März 2016 DLA 07/2015 Allergene VII (Korrektur: ) Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung 07/2015.

Transkript

1 DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung 07/2015 Allergene VII: Crustaceae und Mollusken in Instantsuppenpulver Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Waldemar-Bonsels-Weg Ahrensburg, Germany Koordinator der LVU: Dr. Matthias Besler Korrekturen: Die Angabe obere Grenze des Zielbereichs wurde auf Seite 17 (Crustacean-ELISA) korrigiert. Im unteren Teil der Ergebnistabelle in Abschnitt PCR-Ergebnisse: Mollusken wurden die Anzahl und der Prozentsatz negativer bzw. positiver Ergebnisse zur Feststellung der Konsenswerte korrigiert (Seite 24). Seite 1 von 33

2 Inhalt 1. Einleitung Durchführung Untersuchungsmaterial Homogenität Untersuchung Ergebnisübermittlung Auswertung Bezugswert (zugewiesener Wert) Standardabweichung Ausreißer Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Allgemeines Modell nach Horwitz Auswertung eines Versuchs zur Präzision Werte aus Erkenntnissen z-score Quotient Standardunsicherheit Graphische Darstellung der Bezugswerte Wiederfindungsraten: Dotierung Ergebnisse Vergleichsuntersuchung Crustacean ELISA-Ergebnisse: Crustacean PCR-Ergebnisse: Crustacean Vergleichsuntersuchung Mollusken ELISA-Ergebnisse: Mollusken PCR-Ergebnisse: Mollusken Dokumentation ELISA: Crustacean ELISA: Mollusken PCR: Crustacean PCR: Mollusken Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Verzeichnis relevanter Literatur...32 Seite 2 von 33

3 1. Einleitung Die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen (LVU) ist ein unverzichtbarer Baustein für das Qualitäts-Management-System eines jeden, mit der Untersuchung von Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetik und Bedarfsgegenständen befassten Labors. Die Durchführung von Laborvergleichsuntersuchungen ermöglicht den teilnehmenden Instituten die eigene analytische Kompetenz unter realen Bedingungen nachzuweisen. Gleichzeitig erhalten sie wertvolle Daten zur Validität der durchgeführten Untersuchungsmethode. Das Ziel von DLA ist es, LVU für ausgesuchte Parameter in praxisrelevanten Konzentrationen anzubieten. Durchführung und Auswertung der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung erfolgten nach den technischen Anforderungen der DIN EN ISO/IEC (2010) und DIN ISO Durchführung 2.1 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung wurden zwei LVU-Proben für den Nachweis von Allergenen im mg/kg-bereich und eine Dotierungsmaterialprobe zur Verfügung gestellt. Die Dotierungsmaterialprobe enthält die betreffenden allergenen Zutaten im Bereich von 1-10 % und wurde der dotierten LVU-Probe zugesetzt. Die Untersuchungsergebnisse der Dotierungsmaterialprobe sollen im Vergleich zur dotierten LVU-Probe die Möglichkeit geben, die Nachweisbarkeit der Allergene ohne und mit Einfluss der Lebensmittelmatrix bzw. -prozessierung zu charakterisieren. Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um ein handelsübliches Instantsuppen-Pulver. Die Grundzusammensetzung war für beide Proben A und B gleich (s. Tabelle 1). Probe B wurde das Dotierungsmaterial mit den allergenen Zutaten Crustacean- und Molluskenpulver zugesetzt. Die Proben wurden nach dem Homogenisieren zu Portionen von ca. 25 g abgefüllt. Die Zusammensetzung der Dotierungsmaterialprobe und die Gehalte der allergenen Zutaten in Probe B sind Tabelle 2 zu entnehmen. Seite 3 von 33

4 Tabelle 1: Zusammensetzung der DLA-Proben Zutaten Probe A Probe B Spargelcremesuppe (Pulver) Zutaten: Palmfett, Maltodextrin, modifizierte Stärke, Weizenmahl, Salz, Zucker, Laktose, Aromen, Hefeextrakt, Milcheiweiß, Sonnenblumenöl, Spargel, Zwiebel, Säuerungsmittel: Citronensäure, Kurkuma Nährwertangaben pro 100 g: Eiweiß 3,8 g, Kohlenhydrate 60 g, Fett 24 g Allergen-Hinweis: kann Spuren von Ei, Soja, Sellerie und Senf enthalten. 100 g/100 g 99,6 g/100 g Dotierungsmaterialprobe - 0,43 g/100g Tabelle 2: Zugesetzte Mengen allergener Zutaten Zutaten Dotierungsmaterialprobe Gehalt in Probe B Kartoffelmehl Nährwertangaben pro 100g: Protein 0 g Shrimp-Pulver Zutaten: Shrimp (Pandalus borealis) (gekocht, getrocknet und gemahlen) Nährwertangaben pro 100g: Protein 62 g 88,5 % 0,38 % mg/kg (= 2,65 %) 113 mg/kg davon Shrimpprotein* mg/kg 70 mg/kg Miesmuschel-Pulver Zutaten: Miesmuschel (Mytilus edulis) (gekocht, getrocknet und gemahlen) Nährwertangaben pro 100g: Protein 74 g davon Miesmuschelprotein* mg/kg (= 3,29 %) mg/kg 140 mg/kg 104 mg/kg * Proteingehalt gemäß Kennzeichnung/Spezifikation berechnet Seite 4 von 33

5 2.1.1 Homogenität Die Homogenität der dotierten Probe B und der Dotierungsmaterialprobe wurde anhand von 5-fach Bestimmungen geprüft (s. Abb. 1). Von der Dotierungsmaterialprobe wurde der Proteingehalt bestimmt, der ausschließlich aus den allergenen Zutaten Shrimps- und Miesmuschel-Pulver stammt. Für die Homogenität von Probe B wurden die ELISA-Ergebnisse der Teilnehmer herangezogen (ELISA Crustacean, Methode RS). Mit einer Standardabweichung von 1,1 % für die Dotierungsmaterialprobe und mit einer Standardabweichung zwischen den Laboren von < 25% für Probe B wurde die Homogenität bezüglich der verwendeten Verfahren als hinreichend gesichert angesehen (17, 18, 20). Homogenität / Homogeneity Test - ELISA Ergebnisse in % des MW results in % of mean Unabhängige Proben, independant samples n = 5 Spiking Sample, SD=1,1% Sample B, SD=21% Abb. 1: Homogenitätsprüfung der DLA-Probe B und Dotierungsmaterialprobe Darstellung der Ergebnisse relativ in Prozent des arithmetischen Mittelwerts 2.2 Untersuchung An jedes teilnehmende Institut wurden in der 45. Kalenderwoche 2015 je eine Portion der Untersuchungsmaterialien A und B sowie eine Dotierungsmaterialprobe verschickt. Die Untersuchungsverfahren wurden freigestellt. Die Untersuchungen waren durchzuführen bis spätestens 18. Dezember Ergebnisübermittlung Die Ergebnisabgabe erfolgte einheitlich auf, an die teilnehmenden Institute versandten Übermittlungsbögen bzw. -dateien. Zur Auswertung kamen einerseits die Ergebnisse als positiv/negativ Angaben und andererseits angegebene Gehalte an allergenen Zutaten in mg/kg z.b. als Crustacean- bzw. Molluskenprotein. Die den Positiv-Proben zugesetzten Spezies (Shrimp und Miesmuschel) wurden den Teilnehmern per aufgrund einer Teilnehmernachfrage in der 46. KW mitgeteilt. Im Zuge der Auswertung wurde darüberhinaus bei einigen Teilnehmern die Art der Angabe der quantitativen Ergebnisse von DLA durch Nachfragen per abgesichert. Abgefragt und dokumentiert wurden die o.g. Ergebnisse sowie Angaben zu den Testmethoden wie Spezifitäten, Testkit-Hersteller und Stichpunkte zur Durchführung der Methoden. Seite 5 von 33

6 Falls Teilnehmer mehrere Ergebnisse für denselben Parameter abgegeben haben, die mit unterschiedlichen Methoden erhalten wurden, wurden diese Ergebnisse mit derselben mit einem Buchstaben als Suffix unter Angabe der jeweiligen Methode ausgewertet. Ein Teilnehmer hat verspätet Ergebnisse eingereicht. Alle anderen Teilnehmer haben fristgerecht Ergebnisse abgegeben. Seite 6 von 33

7 3. Auswertung Verschiedene ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln können verschiedene Antikörper-Spezifitäten aufweisen, mit unterschiedlichem Referenzmaterial kalibriert worden sein und sich unterschiedlicher Extraktionsverfahren bedienen. Die verschiedenen ELISA- Methoden können daher zu einer unterschiedlichen Bewertung des Gehalts eines Analyten führen (20, 21, 22, 23). Aus diesem Grund werden die Ergebnisse, wenn möglich in der Auswertung verschiedenen Bezugswerten gegenübergestellt. Dadurch soll jedes einzelne Ergebnis im Vergleich mit dem Mittelwert aller eingesandten Ergebnisse und/oder im Vergleich mit dem Mittelwert aller Ergebnisse derselben Methode bewertet werden können. Zum Vergleich mit der rechnerisch zugesetzten Menge wurde diese in den graphischen Darstellungen der Ergebnisse mit angegeben. Für quantitative Ergebnisse der Dotierungsmaterialprobe und der dotierten Probe wurden anhand der bekannten Zusammensetzung Wiederfindungsraten berechnet und zur Information angegeben. Hierbei erfolgte keine statistische Auswertung. Die angegebenen Wiederfindungsraten dienen ausschließlich einer Einschätzung von Matrix- und/oder Prozessierungseinflüssen. Die PCR-Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. 3.1 Bezugswert (zugewiesener Wert) Da es sich bei dem untersuchten Material nicht um zertifiziertes Referenzmaterial handelt wird als Bezugswert (X) für die Auswertung der robuste Mittelwert der eingesandten Ergebnisse verwendet (6). Sofern eine Prüfung der Verteilung der eingesandten Ergebnisse Hinweise für Quellen von höherer Variabilität, wie z.b. eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, ergibt, werden zusätzlich als Bezugswerte die robusten Mittelwerte von Einzelmethoden herangezogen. Bei den ELISA-Methoden zur Bestimmung von Allergenen wird, wenn möglich, stets so vorgegangen: i) Robuster Mittelwert aller Ergebnisse - X ALL ii) Robuster Mittelwert von Einzelmethoden - X METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. Einzelergebnisse die außerhalb des angegebenen Messbereiches eines teilnehmenden Labors liegen (z.b. mit der Angabe > 25 mg/kg oder < 2,5 mg/kg) werden für die statistische Auswertung berücksichtigt, sofern eine Angabe mit > oberhalb und eine Angabe mit < unterhalb des Zielbereichs liegt. Seite 7 von 33

8 3.2 Standardabweichung Zum Vergleich mit der Zielstandardabweichung wird ebenfalls die robuste Standardabweichung (S x ) berechnet (6). Folgende robuste Standardabweichungen werden herangezogen: i) Robuste Standardabweichung aller Ergebnisse - S x ALL ii) Robuste Standardabweichung von Einzelmethoden - S x METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. 3.3 Ausreißer Auf Ausreißer wird mittels Mandel s-h-statistik Signifikanz-Niveau 95% geprüft (5). Ermittelte Ausreißer werden informativ genannt sofern gleichzeitig der z-score des Instituts < -2 oder > 2 ist. 3.4 Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Die Zielstandardabweichung des Bezugswertes wird nach unten dargestellten, unterschiedlichen Verfahren bestimmt Allgemeines Modell nach Horwitz Die relative Zielstandardabweichung in % des Bezugswertes wird i.d.r. nach folgender Gleichung (Horwitz ) berechnet σ (%) = 2 (1-0,5logX) hieraus wird die Zielstandardabweichung in mg/kg berechnet σ = X * σ (%) / 100. Die Zielstandardabweichung nach Horwitz wird z.z. in der Praxis von ELISA-Verfahren mit Messwerten im mg/kg Bereich nur in Ausnahmefällen erreicht Auswertung eines Versuchs zur Präzision Aus der Vergleichstandardabweichung σ R und der Wiederholstandardabweichung σ r eines Versuchs zur Präzision einer Methode (z.b. aus Ringversuchen nach ASU 64 LFGB) wird die Standardabweichung zwischen Laboratorien σ L berechnet: L = R 2 r 2. Aus den obigen Größen und der Anzahl der Wiederholmessungen n der laufenden Vergleichsuntersuchung wird nun die Zielstandardabweichung berechnet: = L 2 r 2 /n. Da in der vorliegenden Vergleichsuntersuchung die Anzahl der Seite 8 von 33

9 Wiederholmessungen n = 1 ist, ist die Vergleichsstandardabweichung σ R gleich der Zielstandardabweichung σ. Nachstehend sind die relativen Vergleichsstandardabweichungen aus Ringversuchen einiger ELISA-Methoden nach ASU 64 angegeben (24, 25, 26): Methode Parameter Matrix Mittelwerte Relative σ R Literatur ELISA Sojaprotein Brühwurst 0,36-4,07% 14-28% L ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. B) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) Erdnuss Erdnuss Erdnuss Haselnuss Haselnuss Vollmilchschokolade Vollmilchschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade 5,9-174 mg/kg 20-31% L ,1-216 mg/kg 14-32% L ,7-148 mg/kg 22-33% L ,6-16,3 mg/kg 12-33% L ,4-21,3 mg/kg 14-19% L Aus den o.g. Präzisionsdaten der ASU 64 Methoden ergeben sich relative Zielstandardabweichungen im Bereich von 12-33%. Das IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) hat in einem Ringversuch die Eignung fünf verschiedener ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Erdnuss getestet (22). Die Mittelwerte lagen im Konzentrationsbereich von 0,3-16,1 mg/kg bzw. 1,2-20,4 mg/kg. Die jeweils niedrigsten relativen Vergleichsstandardabweichungen der fünf Test-Kits lagen für die Matrix Bitterschokolade bei 20-42% und für Kekse bei 23-61%. In einer Laborvergleichsuntersuchung 2007 in Japan zur Validierung von ELISA-Test-Kits zur Crustacean-Protein-Bestimmung in verarbeiteten Lebensmittelprodukten wurden 5 Lebensmittelproben mit Crustacean-Protein- Gehalten von 8 12 mg/kg untersucht (23). Die Wiederfindungsrate lag zwischen %, die relativen Vergleichsstandardabweichungen bei 25%. Laut den Autoren erfüllten beide ELISA-Test-Kits damit die Validierungskriterien für ELISA Methoden (23). Seite 9 von 33

10 3.4.3 Werte aus Erkenntnissen Die Zielstandardabweichung kann für die Eignungsbeurteilung auf einen Wert festgesetzt werden, der dem Leistungsfähigkeitsniveau entspricht, das der Koordinator für ein wünschenswertes Ziel für die teilnehmenden Laboratorien hält (6). Anforderungen an die Leistungsfähigkeit der Analysenmethoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln sind u.a. vom Ministry of Health and Welfare (MHLW) in Japan (17), von der Arbeitsgruppe 12 Lebensmittelallergene des Technischen Komitees CEN/TC 275 (14-16), von einer internationalen "Food Allergen Working Group" unter der Leitung der AOAC Presidential Task Force on Food Allergens (18) und vom Codex Alimentarius Commitee (CAC/GL ) (13) erarbeitet worden. Die hier relevanten ELISA- bzw. PCR-Validierungskriterien der Gremien sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben. Tabelle 3: ELISA-Validierungskriterien Literatur (17, 18, 20) Wiederfindungsrate MHLW % 25% CEN % AOAC % 6,9-34,4% (a) 19,5-57,2 (a) CAC % 25% 35% (a) = Beispiel aus hypothetischem Ringversuch im Konzentrationsbereich von 0,5-5 mg/kg Tabelle 4: PCR-Validierungskriterien Literatur (21) Wiederfindungsrate Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung CAC 2010 ± 25% (a) 25% 35% (a) = Trueness / Richtigkeit Aufgrund der derzeitigen Leistungsfähigkeiten von ELISA- bzw. PCR-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln, die sich aus den Präzisionsdaten von Versuchen und aus den o.g. Validierungsanforderungen ableiten lassen, legen wir für die relative Zielstandardabweichung σ einen Wert von 25% fest. Diese Zielstandardabweichung wurde zur statistischen Bewertung der Ergebnisse mittels z-score herangezogen und auf alle unter 3.1 angegebenen Bezugswerte angewandt. Seite 10 von 33

11 3.5 z-score Der z-score wird herangezogen zur Beurteilung der Ergebnisse der teilnehmenden Institute. Er besagt um welches Vielfache der Zielstandardabweichung ( σ ) das Ergebnis (x) des betreffenden teilnehmenden Instituts vom Bezugswert (X) abweicht (6). Die Berechnung erfolgt nach z = (x X) / σ ; die Anforderungen an die Analytik gelten im Allgemeinen als erfüllt, wenn -2 z 2. Zur Bewertung wurden nachstehende z-scores mit einer Zielstandardabweichung von 25% in der Auswertung angegeben: i) z-score - z ALL (bezogen auf alle Ergebnisse) ii) z-score - z METHOD i (bezogen auf Einzelmethoden) 3.6 Quotient S x / In Anlehnung an den Horrat-Wert kann die Bewertung einer Laborvergleichsuntersuchung als aussagekräftig gelten, wenn der Quotient von robuster Standardabweichung und Zielstandardabweichung nicht über 2 liegt. Ein über 2 liegender Wert bedeutet, dass die Präzision nicht zufriedenstellend ist, d.h., dass die Präzision aus analytischen Gründen zu variabel ist oder die festgestellte Variation höher ist als für die angewandte Methode geschätzt wurde. Somit ist eine Vergleichbarkeit der Messergebnisse nicht gewährleistet (11). 3.7 Standardunsicherheit Jeder Bezugswert ist mit einer Standardunsicherheit behaftet, die von der Analysenmethode, Unterschieden der eingesetzten Analysenmethoden, dem Probenmaterial und der Anzahl der Teilnehmer (P) einer LVU beeinflußt wird. Die Standardunsicherheit (U x ) wird für die vorliegende LVU wie folgt berechnet (6). u X =1,25 S x / p Ist u X 0,3 muss die Standardunsicherheit des Bezugswertes nicht berücksichtigt werden (6). Seite 11 von 33

12 3.8 Graphische Darstellung der Bezugswerte Die Bezugswerte werden als farbige Linien in den Abbildungen der Ergebnisse dargestellt. Dies ermöglicht einen optischen Vergleich der Einzelergebnisse mit den verschiedenen Bezugswerten für das Zusatzniveau eines Analyten einerseits und die robusten Mittelwerte über alle Methoden bzw. über Einzelmethoden andererseits. 3.9 Wiederfindungsraten: Dotierung Für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe werden Wiederfindungsraten in Bezug auf die zugesetzten Allergene berechnet. Die Bezugswerte ergeben sich aus den unter 2.1 Untersuchungsmaterial in Tabelle 1 angegebenen Gehalten. Als Akzeptanzbereich AB für die Bewertung der Teilnehmerergebnisse wird der von der AOAC vorgeschlagene Bereich von % für die Wiederfindungsraten von Allergen-ELISAs herangezogen (18). Für quantitative PCR-Bestimmungen wird ebenfalls dieser Akzeptanzbereich herangezogen. Seite 12 von 33

13 4. Ergebnisse Alle folgenden Tabellen sind anonymisiert. Den teilnehmenden Instituten wird mit dem Versand dieser Auswertung ihre individuelle mitgeteilt. Die folgenden Ergebnisseiten sind für die allergenen Bestandteile jeweils gleich aufgebaut. Es werden zunächst die Ergebnisse aller Methoden zu einem Parameter für die Probe A und dann für die Probe B angegeben. Um die Vergleichbarkeit von quantitativen Ergebnissen zu gewährleisten, wurden Teilnehmerergebnisse mit unterschiedlichen Angaben (z.b. als Protein oder allergenes Lebensmittel) soweit möglich von DLA harmonisiert. ELISA-Ergebnisse, die entweder als Tropomyosin oder als Crustacean/Shrimps oder Mollusken/Miesmuschel angegeben wurden, sind in Crustacean-/Shrimp-Protein bzw. Mollusken-/Miesmuschel-Protein umgerechnet worden. Sofern verfügbar wurden die Angaben des betreffenden Testkit- Herstellers berücksichtigt. Dabei wurde ein Gehalt von 20% Tropomyosin in Crustacean-Protein zugrundegelegt (vgl. Angaben von AgraQuant und ELISA-Systems). Der Protein-Gehalt in getrocknetem Shrimp-Pulver wurde mit 22,78 % für die Veratox-Ergebnisse berücksichtigt (vgl. Food Allergen Handbook, 9th, Neogen). Nassgewichte von Shrimp wurden in Trockengewicht unter Berücksichtigung eines Wassergehalts von 83 % umgerechnet (gemischte Crustacean, USDA Nutrient Database). Nassgewichte von Mollusken/Miesmuscheln wurden in Trockengewicht unter Berücksichtigung eines Wassergehalts von 80,6 % umgerechnet (USDA Nutrient Database). Die Auswertung erfolgte getrennt nach ELISA und PCR-Ergebnissen. Die Ergebnisse wurden nach durchgeführten Methoden zusammengefasst und die n innerhalb der Gruppen aufsteigend sortiert. Die Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. Für jeden Teilnehmer wird in Bezug auf die Konsens-Ergebnisse eine qualitative Bewertung vorgenommen. Hier wurde die Übereinstimmung mit den Konsens-Werten in Prozent angegeben. Gegebenenfalls werden anschließend die Ergebnisse aller Methoden und von Einzelmethoden mit mindestens 5 quantitativen Ergebnissen statistisch ausgewertet. Seite 13 von 33

14 In den Fällen, in denen eine statistische Auswertung der quantitativen Messergebnisse durchgeführt wurde, werden die Ergebnisse tabellarisch folgendermaßen aufgeführt : Ergebnis Ergebnis z-score z-score Methode Hinweis X ALL X M i pos/neg [m g/kg] X All X Method i Die Kenndaten der jeweiligen Vergleichsuntersuchung werden aufgeführt, falls wenigstens 50% positive Ergebnisangaben und mindestens 5 quantitative Messergebnisse vorliegen: Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode i [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Method i Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse Robuster Mittelwert (X) Robuste Standardabweichung (S x ) Median Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) untere Grenze des Zielbereichs (X - 2 σ ) obere Grenze des Zielbereichs (X + 2 σ ) Quotient S x / σ Standardunsicherheit u X Quotient u X / Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Im Anschluss erfolgt die Darstellung der Wiederfindungsraten für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe. Die Anzahl der Ergebnisse im Akzeptanzbereich von % wird aufsummiert. Seite 14 von 33

15 4.1 Vergleichsuntersuchung Crustacean ELISA-Ergebnisse: Crustacean (als Gesamtprotein) Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 2 negativ nd positiv 0,8 2/2 (100%) AQ 13 negativ <0.1 positiv 0,41 2/2 (100%) AQ Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 3 negativ <0,02 positiv 0,13 2/2 (100%) BK 5 negativ <0,25 positiv 0,36 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 21 negativ <0,25 positiv 0,25 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 20 negativ < 0.1 positiv 15 2/2 (100%) IL 11 negativ < 0,005 positiv 0,93 2/2 (100%) NL Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 4 negativ < positiv 0,6 2/2 (100%) RS 9 negativ <0.5 positiv 0,78 2/2 (100%) RS 10 negativ <0.5 positiv 0,54 2/2 (100%) RS 12 negativ < 0,5 positiv 0,62 2/2 (100%) RS 15 negativ <0.5 positiv 0,9 2/2 (100%) RS 7 negativ <0,57 positiv 2,41 2/2 (100%) VT 18 negativ positiv 10 2/2 (100%) VT Angabe als Shrimpprotein Ergebnis umgerechnet (Shrimp in Shrimpprotein) Probe A Probe B * TP: Tropomyosin Anzahl positiv 0 14 Anzahl negativ 14 0 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert negativ positiv * CP: Crustacean-Protein Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA Systems IL = Immunolab NL = nutrilinia RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Crustacean mittels ELISA zu 100% negative Ergebnisse für Probe A und zu 100% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Seite 15 von 33

16 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Crustacean Protein [m g/kg] z-score X ALL Bezug X ALL z-score X RS X Methode RS Methode 2 0,8 AQ Hinweis 13 0,41 AQ Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 3 0,13 BK 5 0,36 ES Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 21 0,25 ES Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* IL 11 0,93 NL Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 4 0,6-0,5 RS 9 0,78 0,5 RS 10 0,54-0,8 RS 12 0,62-0,4 RS 15 0,9 1,2 RS 7 2,41 VT VT Angabe als Shrimpprotein Ergebnis umgerechnet (Shrimp in Shrimpprotein) * TP: Tropomyosin * CP: Crustacean-Protein Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA Systems IL = Immunolab NL = nutrilinia RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Seite 16 von 33

17 Kenndaten: Quantitative Auswertung Crustacean Protein Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse 14 5 Robuster Mittelwert (X) 0,851 0,689 Robuste Standardabweichung (S x ) 0,675 0,167 Median 0,702 0,621 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 0,213 0,172 untere Grenze des Zielbereichs 0,345 obere Grenze des Zielbereichs 1,03 Quotient S x / σ 3,2 0,97 Standardunsicherheit u X 0,0934 Quotient u X / σ 0,54 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS = R-Biopharm, Ridascreen Fast 5 (100%) Anmerkung: Die Auswertung der Ergebnisse aller Methoden weist eine erhöhte Variabilität der Ergebnisse auf. Der Quotient S x / σ liegt bei 3,2. Die Vergleichbarkeit von Ergebnissen unterschiedlicher Methoden (ELISA-Test Kits) ist eingeschränkt. Eine Bewertung der Ergebnisse mittels z-scores wurde daher nicht vorgenommen. Die Auswertung der Ergebnisse von Methode RS zeigt eine geringe Variabilität der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ lag deutlich unter 2,0. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist gegeben. Die Mittelwerte der Auswertungen lagen etwa um den Faktor 100 unter dem Zusatzniveau von Crustacean Protein zu Probe B (s. auch "Wiederfindungsraten für Crustacean" S.19). Es ist dabei zu berücksichtigen, dass die überwiegende Anzahl der Teilnehmer, ihre Ergebnisse nicht Spezies-spezifisch als Shrimp angegeben hat, sondern allgemein als Crustacean. Seite 17 von 33

18 5,0 Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results > 4,0 mg/kg 3,0 2,0 1,0 0, / Evaluation number Abb. 2: ELISA-Ergebnisse Crustacean-Protein grüne Linie = Zusatzniveau (70 mg/kg, nicht dargestellt) rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, / Evaluation number Abb. 3: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Crustacean-Protein) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 18 von 33

19 Wiederfindungsraten für Crustacean-Protein: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis ,8 0,8 1,1 AQ 13 25,5 0,2 0,41 0,58 AQ Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* 3 NA 0,13 0,19 BK ,0 0,36 0,51 ES Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* ,3 0,25 0,36 ES Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* IL 11 0,93 1,3 NL Ergebnis umgerechnet (TP in CP)* ,9 0,6 0,86 RS ,1 0,78 1,1 RS ,9 0,54 0,78 RS 12 > 13,5 0,62 0,89 RS ,9 0,9 1,3 RS ,41 3,4 VT ,3 VT AB* % AB* % Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 0 Prozent im AB 0 Prozent im AB 0 Angabe als Shrimpprotein Ergebnis umgerechnet (Shrimp in Shrimpprotein) * TP: Tropomyosin * CP: Crustacean-Protein Wiederfindungsrate 100% Bezugsgröße: Shrimp-Protein, s. Seite 4 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA Systems IL = Immunolab NL = nutrilinia RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Anmerkung: Mittels ELISA-Methoden lag keine Wiederfindungsrate für die Dotierungsmaterialprobe oder für die mit dem Dotierungsmaterial hergestellte Suppenpulver-Probe B im Bereich der AOAC-Anforderung von %. Zu beachten ist, dass als Bezugsgröße für die Wiederfindungsraten der Shrimp-Protein-Gehalt wie auf Seite 4 angegeben verwendet wurde. Seite 19 von 33

20 4.1.2 PCR-Ergebnisse: Crustacean Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] 17 negativ positiv 2/2 (100%) IC 19 negativ positiv 2/2 (100%) IC 4 negativ > 0.4 positiv > 0.4 2/2 (100%) SFA-ID 8 negativ positiv 2/2 (100%) SFA-ID 10 negativ < 0,17 positiv 115 2/2 (100%) SFA-ID 16 negativ positiv 2/2 (100%) SFA-ID 1 negativ < 20 negativ < 20 1/2 (50%) div als Kalmar-DNS 6 negativ positiv 2/2 (100%) div 14 negativ negativ 1/2 (50%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 0 7 Anzahl negativ 9 2 Prozent positiv 0 78 Prozent negativ Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten als Crustacean-DNA als Crustaceae-DNA Ergebnis umgerechnet (Crustacean Nassgew icht auf Trockenmasse)* als Crustacean-DNA als Crustacean (Trockenmasse) * Umrechnungsfaktor siehe S. 13 Methoden: IC = CrusKit, Incura SFA ID = Sure Food Allergen ID, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Crustacean mittels PCR wurden 100% negative Ergebnisse für Probe A und 78% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Eine Auswertung der quantitativen Ergebnisse erfolgte nicht, weil zu wenige Ergebnisse vorlagen. Seite 20 von 33

21 Wiederfindungsraten für Crustacean: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis 17 IC 19 IC 4 > > SFA-ID 8 SFA-ID SFA-ID 16 SFA-ID < 20 - div als Kalmar-DNS 6 div div als Crustacean-DNA als Crustaceae-DNA Ergebnis umgerechnet (Crustacean Nassgew icht auf Trockenmasse)* als Crustacean-DNA als Crustacean (Trockenmasse) * Umrechnungsfaktor siehe S. 13 AB* % AB* % Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 1 Wiederfindungsrate 100% Bezugsgröße: Prozent im AB 0 Prozent im AB 100 Shrimp-Pulver, s. Seite 4 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: IC = CrusKit, Incura SFA ID = Sure Food Allergen ID, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Kein Teilnehmer hat in der Dotierungsmaterialprobe mittels PCR eine Wiederfindungsrate im Akzeptanzbereich von % erhalten. In der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Suppenpulver-Probe B wurde mittels PCR ein Ergebnis mit einer Wiederfindungsrate im Akzeptanzbereich von % erhalten. Zu beachten ist, dass als Bezugsgröße für die Wiederfindungsraten der Shrimp-Pulver-Gehalt wie auf Seite 4 angegeben verwendet wurde. Seite 21 von 33

22 4.2 Vergleichsuntersuchung Mollusken ELISA-Ergebnisse: Mollusken (als Gesamtprotein) Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] 10 negativ < 1 positiv 2,52 - ET als Molluskenprotein 5 negativ < 50 negativ < 50 - IL Ergebnis umgerechnet (TP in MP)* 20 negativ < 1,8 positiv 22 - IL als Miesmuschelprotein * Faktor für Miesmuschel frisch Probe A Probe B (Test-Kit Angabe) davon 9,8% Protein Anzahl positiv 0 2 (Nährw erttabelle, Souci et al.) Anzahl negativ 3 1 Prozent positiv 0 67 Prozent negativ Konsenswert - - Übereinstimmungen mit Konsenswerten Methoden: ET = Elution Technologies IL = Immunolab Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Mollusken mittels ELISA nur 3 Ergebnisse übermittelt, daher wurden keine Konsenswerte festgestellt. Die Ergebnisse von Teilnehmer 10 und Teilnehmer 20 stehen in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Eine Auswertung der quantitativen Ergebnisse erfolgte nicht, weil zu wenige Ergebnisse vorlagen. Seite 22 von 33

23 Wiederfindungsraten für Mollusken-Protein: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis ,52 2,4 ET als Molluskenprotein < 50 - IL Ergebnis umgerechnet (TP in MP)* IL als Miesmuschelprotein * Faktor für Miesmuschel frisch AB* % AB* % (Test-Kit Angabe) davon 9,8% Protein Anzahl im AB 1 Anzahl im AB 0 (Nährw erttabelle, Souci et al.) Prozent im AB 33 Prozent im AB 0 Wiederfindungsrate 100% Bezugsgröße: Miesmuschel-Protein, s. Seite 4 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: ET = Elution Technologies IL = Immunolab Anmerkung: Mittels ELISA-Methoden lag eine Wiederfindungsrate für die Dotierungsmaterialprobe im Bereich der AOAC-Anforderung von %. Für die mit dem Dotierungsmaterial hergestellte Suppenpulver-Probe B lagen keine Wiederfindungsraten im Akzeptanzbereich von %. Zu beachten ist, dass als Bezugsgröße für die Wiederfindungsraten der Miesmuschel-Protein-Gehalt wie auf Seite 4 angegeben verwendet wurde. Seite 23 von 33

24 4.2.2 PCR-Ergebnisse: Mollusken Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [m g/kg] pos/neg [m g/kg] 17 negativ positiv 2/2 (100%) IC 19 negativ positiv 2/2 (100%) IC 4 negativ < 0.4 positiv > 0.4 2/2 (100%) SFA-ID 7 negativ positiv 2/2 (100%) SFA-ID 8 negativ positiv 2/2 (100%) SFA-ID Mollusken-DNA 10 negativ < 0,19 positiv 198 2/2 (100%) SFA-ID 15 negativ positiv 2/2 (100%) SFA-ID 16 negativ positiv 2/2 (100%) SFA-ID 1 negativ < 20 negativ < 20 1/2 (50%) div Kaisergranat-DNS 6 negativ positiv 2/2 (100%) div 14 positiv 40 positiv /2 (50%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 1 10 Anzahl negativ 10 1 Prozent positiv 9 91 Prozent negativ 91 9 Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten Mollusc-DNA Mollusc-DNA Ergebnis umgerechnet (Mollusken Nassgew icht auf Trockenmasse)* Mollusc-DNA Mollusc-DNA als Bivalven (Trockenmasse) * Umrechnungsfaktor siehe S. 13 Methoden: IC = MollusKit, Incura SFA ID = Sure Food Allergen ID, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Mollusken mittels PCR wurden 91% negative Ergebnisse für Probe A und 91% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die Konsenswerte stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Eine Auswertung der quantitativen Ergebnisse erfolgte nicht, weil zu wenige Ergebnisse vorlagen. Seite 24 von 33

25 Wiederfindungsraten für Mollusken: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis 17 IC 19 IC 4 > 0.4 > 0.4 SFA-ID Mollusc-DNA 7 SFA-ID Mollusc-DNA 8 SFA-ID Mollusken-DNA SFA-ID 15 SFA-ID Mollusc-DNA 16 SFA-ID Mollusc-DNA 1 < 20 - < 20 - div Kaisergranat-DNS 6 div Ergebnis umgerechnet (Mollusken Nassgew icht auf Trockenmasse)* div als Bivalven (Trockenmasse) * Umrechnungsfaktor siehe S. 13 AB* % AB* % Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 1 Wiederfindungsrate Prozent im AB 0 Prozent im AB % Bezugsgröße: Miesmuschel-Pulver, s. Seite 4 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: IC = MollusKit, Incura SFA ID = Sure Food Allergen ID, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Kein Teilnehmer hat in der Dotierungsmaterialprobe mittels PCR eine Wiederfindungsrate im Akzeptanzbereich von % erhalten. In der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Suppenpulver-Probe B wurde mittels PCR ein Ergebnis mit einer Wiederfindungsrate im Akzeptanzbereich von % erhalten. Zu beachten ist, dass als Bezugsgröße für die Wiederfindungsraten der Miesmuschel-Pulver-Gehalt wie auf Seite 4 angegeben verwendet wurde. Seite 25 von 33

26 5. Dokumentation Angaben der Teilnehmer 5.1 ELISA: Crustacean Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe Meth. Methode Dotierungsprobe quantitatives Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg Ergebnis z.b. Lebensmittel als / Protein Test-Kit + Anbieter 2 negativ nd positiv 0,8 positiv 290 Crustacea-Protein AQ Romer AgraQuant Crustacea 13 negativ <0.02 positiv 0,082 positiv 5,09 Tropomyosin AQ 3 negativ <0,02 positiv 0,13 NA NA Crustacea-Protein BK 5 negativ <0,05 positiv 0,071 positiv 32 Tropomyosin ES 21 negativ <0,05 positiv 0,05 positiv 44 Tropomyosin ES 20 negativ < 0,5 positiv 100 positiv Shrimps, roh, feucht IL 20 negativ < 0.1 positiv 20 positiv Shrimps, Trockenware IL 11 - < 0,001-0,186 - Tropomyosin NL 4 negativ < positiv 0,6 positiv 320 Crustacea-Protein RS 9 negativ <0.5 positiv 0,782 positiv 351 Crustacea-Protein RS 10 negativ <0.5 positiv 0,544 positiv 315 Crustacea-Protein RS 12 negativ < 0,5 positiv 0,621 positiv > 13,5 crustacean protein RS 15 negativ <0.5 positiv 0,9 positiv 480 Crustacea-Protein RS 7 negativ <2,5 positiv 10,6 positiv Crustaceae VT 18 negativ positiv 10 positiv Crustacea-Protein VT Romer Labs AgraQuant Crustacea BioKits Shellfish Assay Kit, Neogen ELISA-Systems, Crustacean Residue Assay (ESCRURD-48) ELISA-Systems, Crustacean Residue Assay (ESCRURD-48) Immunolab Crustaceans ELISA (CRU-E01) Immunolab Crustaceans ELISA (CRU-E01) nutrilinia Crustaceae-ELISA (NC-6051), Transia Ridascreen Fast Crustacean (R7302), r-biopharm Ridascreen Fast Crustacean (R7302), r-biopharm Ridascreen Fast Crustacean (R7302), r-biopharm R.Biopharm (R-7302) Batch: Ridascreen Fast Crustacean (R7302), r-biopharm Veratox Crustaceae, Neogen Veratox Crustaceae, Neogen Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA Systems IL = Immunolab NL = nutrilinia RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Seite 26 von 33

27 Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 1 g Probe + 20mL verdünnter Extraktionspuffer aus 2 AQ unbekannt Einzelergebnis Kit; extrahiert für 15 min bei 40C 13 AQ 3 BK Tropomyosin 5 ES Krustaceen Tropomyosin nach Herstellerangaben 21 ES 20 IL Krustentier Tropomyosin 20 IL Krustentier Tropomyosin 11 NL 4 RS 9 RS 10 RS nach Herstellerangaben 12 RS 10 min, 60ºC 15 RS 7 VT Crustacea-Protein nach Herstellerangaben 18 VT Spezifität polyklonal, Crustacea- Tropomyosin Crustacea-Protein Proteine von Crustacean Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Extraktion: Allergen Extraktionspuffer (RIDASCREEN FAST Crustacean ) Sonstige Hinweise Probe A: negativ Probe B: 250 ppb Tropomyosin / ~ 20 ppm Shrimps, Trockengew icht / ~ 100 ppm Shrimps, Nassgew icht / ~ 15 ppm Shrimp-Protein. Spike: 138 ppm Tropomyosin / ~ ppm Shrimps, Trockengew icht / ~ ppm Shrimps, Nassgew icht / ~ 7900 ppm Shrimp-Protein Seite 27 von 33

28 5.2 ELISA: Mollusken Primärdaten Methoden: ET = Elution Technologies IL = Immunolab Weitere Angaben zu den Methoden Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Dotierungsprobe Angabe quantitatives Meth. Abk. Methode qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg Ergebnis z.b. Lebensmittel als / Protein Test-Kit + Anbieter 10 negativ <1 positiv 2,52 positiv 895 Mollusc-Protein ET Elution Technologies Mollusk Kit (E-75MSK) 5 negativ <0,03 negativ <0,03 positiv 2,2 Mollusken- Immunolab Mollusken ELISA IL Tropomyosin (MOL-E01) 20a negativ < 15 positiv 180 positiv Miesmuschel, roh, Immunolab Mollusc ELISA IL feucht (MOL-E01) 20b negativ < 3 positiv 36 positiv Miesmuschel, Immunolab Mollusc ELISA IL Trockenware (MOL-E01) 12 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Auswahl Mollusken-Kits: Antikörper 10 ET nach Herstellerangaben 5 IL Mollusken Tropomyosin nach Herstellerangaben 20a IL Mollusken Tropomyosin 20b IL Mollusken Tropomyosin 12 Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur Sonstige Hinweise Probe A: negativ Probe B: 12 ppb Tropomyosin (Helix aspersa) / ~ 36 ppm Miesmuschel, Trockengew icht / ~ 180 ppm Miesmuschel, Nassgew icht / ~ 22 ppm Miesmuschel-Protein Spike: 7,2 ppm Tropomyosin (Helis aspersa) / ~ ppm Miesmuschel, Trockengew icht / ~ Miesmuschel, Nassgew icht / ~ ppm Miesmuschel-Protein. Seite 28 von 33

29 5.3 PCR: Crustacean Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. pos / neg mg/kg pos / neg mg/kg pos / neg mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 17 negativ positiv - Bitte auswählen! IC CrusKit real Time PCR, InCura 19 negativ positiv - IC CrusKit real Time PCR, InCura 4 positiv > 0.4 positiv > 0.4 positiv > 0.4 Crustacean-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 8 negativ positiv positiv Crustaceae-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 10 negativ <1 positiv 676,53 positiv 55008,86 WT Crustacean SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 16 negativ positiv positiv Crustacean-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 1 - < 20 - < Kalmar-DNS div 6 negativ positiv positiv Bitte auswählen! div Auswahl PCR-Methoden 12 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Bitte auswählen! div Auswahl PCR-Methoden 14 negativ negativ positiv Bitte auswählen! div Auswahl PCR-Methoden Methoden: IC = CrusKit, Incura SFA ID = Sure Food Allergen ID, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. 17 IC 19 IC 4 SFA-ID 8 SFA-ID 10 SFA-ID nach Herstellerangaben 16 SFA-ID 1 div 6 div 12 div 14 div Spezifität Target-Sequenz / -DNA 16S rdna Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen Nucleospin SureFood PREP Advanced, Congen / r-biopharm CTAB-Extraktion, RealTime-PCR 45 Zyklen Sonstige Hinweise Quantiziert anhand von frischem Shrimp als Standard alle Proben w aren nicht sequenzierbar bzw. die Sequenzen nicht ausw ertbar! Seite 29 von 33

30 5.4 PCR: Mollusken Primärdaten Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. pos / neg mg/kg pos / neg mg/kg pos / neg mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 17 negativ positiv Bitte auswählen! IC MollusKit real Time PCR, InCura 19 negativ positiv - IC MollusKit real Time PCR, InCura 4 negativ < 0.4 positiv > 0.4 positiv > 0.4 Mollusc-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 7 negativ positiv positiv Mollusc-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 8 negativ positiv positiv Mollusken-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 10 negativ <1 positiv 1018,81 positiv 17570,81 (WT) Molluscs SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 15 negativ positiv positiv Mollusc-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 16 negativ positiv positiv Mollusc-DNA SFA-ID Sure Food Allergen ID, Congen / r-biopharm 1 - < 20 - < 20 - < 20 Kaisergranat-DNS div 6 negativ positiv positiv Bitte auswählen! div Auswahl PCR-Methoden 12 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Bitte auswählen! div Auswahl PCR-Methoden 14 positiv 40 positiv 1000 positiv als Bivalven (Trockenmasse) div Auswahl PCR-Methoden Methoden: IC = MollusKit, Incura SFA ID = Sure Food Allergen ID, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Weitere Angaben zu den Methoden Meth. Abk. 17 IC 19 IC 4 SFA-ID Spezifität Target-Sequenz / -DNA 7 SFA-ID Mollusken Real time PCR 8 SFA-ID SureFood PREP Advanced, Congen / r-biopharm 10 SFA-ID nach Herstellerangaben Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen Nucleospin Sonstige Hinweise Quantifiziert anhand von frischen Muscheln als Standard 15 SFA-ID Mollusken, frisch Extraktion und Clean-up: R-Biopharm Surefood PREP- Allergen/ Realtime PCR: Stratagene MX3005P / 45 Zyklen 16 SFA-ID 1 div 6 div 12 div 14 div 18S rdna CTAB-Extraktion, RealTime-PCR auf Mytilus edulis mit EvaGreen 45 Zyklen Seite 30 von 33

31 6. Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Teilnehmer / Participant Ort / Town Land / Country SPANIEN FRANKREICH CANADA CANADA ITALIEN SPANIEN ZYPERN Deutschland Deutschland ITALIEN SCHWEDEN Deutschland Deutschland ITALIEN SCHWEIZ Deutschland Deutschland GROSSBRITANIEN Deutschland AUSTRALIEN GROSSBRITANIEN [Die Adressdaten der Teilnehmer wurden für die allgemeine Veröffentlichung des Auswerte-Berichts nicht angegeben.] [The address data of the participants were deleted for publication of the evaluation report.] Seite 31 von 33

32 7. Verzeichnis relevanter Literatur 1. DIN EN ISO/IEC 17043:2010; Konformitätsbewertung Allgemeine Anforderungen an Eignungsprüfungen / Conformity assessment General requirements for proficiency testing 2. Verordnung / Regulation 882/2004/EU; Verordnung über amtliche Kontrollen / Regulation on official controls 3. DIN EN ISO/IEC 17025:2005; Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien / General requirements for the competence of testing and calibration laboratories 4. Richtlinie / Directive 1993/99/EU; über zusätzliche Maßnahmen im Bereich der amtlichen Lebensmittelüberwachung / on additional measures concerning the official control of foodstuffs 5. ASU 64 LFGB : Planung und statistische Auswertung von Ringversuchen zur Methodenvalidierung 6. DIN ISO 13528:2009; Statistische Verfahren für Eignungsprüfungen durch Ringversuche / Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons 7. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Laboratories ; J.AOAC Int., 76(4), (1993) 8. The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of Ananlytical Chemistry Laboratories ; Pure Appl Chem, 78, (2006) 9. Evaluation of analytical methods used for regulation of food and drugs;w. Horwitz; Analytical Chemistry, 54, (1982) 10.A Horwitz-like funktion describes precision in proficiency test; M. Thompson, P.J. Lowthian; Analyst, 120, (1995) 11.Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies; W. Horwitz; Pure & Applied Chemistry, 67, (1995) 12.Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing; M. Thompson; Analyst, 125, (2000) 13.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Erdnuss-Kontaminationen in Lebensmitteln mittels ELISA im Mikrotiterplattensystem (2003) 14.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Haselnuss-Kontaminationen in Schokolade und Schokoladenwaren mittels ELISA im Mikrotiterplattensystem (2006) 15.ASU 64 LFGB L Bestimmung von Sojaprotein in Fleisch und Fleischerzeugnissen Enzymimmunologisches Verfahren (2007) 16.IRMM, Poms et al.; Inter-laboratory validation study of five different commercial ELISA test kits for determination of peanut residues in cookie and dark chocolate; European Commission, Joint Research Centre, Belgium; GE/R/FSQ/D08/05/ Ministry of Health and Welfare, JSM, Japan DIN EN ISO :2009; Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren - Teil 1: Allgemeine Betrachtungen 19.DIN EN ISO 15842:2010 Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen Allgemeine Betrachtungen und Validierung von Verfahren 20.Working Group Food Allergens, Abbott et al., Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods: Community Guidance and Best Practices JAOAC Int. 93: (2010) 21.Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT): Méndez et al. Report of a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked immunoassay to determine gliadin in gluten-free food. Eur J Gastroenterol Hepatol. 17: (2005) 22.DLA Publikation: Performance of ELISA and PCR methods for the determination of allergens in food: an evaluation of six years of proficiency testing for soy (Glycine max L.) and wheat gluten (Triticum aestivum L.); Scharf et al.; J Agric Food Chem. 61(43): (2013) Seite 32 von 33

33 23.Interlaboratory Evaluation of Two Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kits for the Determination of Crustacean Protein in Processed Foods, S. Sakai et al., Journal of AOAC J International Vol. 91, No.1, 2008, DLA-07/2015-Allergene VII Von 21 Teilnehmern hat jeder mindestens ein Ergebnis eingereicht. Die Auswertung erfolgte hinsichtlich des Parameters Crustacean für ELISA- (qualitativ und quantitativ) und PCR-Methoden (qualitativ) und hinsichtlich des Paramters Mollusken für PCR-Methoden (qualitativ), während die ELISA-Ergebnisse rein informativ dargestellt wurden. Zusätzlich wurden für jeden Teilnehmer Wiederfindungsraten für die Dotierungsmaterialprobe und die dotierte Probe ermittelt. Details zu den einzelnen Parametern inklusive separater Auswertung nach Testkit-Herstellern sind dem Auswertebericht zu entnehmen. 14 Teilnehmer hatten ihren Sitz im Europäischen Ausland (Frankreich, Großbritannien, Italien, Schweden, Schweiz, Spanien, Zypern) und zwei Teilnehmer im Nicht-EU-Ausland (Australien, Canada). Seite 33 von 33