mg/kg Probe A: Ergebnisse / Sample A: Results / Evaluation number Abb. 5: ELISA-Ergebnisse Casein grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe A / Sample A z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, / Evaluation number Abb. 6: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Casein) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 26 von 41

27 3,0 Probe A / Sample A z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, / Evaluation number Abb. 7: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Casein) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 27 von 41

28 Wiederfindungsraten für Casein: Dotierungsmaterialprobe und Probe A [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe A Wiederfindungsrate Methode Hinweis AQ ,2 119 NL RS ,3 56 RS , ,4 67 RS1 6 > RS RS1 AB* % AB* % Anzahl im AB 3 Anzahl im AB 7 Prozent im AB 50 Prozent im AB 100 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast Anmerkung: 50% (3 von 6) der Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Trockensuppen-Probe A haben 100% der Teilnehmer eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung erhalten. Die Wiederfindungsraten lagen hier im Bereich von %. Seite 28 von 41

29 4.2.3 ELISA-Ergebnisse: beta-lactoglobulin Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 10 positiv 0,49 negativ < 0,1 2/2 (100%) ES 5 positiv 0,72 negativ < 0,015 2/2 (100%) NL 4 positiv 1,43 negativ < 0,5 2/2 (100%) RS1 6 positiv 4 negativ < 0,5 2/2 (100%) RS1 3b positiv 0,19 0,5 negativ 2/2 (100%) RS1 3a positiv 2,3 negativ 2/2 (100%) RS2 Probe A Probe B Anzahl positiv 6 0 Anzahl negativ 0 6 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert positiv negativ Methoden: ES = ELISA-Systems NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von beta-lactoglobulin mittels ELISA zu 100% positive Ergebnisse für Probe A und zu 100% negative für Probe B erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe A. Seite 29 von 41

30 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe A beta-lg z-score X ALL [mg/kg] Bezug X ALL Methode 10 0,49-2,7 ES 5 0,72-2,1 NL 4 1,43-0,2 RS ,7 RS1 Hinweis 3b < 0,5 < -2,7 RS1 0,19 0,5 mg/kg 3a 2,3 2,1 RS2 Methoden: ES = ELISA-Systems NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Seite 30 von 41

31 Kenndaten: Quantitative Auswertung beta-lactoglobulin Probe A Kenndaten Bezugswert (X) Alle Ergebnisse [mg/kg] Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse 6 X ALL Robuster Mittelwert (X) 1,52 Robuste Standardabweichung (S x ) 1,43 Median 1,08 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 0,38 untere Grenze des Zielbereichs 0,76 obere Grenze des Zielbereichs 2,28 Quotient S x / σ 3,8 Standardunsicherheit u X 0,73 Quotient u X / 1,9 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich 0 (0%) Anmerkung: Die Auswertung der Ergebnisse aller Methoden zeigte eine erhöhte Variabilität der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ lag deutlich über 2,0. Kein Ergebnis lag im Zielbereich. Es lagen von einer Einzelmethode maximal 3 Ergebnisse vor. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist bei dem vorliegenden Zusatzniveau und der geringen Anzahl von Ergebnissen bezüglich beta-lactoglobulin eingeschränkt. Der Mittelwert der Auswertung lag etwa um den Faktor 4-5 unter dem Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für beta-lactoglobulin" S.33). Seite 31 von 41

32 mg/kg 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Probe A: Ergebnisse / Sample A: Results < b 3a / Evaluation number Abb. 8: ELISA-Ergebnisse beta-lactoglobulin grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse 4,0 Probe A / Sample A z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 3,0 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3,0-4,0 < 10 3b 5 4 3a 6 / Evaluation number Abb. 9: z-scores (ELISA-Ergebnisse als beta-lactoglobulin) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 32 von 41

33 Wiederfindungsraten für beta-lactoglobulin: Dotierungsmaterialprobe und Probe A [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe A Wiederfindungsrate Methode Hinweis ,49 7 ES 5 64,1 12 0,72 11 NL 4 322, ,43 21 RS1 6 > RS1 3b 8,3 2 < 0,5 < 7 RS1 A: 0,19 0,5 mg/kg 3a ,3 34 RS2 AB* % AB* % Anzahl im AB 1 Anzahl im AB 1 Prozent im AB 20 Prozent im AB 17 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: ES = ELISA-Systems NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Anmerkung: Jeweils ein Teilnehmer hat in der Dotierungsmaterialprobe bzw. in der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Trockensuppen-Probe A mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Seite 33 von 41

34 5. Dokumentation Angaben der Teilnehmer 5.1 ELISA: Fisch Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter Fisch (Kabeljau) 4a negativ < 50 negativ < 50 positiv 1991,86 umgerechnet gemäß Kreuzreaktivität zu AQ AgraQuant ELISA Fish (COKAL2548), RomerLabs Thunfisch 4b negativ < 4 negativ < 4 positiv 16,03 Fisch (Kabeljau) AQ 8 - < 5 - < 5 - < 5 Fisch (roher Kabeljau)* BC 12 positiv negativ positiv Fisch, frisch IL 5 negativ < 4 negativ < 4 positiv 6,0 Fischprotein NL AgraQuant ELISA Fish (COKAL2548), RomerLabs Bio-check Fish-check ELISA, R6010 Immunolab Fisch ELISA TRANSIA nutri linea Fish-E Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BC = Bio-Check IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Sonstige Hinweise Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur AQ Parvalbumin Nach Kit-Anweisungen mit Anhang zur Quantifizierung von Thunfisch angegeben als frischer Thunfisch AQ Parvalbumin Nach Kit-Anweisungen angegeben als frischer Kabeljau BC Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Polyklonale Antikörper gegen Kabelja-Parvalbumin BG ist 5 mg Fisch (roher Kabeljau)/kg. Aber die BG unterscheidet sich für verschiedene Fischspezies und ist z.b. 10 ppm für Extraktionspuffer Tris-glycin, 0.4 g Probe und 3.5 ml Schellfisch und 100 ppm für Lachs. Puffer. 19 min bei Raumtemperatur und schütteln für Darüberhinaus setzt Lebensmitteldie ersten und letzten 2 min Prozessierung die Sensitivität herab. Bei Anchovies in Konserven beträgt die BG ppm. IL Fischprotein NL Fischprotein Extraktionslösung / 15 min / 60ºC Seite 34 von 41

35 5.2 ELISA: Milchprotein Primärdaten Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur IL Casein IL Milchproteine, gesamt NL Casein Extraktionslösung / 15 min / 60ºC RS1 Milchproteine, gesamt nach Testvorschrift RS1 nach Anleitung des Herstellers RS1 Caseine und beta- Lactoglobulin aus Kuh-, Schaf-, Ziegen- und Büffelnach Kit-Anweisungen RS1 Milch RS1 Milchproteine, gesamt Extraktor 2+A-AEP-Puffer; 10 min, 60 C RS1 Milchproteine, gesamt 1 g Probe / 4 ml Lösung 2 Extraktion / 10 min / Temperatur 100 C, abkühlen in Wasserbad / Zugabe von 16 ml Extraktion mit Additive-1 Lösung / RS1 Milchproteine, gesamt inkubieren bei 60 C für 10 min in Wasserbad / zentrifugieren für 10 min bei 4050 rpm / filtrierter NWG= 7,5 mg/kg Überstand / weiter zur ELISA Bestimmung Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 12a positiv 147 negativ < 0,72 positiv Magermilchpulver IL 12b positiv 155 negativ < 1,1 positiv Magermilchpulver IL 5 positiv 231,1 negativ < 0,9 positiv 8906,4 Magermilchpulver NL 1 positiv 41,6 negativ positiv 4558 Milchproteine, gesamt RS1 2 positiv 49,3 negativ < 2,5 positiv 8156 Angabe als Milchprotein RS1 3 positiv 17,2 negativ positiv > 67,5 Milchproteine, gesamt RS1 4 positiv 16,55 negativ < 2,5 positiv 4268,83 Milchprotein RS1 7 positiv 37 negativ < 2,5 positiv 600 Milchproteine, gesamt RS1 11 positiv 36 negativ positiv RS1 13 positiv negativ positiv RS ,2 - < 2, Gesamtmilch VT 14 positiv 182 negativ < 1 positiv > 2500 Magermilchpulver VT 15 positiv 180 negativ < 2,5 positiv Magermilchpulver VT Immunolab Casein ELISA Immunolab Milch ELISA TRANSIA nutri linea Casein Ridascreen Fast Milk (R4652), r-biopharm Ridascreen FastMilk (R4652), r-biopharm Ridascreen Fast Milk (R4652), r-biopharm Ridascreen Fast Milk (R4652), r-biopharm Ridascreen Fast Milk (R4652), r-biopharm Ridascreen Fast Milk (R4652), r-biopharm Ridascreen Fast Milk (R4652), r-biopharm Veratox Total Milk Allergen, Neogen Veratox Total Milk Allergen, Neogen Veratox Total Milk Allergen, Neogen Methoden: IL = Immunolab NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast VT = Veratox, Neogen Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Sonstige Hinweise VT Casein und Molkeprotein nach Anleitung, Probe A 1:30 verdünnt, Dotierungsprobe 1:3000 verdünnt VT k.a. - Nachweisgrenze 1 mg/kg VT Milchproteine, gesamt erfasst Milch- und Molkeproteine Seite 35 von 41

36 5.3 ELISA: Casein Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 10 positiv 65 negativ < 0,2 positiv 9400 Casein AQ 5 positiv 64,2 negativ < 0,25 positiv 2474 Casein NL 2 positiv 58 negativ < 2,5 positiv 7258 Angabe als Casein RS1 3 positiv 30,3 negativ positiv 916 Casein RS1 4 positiv 36,4 negativ < 2,5 positiv 2645,59 Casein RS1 6 positiv 42 negativ < 2,5 positiv > 70 Casein RS < 0, Casein RS1 AgraQuant Casein (COKAL1200), RomerLabs TRANSIA nutri linea Casein RIDASCREEN FAST Casein (R4612), r-biopharm Ridascreen Fast Casein (R4612), r-biopharm Ridascreen Fast Casein (R4612), r-biopharm Ridascreen Fast Casein (R4612), r-biopharm R-biopharm, RIDASCREEN Fast Casein R4612, Lot Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 10 AQ Casein Nach Testanleitung 5 NL Casein Extraktionslösung / 15 min / 60ºC 2 RS1 Aufarbeitung mit RIDA Extraktionslösung (R7099), r- biopharm 3 RS1 4 RS1 Casein aus Kuh-, Schaf-, nach Kit-Anweisungen mit Extraktor 2 Ziegen- und Büffel-Milch Extraktionsmethode Extraktion: Allergen-Extraktionspuffer mit Additiv 1 6 RS1 Casein (AAEP) Probenextraktion mit Extraktor 2 (RIDASCREEN FAST Casein ) 8 RS1 alpha, beta, kappa Casein 1g Probe + 20 ml vorgewärmter Extraktionspuffer. 10 min bei 60 C. Sonstige Hinweise Seite 36 von 41

37 5.4 ELISA: beta-lactoglobulin Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 10 positiv 0,49 negativ < 0,1 positiv 44 beta-lactoglobulin ES ELISA-Systems β-lactoglobulin Residue Detection ELISA 5 positiv 0,72 negativ < 0,015 positiv 64,1 beta-lactoglobulin NL TRANSIA nutri linea BLG 3a positiv 0,19-0,5 negativ positiv 8,3 beta-lactoglobulin RS1 Ridascreen Fast β-lactoglobulin (R4902), r- Biopharm 4 positiv 1,43 negativ < 0,5 positiv 322,46 beta-lactoglobulin Ridascreen Fast β-lactoglobulin (R4902), r- RS1 Biopharm 6 positiv 4 negativ < 0,5 positiv > 14 beta-lactoglobulin RS1 Ridascreen Fast β-lactoglobulin (R4902), r- Biopharm 3b positiv 2,3 negativ positiv 22 beta-lactoglobulin RS2 Ridascreen β-lactoglobulin (R4901), r-biopharm Methoden: ES = ELISA-Systems NL = TRANSIA, nutrilínia RS1 = R-Biopharm, Ridascreen Fast RS2 = R-Biopharm, Ridascreen Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 10 ES beta-lactoglobulin Nach Testanleitung 5 NL beta-lactoglobulin Extraktionslösung / 15 min / 60ºC 3a RS1 beta-lactoglobulin aus Kuh-, 4 Schaf-, Ziegen- und Büffel- Nach Testanleitung RS1 Milch 6 RS1 beta-lactoglobulin 3b RS2 Hausmethode Sonstige Hinweise Seite 37 von 41

38 5.5 PCR: Fisch Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 2 positiv negativ positiv Angabe als Fisch SFA ID SureFood Allergen Fish (S3110), Congen/r-biopharm 3 positiv negativ positiv DNA-Fish SFA ID Sure Food ALLERGEN Fish S3110, Congen / r-biopharm 6 positiv negativ positiv DNA-Fish SFA ID Sure Food ALLERGEN Fish S3110, Congen / r-biopharm 14 positiv negativ positiv DNA-Fisch SFA ID Sure Food ALLERGEN Fish S3110, Congen / r-biopharm 7 positiv negativ positiv Angabe als div Cytochrom b Nachweis entsprechend Fish Database 11 negativ negativ positiv DNA div Hausverfahren 15 positiv negativ positiv Angabe als div Auswahl PCR-Methoden Methoden: SFA ID = Sure Food Allergen S3110, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Target-Sequenz / -DNA z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen 2 SFA ID SureFood PREP Advanced (S1053), Congen/r-biopharm 3 SFA ID 6 SFA ID Fisch, frisch Extraktion und Clean up: R-Biopharm Surefood PREP-Allergen/ Realtime PCR: Stratagene MX3005P / 45 Zyklen 14 SFA ID - Extraktion mit S1053 SureFood PREP Advanced, Protokoll 1-7 div 11 div 15 div Spezifität Extraktion mit CTAB, Clean-UP: Chloroformextraktion, Mericon Food Kit/Qiagen; Endpunkt PCR/45 Zyklen Sonstige Hinweise Seite 38 von 41

39 6. Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Teilnehmer / Participant Ort / Town Land / Country FRANKREICH SCHWEIZ SPANIEN Deutschland SPANIEN Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland SPANIEN SCHWEDEN ENGLAND Deutschland [Die Adressdaten der Teilnehmer wurden für die allgemeine Veröffentlichung des Auswerte-Berichts nicht angegeben.] Seite 39 von 41

40 7. Verzeichnis relevanter Literatur 1. DIN EN ISO/IEC 17043:2010; Konformitätsbewertung Allgemeine Anforderungen an Eignungsprüfungen / Conformity assessment General requirements for proficiency testing 2. Verordnung / Regulation 882/2004/EU; Verordnung über amtliche Kontrollen / Regulation on official controls 3. DIN EN ISO/IEC 17025:2005; Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien / General requirements for the competence of testing and calibration laboratories 4. Richtlinie / Directive 1993/99/EU; über zusätzliche Maßnahmen im Bereich der amtlichen Lebensmittelüberwachung / on additional measures concerning the official control of foodstuffs 5. ASU 64 LFGB : Planung und statistische Auswertung von Ringversuchen zur Methodenvalidierung 6. DIN ISO 13528:2009; Statistische Verfahren für Eignungsprüfungen durch Ringversuche / Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons 7. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Laboratories ; J.AOAC Int., 76(4), (1993) 8. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Chemistry Laboratories ; Pure Appl Chem, 78, (2006) 9. Evaluation of analytical methods used for regulation of food and drugs;w. Horwitz; Analytical Chemistry, 54, (1982) 10.A Horwitz-like funktion describes precision in proficiency test; M. Thompson, P.J. Lowthian; Analyst, 120, (1995) 11.Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies; W. Horwitz; Pure & Applied Chemistry, 67, (1995) 12.Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing; M. Thompson; Analyst, 125, (2000) 13.Codex Alimentarius Commission (2010) - Guidelines on performance criteria and validation of methods for detection, identification and quantification of specific DNA sequences and specific protiens in foods, CAC/GL DIN EN ISO :2009; Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren - Teil 1: Allgemeine Betrachtungen / Foodstuffs - Detection of food allergens by immunological methods - Part 1: General considerations 15.DIN EN ISO :2009; Nachweis von Lebensmittelallergenen mit molekularbiologischen Verfahren - Teil 1: Allgemeine Betrachtungen / Foodstuffs - Detection of food allergens by molecular biological methods - Part 1: General considerations 16.DIN EN ISO 15842:2010 Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen Allgemeine Betrachtungen und Validierung von Verfahren / Foodstuffs - Detection of food allergens - General considerations and validation of methods 17.Ministry of Health and Welfare, JSM, Japan Working Group Food Allergens, Abbott et al., Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods: Community Guidance and Best Practices JAOAC Int. 93: (2010) 19.Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT): Méndez et al. Report of a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked immunoassay to determine gliadin in gluten-free food. Eur J Gastroenterol Hepatol. 17: (2005) 20.DLA Publikation: Performance of ELISA and PCR methods for the determination of allergens in food: an evaluation of six years of proficiency testing for soy (Glycine max L.) and wheat gluten (Triticum aestivum L.); Scharf et al.; J Agric Food Chem. 61(43): (2013) 21.EFSA (2014) Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and Seite 40 von 41

41 food ingredients for labelling purposes1, EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy, EFSA Journal 2014;12(11): IRMM, Poms et al.; Inter-laboratory validation study of five different commercial ELISA test kits for determination of peanut residues in cookie and dark chocolate; European Commission, Joint Research Centre, Belgium; GE/R/FSQ/D08/05/ Jayasena et al. (2015) Comparison of six commercial ELISA kits for their specificity and sensitivity in detecting different major peanut allergens. J Agric Food Chem Feb 18;63(6): ASU 64 LFGB L Bestimmung von Erdnuss-Kontaminationen in Lebensmitteln mittels ELISA im Mikrotiterplattensystem (2003) 25.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Haselnuss-Kontaminationen in Schokolade und Schokoladenwaren mittels ELISA im Mikrotiterplattensystem (2006) 26.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Sojaprotein in Fleisch und Fleischerzeugnissen Enzymimmunologisches Verfahren (2007) 27.Štumr et al.; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit for Beta- Lactoglobulin Determination: Interlaboratory Study, JAOAC 92: (2009) 28.Štumr et al.; ELISA Kit for Casein Determination: Interlaboratory Study, JAOAC 93: (2010) DLA-01/2015-Allergene I Alle 15 Teilnehmer haben mindestens ein Ergebnis eingereicht. Die Auswertung erfolgte hinsichtlich der Parameter Fisch, Milchprotein, Casein und beta-lactoglobulin für ELISA-Methoden und Fisch für PCR- Methoden. Zusätzlich wurden Wiederfindungsraten für die Dotierungsmaterialprobe und die dotierte Probe ermittelt. Details zu den einzelnen Parametern inklusive separater Auswertung nach Testkit- Herstellern sind dem Auswertebericht zu entnehmen. 7 Teilnehmer hatten ihren Sitz im Europäischen Ausland (England, Frankreich, Schweden, Schweiz, Spanien). Seite 41 von 41