Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Rinder

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Rinder Auswirkung einer verkürzten präovulatorischen Follikelphase auf den genitalen Blutfluss und die endometriale Hormonrezeptorkonzentration des Rindes INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.) vorgelegt von David Prost aus Coesfeld Hannover 2008

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann Institut für Nutztiergenetik, Mariensee, des Bundesforschungsinstitutes für Tiergesundheit des Friedrich Löffler Institutes (FLI) 1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H. Sieme Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinem treuen Jagd- und Lebensbegleiter

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Schrifttum Das Ovulationssynchronisationsprogramm (OvSynch-Programm) Grundlagen Trächtigkeitsrate im Vergleich zur künstlichen Besamung nach natürlicher Ovulation Einflüsse auf die Trächtigkeitsrate nach Ovulationssynchronisation Steroidhormone und deren Rezeptoren im Endometrium des Rindes Steroidhormone im Plasma während des Zyklus beim Rind Steroidhormon- und Oxytozinrezeptoren im Endometrium des Rindes Auswirkungen einer verkürzten präovulatorischen Follikelphase auf die Plasmasteroidgehalte und ihre Rezeptoren im Endometrium Gefäßversorgung des inneren Genitale des Rindes Gefäßversorgung des Uterus Gefäßversorgung des Ovars Dopplersonographie Dopplersonographische Grundlagen Gerätetechnologie Auswertung dopplersonographischer Untersuchungen Ovarieller Blutfluss des Rindes A. ovarica Follikuläre Durchblutung Luteale Durchblutung Zusammenhang zwischen ovariellen Blutfluss und endogenen Steroidhormonkonzentrationen Zusammenhang zwischen dem ovariellen Blutfluss, der Oozyten-qualität und dem Schwangerschaftserfolg bei der Frau Uteriner Blutfluss Änderungen im Zyklus des Rindes I

6 Inhaltsverzeichnis Zusammenhang zwischen uterinem Blutfluss und endogenen Steroidhormonkonzentrationen des Rindes Zusammenhang zwischen uteriner Durchblutung und dem Schwangerschaftserfolg bei der Frau Progesteronmangel während der Lutealphase Beim Rind Lutealphasendefekt (luteal phase defect; LPD) bei der Frau Material und Methoden Tiere Definitionen Versuchsdesign Klinische Untersuchung Sonographische Untersuchungen Verwendete Geräte und Sonden B-Bild-Sonographie Farbdopplersonographie Plasmagewinnung und hormonanalytische Untersuchung Gewinnung von Endometrium-Biopsien und Hormonrezeptoranalyse Hormonelle Behandlung Statistische Auswertungen Ergebnisse Klinisch-gynäkologische Befunde Hormonelle Befunde Plasmaöstrogenkonzentrationen im Östrus Expression der mrna der Östrogen-, Progesteron- und Oxytozinrezeptoren im Östrus Plasmaprogesteronkonzentrationen im Diöstrus II

7 Inhaltsverzeichnis Expression der mrna der Östrogen-, Progesteron- und Oxytozinrezeptoren im Diöstrus Sonographische Befunde Follikel im Östrus Uteriner Blutfluss im Östrus Corpora lutea im Diöstrus Uteriner Blutfluss im Diöstrus Diskussion Pathologische Befunde Endokrinologische Befunde Sonographische Befunde der Ovarien Follikel Corpora lutea Sonographische Befunde des Uterus Schlussfolgerungen und Ausblick Zusammenfassung Summary Anhang Verzeichnisse Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis III

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9 Abkürzungen A. Arteria Abb. Abbildung Acl Gelbkörperquerschnittsfläche Afol Follikelquerschnittsfläche Alut Lutealgewebefläche BFV Blutflussvolumen bzw. beziehungsweise ca. circa cdna complementary deoxyribonucleic acid CF-Modus Color-Flow-Modus Cl Corpus luteum d Durchmesser CP gegen Ubiqitin und Histon normalisierte Zyklenanzahl der Zielgen-RNA D e E ges EIA ET FAL folbl FSH GnRH h hcg hmg i.d.r. i.m. IVF kg enddiastolische Frequenzverschiebung Gesamtöstrogen Enzyme linked Immune Assay Embryo Transfer Forschungsanstalt für Landwirtschaft absolute Follikeldurchblutung Follikel-stimulierendes Hormon Gonadotropin Releasing Hormone Stunden humanes Choriongonadotropin humanes Menopausal Gonadotropin in der Regel intramuskulär In vitro Fertilisation Kilogramm 1

10 LH Luteinisierendes Hormon LPD Lutealphasendefekt lutbl absolute Gelbkörperdurchblutung M Median MAD Median absolute deviation Max Maximum MDV Minimum diastolic velocity MHz Megahertz Min Minimum ml Milliliter mm Millimeter mrna messenger Ribonucleic Acid µg Mikrogramm µl Mikroliter n Stichprobenumfang ng Nanogramm Ov-Synch Ovulations-Synchronisation p Irrtumswahrscheinlichkeit P 4 Plasmaprogesteronkonzentration PGF 2α PI p.i. pmol PSV r relfolblfl rellutblfl rellutbllut RI ROI RT PCR Prostaglandin F 2α Pulsatily Index; uteriner Blutflusswiderstand post inseminationem Pico mol peak systolic velocity Korrelationskoeffizient relative follikuläre Durchblutung relative luteale Durchblutung relative luteale Durchblutung des Lutealgewebes Resistance Index Region Of Interest Real Time Polymerase Chain Reaction 2

11 S maximale systolische Frequenzverschiebung Tab. Tabelle TAMF time averaged maximum frequency shift TAMV time averaged maximum velocity; uterine Blutflussgeschwindigkeit V. Vena vs. versus 3

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13 Einleitung 1 Einleitung Vor mehr als zehn Jahren wurde von PURSLEY et al. (1995) ein Verfahren zur hormonellen Ovulations-Synchronisation (OvSynch) von Rindern ohne Brunstbeobachtung mit terminierter Besamung entwickelt. Die nach Anwendung dieser Programme erzielten Trächtigkeitsraten sind jedoch im Vergleich zu Besamungen, welche nach spontaner Ovulation erfolgten, meist deutlich reduziert (MAWHINNEY et al. 1999; KLIDWORTH et al. 2001; DECKER et al. 2002). Daher wurde eine Vielzahl von Modifikationen des ursprünglichen OvSynch Programms getestet, um die Trächtigkeitsraten zu erhöhen (THATCHER et al. 2006; YAMADA 2005; STEVENSON 2005). Es hat sich dabei gezeigt, dass durch die Verlängerung des Zeitraums zwischen der Prostaglandininjektion und der zweiten GnRH Verabreichung auf 52 bis 60 Stunden die Graviditätsraten gesteigert werden können (PETERS et al. 1999; MAWHINNEY et al. 1999). Es ist aber bisher nicht bekannt, welche Ursache dieses Phänomen hat. So werden positive Auswirkungen einer Verlängerung des Zeitintervalls zwischen Prostaglandin- und zweiter GnRH-Injektion über 48 Stunden hinaus auf die Reifung des präovulatorischen Follikels und des sich daraus entwickelnden Corpus luteum diskutiert (TAPONEN et al. 1999; BURKE et al. 2001; VASCONCELOS et al. 2001). Ausserdem wird vermutet, dass die Verlängerung der präovulatorischen Follikelphase positive Auswirkungen auf den Gehalt an Sexualhormonrezeptoren im Endometrium haben könnte (ZOLLERS et al. 1993; MUSSARD et al. 2007). Bereits seit Jahrzehnten wird der Blutversorgung des Genitales eine wichtige Rolle hinsichtlich der Fertilität zugesprochen (NISWENDER et al. 1976; FORD et al. 1979). So gibt es in der Humanmedizin eine Reihe von farbdopplersonographischen Studien, welche positive Zusammenhänge zwischen der Follikel- (OYESANA et al. 1996; NARGUND et al. 1996a; NARGUND et al. 1996b; COULAM et al. 1999) bzw. der Corpus luteum Durchblutung (KURJAK u. KUPESIC 1995; OTTANDER et al. 2004) und der uterinen Blutversorgung (GOSWAMY et al. 1988; KUPESIC u. 5

14 Einleitung KURJAK 1993; CACCIATORE u. TIITINEN 1996) auf der einen Seite und der Fertilität der Frau auf der anderen Seite beobachtet haben. Seit einigen Jahren wird die Farbdopplertechnik auch beim Rind durchgeführt, wobei sich die Untersuchungen bisher weitgehend auf die Darstellung physiologischer Veränderungen während des Zyklus und der Gravidität beschränkt haben (KOBAYASHI et al. 2002; ACOSTA et al. 2003; SHIRASUNA et al. 2004; ACOSTA et al. 2004; ACOSTA et al. 2005; KAWASHIMA et al. 2006). Mit der Etablierung molekularbiologischer Methoden im Bereich der Gynäkologie des Rindes gibt es daneben nun auch die Möglichkeit, die Genexpression der Hormonrezeptoren im Endometrium des Rindes zu quantifizieren (MEYER et al. 1988; JENNER et al. 1991; KIMMINGS u. MCLAREN 2001). Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu überprüfen, inwieweit eine frühzeitige Induktion der Ovulation im Rahmen von Synchronisationsprogrammen Auswirkungen auf die genitale Durchblutung einerseits und auf die mrna-expression ausgewählter Hormonrezeptoren andererseits besitzt. Es sollen dadurch Hinweise darauf erhalten werden, ob die im Rahmen der Verlängerung des Zeitintervalls zwischen Prostaglandin- und zweiter GnRH-Verabreichung innerhalb eines OvSynch Programms beobachteten Fertilitätsunterschiede vorwiegend auf positiven Auswirkungen auf das ovarielle Geschehen oder das uterine Milieu oder auf beiden Faktoren beruhen. 6

15 Schrifttum 2 Schrifttum 2.1 Das Ovulationssynchronisationsprogramm (OvSynch-Programm) Grundlagen PURSLEY et al. (1999) entwickelten eine Methode zur präzisen Synchronisation der Ovulation, um die künstliche Besamung ohne Brunstbeobachtung zu ermöglichen. Dieses Programm beinhaltet drei Hormon-Injektionen zu bestimmten Zeitpunkten mit anschließender terminierter Besamung (Abb. 1.1). GnRH PGF2α GnRH terminierte Besamung 7d 48h 16-20h Abbildung 2.1: Zeitpunkte der Hormon-Injektionen und der Besamung in dem OvSynch Programm nach PURSLEY et al. (1999) (modifiziert nach WILTBANK (1998)) Die erste GnRH-Injektion wird den Tieren zu einem beliebigen Zyklusstand verabreicht und führt nach PURSLEY et al. (1999) bei den meisten Kühen zu einer Ovulation oder Luteinisierung des dominanten Follikels. Dadurch wird eine neue Follikelwelle induziert, aus der sich sieben Tage später ein dominanter Follikel entwickeln soll (MACMILLAN u. THATCHER 1991; WOLFENSON et al. 1994; KOHRAM et al. 1998; VASCONCELOS et al. 1999). Die PGF 2α -Injektion sieben Tage nach Beginn des Programms induziert nach PURSLEY et al. (1997a) eine Luteolyse des zyklischen und/oder akzessorischen Gelbkörpers und ermöglicht so dem dominanten Follikel die Ovulation. Ohne eine weitere GnRH-Injektion würde die Zeit zwischen PGF 2α -Injektion und Ovulation des dominanten Follikels sehr variabel ausfallen (WOLFENSON et al. 1994; STEVENSON et al. 1996; STOLLA et al. 1998). 7

16 Schrifttum So variierten die Ovulationszeitpunkte bei einer von HEGEMANN (1998) durchgeführten Studie nach einer alleinigen Behandlung mit GnRH und PGF 2α zwischen 48 und 168 Stunden. Nach STEVENSON et al. (1996) könnten die unterschiedlichen Reifestadien der dominanten Follikel zum Zeitpunkt der induzierten Luteolyse der Grund für die variablen Zeitspannen bis zur spontanen Ovulation sein. Um die Ovulation des dominanten Follikels zeitlich einzugrenzen, injizierten PURSLEY et al. (1999) 48 Stunden nach der PGF 2α -Applikation nochmals GnRH, wodurch die Ovulation innerhalb von 32 Stunden post injectionem ausgelöst wurde. Dadurch wird eine terminierte künstliche Besamung ohne vorherige Brunstbeobachtung ermöglicht (THATCHER et al. 1993; FRICKE et al. 1998; VASCONCELOS et al. 1999). DE JARNETTE et al. (2001) beobachteten jedoch bei den von ihnen durchgeführten Untersuchungen zum OvSynch Programm bei 71 von 354 Kühen bereits 48h nach der PGF 2α -Applikation Brunstsymptome. Ihrer Ansicht nach könnte bei diesen Tieren ein bereits vor der zweiten exogenen GnRH-Gabe erfolgter endogener LH-Peak zur vorzeitigen Ovulation geführt haben. Daher empfehlen sie zur Verbesserung der Konzeptionsraten eine zusätzliche Brunstbeobachtung zwischen PGF 2α -Injektion und der zweiten GnRH-Injektion und eine Besamung bei vorzeitiger Brunst Trächtigkeitsrate im Vergleich zur künstlichen Besamung nach natürlicher Ovulation In diversen Studien (PURSLEY et al. 1995; PURSLEY et al. 1997; MAWHINNEY et al. 1999; SURHOLT 2001; KLINDWORTH et al. 2001; DECKER et al. 2002) wurden die Trächtigkeitserfolge von Tieren, die nach natürlicher Brunst besamt wurden, mit Tieren, die im Rahmen eines OvSynch Programms terminiert inseminiert wurden, verglichen. In Arbeiten von PURSLEY et al. (1997a) und MAWHINNEY et al. (1999) wurden Kontrolltiere, die etwa 15 Tage nach der Erstbesamung Brunst zeigten, erneut besamt. Tiere der OvSynch-Gruppe wurden erst nach negativer Trächtigkeitsdiagnose, welche am Tag 32 nach der Insemination durchgeführt wurde, erneut hormonell behandelt und besamt. Die Autorgruppen kamen in ihren Vergleichsstudien zu folgenden Ergebnissen. In der Studie von PURSLEY et al. 8

17 Schrifttum (1999) unterschieden sich die Trächtigkeitsraten nach Erstbesamung nicht (OvSynch-Gruppe 37%; Kontrollgruppe 39%). In den Untersuchungen von MAWHINNEY et al. (1999) lagen die Trächtigkeitsraten nach Erstbesamung bei unbehandelten Tieren höher (50% vs. 40%). Übereinstimmend konnten beide Autorgruppen 100 Tagen post partum (VASCONCELOS et al. 1999) bzw. 125 Tage post partum (MAWHINNEY et al. 1999) mehr behandelte als unbehandelte Tiere (53% vs. 35% bzw. 78% vs. 66%) tragend diagnostizieren. Nach PURSLEY et al. (1997a) und MAWHINNEY et al. (1999) könnten die geringeren Trächtigkeitsraten nach der Erstbesamung bei Tieren, die dem OvSynch Programm unterzogen wurden, darauf zurückzuführen sein, dass die synchronisierten Tiere früher nach der Geburt und damit in einem Stadium niedrigerer Fruchtbarkeit als die Kontrolltiere besamt wurden. Kürzere Zeitintervalle zwischen der Diagnose nicht tragend und einer erneuten Besamung bei OvSynch Tieren könnten dagegen die Ursache für die größere Anzahl am Tag 100 post partum bzw. Tag 125 post partum tragender Tiere im Vergleich zu unbehandelten Tieren sein. SURHOLT (2004) verglich in einem Betrieb mit mangelhafter Brunstbeobachtung nach dem klassischen OvSynch Programm behandelte Tiere (330) mit unbehandelten Tieren (337). Die durchschnittliche Rastzeit der OvSynch-Gruppe war mit 62,5 Tagen geringer, als die Rastzeit der Kontrollgruppe mit 106,1 Tagen. Auch waren 200 Tage post partum mehr behandelte Tiere als unbehandelte Tiere trächtig (71,2% vs. 52,2%). Übereinstimmend mit den Ergebnissen von MAWHINNEY et al. (1999) fiel auch in der Studie von SURHOLT (2001) die Trächtigkeitsrate nach Erstbesamung in der OvSynch-Gruppe geringer aus (35,6%) als die der Kontrolltiere (44,8%). Mögliche Gründe für die Ergebnisse werden von dem Autor aber nicht genannt. In einer Studie zur Praxistauglichkeit von OvSynch Programmen in norddeutschen Betrieben verglichen KLINDWORTH et al. (2001) Kühe, die einem OvSynch- Programm (n = 187) unterzogen wurden, mit spontan brünstigen Tieren (n = 175), wobei auch nach Laktationsstand und Abkalbemonat der Tiere differenziert wurde. Auch diese Autorengruppe kam zu übereinstimmenden Ergebnissen mit den erstgenannten Studien. Der Erstbesamungserfolg fiel bei den Versuchstieren mit 9

18 Schrifttum 39,8% deutlich geringer aus als bei den Kontrolltieren mit 54,3%. Zusätzlich fanden die Autoren heraus, dass bei OvSynch Tieren, die sich in der ersten Laktation befanden, der Erstbesamungserfolg deutlich niedriger war, als bei den entsprechenden, unbehandelten Kontrolltieren (37,8% vs. 71,1%). Dagegen waren bei Tieren mit einer höheren Laktationsnummer keine Unterschiede im Erstbesamungserfolg zwischen Versuchstieren und Kontrolltieren festzustellen. Auch der Zeitpunkt der Besamung nach der Geburt hatte keinen Einfluss auf die Erfolgsrate des OvSynch Programms im Vergleich zu den Kontrolltieren. Gründe für die von ihnen erhaltenen Ergebnisse nennen die Autoren aber nicht. DECKER et al. (2002) verglichen in 60 Milchviehbetrieben die Konzeptionsraten von synchronisierten Tieren mit den Konzeptionsraten spontan brünstiger Tiere. Insgesamt wurden die Daten von 195 synchronisierten Tieren mit denen von 100 spontan brünstigen Tieren verglichen. Die synchronisierten Tiere wurden wiederum in zwei Gruppen aufgetrennt (OvSynch bei Erstbesamung / OvSynch bei Nachbesamung). Nach einmaliger Besamung lagen die Konzeptionsraten bei 51,9% (OvSynch bei Erstbesamung), 53% (Besamung nach spontaner Brunst) bzw. 62,6% (OvSynch bei Nachbesamung) Einflüsse auf die Trächtigkeitsrate nach Ovulationssynchronisation Zyklusstand zu Beginn eines OvSynch Programms Synchronisationsverfahren, wie das klassische OvSynch Programm, werden zu einem beliebigen Zyklusstand begonnen. Es zeigte sich aber (AMBROSE et al. 1998; VASCONCELOS et al. 1999; THATCHER et al. 2006), dass der Zyklusstand zu Beginn eines OvSynch Programms einen Einfluss auf die Ovulationsraten nach der ersten und zweiten GnRH-Gabe besitzt. Die Ovulationsrate in einem definierten Zeitintervall nach der zweiten GnRH-Gabe bezeichnet man laut VASCONCELOS et al. (1999) als Synchronisationsrate. Die Ovulationsraten nach der ersten GnRH-Injektion schwankten in verschiedenen Studien zwischen 58% und 90% (AMBROSE et al. 1998; VASCONCELOS et al. 1999). In den Untersuchungen von VASCONCELOS et al. (2001) induzierte die erste GnRH-Gabe zu Beginn eines Zyklus (Tag eins bis vier) bei 23%, in der frühen Zyklusphase (Tag fünf bis neun) bei 96%, in der mittleren 10

19 Schrifttum Zyklusphase (Tag zehn bis 16) bei 54% und in der letzten Zyklusphase (Tag 17 bis 21) bei 77% der Tiere eine Ovulation. Ferner ovulierten Kühe in ihren Studien nach Beginn des OvSynch Programms in der mittleren Zyklusphase (Tag fünf bis 13) mit kleineren Follikeln. Dabei teilten VASCONCELOS et al. (1999) die Follikelgrößen in die Gruppen kleiner oder größer als der mittlere Follikeldurchmesser am Tage der PGF 2α -Gabe (mittlerer Durchmesser = 15,4mm) und am Tag der zweiten GnRH- Gabe (mittlerer Durchmesser = 18,2mm) ein. VASCONCELOS et al. (2001) stellten fest, dass die Trächtigkeitsraten bei Tieren mit kleineren Follikeln sowohl zum Zeitpunkt der Prostaglandininjektion als auch zum Zeitpunkt der zweiten GnRH-Gabe höher waren, als bei Tieren mit einem größeren Follikel (42% vs. 32%). Auch korrelierte die Größe des ovulatorischen Follikels am Tag der Prostaglandininjektion negativ mit der Trächtigkeitsrate (r = -0,44, p = 0,06). Möglicherweise könnten nach VASCONCELOS et al. (1999) größere Follikel in ihren Untersuchungen bereits das Stadium der Follikelreife durchlaufen haben. MOREIRA et al. (2000a) injizierten im Rahmen des OvSynch Programms erstmals an den Zyklustagen zwei, fünf, zehn, 15 und 18 (Tag 0 = Ovulation). Dabei beobachteten sie unterschiedliche Trächtigkeitsraten mit 40% (2/5) an Tag zwei, 20% (1/5) an Tag fünf, 75% (3/4) an Tag zehn, 0% (0/5) an Tag 15 sowie 60% (3/5) an Tag 18. Jedoch ist anhand dieser Studie nach Meinung der Autoren aufgrund zu geringer Tierzahlen eine direkte Aussage über den Einfluss des Zeitpunktes des Beginns mit dem OvSynch Programm auf die Trächtigkeitsraten nicht möglich. In derselben Studie beobachteten die Autoren anhand sonographischer Verlaufskontrollen der Follikeldynamik unterschiedliche Ovarreaktionen der verschiedenen Gruppen. Tiere, welche die erste GnRH-Gabe an Zyklustag zwei erhielten, reagierten weder auf die erste GnRH-Injektion noch auf die zweite GnRH-Injektion mit einer Ovulation. Am Tag der ersten Hormongabe waren nach MOREIRA et al. (2000a) die Follikel anscheinend in der frühen Rekrutierungsphase und zum Zeitpunkt der zweiten GnRH-Injektion war der dominante Follikel vermutlich bereits wieder atretisch. Tiere, die am 15. Zyklustag die erste GnRH-Injektion eines Ov-Synch- Programms erhielten, zeigten eine vorzeitige Regression des Gelbkörpers noch vor der exogenen PGF 2α -Applikation. Dafür könnte nach Ansicht der Autoren ursächlich 11

20 Schrifttum PGF 2α endometrialen Ursprungs verantwortlich gewesen sein. Bei Tieren, welche die erste GnRH-Injektion innerhalb des Programms an Zyklustag 18 erhielten, beobachteten MOREIRA et al. (2000a) nach der Prostaglandininjektion eine unvollständige luteale Regression mit Plamsaprogesteronkonzentrationen über 3 ng/ml. Die Autoren vermuten, dass es durch die erste GnRH-Injektion wenig später zu der Entstehung eines akzessorischen Corpus luteum kam, das sieben Tage später eine verminderte Ansprechbarkeit gegenüber exogenem PGF 2α aufwies. In einer weiteren Studie stellten MOREIRA et al. (2000b) fest, dass bei Kühen mit einer unvollständigen Gelbkörperregression die Trächtigkeitsraten an Tag 27 p.i. niedriger lagen als bei Tieren mit einer vollständigen Gelbkörperregression (8,4% vs. 35%). Anhand der Ergebnisse ihrer Studien empfehlen die Autoren (MOREIRA et al. 2000a; 2000b) daher, die erste Hormoninjektion in einem OvSynch Programm zwischen den Zyklustagen fünf und zehn durchzuführen Zeitpunkt der zweiten GnRH-Injektion nach PGF 2α In diversen Studien zeigte sich (THATCHER et al. 1993; STEVENSON et al. 1999; TAPONEN et al. 1999; DOLEZEL et al. 2002; PETERS u. PURSLEY 2003), dass auch eine vorzeitige zweite GnRH-Gabe vor den empfohlenen 48 Stunden nach der Prostaglandininjektion zu erniedrigten Trächtigkeitsraten im Vergleich zum klassischen OvSynch Programm nach PURSLEY et al. (1997a) führt. PETERS und PURSLEY (2003) untersuchten in einer Studie an 675 Tieren die Trächtigkeitsraten nach Modifikationen des OvSynch Programms, bei denen die GnRH-Injektion zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach PGF 2α -Injektion erfolgte. In einem ersten Versuchsabschnitt wurde eine Gruppe dem klassischen OvSynch Programm unterzogen, während bei einer zweiten Gruppe die zweite GnRH-Injektion zeitgleich mit der PGF 2α -Injektion durchgeführt wurde. Die Trächtigkeitsraten waren bei der klassischen OvSynch Gruppe deutlich höher als bei der modifizierten OvSynch Gruppe (31,3% vs. 14,7%). In einem zweiten Versuchsabschnitt erhielten die Tiere die zweite GnRH-Gabe null, zwölf, 24 oder 36 Stunden nach der PGF 2α - Gabe. In diesen Gruppen wurden eine lineare Zunahme des Durchmessers des dominanten Follikels sowie eine lineare Zunahme der Trächtigkeitsraten mit 12

21 Schrifttum zunehmendem Abstand zwischen der PGF 2α -Gabe und der zweiten GnRH-Gabe beobachtet. Die Autoren nehmen an, dass die Ursache für die geringeren Trächtigkeitsraten bei vorzeitiger GnRH-Injektion in Störungen bei der Entwicklung des Corpus luteum und einer dadurch bedingten frühzeitigen Regression des angebildeten Gelbkörpers liegen könnte. Auch SCHMITT et al. (1993) und TAPONEN et al. (1999) sind der Ansicht, dass durch eine frühzeitige Induktion des LH-Peaks vor der eigentlichen Follikelreife die Lutealphase verkürzt wird. TAPONEN et al. (1999) verfolgten das Follikelwachstum und die Gelbkörperentwicklung im Anschluss an eine Synchronisation. Zur Induktion der Luteolyse erhielten alle Studientiere acht bzw. neun Tage nach Ovulation eine PGF 2α -Injektion und im Anschluss 24, 48 oder 72 Stunden später eine GnRH-Gabe. Eine weitere Kontrollgruppe erhielt nur die erste PGF 2α Injektion. Dabei beobachteten die Autoren in der 24-Stunden-Gruppe tendenziell kleinere Follikel um den Zeitpunkt der Ovulation (15,8mm vs. 16,7mm) und ein signifikant geringeres Wachstum des dominanten Follikels vom Tag der Prostaglandininjektion bis zur Ovulation (0,6mm/Tag) im Vergleich zu Tieren der Kontrollgruppe (0,8mm/Tag). Nach Auslösung der Ovulation kleinerer Follikel beobachteten TAPONEN et al. (1999) ab Tag fünf post ovulationem bei zwei von sieben Versuchstieren (29%), welche die GnRH-Injektion 24 Stunden nach der Prostaglandininjektion erhielten, eine vorzeitige Luteolyse des sich daraus resultierenden Gelbkörpers. MOREIRA et al. (2000a) stellten eine positive Korrelation zwischen der Größe der präovulatorischen Follikel und dem Progesterongehalt sieben Tage nach einer Besamung fest. Weitere Autoren verglichen die Trächtigkeitsraten von Kühen, die 24 bzw. 33 Stunden nach der PFG 2α -Injektion die zweite GnRH-Gabe erhielten, mit Tieren, denen 48 Stunden nach der PFG 2α -Injektion die zweite GnRH-Gabe verabreicht wurde (THATCHER et al. 1993; STEVENSON et al. 1999; DOLEZEL et al. 2002). Dabei wies die letztgenannte Gruppe nach STEVENSON et al. (1999) deutlich höhere Trächtigkeitsraten (35,6% vs. 22,1%) auf. Auch in den anderen Studien (SCHMITT et al. 1996; DOLEZEL et al. 2002) konnten bei den Kühen, denen 48 Stunden nach der PFG 2α -Injektion GnRH verabreicht wurde, höhere Trächtigkeitsraten erzielt werden (25,8% vs. 45,5% bzw. 42% vs. 66%), als bei den 13

22 Schrifttum Tieren die GnRH 24 bzw. 33 Stunden nach PFG 2α erhielten. Ähnlich wie SCHMITT et al. (1996) und TAPONEN et al. (1999) führen auch DOLEZEL et al. (2002) die Reife eines dominanten Follikels zum Zeitpunkt der zweiten GnRH-Injektion als entscheidendes Kriterium für eine erfolgreiche Trächtigkeit an. Darüber hinaus sind SCHMITT et al. (1996) der Ansicht, dass möglicherweise das Intervall zwischen der ansteigenden pulsatilen LH-Sekretion im Anschluss an eine Luteolyse und dem LH- Peak essentiell für die ribosomale RNA Transkription der Oozyte des Rindes sind. In anderen Studien (PETERS et al. 1999; MAWHINNEY et al. 1999) wurde nachgewiesen, dass im Vergleich zum klassischen OvSynch Programm die Verlängerung des Zeitintervalls von der Prostaglandininjektion bis zur zweiten GnRH- Gabe auf maximal 60 Stunden zu einer Erhöhung der Graviditätsrate führte. PETERS et al. (1999) verglichen die Intervalle 48 Stunden, 56 bis 60 Stunden und 72 Stunden zwischen Prostaglandininjektion und der zweiten GnRH-Injektion und überprüften die Ovulationen mittels Ultraschall. Sie fanden heraus, dass zehn von elf Tiere zwölf bis 36 Stunden nach der zweiten GnRH-Gabe ovulierten, falls die zweite GnRH-Injektion 56 bis 60 Stunden nach der PGF 2α -Injektion erfolgte. Dagegen ovulierten Tiere, die 72 Stunden nach der PGF 2α -Injektion die zweite GnRH-Injektion erhielten bzw. keine zweite GnRH-Injektion erhielten, überwiegend (50% bzw. 65%) mehr als vier Tage nach der PGF 2α -Injektion. In Anlehnung an diese Ergebnisse verglichen MAWHINNEY et al. (1999) ein modifiziertes OvSynch Programm bei dem die zweite GnRH-Gabe zwischen 52 und 56 Stunden nach Prostaglandininjektion erfolgte, mit spontan ovulierenden Tieren. Diese Autorengruppe beobachtete 125 Tage post partum höhere Trächtigkeitsraten bei synchronisierten Tieren im Vergleich zu spontan ovulierenden Tieren (78% vs. 66%). Somit ist nach Ansicht vieler Autoren (AMBROSE et al. 1998; TAPONEN et al. 1999; BURKE et al. 2001; VASCONCELOS et al. 2001) die Reife des dominanten Follikels entscheidend für den Trächtigkeitserfolg nach Anwendung eines OvSynch Programms, wobei als Kriterium für die Reife der Durchmesser des dominanten Follikels zum Zeitpunkt der Ovulation herangezogen wurde. MUSSARD et al. (2007) verglichen die Progesteronspiegel in der Mitte der Lutealphase an Tag 12 post ovulationem und die Konzeptionsraten 30 Tage nach Besamung von Tieren nach 14

23 Schrifttum spontaner und Tieren nach induzierter Ovulation, wobei letztere bei einem Durchmesser des dominanten Follikels von 10mm mittels GnRH induziert wurde. Zuvor waren bei allen Tieren die Follikel mittels transvaginaler Follikelpunktion entfernt und die Luteolyse induziert worden. Tiere der spontan ovulierenden Gruppe besaßen kurz vor der Ovulation einen größeren Follikeldurchmesser (12 vs. 10,5 mm), 12 Tage post ovulationem eine größere Lutealfläche (3,6 vs. 3,0 cm 2 ) und eine höhere Plasmaprogesteronkonzentration (6,4 vs. 5,4 ng/ml) und schließlich auch eine höhere Trächtigkeitsrate 30 Tage post inseminationem (100% vs. 76%) im Vergleich zu den Tieren, bei denen die Ovulation induziert wurde. Um den Einfluss unterschiedlicher Proöstruslängen auf die Fertilität auszuschließen, führten die Autoren in einer zweiten Studie eine Vorsynchronisation durch und induzierten die Ovulation von Follikeln mit einem Durchmesser von 10 mm oder 13 mm mittels GnRH. Auch in dieser Studie besaßen Tiere mit einem größeren präovulatorischen Follikel zwölf Tage post ovulationem einen höheren Progesterongehalt (5,5 vs. 4,9 ng/ml) und 30 Tage post inseminationem eine höhere Trächtigkeitsrate (57,4 vs. 4,4%) im Vergleich zu Tieren mit einem kleineren präovulatorischen Follikel. Mit diesen Ergebnissen konnte zwar nach Meinung der Autoren ein Einfluss der Follikelreife auf die folgende Lutealphase bzw. auf den Erfolg einer Trächtigkeit nachgewiesen werden (MUSSARD et al. 2007), jedoch seien auch Trächtigkeitsverluste aufgrund einer Beeinträchtigung der Befruchtung oder der frühen Embryonalentwicklung möglich. Daher wurden in einer dritten Studie Tiere nach dem Versuchschema des zweiten Versuches behandelt. Jedoch wurden die Tiere nicht besamt, sondern ein Embryotransfer am Tag sieben post ovulationem durchgeführt, um so negative Einflüsse auf die frühe embryonale Entwicklung auszuschließen. Auch in diesem Versuchsabschnitt wurden zwölf Tage nach der Ovulation bei Tieren mit einem Follikeldurchmesser von 13mm bei Ovulationsinduktion höhere Plasmaprogesterongehalte (5,6 vs. 3,4ng/ml) und 30 Tage nach der Besamung höhere Trächtigkeitsraten (66,7 vs. 8,3%) festgestellt, im Vergleich zu Tieren, bei denen die Ovulation bei einem Follikeldurchmesser von 10mm induziert wurde. Nach MUSSARD et al. (2007) ist somit die Follikelreifung ein komplexes System und wird durch weitere Faktoren beeinflusst, die ausschlaggebend für die Etablierung einer 15

24 Schrifttum Trächtigkeit sind. Ihrer Meinung nach geht aus den Ergebnissen der Studien zwei und drei darüber hinaus hervor, dass solche unbekannten Mechanismen an der Entwicklung einer adäquaten uterinen Umwelt zur Aufnahme eines Embryos beteiligt sein könnten. Ob der unterschiedliche Progesterongehalt allein den uterinen Status bestimmt oder ob andere hormonelle Interaktionen beteiligt sind, bleibt Ihrer Meinung nach fraglich. So könnte Ihrer Ansicht nach möglicherweise eine mangelhafte Östrogeneinwirkung auf den Uterus während des Proöstrus frühzeitig ovulierender Tiere eine verminderte Expression der uterinen Progesteronrezeptoren bewirken. In Kombination mit einer verminderten Progesteronsekretion eines insuffizienten Gelbkörpers ergebe sich so möglicherweise ein negativer kumulativer Effekt in Hinblick auf die Etablierung einer Trächtigkeit. 2.2 Steroidhormone und deren Rezeptoren im Endometrium des Rindes Steroidhormone im Plasma während des Zyklus beim Rind GnRH, FSH, LH und Östrogene Das Zentrum der hormonellen Steuerung der Ovulation stellt der Hypothalamus dar. Hier wird das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) gebildet und über Neurosekretion an den Hypophysenvorderlappen sezerniert. Dort stimuliert es die Synthese und Abgabe der hypophysären Gonadotropine Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikelstimulierendes Hormon (FSH). Die Erfolgsorgane dieser Hormone sind die Gonaden (SCHULER et al. 1999). FSH spielt dabei die wichtigste Rolle für das Wachstum der Follikel. Ein starker FSH-Anstieg stimuliert bereits zwei Tage vor Erscheinen einer neuen Follikelwelle die Follikelanbildung (ADAMS et al. 1992; SUNDERLAND et al. 1994). Der FSH-Anstieg, welcher die erste Follikelwelle induziert, fällt mit dem LH-Anstieg zusammen (BERGFELT et al. 1997). LH, das pulsatil ausgeschüttet wird, ist wiederum für das Heranreifen der Follikel, die Ovulation und die Ausbildung eines Gelbkörpers entscheidend. Nach CHRISTENSEN et al. (1997) steigt die LH-Konzentration sieben Stunden nach Beginn des Östrus für zwölf Stunden auf ein präovulatorisches Maximum von 16

25 Schrifttum 58,9 ng/ml an (CHRISTENSEN u. SCHINDLER 1997) und löst dadurch eine Ovulation aus (WALTERS u. SCHALLENBERGER 1984). Während der übrigen Zyklusabschnitte bleibt die LH-Konzentration relativ konstant auf einem basalen Wert von 1,8ng/ml (CHRISTENSEN et al. 1974). Mit der Follikelreifung steigen auch die Konzentrationen an Östrogenen im peripheren Plasma. Zwei Tage vor der Ovulation, d.h. sechs bis acht Stunden vor dem LH-Peak, nehmen sie Maximalwerte an (WALTERS u. SCHALLENBERGER 1984). Eine Stunde nach dem LH-Peak, noch vor der eigentlichen Ovulation, sinken sie bereits wieder ab (HENRICKS et al. 1971; WALTERS u. SCHALLENBERGER 1984; CHRISTENSEN u. SCHINDLER 1997; BAUMGARTNER 1998). Ein hoher Östrogenspiegel ist unter anderem verantwortlich für die Verhaltensänderung in der Brunst und steigert Proliferationsvorgänge am Endometrium durch Zunahme der sekretorisch aktiven Zellen (UHRIN 1984; WATSON 1985). Darüber hinaus schafft ein erhöhter Östrogenspiegel die Voraussetzung für eine vermehrte Kontraktilität des Myometriums durch eine erhöhte Oxytozinansprechbarkeit der Myozyten (Glatzel 1997) und bewirkt durch einen positiven Feedback auf den Hypophysenvorderlappen eine vermehrte Ausschüttung von LH (NIEMANN u. MEINECKE 1993; GRUNERT 1999) Progesteron Nach der Ovulation des dominanten Follikels bildet sich aus dem in das Antrum eingeflossene Blut und dem Follikelrestgewebe ein Corpus luteum. Dieses sezerniert als temporäre Hormondrüse vor allem Progesteron (STABENFELDT et al. 1969; HENRICKS et al. 1970; POPE et al. 1982; BAUMGARTNER 1998). Mit der Reifung des Corpus luteum steigt der Progesteronspiegel immer weiter an und erreicht sein Maximum von 7ng/ml (HENRICKS et al. 1970) um den Zyklustag 13 (STABENFELDT et al. 1969; HENRICKS et al. 1970; POPE et al. 1982; BAUMGARTNER 1998). Liegt keine Trächtigkeit vor, wird etwa 14 Tage nach der Ovulation (NIEMANN u. MEINECKE 1993) vermehrt uterines Prostaglandin F 2α (PGF 2α ) freigesetzt, welches die Rückbildung des Gelbkörpers induziert (AURICH 1995) und die Plasmaprogesteronkonzentration sinkt um den Zyklustag 16 auf 17

26 Schrifttum Basalwerte unter 1,0 ng/ml ab (STABENFELDT et al. 1969; HENRICKS et al. 1970; POPE et al. 1982; BAUMGARTNER 1998). Progesteron schafft als wichtiges natürliches Gestagen die Voraussetzung für die Konzeption und Nidation. Es wirkt embryotroph durch Stimulierung der sekretorischen Aktivität des Endometrium (SAMUEL et al. 1979; WATSON 1985) und soll die Kontraktionsfähigkeit des Myometriums herabsetzen. So wird zum einen eine Hemmung der Na-Pumpe in der Zellmembran des Myozyten diskutiert (CSAPO 1956), zum anderen eine Senkung der Empfindlichkeit der Zellen für Signale wie Oxytozin oder Prostaglandin (HALUSKA et al. 1987). ZARAHDNIK und BEYER (1980) vermuten anhand ihrer Studien am Pferd, dass Progesteron die Synthese von Prostaglandin E fördert, welches seinerseits für eine Senkung des Tonus der glatten Muskulatur sorgt. TAVERNE et al. (1979) beobachteten unter Progesterondominanz am Pferdeuterus mit Hilfe der Elektromyographie nur diffuse, myometriale Aktivitätsphasen mit niedrigen Amplituden. Progesteron hemmt außerdem die Freisetzung von LH und damit die Ovulation dominanter Follikel während des Diöstrus bzw. während der Gravidität (HANSEL u. CONVEY 1983; GINTHER et al. 1989; VESANEN et al. 1991) Steroidhormon- und Oxytozinrezeptoren im Endometrium des Rindes Zyklusabhängige Steroidhormonwirkungen am Uterus werden durch Interaktionen mit ihren endometrialen Rezeptoren reguliert (CLARK et al. 1977; COULSON u. PAVLIK 1977; EVANS et al. 1994). Studien an verschiedenen Säugerspezies haben gezeigt, dass die zyklusabhängige Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren durch Progesteron gehemmt und durch Östrogen induziert werden kann (CLARK et al. 1977; COULSON u. PAVLIK 1977; EVANS et al. 1994). Bei der Kuh konnten mittels markierter Steroide maximale endometriale Östrogen- und Progesteronrezeptorkonzentrationen um den Östrus und minimale Konzentrationen im Diöstrus gefunden werden (ZELINSKI et al. 1982; MEYER et al. 1988; VESANEN et al. 1991). Vergleichbare Konzentrationsveränderungen im Zyklusverlauf des Rindes erfährt auch der endometriale Oxytozinrezeptor (JENNER et al. 1991; LAMMING u. MANN 18

27 Schrifttum 1995; IVELL et al. 2000). So konnten JENNER et al. (1991) und LAMMING und MANN (1995) während des Zyklus der Kuh die höchste Oxytozinrezeptorexpression im Östrus und die niedrigste Oxytozinrezeptorexpression im Diöstrus beobachten. Darüber hinaus erkannten JENNER et al. (1991) eine negative Korrelation zwischen der Oxytozinrezeptorexpression und der peripheren Plasmaprogesteronkonzentration. Die Hemmung der endometrialen Östrogen- und Oxytozinrezeptorexpression durch Progesteron in den ersten zehn bis zwölf Zyklustagen konnten MCCRACKEN et al. (1984) auch beim Schaf beobachten. Diese Autorengruppe nennt den hemmenden Effekt des Progesterons auf den Östrogen- und Oxytozinrezeptor Progesteron Block. In den folgenden Zyklustagen bewirkt Progesteron durch negative Autoregulation einen Rückgang des eigenen Rezeptors (MEYER et al. 1988; BOOS et al. 1989). MEYER et al. (1988) beobachteten an Zyklustag acht eine Progesteronrezeptorkonzentration von 9 pmol cpr/mg DNA. An Zyklustag 13 war der Progesteronrezeptor mit Werten von unter 0,5pmol cpr/mg DNA am geringsten expremiert, wodurch der inhibitorischen Effekt auf die mrna-expression von Östrogen- und Oxytozinrezeptoren aufgehoben wurde (MEYER et al. 1988). KIMMINGS und MACLAREN (2001), welche die Genexpression der Steroidhormonrezeptoren mittels quantitativer RT-PCR an ovariektomierten Rindern untersuchten, konnten die Ergebnisse von MEYER et al. (1988) bestätigen. In ihrer Studie bewirkte die exogene Verabreichung von Progesteron eine Hemmung der endometrialen Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Exogene Östrogengaben hatten dagegen eine steigernde Wirkung auf die Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren zur Folge. MEYER et al. (1988) nahmen an, dass die steigende Sensitivität des Uterus gegenüber den Steroidhormonen Östrogen und Progesteron in den ersten acht Tagen nach der Ovulation die Ursache für erste PGF 2α- Freigaben mit folgender Luteolyse sein könnte. Oxytozin schien Ihrer Meinung nach eine geringere Bedeutung bei der PGF 2α Freisetzung in diesem Zeitraum zu spielen. Dagegen sprechen Jenner et al. (1991) dem Oxytozinrezeptor eine Schlüsselrolle in der Luteolyse des Rindes zu. Sie ermittelten einen Anstieg der Oxytozinrezeptor- 19

28 Schrifttum konzentrationen um den Zeitraum der Luteolyse und des folgenden Östrus. Darüber hinaus beobachteten die Autoren eine Hemmung des Oxytozinrezeptors um den Zeitpunkt der erwarteten Luteolyse bei graviden Rindern. Ihrer Meinung nach wird die Expression des Oxytozinrezeptors teilweise durch Steroidhormone kontrolliert Auswirkungen einer verkürzten präovulatorischen Follikelphase auf die Plasmasteroidgehalte und ihre Rezeptoren im Endometrium TAPONEN et al. (1999) beobachteten bei Tieren nach einem verkürzten OvSynch- Programm, bei dem GnRH bereits 24 statt 48 Stunden nach der Prostaglandin- Injektion verabreicht wurde, zwei Tage nach der PGF 2α -Injektion geringere Plasmakonzentrationen an Estradiol-17ß als bei spontan ovulierenden Tieren (4,8 pmol/l vs. 35,2 pmol/l). Bezüglich der Progesteronkonzentration in der auf die Ovulation folgenden Lutealphase liegen widersprüchliche Ergebnisse vor. Während meist keine Auswirkungen einer vorzeitigen GnRH-Applikation bereits 24 Stunden nach einer Prostaglandininjektion auf die Progesteronkonzentration zu beobachten waren (THATCHER et al. 1993; TAPONEN et al. 1999; DOLEZEL et al. 2002), stellten TAPONEN et al. (1999) bei einigen der auf diese Weise behandelten Tiere ab dem fünften Tag post ovulationem geringere Progesteronkonzentrationen im Vergleich zu herkömmlich behandelten Kontrolltieren fest (4 vs. 5 nmol/l). Auch andere Autoren beobachteten geringere Progesteronkonzentrationen in der folgenden Lutealphase und eine vorzeitige Luteolyse bei Tieren, welche die zweite GnRH-Gabe zeitgleich mit der Prostaglandininjektion erhielten (PETERS u. PURSLEY 2003). Aber auch bei einigen Tieren, die dem klassischen Ov-Synch-Programm unterzogen worden waren, wurde eine vorzeitige Luteolyse festgestellt (THATCHER et al. 1993). DOLEZEL et al. (2002) wiesen jedoch darauf hin, dass die Progesteronspiegel einer sehr starken individuellen Variation unterliegen. MEIKLE et al. (2001) injizierten Kühen PGF 2α und teilten die Tiere in eine Gruppe mit einer verkürzten Zykluslänge von 16 Tagen und eine Gruppe mit einer normalen Zykluslänge von 21 Tage im darauf folgenden Zyklus ein. Ab Tag neun post ovulationem waren bei den Tieren der verkürzt zyklischen Gruppe die Progesteron- 20

29 Schrifttum konzentrationen niedriger im Vergleich zu Tieren mit einer physiologischen Zykluslänge von 21 Tagen (18 nmol/l vs. 21 nmol/l). Darüber hinaus bestimmten die Autoren am Tag des Brunstbeginns nach der Prostaglandingabe die höchsten Progesteronrezeptor- und Östrogenrezeptor-α-mRNA-Expressionen bei normal zyklischen Tieren. Ab Zyklustag fünf war dann ein stetiger Rückgang der Rezeptorexpressionen bis zu einem Minimum an Zyklustag 19 zu beobachten. Während die m-rna-expressionen verkürzt zyklischer Tiere an Tag fünf des Zyklus gegenüber normal zyklischen Tieren erhöht waren, zeigten sie an Tag zwölf niedrigere Werte und ermöglichten dadurch nach Ansicht der Autoren möglicherweise eine frühzeitige Luteolyse. Die Tiere mit einem vorangegangenen verkürzten Zyklus hatten bereits 19 Tage nach Brunstbeginn wieder ovuliert, befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits zwischen den Tagen null und fünf eines neuen Zyklus (Tag 0 = Ovulation) und zeigten hier die für dieses Zyklusstadium typischen Expressionsmuster der Steroidhormonrezeptoren. MEIKLE et al. (2001) stellten ebenfalls fest, dass bei verkürzt zyklischen Tieren vor der Luteolyse die mrna-expression des Progesteronrezeptors herunterreguliert ist. Nach Meinung der Autoren ist die mrna-expression der Steroidhormonrezeptoren bei Tieren mit einem verkürzten Zyklus an Tag zwölf post ovulationem mit der Situation normal zyklischer Tiere an Tag 19 post ovulationem vergleichbar. Falls dies auch auf die Proteinexpression des Rezeptors zutreffen würde, könnte dies nach Meinung der Autoren einen vorzeitigen Verlust der Progesteronhemmung auf die uterinen Steroidhormon- und Oxytozinrezeptoren bei verkürzt zyklischen Tieren bedeuten. Dadurch würden die Voraussetzungen für eine erfolgreiche Gravidität bei diesen Tieren fehlen. In einer vorangehenden Studie konnten bereits ZOLLERS et al. (1993) mit Hilfe markierter Steroide die Progesteron- und Oxytozinrezeptoren von Rindern mit physiologischen und verkürzten Zyklen am Tag fünf post ovulationem vergleichen. Dabei wurden als verkürzte Zyklen diejenigen von Mutterkühen, bei denen kurz vorher die Kälber abgesetzt worden waren und bei denen das Ovulationsintervall zwölf Tage betrug, herangezogen. Die Autoren beobachteten, dass bei verkürzt zyklischen Tieren die Progesteronrezeptorkonzentration im Endometrium am 21

30 Schrifttum Zyklustag fünf niedriger und die Oxytozinrezeptorkonzentration höher war als bei normal zyklischen Tieren. Die Autoren stellten aufgrund ihrer Ergebnisse die Hypothese auf, dass durch teilweisen Wegfall der Progesteronhemmung verstärkt Oxytozin produziert werden könnte und so die uterine PGF 2α -Freisetzung ermöglicht würde. Dies könnte ihrer Meinung nach letztendlich zu einer vorzeitigen Luteolyse führen. Als entscheidenden Grund für eine vorzeitige Luteolyse nennen weitere Autoren (SCHMITT et al. 1996; TAPONEN et al. 1999; PETERS und PURSLEY 2003) die Induktion der Ovulation eines unreifen Follikels. Aus diesem gehe ein insuffizienter Gelbkörper hervor, der ihrer Meinung nach die Ursache für eine Lutealphasenverkürzung darstellt. Auch DOLEZEL et al. (2002) wiesen auf die Bedeutung der Follikelreife zum Zeitpunkt der Ovulationsinduktion hin. Ihrer Meinung nach ist eine exogene GnRH-Gabe zur Ovulationsinduktion nur zu empfehlen, wenn der dominante Follikel eine maximale Zahl an Granulosazellen besitzt und diese wiederum eine hohe LH-Rezeptoren-Expression aufweisen. Darüber hinaus wiesen TAPONEN et al. (1999) darauf hin, dass vermehrte Oxytozin- und verminderte Progesteronrezeptorexpressionen im Endometrium eine vorzeitige uterine PGF 2α - Freisetzung begünstigen könnten. Damit würde eine vorzeitige Luteolyse des Corpus luteum eingeleitet und die Lutealphase könnte dadurch möglicherweise verkürzt werden. 2.3 Gefäßversorgung des inneren Genitale des Rindes Gefäßversorgung des Uterus Die A. uterina entspringt als erstes Gefäß aus der A. umbilicalis (Abbildung 2.2). Diese wiederum geht aus der A. iliaca interna hervor. Im Mesometrium zieht die A. uterina zum gleichseitigen Uterushorn und teilt sich dort in mehrere Äste auf. Am mesometralen Rand anastomosieren diese Äste bogenförmig untereinander sowie kranial mit dem Ramus uterinus der A. ovarica, der die Uterushornspitze versorgt und kaudal mit dem Ramus uterinus der A. vaginalis, der Cervix und Uteruskörper speist. Die A. uterina entlässt während ihres Verlaufs Zweige an beide Seiten des 22

31 Schrifttum Uterushorns sowie in das Mesometrium (WAIBL u. WILKENS 1996). Die A. uterina liegt bei nicht graviden Kühen als etwa strohhalmstarker Strang mit stark geschlängeltem Verlauf der seitlichen Bauchwand an (VOLLMERHAUS 1964). Die Konsistenz und der Verlauf der A. uterina ändern sich im Laufe des Lebens und mit zunehmender Zahl an Graviditäten. Je älter ein Tier ist und je öfter es trächtig war, umso geschlängelter verläuft das Gefäß und umso härter ist seine Konsistenz (VOLLMERHAUS 1964). Die V. uterina entspringt beim Rind als ein funktionell relativ unbedeutendes Gefäß aus der V. iliaca, in manchen Fällen fehlt sie sogar vollständig (VOLLMERHAUS 1964; WAIBL u. WILKENS 1996). Auch der R. uterinus der V. vaginalis und der R. uterinus der A. vaginalis accessoria sind eher schwach ausgebildet. Der größte Teil des venösen Blutes des Uterus wird durch den R. uterinus der V. ovarica abtransportiert (LAMOND u. DROST 1974; WAIBL u. WILKENS 1996). 23

32 Schrifttum V. cava caudalis Aorta A. illiaca ext. sin. Rectum Mesometrium A. ovarica sin. A. uterina dext. Ovar A. umbilicalis sin. Uterus Harnblase A. uterina sin. V. cava caudalis Aorta A. circumflexa ilium prof. Rectum A. iliaca ext. Ultraschallsonde A. ovarica sin. A. umbilicalis sin. A. uterina sin. A. Iliaca int. sin. Uterus A. uterina sin. Abbildung 2.2 : schematische Darstellung der Beckenorgane einer Kuh in situ unter besonderer Berücksichtigung der uterinen Gefäßversorgung (mit freundlicher Genehmigung von Dr. J. Maierl, Institut für Tieranatomie I der Universität München) 24

33 Schrifttum Gefäßversorgung des Ovars Im folgenden Kapitel wird lediglich das intraovarielle System der Gefäßversorgung des Ovars und nicht die A. ovarica beschrieben, da nur ersteres in der vorliegenden Studie untersucht wurde. Durch schlängelnde Aufzweigung des Ramus ovaricus der A. ovarica entsteht ein Gefäßnetz aus gewundenen Arterien, die alle einen abgegrenzten Ovarabschnitt der gefäß- und nervenführenden Markzone (Zona vasculosa) versorgen (KÖNIG et al. 1988). Die Markzone wird von der Rindenzone (Zona parenchymatosa) umgeben, in deren Stroma die Eizellen eingebettet sind. Die Primärfollikel werden allseitig von einem Rindenkapillarnetz umgeben, das sich parallel zur Follikelreifung entwickelt. Aus in der Nachbarschaft gelegenen Markarteriolen wachsen dabei Gefäße in der Rindenkapillarschicht auf die Follikel zu und verdichten das Gefäßsystem. Schließlich bilden sich mit zunehmender Follikelgröße in der Regel für jeden Follikel eine größere Arterie und eine größere Vene heraus. Bedingt durch den steigenden Innendruck des wachsenden Graaf`schen Follikels kommt es zu einer Verlagerung der Blutgefäße, so dass sich auf der erhabenen Oberfläche des Graaf`schen Follikels ein gefäßlose Stelle, das Stigma entwickelt (KÖNIG 1981). Das Gefäßsystem des Corpus luteum ist meist strikt von dem des übrigen Ovars getrennt (KÖNIG 1981). Ein Corpus luteum wird jeweils von einem (VOLLMERHAUS 1964; YAMADA 2005), manchmal auch von zwei (LAMOND u. DROST 1974) stärker ausgebildeten Endästen der A. ovarica versorgt, die mäanderförmig an den inneren Pol des Corpus luteum herantreten. Aus diesen Arterien entspringen geradlinige Kapselarterien, welche das Corpus luteum korbartig umgeben (Abbildung 2.3). Aus diesen gehen wiederum zentripetal verlaufende Septumarterien hervor, die jeweils ein Gelbkörperläppchen versorgen (KÖNIG et al. 1988). Aus den Septumarterien zweigen wiederum Parenchymarteriolen ab, die tief in das Läppchen eindringen und sich in ein dichtes Kapillarnetz auflösen, in dessen Maschen die Luteinzellen eingebettet sind (KÖNIG u. AMSELGRUBER 1986). 25

34 Schrifttum Parenchymarteriole Kapselvene Septumarterie Kapselarterie Hauptarterie Abbildung 2.3: schematische Darstellung der Durchblutung eines Corpus luteum etwa sieben Tage nach der Ovulation in der Achse halbiert, modifiziert nach KÖNIG (1981); Das arterielle Gefäßsystem ist auf der rechten Seite und das venöse Gefäßsystem auf der linken Seite der Abbildung dargestellt. Der venöse Abfluss erfolgt über Venolen im Läppchenzentrum, die sich zu Venen vereinigen und den Kapselvenen zustreben (KÖNIG u. AMSELGRUBER 1986). Das Corpus luteum ist während der frühen Anbildungsphase bis Tag fünf post ovulationem allseits von einem relativ weitmaschigem Kapillarnetz durchzogen, welches direkt unter der Gelbkörperoberfläche verläuft. Dieses verdichtet sich in der späten Anbildungsphase, d.h. zwischen den Tagen fünf bis neun, und besitzt an Tag neun post ovulationem seine größte Dichte (König et al. 1988). Der Anbildungsphase schließt sich das Blütestadium des Corpus luteum, das nach KÖNIG et al. (1988) von Tag zehn bis 15 währt, an. Der im Ovar verankerte Abschnitt des Corpus luteum gliedert sich in diesem Stadium durch Sprossung des Gefäßsystems in Läppchen, während die über die Ovaroberfläche erhabene 26

35 Schrifttum pilzförmige Kuppel des Gelbkörpers aus einem feinen Kapillarschwamm besteht (KÖNIG et al. 1988). Mit der Regression des Gelbkörpers ab Tag 16 post ovulationem beginnt zunächst die Rückbildung des Kapillarnetzes im Bereich der Kuppe. Danach kommt es zur Verengung größerer Gefäße, wodurch die Abnahme der Kapillardichte des gesamten Gelbkörpers ausgelöst wird (KÖNIG et al. 1988). 27

36 Schrifttum 2.4 Dopplersonographie Im Folgenden wird lediglich ein kurzer Überblick über die Grundlagen der Dopplersonographie gegeben. Für eine ausführliche Beschreibung der Grundlagen, der Gerätetechnologie sowie der Auswertungen wird an dieser Stelle auf die Dissertationen von BAUMGARTNER (1998) und MAYER (1999) verwiesen Dopplersonographische Grundlagen Werden piezoelektrische Kristalle in Schwingung versetzt, so senden diese Ultraschallwellen aus. Treffen diese auf Grenzflächen von Geweben unterschiedlicher Dichte, so werden sie zum Teil reflektiert (WAITE et al. 1990; DICKEY 1997; FLÜCKIGER 1997). Treffen diese Schallwellen auf sich bewegende Strukturen, wie beispielsweise auf fließende Blutkörperchen, so erfahren sie bei der Reflektion eine Frequenzverschiebung. Diese Frequenzverschiebung, nach ihrem Entdecker Christian Doppler auch als Dopplershift bezeichnet, wird von den Geräten gemessen. Sie ergibt sich aus folgender Formel (WAITE et al. 1990; DUDWIESUS et al. 1993; MARSAL 1993): f d = f 0 f e = 2 f 0 v cosα c f d = Frequenzverschiebung = Dopplershift [Hz] f 0 = Sendefrequenz des Schallkopfes [Hz] f e = Empfangsfrequenz [Hz] v = Blutflussgeschwindigkeit [m/sec] α = Winkel zwischen Ultraschallstrahl und Richtung des Blutflusses c = Ausbreitungsgeschwindigkeit des Ultraschalls im Weichteilgewebe (ca m/sec) Gerätetechnologie In der Farbdopplersonographie wird die Frequenzverschiebung in einem Fenster farbkodiert über das im B-Modus erstellte Bild projeziert. In der Regel werden im so 28

37 Schrifttum genannten Color-Flow-Modus Strömungen zur Sonde hin rot und solche von der Sonde weg blau dargestellt. Die Farbhelligkeit ist ein Maß für die Höhe der Frequenzverschiebung, d.h. je heller die Farben erscheinen, desto höher ist die Frequenzverschiebung (DEANE 1995). Im Color-Angio-Modus wird nicht die Frequenzverschiebung, sondern die Intensität des Blutflusses, d.h. die Anzahl der pro Zeiteinheit durch das Gefäß strömenden Blutkörperchen dargestellt. Hierbei wird der Blutfluss unabhängig von dessen Richtung in der Regel in den Farbabstufungen von rot bis gelb wiedergegeben (DUDWIESUS et al. 1993; DEANE 1995), wobei die Farbe gelb eine relativ intensive und die Farbe rot eine schwächere Blutflussintensität anzeigt. Zusätzlich kann die Frequenzverschiebung in Abhängigkeit von der Zeit in einem Koordinatensystem visualisiert werden. Dabei stellt die Abszisse die Zeit und die Ordinate die Höhe der Frequenzverschiebung dar. Der zur Sonde fließende Blutstrom wird oberhalb und der von der Sonde wegströmende Blutfluss unterhalb der Nulllinie angezeigt. So entstehen für die arteriellen Gefäße jeweils charakteristische Dopplerwellen, welche sich aus den unterschiedlichen Blutflussgeschwindigkeiten während der Systole und Diastole ergeben (DUDWIESUS et al. 1993). Heutzutage werden vorwiegend pulsed-wave-dopplergeräte (PW-Doppler) eingesetzt. Im Gegensatz zu continuous-wave-geräten (CW-Doppler), bei denen die Frequenzverschiebungen aller Ebenen innerhalb des Ultraschallstrahls erfasst werden, besitzen sie den Vorteil einer tiefenselektiven Blutflussmessung. Dies bedeutet, dass die Messtiefe vom Untersucher durch Wählen eines Dopplerfensters exakt bestimmt werden kann (DUDWIESUS et al. 1993; DICKEY 1997) Auswertung dopplersonographischer Untersuchungen Die Auswertung der im Color-Angio- und im Color-Flow-Modus aufgenommenen Farbdopplerbilder erfolgt mit Hilfe eines computergestützten Bildanalyseverfahrens (DELORME u. ZUNA 1995; BAUMGARTNER 1998; ACOSTA et al. 2004). Zunächst werden digitalisierte Bilder von Querschnitten des zu untersuchenden Gewebes erstellt. Anschließend werden diese Bilder in einen PC eingelesen. Um ausschließlich Gefäße innerhalb des zu untersuchenden Gewebes zu erfassen, wird die so 29

38 Schrifttum genannte Region Of Interest (ROI) eingezeichnet, innerhalb welcher die Gesamtfläche der durchbluteten Areale bzw. die Gesamtanzahl der Farbpixel als Maß für die Durchblutung mit Hilfe der Software berechnet wird (DELORME u. ZUNA 1995; BAUMGARTNER 1998; ACOSTA et al. 2004). Die Analyse der Dopplerwellen kann qualitativ, semiquantitativ und quantitativ erfolgen (DICKEY 1997): Bei der qualitativen Analyse werden die Dopplerwellen deskriptiv beurteilt. Insbesondere wird auf das Vorkommen und die Richtung des diastolischen Blutflusses, das Auftreten eines frühdiastolischen Einschnitts, den so genannten notch, und auf die Kontinuität des Blutflusses während der gesamten Herzaktion geachtet (GOSWAMY u. STEPTOE 1988; TEKAY et al. 1996). Die quantitative Auswertung des Blutflusses erfolgt unter anderem über die Berechnung der Blutflussgeschwindigkeit. Dafür ist es jedoch erforderlich, den Winkel zwischen Dopplerstrahl- und Blutflussrichtung zu ermitteln. Die maximale systolische (PSV = peak systolic velocity), minimale diastolische (MDV = minimum diastolic velocity) und mittlere maximale Blutflussgeschwindigkeit über den Herzzyklus (TAMV = time averaged maximum velocity) werden nach Umstellung der so genannten Dopplergleichung durch Einsetzen der entsprechenden Frequenzverschiebungen S, M und TAMF in die Gleichung berechnet: v = f d c 2 f 0 cosα v = Blutflussgeschwindigkeit (PSV, MDV oder TAMV) [m/sec] f d = Frequenzverschiebung (S, D m oder TAMF) [Hz] c = Ausbreitungsgeschwindigkeit des Ultraschalls im Weichteilgewebe (ca m/sec) f 0 = Sendefrequenz des Schallkopfes [Hz] α = Winkel zwischen Ultraschallstrahl und Richtung des Blutflusses 30

39 Schrifttum Da die genaue Bestimmung des Winkels α Schwierigkeiten bereiten kann, wird häufig mit Hilfe von winkelunabhängigen Dopplerindices eine semiquantitative Beurteilung des Blutflusses vorgenommen (DEANE 1995). Die Dopplerindices stellen Maße für die Widerstandsverhältnisse in dem distal der untersuchten Arterie gelegenen Gefäßbett dar. Je höher die Index-Werte sind, desto größer ist der Blutflusswiderstand in dem vom jeweiligen Gefäß versorgten Organ und umgekehrt (DICKEY 1997). Die gebräuchlichsten Indizes sind in der Dopplersonographie der Resistance Index (RI) (POURCELOT 1974) und der Pulsatily Index (PI) (DICKEY 1997). In die Berechnungen gehen die maximale systolische (S), die minimale diastolische (D m ), die enddiastolische (D e ) und die mittlere maximale (TAMF) Frequenzverschiebung ein (Abb. 2.4): Frequenzverschiebung [Hz] S D m D e TAMF Zeit Herzzyklus Abb. 2.4: Schematische Darstellung einer Dopplerwelle mit der maximalen systolischen (S), minimalen diastolischen (D m ), enddiastolischen (D e ) und mittleren maximalen (TAMF) Frequenzverschiebung während eines Herzzyklus. Resistance Index: RI = S - D e S Pulsatility Index: PI = S - D m TAMF 31

40 Schrifttum 2.5 Ovarieller Blutfluss des Rindes A. ovarica Frühe Arbeiten zur Messung der ovariellen Blutversorgung wurden mittels implantierter Dopplersonden durchgeführt. So stellten bereits NISWENDER et al. (1976) an Schafen fest, dass das ovarielle Blutflussvolumen zyklusabhängigen Schwankungen unterliegt. Ihre Erkenntnisse konnten von CHAN (1997) durch transrektale farbdopplersonographische Untersuchungen an Kühen bestätigt werden. Er bestimmte den ovariellen Blutfluss anhand des Resistance Index (RI) der A.ovarica. So ist nach NISWENDER et al. (1976) und CHAN (1997) die ovarielle Durchblutung an einem Ovar ohne Corpus luteum während des gesamten Zyklus relativ niedrig. Erst mit Heranreifung eines Corpus luteum steigt die ovarielle Durchblutung nach WISE et al. (2000) und CHAN (1997) an, erreicht ihren Höhepunkt zum Zeitpunkt der Gelbkörperblütephase und nimmt mit der lutealen Regression wieder ab Follikuläre Durchblutung Nach ACOSTA et al. (2005) erlaubt die Bestimmung der ovariellen Blutversorgung mittels farbdopplersonographischer Darstellung der A. ovarica zwar die Darstellung der Blutflussversorgung des gesamten Ovars, eine Beurteilung der Änderungen der Perfusionsverhältnisse während der Entwicklung des Follikels sei jedoch nur durch die Bestimmung der individuellen Follikelwanddurchblutung möglich. ACOSTA et al. (2005) verfolgten mittels transrektaler Farbdopplersonographie beim Rind im Anschluss an die Ovulationsinduktion des präovulatorischen Follikels mit einer GnRH-Gabe 48 Stunden nach einer PGF 2α -Injektion die Größenentwicklung und die Durchblutungsveränderungen von Follikeln einer neuen Follikelwelle bis Tag sieben nach GnRH-Injektion. Dabei stellten sie fest, dass die Durchmesser der zwei größten Follikel drei bis vier Tage nach der GnRH-Gabe auseinander wichen. Dieser Zeitpunkt wurde als Beginn der Selektion definiert und erst von da an war auch ein höherer follikulärer Blutfluss in den größeren Follikeln festzustellen. Nach ACOSTA et al. (2005) zeigten ihre Studien erstmals in Echtzeit die Durchblutungsverän- 32

41 Schrifttum derungen nach der Selektion des dominanten Follikels bei der Kuh. Die Änderungen in der follikulären Perfusion seien ein Hinweis darauf, dass die Angiogenese eine Schlüsselrolle hinsichtlich der Dominanz oder Atresie eines Follikels zum Zeitpunkt der Follikelselektion einnimmt (ACOSTA et al. 2005). In einer vorangehenden Studie verglichen ACOSTA et al. (2003) die durchblutete Fläche der Follikelwand und die mittlere Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) in der Follikelwand bei spontanen und bei mittels GnRH-induzierten Ovulationen. In beiden Gruppen folgte die Ovulation 26 bis 34 Stunden nach dem LH-Peak. Während die durchblutete Follikelwandfläche bei der spontan ovulierenden Gruppe parallel mit steigender Plasmaöstradiolkonzentration anstieg, nahm sie bei der Gruppe mit induzierter Ovulation erst 30 Minuten nach GnRH-Injektion, parallel mit einem steigenden LH-Peak, zu. Auch hinsichtlich der follikulären Blutflussgeschwindigkeit machten die Autoren ähnliche Beobachtungen. Die höchsten Blutflussgeschwindigkeiten in der Follikelwand konnten in beiden Gruppen während der Phase hoher Plasma-LH-Konzentrationen bestimmt werden. Die Blutflussgeschwindigkeit in der Follikelwand stieg jedoch bei Tieren mit induzierter Ovulation synchron mit der durchbluteten Follikelwandfläche an, während die Blutflussgeschwindigkeit in der Follikelwand bei spontan ovulierenden Tieren bereits zu steigen begann als die Plasma-LH-Konzentration noch niedrig war. ACOSTA et al. (2003) kamen anhand ihrer Ergebnisse zu der Feststellung, dass ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Follikelwanddurchblutung und der Plasmaöstradiolkonzentration sowie der Plasma-LH-Konzentration während der präovulatorischen Phase der Kuh besteht. Darüber hinaus beobachteten ACOSTA et al. (2003), dass in anovulatorischen Follikeln weniger Follikelwanddurchblutung messbar war als in Follikeln, die später ovulierten. In Ihrer Studie kamen nur gut durchblutete Follikel zur Ovulation und es entstand nur aus diesen ein Corpus luteum. Im Gegensatz dazu konnten KAWASHIMA et al (2006) keine Unterschiede in der darstellbaren follikulären Wanddurchblutung ovulatorischer und anovulatorischer Follikel während des ersten Zyklus nach der Geburt feststellen. Ihrer Meinung nach ist eher die mangelnde Östradiolsynthese der follikulären Granulosazellen der bestimmende Faktor für das Ausbleiben der Ovulation und nicht eine insuffiziente 33

42 Schrifttum Angiogenese. Die Autoren beurteilten in ihren Studien jedoch nur qualitativ das Vorhandensein von follikulärer Wanddurchblutung. Eine quantitative Differenzierung durch Messung der mittleren Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) bzw. eine Erfassung der durchbluteten Fläche wurde nicht durchgeführt Luteale Durchblutung Ähnlich wie die Follikelwanddurchblutung kann die Perfusion des Corpus luteum mit Hilfe der Farbdopplersonographie dargestellt werden (MIYAMOTO et al. 2006). BAUMGARTNER (1998) untersuchte die Änderungen in der lutealen Durchblutung des Rindes während des Zyklus. Bis Tag sieben post ovulationem stieg die Durchblutung des Corpus luteum kontinuierlich an, blieb während der gesamten Blütephase auf einem hohen Niveau, fiel dann fünf Tage vor der nächsten Ovulation ab und erreichte drei Tage vor der nächsten Ovulation Basalwerte. Auch ACOSTA et al. (2003) beobachteten, dass die luteale Durchblutung, beurteilt anhand der durchbluteten Fläche und der mittleren Blutflussgeschwindigkeit (TAMV), parallel zum Gelbkörperdurchmesser und zur Plasmaprogesteronkonzentration von Tag zwei bis Tag fünf post ovulationem anstieg. SHIRASUNA et al. (2004) und MIYAMOTO et al. (2005) untersuchten die Veränderungen der lutealen Durchblutung während der spontan eintretenden Luteolyse. Sie beobachteten dabei einen Anstieg der lutealen Durchblutung zwischen den Zyklustagen 17 und 18 Tage, zeitgleich mit dem drastischen Anstieg an Plasmaprostaglandin-F-metaboliten (PGFM). Auf diesen Anstieg folgte erst einen Tag später der Abfall der Plasmaprogesteronkonzentration. Nach MIYAMOTO et al. (2005) weisen diese Ergebnisse auf eine stimulierende Wirkung von freigesetztem PGF 2α uterinen Ursprungs auf den lutealen Blutfluss hin. Dies sei der erste direkte Beweis dafür, dass im Verlauf der Luteolyse der luteale Blutfluss akut ansteigt, bevor die Plasmaprogesteronkonzentration abfällt (MIYAMOTO et al. 2005). Die lutealen Durchblutungsveränderungen nach mittels PGF 2α induzierter Luteolyse bestimmten ACOSTA et al. (2002) in einer vorangegangenen Studie an Kühen, welche sich an den Tagen vier bzw. zehn bis zwölf des Zyklus befanden. Tiere am Tag zehn bis zwölf des Zyklus zeigten 30 Minuten bis zwei Stunden nach einer 34

43 Schrifttum PGF 2α -Injektion einen Anstieg der lutealen Durchblutung, gefolgt von einem drastischen Abfall derselben. Die Prostaglandin-Injektion am Tag vier des Zyklus bewirkte dagegen keine Änderungen in der lutealen Durchblutung. Die Luteolyse blieb bei diesen Tieren aus, d.h. die Plasmaprogesteronkonzentration und der Gelbkörperdurchmesser stiegen im Laufe der Untersuchungen weiter an. ACOSTA et al. (2002) folgerten daraus, dass ein direkter Zusammenhang zwischen akutem Anstieg der lutealen Durchblutung und der Luteolyse besteht Zusammenhang zwischen ovariellen Blutfluss und endogenen Steroidhormonkonzentrationen BAUMGARTNER (1998) konnte in seinen Untersuchungen zur Gelbkörperdurchblutung eine hohe Korrelation (r = 0,87) zwischen den zyklischen Änderungen der Plasmaprogesteronkonzentration und denen der lutealen Durchblutung feststellen. Sowohl Baumgartner (1998), als auch ACOSTA et al. (2003) beobachteten in der frühen Lutealphase von Zyklustag eins bis sieben einen parallelen Anstieg der lutealen Durchblutung und der Plasmaprogesteronkonzentration bis Tag sieben des Zyklus. Die Werte beider Parameter blieben bis Tag 16 des Zyklus auf hohem Niveau und fielen dann wieder in den letzten fünf Zyklustagen vor der nächsten Ovulation ab (BAUMGARTNER, 1998). Während der Luteolyse konnten verschiedene Autoren (BAUMGARTNER 1998; ACOSTA et al. 2002; SHIRASUNA et al. 2004; KAWASHIMA et al. 2007) jedoch eine zeitliche Differenz zwischen dem Verlauf der Plasmaprogesteronkonzentration und der lutealen Durchblutung ermitteln. So war die durchblutete Gelbkörperfläche bzw. TAMV der lutealen Gefäße zunächst innerhalb einer Stunde sowohl nach spontaner (SHIRASUNA et al. 2004; KAWASHIMA et al. 2007) als auch nach induzierter mittels PGF2α-Injektion Luteolyse (BAUMGARTNER 1998; ACOSTA et al. 2002) angestiegen. Die Plasmaprogesteronkonzentration sank bis sechs Stunden nach Beginn der Luteolyse signifikant ab und fiel dann in den folgenden sechs bis acht Stunden stetig gemeinsam mit dem lutealen Blutflusses weiter ab (BAUMGARTNER 1998; ACOSTA et al. 2002; SHIRASUNA et al. 2004; KAWASHIMA et al. 2007). 35

44 Schrifttum Zusammenhang zwischen dem ovariellen Blutfluss, der Oozytenqualität und dem Schwangerschaftserfolg bei der Frau Bisher gibt es keine Studien über Zusammenhänge zwischen dem ovariellen Blutfluss, der Oozytenqualität und dem Schwangerschaftserfolg weder beim Rind noch bei anderen Tierarten. Entsprechende Studien wurden bisher nur bei der Frau durchgeführt. Diverse Autoren (NAVOT et al. 1991; WEINER et al. 1993; ZAIDI et al. 1996; OYESANA et al. 1996; NARGUND et al. 1996a; NARGUND et al. 1996b; COULAM et al. 1999; SHRETSA et al. 2006) untersuchten ovarielle Perfusionsparameter vor einer hormonellen Stimulation. WEINER et al. (1993) und ZAIDI et al. (1996) stellten in ihren Untersuchungen fest, dass in der frühen Follikelphase, vor einer hormonellen Stimulation, die intraovarielle Durchblutung positiv mit der Ovarreaktion nach der Hormongabe, beurteilt anhand der Zahl angebildeter Follikel, korreliert, wobei sich die Studien in den untersuchten Blutflussparametern voneinander unterschieden. ZAIDI et al. (1996) beobachteten ausschließlich positive Zusammenhänge (r = 0,50, p = 0,001) zwischen der intraovariellen maximalen systolischen Blutflussgeschwindigkeit (Peak Systolic Velocity, PSV) und der Zahl angebildeter Follikel. Der an intraovariell gelegenen Gefäßen bestimmte PI korrelierte in ihrer Studie nicht mit der Ovarreaktion. Im Gegensatz dazu konnten WEINER et al. (1993) negative Zusammenhänge (r = -0,67) zwischen dem an diesen Gefäßen ermittelten PI und der Ovarreaktion nachweisen. Ferner beobachteten einige Autoren (OYESANA et al. 1996; NARGUND et al. 1996a; NARGUND et al. 1996b) Korrelationen zwischen ovariellen Perfusionsparametern und der Quantität und der Qualität gewonnener Oozyten. OYESANA et al. (1996) stellten positive Korrelationen (r = 0,47, p = 0,0001) zwischen dem Vaskularisationsindex vor der Stimulation mittels hcg (humanes Choriongonadotropin) und der Anzahl der danach gewonnenen Oozyten fest. Der follikuläre Vaskularisationsindex ergibt sich dabei nach OYESANA et al. (1996) aus dem Verhältnis zwischen den Zahlen an Follikeln mit darstellbarer Durchblutung und allen Follikeln. Auch NARGUND et al. (1996b) konnten positive Zusammenhänge (r = 0,75, p = 0,0001) zwischen der Durchblutung der Follikel vor der hormonellen 36

45 Schrifttum Stimulation und der Zahl gewonnener Eizellen finden. Nach Meinung dieser Autoren (NARGUND et al. 1996b) könnte die Quantifizierung der follikulären Blutversorgung daher zur Vorhersage der Oozyten-Gewinnungsrate herangezogen werden. Aber nicht nur die Anzahl an gewonnenen Oozyten, auch die Qualität ist nach NAVOT et al. (1991) für eine erfolgreiche Schwangerschaft entscheidend. In Studien von NARGUND et al. (1996a; 1996b) stammten Oozyten, denen eine erfolgreiche Implantation folgte, zu 78% aus Follikeln mit messbarem, follikulärem Blutfluss (peak systolic velocity, PSV). COULAM et al. (1999) bestimmten quantitativ den follikulären Blutfluss (PSV) vor der hormonellen Stimulation mittels hcg-applikation und beurteilten ausserdem qualitativ den Anteil an perifollikulär durchbluteter Fläche, wobei bei einem Score von I weniger als 25% des umgebenden Follikelgewebes, bei einem Score von II 26% bis 50% des Gewebes, bei einem Score von III 51% bis 75% des Gewebes und bei einem Score von IV 100% des umgebenden Follikelgewebes durchblutet waren. Patientinnen, die eine erfolgreiche Schwanger-schaft austrugen, besaßen ausschließlich einen qualitativen follikulären Blutfluss mit Scores von III und IV. Darüber hinaus besaßen 91% der Patientinnen, die nach der Behandlung schwanger wurden, PSV-Werte über 10 cm/s auf. Auch SHRESTA et al. (2006) untersuchten während 37 IVF-Zyklen den perifollikulären Blutfluss in der frühen Follikelphase vor hormoneller Stimulation. Die Autoren teilten Patientinnen retrospektiv in eine Gruppe A mit geringer follikulärer Durchblutung in allen Follikeln und in eine Gruppe B mit hoher follikulärer Durchblutung zumindest in einem kleinen oder mittelgroßen Follikel ein. Übereinstimmend mit den Ergebnissen von COULAM et al. (1999) wiesen auch bei SHRESTA et al. (2006) Patientinnen aus Gruppe B sowohl einen höheren Anteil an gut durchbluteten, großen Follikeln in der späten Follikelphase (35% vs. 21%), als auch eine höhere Schwangerschaftsrate (47% vs. 12%) auf, als Frauen der Gruppe A. In weiteren Studien (STERZIK et al. 1989; TEKAY et al. 1995; NARGUND et al. 1996a; CHUEY et al. 1997; HUEY et al. 1999; BORINI et al. 2001; PALOMBA et al. 2006; KAWASHIMA et al. 2007) wurde der follikuläre Blutfluss nach hormoneller 37

46 Schrifttum Stimulation der Follikelentwicklung und unmittelbar vor einer Follikelaspiration untersucht. Nach BATTAGLIA et al. (2000) ist eine gesteigerte ovarielle Perfusion entscheidend für die Selektion und Reifung von Follikeln, bei normalen wie auch bei stimulierten Zyklen. Im Rahmen ihrer Studien teilten die Autoren Frauen auf Basis der Follikelzahlen ( bzw. > 3 Follikel) und der Östrogenkonzentrationen ( bzw. > pmol/l), die sie 8 Tage nach Beginn der Hormontherapie feststellten, in schwache und normale Reagenten ein. Sie beobachteten, dass die schwachen Reagenten nach der hormonellen Stimulation einen höheren Blutflusswiderstand in den perifollikulären Gefäßen aufwiesen als die normalen Reagenten. Auch nach WEINER et al. (1993) und ZAIDA et al. (1996) ist der Anstieg in der Blutversorgung des Ovars eine Voraussetzung für die Anbildung von Follikeln nach hormoneller Stimulation. In den Untersuchungen von NARGUND et al. (1996a) stammten Oozyten, aus denen ein guter oder sehr guter Embryo hervorging, aus Follikeln mit hoher Blutflussgeschwindigkeit in der Follikelwand. Betrug die Blutflussgeschwindigkeit in der Follikelwand vor der Follikelaspiration mindestens 10 cm/s, so lag der Prozentsatz guter Embryonen bei 70%, im Gegensatz zu 14% bei einem Blutfluss von unter 10 cm/s. Der follikuläre PI korrelierte in ihren Untersuchungen nicht mit der Oozytenqualität. Dagegen sahen HUEY et al. (1999) im perifollikulären Blutflusswiderstand des präovulatorischen Follikels einen indirekten Marker für die Kompetenz der Oozyte sich zu entwickeln. Sie beobachteten eine negative Korrelation (r = -0,32) des RI mit der Fertilisationsrate der Oozyten sowie eine negative Korrelation des PI (r = - 0,33) und des RI (r = -0,37) mit dem Entwicklungsstand drei Tage alter Embryonen. Jedoch zweifeln HUEY et al. (1999) aufgrund der moderaten Zusammenhänge an der klinischen Anwendbarkeit des follikulären Blutflusswiderstandes zur Prognose einer erfolgreichen Schwangerschaft. PALOMBA et al. (2006) überprüften die Blutflussgeschwindigkeit und den Blutflusswiderstand in der Peripherie der Follikel hinsichtlich ihrer Eignung zur Beurteilung der Anzahl zu gewinnender Oozyten im Vergleich zur morphologischen Beurteilung der gewonnenen Oozyten. Dabei beurteilten sie unter anderem die Wahrscheinlichkeit einer hohen Oozytenanzahl, einer guten Oozytenqualität und 38

47 Schrifttum einer erfolgreichen Schwangerschaft sowohl anhand der morphologischen Beurteilung gewonnener Eizellen unter dem Lichtmikroskop, als auch anhand der perifollikulären Perfusion. In Bezug auf die Vorhersagbarkeit einer erfolgreichen Schwangerschaft konnten sie keine Unterschiede zwischen den beiden Methoden beobachten und sehen damit keinen klinischen Nutzen in der Bestimmung der perifollikulären Vaskularität (PALOMBA et al. 2006). Hinsichtlich der Etablierung einer Schwangerschaft konnten von verschiedenen Autoren (NARGUND et al. 1996a; HUEY et al. 1999; BORINI et al. 2001; KAN et al. 2006) Zusammenhänge mit der follikulären Durchblutung nach hormoneller Behandlung unmittelbar vor der Follikelaspiration beobachtet werden. BORINI et al. (2001) erstellten ein Score-System zur qualitativen Beurteilung der perifollikulären Durchblutung und stellten eine signifikant höhere Schwangerschaftsrate bei Patientinnen mit gut (Grad III bis IV) durchbluteten Follikeln als bei Patientinnen mit schlecht (Grad I bis II) durchbluteten Follikeln fest (34% vs. 13,7%). Andere Autoren (STERZIK et al. 1989; TEKAY et al. 1995; CHUI et al. 1997; PALOMBA et al. 2006) fanden dagegen keine Zusammenhänge zwischen der ovariellen Durchblutung nach hormoneller Behandlung und dem Schwangerschaftserfolg. STERZIK et al. (1998) konnten keine Unterschiede des RI intraovarieller Gefäße zwischen Patientinnen feststellen, die nachher schwanger wurden und Patientinnen, die anschließend nicht schwanger wurden. Auch TEKAY et al. (1995) und CHUI et al. (1997) sahen im Rahmen eines IVF-Programms keine Unterschiede im intraovariellen PI zwischen schwanger gewordenen und nicht schwanger gewordenen Patientinnen. Jedoch beobachteten CHUI et al. (1997) bei Patientinnen mit einer größeren durchbluteten Follikelfläche tendenziell höhere Fertilisationsraten (57,1% vs. 61,9% vs. 72,3% vs. 78,6%). CHUI et al. (1997) hatten dabei die Patientinnen nach dem prozentualen Anteil der durchbluteten Follikelumgebung subjektiv in vier Grade eingeteilt, wobei die beste Durchblutung mit einer durchbluteten Follikelumgebung von 76% bis 100% als Grad vier benannt wurde. 39

48 Schrifttum 2.6 Uteriner Blutfluss Änderungen im Zyklus des Rindes Ähnlich dem ovariellen unterliegt auch der uterine Blutfluss beim Rind zyklusabhängigen Schwankungen (FORD et al. 1979; FORD u. CHENAULT 1981; WAITE et al. 1990; CHAN 1997; DECKER et al. 2002). WAITE et al. (1990) bestimmten mit Hilfe implantierter pulsed-wave Dopplerultraschallsonden sowohl die uterine Blutflussgeschwindigkeit (TAMV) als auch den uterinen Pulsatily Index (PI). Sie fanden heraus, dass die Durchblutung der Gebärmutter beim Rind um den Zeitpunkt des Östrus am höchsten und in der Lutealphase am geringsten ist und bestätigten damit Ergebnisse von FORD et al. (1979; 1981), die den uterinen Blutfluss mit Hilfe implantierter elektromagnetischer Blutflusssonden bestimmt hatten. WAITE et al. (1990) aufgrund ihrer Ergebnisse den Zyklus weiter in eine Phase mit einem hohen Blutfluss von Tag minus vier bis plus vier (Tag 0 = Tag der Brunst), eine Übergangsphase von Tag vier bis sieben und eine Phase mit einem niedrigem Blutfluss von Tag sieben bis 14 ein. Eine hohe uterine Blutfluss-geschwindigkeit bestimmten WAITE et al. (1990) ausschließlich in der Phase mit hohen Blutflussgeschwindigkeiten. Während der Übergangsphase und der niedrigen Blutflussphase war die uterine Blutflussgeschwindigkeit dagegen konstant niedrig. Der uterine PI war einem starken Wechsel von Tag minus vier bis plus vier unterlegen, wobei Minimalwerte am Tag der Brunst zu beobachten waren. Darüber hinaus korrelierte der PI in der hohen Blutflussphase negativ mit der uterinen Blutflussgeschwindigkeit (r = -0,92, p < 0,01). In der Übergangsphase von Tag vier bis sieben sank der PI geringgradig ab (WAITE et al. 1990) und stieg dann in der folgenden niedrigen Blutflussphase von Tag sieben bis 14 konstant an. Die Autoren nehmen an, dass der Widerstand der Gefäße trotz einer konstant niedrigen Blutflussgeschwindigkeit bereits in der Übergangsphase abnimmt und es dadurch zu einer Abnahme des PI kommt. Während der folgenden niedrigen Blutflussphase von Tag sieben bis 14 steigt dann nach Meinung der Autoren aufgrund eines konstanten Gefäßwiderstandes und eines sukzessiven Abfalls der Blutflussgeschwindigkeit der PI an. 40

49 Schrifttum CHAN (1997) und BOLLWEIN et al. (2000) bestimmten den uterinen Blutfluss des Rindes mit Hilfe der nicht invasiven, transrektalen Dopplersonographie. Sie konnten in Ihren Studien die Ergebnisse von FORD et al. (1979; 1981) und WAITE et al. (1990) überwiegend bestätigen. Während CHAN (1997) nur den uterinen RI bestimmte, verfolgten BOLLWEIN et al. (2000) zusätzlich den Verlauf der mittleren maximalen uterinen Blutflussgeschwindigkeit (Time averaged maximum velocity, TAMV). Die höchste RI- und die niedrigsten TAMV-Ergebnisse erhielten sie am Tag der Ovulation sowie einen Tag später. Die geringsten RI- und höchsten TAMV- Ergebnisse erhielten sie drei bis einen Tag vor der Ovulation. Wie bereits WAITE et al. (1990) konnten auch BOLLWEIN et al. (2000) während der Lutealphase einen konstant niedrigen Blutfluss ermitteln. Darüber hinaus stellten BOLLWEIN et al. (2000), vergleichbar mit den Ergebnissen von WAITE et al. (1990) in der hohen Blutflussphase, eine stark negative Korrelation (r = -0,92, p = 0,0001) zwischen dem uterinen RI und TAMV fest. Im Gegensatz zu den Beobachtungen von WAITE et al. (1990) blieb jedoch in den Untersuchungen von BOLLWEIN et al. (2000) der Blutflusswiderstand über die gesamte Lutealphase konstant, weshalb letztgenannte Autoren keine weitere Unterteilung der Lutealphase vornahmen Zusammenhang zwischen uterinem Blutfluss und endogenen Steroidhormonkonzentrationen des Rindes FORD und CHENAULT (1981) sowie BOLLWEIN et al. (2000) beobachteten positive Korrelationen zwischen der 17ß-Östradiolkonzentration im Plasma und der uterinen Durchblutung. In der Studie von FORD und CHENAULT (1981) stieg das uterine Blutflussvolumen parallel mit dem Plasmaöstradiolgehalt drei Tage vor dem Östrus an und erreichte seinen Maximalwert einen Tag vor dem Östrus. Sowohl FORD und CHENAULT (1981) als auch BOLLWEIN et al. (2000) beobachteten eine maximale uterine Durchblutung im Östrus, also während hoher Östradiolkonzentrationen. Jedoch wurde die maximale uterine Durchblutung, d.h. höchste TAMV- und geringste RI-Werte, drei bis einen Tag vor der Ovulation festgestellt, während die höchsten Östrogenkonzentrationen zwei Tage vor der Ovulation festzustellen waren. Am Tag 41

50 Schrifttum der Ovulation war sowohl die uterine Durchblutung, als auch die Östradiolkonzentration wieder deutlich abgesunken Zusammenhang zwischen uteriner Durchblutung und dem Schwangerschaftserfolg bei der Frau Da bisher keine Studien über Zusammenhänge zwischen uterinem Blutfluss und der Trächtigkeitsrate in der Veterinärmedizin existieren, wird im Folgenden auf entsprechende Studien bei der Frau eingegangen. Neben der ausreichenden Qualität einer Oozyte ist für eine erfolgreiche Implantation auch der uterine Status, insbesondere die uterine Blutversorgung von Bedeutung (GOSWAMY et al. 1988; KUPESIC und KURJAK 1993; CACCIATORE und TIITINEN 1996). So wurde in dopplersonographischen Studien festgestellt, dass Zusammenhänge zwischen der Durchblutung der A. uterina und der Implantationsbereitschaft des Endometriums bestehen (GOSWAMY et al. 1988; KURJAK et al. 1991; FUJINO et al. 1993; STEER et al. 1994). CACCIATORE und TIITINEN (1996) sehen in einem Abfall des uterinen PI infolge einer Hormontherapie einen wichtigen Faktor für die Fertilität im Rahmen eines IVF- Programms und einen therapeutischen Ansatz zur Verbesserung der Konzeptionschancen. So bestanden in ihren Studien positive Korrelationen zwischen der Abnahme des uterinen PI vor der Ovulation und der Zahl angebildeter Follikel (r = 0,29) sowie der Zahl gewonnener Oozyten (r = 0,28). Darüber hinaus war in ihrer Studie bei Frauen, die am Tage des Embryotransfers einen PI-Werte unter 3,0 aufwiesen, eine höhere Schwangerschaftsrate zu verzeichnen, als bei Frauen, die einen uterinen PI größer oder gleich 3,0 (35% vs. 8%) besaßen. GOSWAMY et al. (1988) brachten erstmals Fruchtbarkeitsstörungen der Frau mit einer verminderten Durchblutung der A. uterina in Zusammenhang. Sie hatten Frauen untersucht, die nach drei IVF-Zyklen nicht schwanger geworden waren. Bei 82% der Patientinnen mit niedrigem diastolischem Blutfluss in der A. uterina konnte durch eine Östradiolbehandlung über 21 Tage eine Verbesserung des diastolischen Vorwärtsflusses in den Aa. uterinae erzielt werden. Die Schwangerschaftsrate betrug im Anschluss an diese Hormonbehandlung bei allen Frauen 43%. 42

51 Schrifttum WEINER et al. (1993) beobachteten bei infertilen Frauen im Rahmen eines IVF- Programms ein Absinken des uterinen Gefäßwiderstandes (PI). Die Autoren hatten bei einem Teil der Patientinnen bis zu einer Follikelgröße von 16 mm das Follikelwachstum durch die wiederholte Verabreichung von hmg angeregt und danach durch eine einmalige Injektion von hcg die Ovulation induziert. Die behandelten Patientinnen wiesen gegenüber Frauen mit unbehandelten Zyklen zu Beginn der Follikelphase und während der frühen Lutealphase deutlich niedrigere Gefäßwiderstände in den intraovariellen Gefäßen und den Aa. uterinae auf. Auch andere Autoren, die den uterinen Blutflusswiderstand (PI) von unbehandelten Frauen mit demjenigen behandelter IVF-Patientinnen verglichen hatten, kamen zu vergleichbaren Ergebnissen (SPERNOL et al. 1993; LEVI-SETTI et al. 1995; STRIGINI et al. 1995; CACCIATORE u. TIITINEN 1996; TEKAY et al. 1996; CACCIATORE et al. 1997). KUPESIC und KURJAK (1993) erhielten jedoch abweichende Ergebnisse. Letztgenannte Autoren beobachteten bei Frauen mit einem unbeeinflussten Zyklus ein Absinken des uterinen PI. Bei Frauen mit einem stimulierten Zyklus traten diese Veränderungen jedoch nicht ein, d.h. der uterine PI blieb während der präovulatorischen Phase konstant. Nach Meinung der Autoren lassen ihre Ergebnisse darauf schließen, dass der Uterus bei Frauen mit einem unbeeinflussten Zyklus eine höhere Implantationsbereitschaft aufweist als derjenige von Frauen mit einem hormonell beeinflussten Zyklus. Dagegen fanden TEKAY et al. (1995) zwischen den Zeitpunkten des Stimulationsbeginns und des Embryotransfers keine Änderungen im uterinen Blutflusswiderstand. Auch drei Wochen nach dem Embryotransfer waren zwischen schwangeren und nicht schwanger gewordenen Patientinnen keine Unterschiede im uterinen Blutflusswiderstand festzustellen. Aus den Ergebnissen dieser Studie folgerten letztgenannte Autoren, dass eine Prognose über den Ausgang einer hormonellen Behandlung mit Hilfe der Dopplersonographie nicht durchgeführt werden könne. Zwar scheint ihrer Meinung nach die uterine Blutversorgung eine wichtige Rolle im Rahmen der Befruchtung zu spielen, jedoch sei sie nicht der einzige Faktor, der über Erfolg oder Misserfolg eines IVF-Programms bestimmt. 43

52 Schrifttum 2.7 Progesteronmangel während der Lutealphase Beim Rind Eine geringe Plasmaprogesteronkonzentration während des Diöstrus der Kuh stellt nach GRUNERT (1999b) weniger eine eigenständige als ein Begleitsymptom einer anderen Erkrankung von Ovar und Uterus mit einer dadurch bedingten endokrinen Produktions- und Sekretionsstörung dar. Als Ursachen für einen Progesteronmangel sind nach GRUNERT (1999b) eine gestörte präovulatorische Follikelreifung, eine abnormale luteale Reifung oder auch eine zu geringe Lebensdauer des Gelbkörpers in Betracht zu ziehen. Auch WATHES (1992) und MANN et al. (1998) sehen die primäre Gelbkörperinsuffizienz mit mangelhafter Progesteronproduktion als ein eher seltenes Ereignis an, welches zu einer embryonalen Mortalität führen kann. Jedoch kann es nach BUTLER (2000) beim Rind durch die negative Energiebilanz in den ersten sechs Wochen post partum im Folgenden unter anderem zu einer Hemmung der Östrogenproduktion dominanter Follikel und zu einer geringeren Progesteronproduktion des Corpus luteum kommen. In diesem Zusammenhang wurden in der Vergangenheit neben diätetischen Maßnahmen auch hormonelle Therapien zur Steigerung der Progesteronsynthese durchgeführt (RAJAMAHENDRAN und SIANGAMA 1992; DIAZ 1998; NISHIGAI et al. 2002; LOPEZ-GATIUS et al. 2004; THATCHER und SANTOS 2007; LARSON et al. 2007). So konnten beim Rind durch eine hcg-applikation am Tag fünf nach einer Besamung im Anschluss an ein Synchronisationsverfahren die Ausbildung eines akzessorischen Gelbkörpers und damit höhere Progesteronwerte (7,4ng/ml bis 15,3ng/ml) und höhere Trächtigkeitsraten (45% bis 78%) erzielt werden (RAJAMAHENDRAN u. SIANANGAMA 1992; SIMON et al. 1994; AMBROSE et al. 1998; MOREIRA et al. 2001; THATCHER u. SANTOS 2007). Auch im Anschluss an eine hcg-gabe am Tag sechs nach der Embryonenübertragung im Rahmen eines ET-Programms wurden höhere Progesteronwerte und höhere Trächtigkeitsraten bei den Empfängerkühen beobachtet (NISHIGAI et al. 2002). In anderen Studien, bei 44

53 Schrifttum denen am Tag nach der Besamung hcg appliziert wurde, waren dagegen keine positiven Effekte auf die Graviditätsrate festzustellen (WALTON et al. 1990; THATCHER et al. 1993; CHAGAS E SILVA u. LOPES DA COSTA 2005; FUNSTON et al. 2005; HANLON et al. 2005a). Die Applikation von GnRH an Tag fünf nach einer Besamung synchronisierter Kühe hatte zwar die Ausbildung eines akzessorischen Gelbkörpers und höhere Progesteronkonzentrationen zur Folge (THATCHER et al. 1993; HOWARD et al. 2006), jedoch konnte kein Anstieg der Trächtigkeitsraten beobachtet werden. In weiteren Arbeiten (RHODES et al. 2001; LOPEZ-GATIUS et al. 2004; HANLON et al. 2005b; LARSON et al. 2007) wurde versucht, die frühe Embryonalphase mit Hilfe exogener Progesterongaben zu unterstützen. So stieg in Studien von LARSON et al. (2007) nach intravaginaler Progesteronapplikation zwischen dreieinhalb und zehn Tagen nach der Besamung die Trächtigkeitsrate gegenüber unbehandelten Kontrolltieren an (48% vs. 35%). Auch LOPEZ-GATIUS et al. (2004) konnten im Anschluss an eine positive Trächtigkeitsuntersuchung an Tag 28 p.i. durch eine intravaginale Progesteronapplikation von Tag 36 bis 42 p.i. eine Abnahme von embryonalen bzw. fetalen Verlusten bis Tag 90 p.i. feststellen (5,3% vs. 12%). RHODES et al. (2001) und HANLON et al. (2005b) erzielten jedoch keine besseren Trächtigkeitsraten bzw. Erstbesamungserfolge durch eine intravaginale Progesteronapplikation von Tag acht bis 15 (RHODES et al. 2001) bzw. von Tag fünf bis 12 (HANLON et al. 2005b) nach der Besamung synchronisierter vorher anöstrischer Kühe. HAYASHI et al. (2006) untersuchten in einer Studie, ob der LH-Peak entscheidend für die Ausbildung eines funktionellen Gelbkörpers nach der Ovulation bei der Kuh ist und so ein mangelnder LH-Peak mit einem Progesteronmangel ursächlich zusammenhängen könnte. Sie definierten die Aspiration des dominanten Follikels als Zeitpunkt der Ovulation und verglichen Tiergruppen, bei denen die Aspiration sieben Tage nach einer GnRH Gabe in der Lutealphase, 42 Stunden nach einer Prostaglandingabe, also vor dem LH-Peak und 48 Stunden nach einer zweiten GnRH-Gabe, also nach dem LH-Peak ausgeführt wurde. Eine Gruppe ohne Aspiration des dominanten Follikels diente als Kontrollgruppe, wobei der LH-Peak durch eine GnRH-Gabe nach Prostaglandininjektion ausgelöst wurde. 45

54 Schrifttum Dopplersonographische Untersuchungen der Ovarien und Steroidhormonbestimmungen im peripheren Plasma wurden am Tag der Follikelaspiration, sowie drei, sechs und neun Tage später durchgeführt. Dabei beobachteten die Autoren die Entwicklung eines Gelbkörpers mit erkennbarer Durchblutung nur im Anschluss an eine Follikelaspiration des dominanten Follikels nach dem induzierten LH-Peak und in der Kontrollgruppe. Darüber hinaus unterschieden sich diese zwei Gruppen weder in der Gelbkörperdurchblutung, der Gelbkörperfläche noch in der Plasmaprogesteronkonzentration in der folgenden Lutealphase. HAYASHI et al. (2006) schlossen daraus, dass vorwiegend der LH-Peak entscheidend für die Entwicklung eines funktionellen Gelbkörpers sei und nicht allein die Follikelruptur im Rahmen einer Ovulation Lutealphasendefekt (luteal phase defect; LPD) bei der Frau Eine verminderte Progesteronproduktion bei der Frau kann zu einer Verkürzung der Lutealphase führen und wird von diversen Autoren als so genannter Lutealphasendefekt (luteal phase defect, LPD) bezeichnet (JONES 1991; GINSBURG 1992; SUH u. BETZ 1993; WEISSMAN u. SHOHAM 1996; CHRISTENSEN u. SCHINDLER 1997; KALOGIROU et al. 1997; KUPESIC et al. 1997; STAPLEY 2001; WUTTKE et al. 2001; JORDAN et al. 2002; PRITTS u. ATWOOD 2002; CUNHA-FILHO et al. 2003; BUKULMEZ u. ARICI 2004; SUGINO 2006). In der Vergangenheit wurde versucht, die Diagnose LPD über verschiedene klinische Tests zu erlangen. Dabei wurden unter anderem der Verlauf der basalen Körpertemperatur bestimmt (CHRYSSIKOPOULOS et al 1990; HE 1993), die Plasmaprogesteronkonzentrationen in der Lutealphase gemessen (KUSUHARA 1992; HE 1993; JORDAN et al. 1994) und eine oder mehrere Gewebeproben des Endometriums in der Lutealphase untersucht (WILSON et al. 1990; JONES 1990; HE 1993; JORDAN et al. 1994; JOHN et al. 1997; ABD-EL-MAEBOUD et al. 1997). Die Angaben in der Literatur über die Sensitivität und Spezifität dieser Testverfahren, einzeln oder in unterschiedlichen Kombinationen angewandt, gehen dabei weit auseinander. CHRYSSIKOPOULOS et al. (1990) verglichen die Spezifität der Diag- 46

55 Schrifttum nose LPD bei 149 Patientinnen unter Heranziehung verschiedener diagnostischer Verfahren, der Bestimmung der basalen Körpertemteratur, der histologischen Untersuchung von Endometriumbiopsieproben und der Serumprogesteronbestimmung. Die Autoren konnten bei 65% der Patientinnen bei kombinierter Beurteilung der basalen Körpertemperatur und der Histologie von Endometriumproben die Diagnose LPD stellen. Die Spezifität der Diagnose war damit um etwa 20% höher als bei den anderen Kombinationen der in dieser Studie verwandten diagnostischen Verfahren. Andere Autoren (JONES 1991; THATCHER et al. 1993; JORDAN et al. 2002; JOHNSON 2005) sehen allein die histologische Datierung mit Hilfe der von NOYES et al. (1950) beschriebenen Kriterien als sicheres Diagnostikum an. Dabei wurden der Zyklus der Frau in die Menstruation (Tag eins bis vier), die frühe proliferative Phase (Tag vier bis sieben), die mittlere proliferative Phase (Tag sieben bis zehn), die späte proliferative Phase (Tag elf bis 14), die Ovulation an Tag 14 und die folgende Sekretionsphase (Tag 14 bis 28) eingeteilt. Konstante und charakteristische histologische Komponenten des Endometriums, wie z.b. Kernmitosen, basale Vakuolenbildung oder sichtbare Sekretion im Innern von Drüsen, bildeten die Grundlage für die Datierung endometrialer Gewebeproben nach NOYES et al. (1950). KUSUHARA (1992) fanden bei 43 von 126 infertilen Frauen in der Lutealphase neben abweichenden Progesteronprofilen Endometriumproben mit Zellformen, die noch keine Implantation ermöglichen. JORDAN et al. (2002) sahen eine einfache Progesteronbestimmung in der mittleren Lutealphase bei einem Serumprogesterongehalt von unter 10ng/ml oder eine dreimalige Progesteronbestimmung in der mittleren Lutealphase mit einem Summenwert von unter 30 ng/ml als sichersten Test an. Ferner ist nach HE (1993) die anhand der Progesteronbestimmung in Kombination mit der Erhebung der basalen Körpertemperatur gestellte Diagnose LPD genauso sicher wie diejenige, welche mittels histologischer Untersuchung des Endometrium erhoben wurde. Dagegen sind nach JONES (1991) die Biopsie des Endometriums und eine histologische Datierung der Progesteronbestimmung vorzuziehen. 47

56 Schrifttum Ein weiteres Diagnostikum ist die Ermittlung des Gehalts an endometrialen Hormonrezeptoren. ABD-EL-MAEBOUD et al. (1997) beurteilten bei LPD- Patientinnen die endometrialen Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Sie beobachteten weniger Östrogen- und Progesteronrezeptoren in der Lutealphase. Insbesondere ein hohes Progesteron-/Östrogenrezeptorverhältnis ist ihrer Meinung nach ein verlässlicher Test zur Diagnose eines LPD, denn dieses veranschauliche die endometriale Rezeptorimbalance. Nach den Autoren ist bereits eine abnorme Follikulogenese als mögliche Ursache eines LPD in Betracht zu ziehen. Diese führe in der folgenden Lutealphase zu einem weiten Abstand zwischen Östrogen- und Progesteronrezeptorkonzentrationen im Endometrium. Einige Autoren (GLOCK u. BRUMSTED 1995; KALOGIROU et al. 1997; KUPESIC u. KURJAK 1997) konnten darüber hinaus bei LPD-Patientinnen farbdopplersonographisch Abweichungen von den physiologischen Perfusionsverhältnissen feststellen. So beobachteten GLOCK und BRUMSTED (1995) höhere Blutflusswiderstände (RI) und geringere Blutflussgeschwindigkeiten in den intraovariellen Gefäßen bei LPD-Patientinnen. Auch KALOGIROU et al. (1997) und KUPESIC und KURJAK (1997) stellten bei betroffenen Patientinnen während der gesamten Lutealphase höhere RI-Werte in den ovariellen Gefäßen fest. KALOGIROU et al. (1997) haben daneben höhere PI-Werte beobachtet. KUPESIC und KURJAK (1997) fanden darüber hinaus bei LPD-Patientinnen neben geringeren Plasmaprogesteronkonzentrationen und verzögerten endometrialen Umbauvorgängen negative Korrelationen zwischen dem uterinen bzw. ovariellen Blutflusswiderstand (RI) und den Plasmaprogesteronkonzentrationen in der Lutealphase (r = -0,94, p = 0,01). Im Gegensatz dazu konnte TINKANEN (1994) zwischen LPD Patientinnen und fertilen Frauen keine Unterschiede in den Blutflusswiderständen (RI, PI) der intralutealen Gefäße feststellen. Die Ursachen für einen Lutealphasendefekt werden bisher an verschiedenen Regelstellen des Endokriniums vermutet. Von verschiedenen Autoren (AYABE 1994; SUH u. BETZ 2003) wird eine gestörte LH-Sekretion während der Lutealphase als Ursache für einen LPD angesehen. So beobachteten SUH und BETZ (1993) in der 48

57 Schrifttum frühen Follikelphase eine erhöhte LH-Freisetzung, gefolgt von einer Lutealphase mit reduzierter Progesteronproduktion und herabgesetzter LH-Freisetzung. Die Autoren sind der Ansicht, dass eine abnormal erhöhte LH-Sekretion in der frühen Follikelphase zu einer Ovulation unreifer Follikel führen und bereits in dieser Phase als Ursache für die Lutealphasendefekte verantwortlich sein könnte. Dagegen stellten AYABE et al. (1994) während der Follikelphase ein beeinträchtigtes Follikelwachstum und im Laufe des gesamten Zyklus eine abnorme LH-Sekretion bei LPD Patientinnen fest. Andere Autoren haben bei LPD Patientinnen neben Veränderungen in den Plasmahormonprofilen auch veränderte Hormonrezeptorgehalte im Endometrium nachgewiesen (MOELOEK u. MOEGNY 1993; MA et al. 1998). In der frühen Mitte der Lutealphase beobachteten MA et al. (1998) geringere Progesteronrezeptorkonzentrationen und MOELOEK und MOEGNY (1993) geringere LH-Rezeptorkonzentrationen im Endometrium von LPD-Patientinnen. Laut MA et al. (1998) sei das Endometrium aufgrund der geringen Progesteron- und LH-Rezeptorexpressionen in dieser Phase nicht fähig, auf einen adäquaten Stimulus durch luteales Progesteron zu reagieren. Auch exogene GnRH-Gaben im Rahmen eines IVF Programms können einen LPD auslösen (PRITTS u. ATWOOD 2002; TAVANIOTOU et al. 2002; FATEMI et al. 2007). In diesem Zusammenhang wird in der Literatur auch von dem so genannten iatrogenen LPD gesprochen. Nach TAVANIOTOU et al. (2002) werde bei diesem die LH-Sekretion in der Follikelphase durch das exogen zugeführte GnRH übermäßig angeregt und daher stehe LH in der folgenden Lutealphase nicht mehr ausreichend zur Verfügung. Der LPD ist nach Meinung diverser Autoren einer der wesentlichen Gründe für wiederholte Verluste einer Schwangerschaft und für Unfruchtbarkeit bei der Frau (ODA et al. 1992; CHRISTENSEN u. SCHINDLER 1997; CRAMER u. WISE 2000; ROBERTS u. MURPHY 2000; PRITTS u. ATWOOD 2002; TAVANIOTOU et al. 2002; POTDAR u. KONJE 2005; NARDO u. SALLAM 2006). Nach wiederholten Schwangerschaftsverlusten konnten GUILLAUME et al. (1995) bei Patientinnen mit einem retrospektiv diagnostizierten LPD signifikant mehr ektopische Schwangerschaften (11,8% vs. 2,9%) und hoch signifikant mehr spontane Aborte (37,3% vs. 49

58 Schrifttum 5,7%) feststellen als bei Patientinnen, deren Unfruchtbarkeit in der Vergangenheit mit anovulatorischen Follikeln in Zusammenhang gebracht werden konnte. GINSBURG (1992) sieht den Lutealphasendefekt als die vermutlich weit verbreiteste ovarielle Störung der Frau an, welche seiner Meinung nach zu einer herabgesetzten uterinen Reife führt. Im Gegensatz zu den genannten Autoren sind JORDAN et al. (2002) der Meinung, dass der LPD ein sehr seltenen und ungewöhnlichen Grund für einen Schwangerschaftsverlust darstellt. Im Rahmen der Therapie von LPD-Patienten wird mittels verschiedener Maßnahmen versucht, den Gelbkörper während der frühen Lutealphase in der Progesteronsekretion zu unterstützen. So konnte in den Studien von ROBERTS und MURPHY (2000) sowie GUZICK und ZELEZNIK (1990) die orale Verabreichung von Progesteron in der frühen Lutealphase die Schwangerschaftsraten bei Frauen mit einem LPD deutlich verbessern. Nach CHRISTENSEN und SCHINDLER (1997) sowie PRITTS und ATWOOD (2002) ist jedoch die Kombination einer täglichen intramuskulären Gestageninjektion mit einer täglichen oralen Östradiolgabe in der frühen Lutealphase als Therapie eines LPD vorzuziehen. Jedoch kann laut PRITTS und ATWOOD (2002) keine Empfehlung zur Therapiedauer gegeben werden. Dazu wären weitere Arbeiten notwendig. GUZICK und ZELEZNIK (1990), GINSBURG (1992) sowie ROBERTS und MORPHY (2000) beobachteten dagegen Verbesserungen bei LPD Patientinnen im Anschluss an eine Behandlung mit dem Antiöstrogen Clomifen während der Follikelphase. Antiöstrogene sollen nach den genannten Autoren den negativen Effekt endogener Östrogenkonzentrationen auf die FSH-Ausschüttung während der Follikelphase unterdrücken und den negativen Feedback-Mechanismus einer geringen Plasmaöstrogenkonzentration auf die LH-Sekretion zu Beginn der Follikelphase blockieren. Somit könnte die FSH- und LH-Sekretion in der frühen Follikelphase gesteigert werden und einer Störung des Follikelwachstums entgegenwirken. Hinsichtlich der Auswirkungen einer hcg-applikation während der Lutealphase gehen die Ansichten verschiedener Autoren weit auseinander. Nach WUTTKE et al. (2001) gibt es in Abhängigkeit von der Sensitivität gegenüber exogenen LH-Gaben 50

59 Schrifttum unterschiedliche Formen des LPD. Reagiert der Gelbkörper auf exogene LH-Gaben mit einer gesteigerten Progesteronproduktion, so sollten die Patientinnen mit hcg oder pulsatilen GnRH-Gaben behandelt werden. Falls der Gelbkörper weder auf LHnoch auf hcg-substitution in Form einer gesteigerten Progesteronproduktion anspricht, so ist nach WUTTKE et al. (2001) die tägliche Progesteronsubstitution vorzuziehen. Auch GINSBURG (1992) empfiehlt nach wiederholt fehlgeschlagenen LH- und hcg-verabreichungen bei LPD-Patientinnen die Gonadotropinsubstitution. Jedoch besteht nach PRITTS und ATWOOD (2002) nach hcg-verabreichung die Gefahr eines ovariellen Hyperstimulationssyndroms. Im Gegensatz dazu ist nach MOMOEDA et al. (1998) ein LPD nicht mit hcg behandelbar. In ihrer Studie stieg trotz hcg-applikation eine Stunde nach der Stimulation bei den LPD Patientinnen die Progesteronkonzentration nur geringgradig auf 1,1 ng/ml an, während die Progesteronkonzentration der Patientinnengruppe ohne LPD auf einen Wert von durchschnittlich 5,7 ng/ml anstieg. LI et al. (2001) stimulierten bei Patientinnen mit vorhergegangenen Fehlgeburten mittels täglicher Verabreichung von hmg und LH die ovarielle Entwicklung bis zu einem definierten Follikelreifestadium. Die Follikelreife beurteilten die Autoren anhand des Erreichens von Plasmaöstradiolkonzentration von 2000 bis 3000 pmol/l oder dem Vorhandensein von mindestens zwei Follikeln mit einem Durchmesser über 16mm. Die Ovulation wurde in diesem Stadium mittels einer hcg-applikation induziert. Die Autoren beobachteten bei 85% der behandelten Frauen anhand der histologischen Untersuchung von Endometriumbiopsien sieben bis zehn Tage nach der hcg-applikation eine für das Zyklusstadium zeitgerechte Entwicklung des Endometrium. Auch die Fehlgeburtenrate war bei behandelten Patientinnen niedriger als bei unbehandelten (15% vs. 58%). 51

60 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Tiere Die Untersuchungen wurden im Zeitraum von April 2006 bis November 2006 an 50 multiparen Kühen der Rassen Deutsche Schwarzbunte (n = 19), Holstein-Friesian (n = 18) und deren Kreuzungen (n = 13) durchgeführt. Die Tiere gehörten dem Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) mit Sitz in Mariensee an. Bei Versuchsbeginn waren die Tiere zwischen 30 und 113 Monate ( x ± s = 58 ± 20 Monate) alt und hatten zwischen ein- und fünfmal abgekalbt ( x ± s = 1,7 ± 1,1 Abkalbungen). Es wurden ausschließlich laktierende Kühe untersucht, deren letzte Geburt bei Versuchsbeginn zwischen 45 und 180 Tagen ( x ± s = 95 ± 46 Tage) zurücklag. Die durchschnittliche Tagesmilchleistung der Herde betrug während des Untersuchungszeitraums zwischen 23,4 und 27,1 Liter pro Kuh ( x ± s = 25,3 ± 1,7 Liter). In der Zeit von April bis Mai 2006 wurden die Tiere in Anbindehaltung mit Stroheinstreu gehalten. Das Grundfutter bestand aus Maissilage, Grassilage, Pressschnitzel, Stroh, Sojaschrot, Rapskuchen, Gerstenschrot und einer Mineralfuttermischung. Die Rationsberechnung des Grundfutters basierte auf 15 kg Milchleistung pro Tier und Tag. Darüber hinaus bekamen die Tiere in Abhängigkeit von ihrer Laktationsleistung bis zu viermal täglich Kraftfutter über einen Kraftfutterautomaten zugeteilt. Im Zeitraum von Mai bis November 2006 wurden die Tiere lediglich für die Untersuchungen über eine Woche nach oben angeführtem Regime gehalten. Während der übrigen Zeit waren sie ganztags auf der Weide. Neben dem Weideaufwuchs erhielten sie zusätzlich zweimal täglich die bereits beschriebene Grund- und Kraftfuttervorlage. 3.2 Definitionen Follikel- bzw. Corpus luteum-größe Die Größe eines Follikels bzw. Corpus luteum wurde als maximale Querschnittsfläche des jeweiligen Funktionsgebildes im sonographischen B-Bild definiert. Der mittlere Durchmesser eines Follikels bzw. Corpus luteum wurde aus der maximalen 52

61 Material und Methoden Querschnittsfläche berechnet, unter der Annahme, dass dieser kreisrund ist (siehe Kapitel ). Dominanter Follikel Wies ein Follikel eine Größe von mindestens 10 mm Durchmesser auf, so wurde dieser als dominant definiert. Großzystische Entartung Wies ein Funktionsgebilde mit Hohlraum einen Durchmesser von mindestens 25 mm auf und war kein Corpus luteum auf dem Ovar vorhanden, so wurde dieses nach der Definition von GRUNERT (1996) als großzystische Entartung definiert und das Tier von der Studie ausgeschlossen. Ovulation War der dominante Follikel bei aufeinander folgenden Untersuchungen nicht mehr vorhanden und entwickelte sich in der Folge ein Corpus luteum, so wurde der Zeitpunkt, an dem der Follikel zum ersten Mal nicht mehr sichtbar war, als Zeitpunkt der Ovulation bezeichnet. Funktionelles Corpus luteum Wiesen die Tiere sieben Tage nach der Ovulation einen Plasmaprogesterongehalt (P 4 ) von über 3,18 pmol/ml auf, so wurde das Corpus luteum als funktionell ungestört definiert. 3.3 Versuchsdesign Es wurden nur Tiere, die als allgemein und gynäkologisch gesund beurteilt wurden und ein Corpus luteum mit einem Durchmesser von mindestens 20mm aufwiesen, in die Studie aufgenommen. Pro Woche wurden maximal drei Tiere, die vor mindestens sechs Wochen abgekalbt hatten, gleichzeitig in die Studie aufgenommen und einer der Versuchsgruppen nach dem Losverfahren zugeordnet. Mit Hilfe hormoneller Behandlung wurde bei den Versuchstieren im Anschluss an eine mittels PGF 2α -Gabe induzierte Luteolyse die Ovulation nach unterschiedlichen Zeitintervallen eingeleitet. Bei Tieren der Gruppe G40 wurde bereits 40 Stunden nach induzierter Luteolyse die zweite GnRH-Injektion durchgeführt. Bei Tieren der Gruppe G60 erfolgte die zweite 53

62 Material und Methoden GnRH-Injektion 60 Stunden nach induzierter Luteolyse. Tiere der Studiengruppe S erhielten keine zweite GnRH-Injektion. Bei ihnen wurde die spontane Ovulation abgewartet. Anschließend wurden die Tiere nach einem zeitlich und inhaltlich identischen Schema untersucht (Abb. 3.1). Mittels transrektaler Farbdopplersonographie wurde darauf geachtet, ob die Größe des dominanten Follikels und des Corpus luteum sowie die Durchblutung des weiblichen Genitales des Rindes, sowohl im Östrus als auch im Diöstrus, von der Zeitspanne zwischen PGF 2α -Injektion und der Ovulation abhängen. Dazu wurden bei den Kühen der Gruppen G40 und G60 unmittelbar vor der zweiten GnRH-Gabe, also 40h (Gruppe G40) bzw. 60h (Gruppe G60) nach Prostaglandininjektion, die follikulären Perfusionsverhältnisse bestimmt. In der Gruppe S wurde der follikuläre Blutfluss, beginnend 60 Stunden nach der Applikation des Prostaglandinanalogons, im Abstand von 12 Stunden bis zur spontanen Ovulation erfasst. Weiterhin erfolgte die farbdopplersonographische Ermittlung der lutealen Durchblutung bei allen Tieren sieben Tage post ovulationem. In den Gruppen G40 und G60 erfolgte zudem im Östrus und im Diöstrus die Bestimmung der Blutversorgung des Uterus mittels dopplersonographischer Untersuchungen beider Aa. uterinae (Abb. 3.1). Mit Hilfe der B-Bild Sonographie wurde parallel zu jeder Blutflussuntersuchung die Größe der ovariellen Funktionsgebilde gemessen. Darüber hinaus wurde in den Gruppen G40 und G60 jeweils 24 und 36 Stunden nach der zweiten GnRH-Applikation und in der Gruppe S alle 12 Stunden, beginnend 60 Stunden nach der Prostaglandingabe, der Ovulationszeitpunkt kontrolliert. Der Zeitpunkt 24 Stunden vor der Ovulation wurde retrospektiv festgelegt. Tiere, die 36 Stunden nach der zweiten GnRH-Injektion nicht ovuliert hatten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Kontrolltiere, die bis 156 Stunden nach der Prostaglandininjektion nicht ovuliert hatten, wurden ebenfalls von der Studie ausgeschlossen. Die P 4 -Bestimmung erfolgte bei allen Studientieren sieben Tage nach der Ovulation. Die E ges -Bestimmung wurde 24 Stunden vor der Ovulation bei Tieren der Gruppen G 40 und G 60 sowie von 60 Stunden nach PGF2 α -Injektion ab alle 12 Stunden bis zur Ovulation bei Tieren der Kontrollgruppe durchgeführt. Die Entnahme der Endometriumbiopsien zur Ermittlung der Hormonrezeptor-mRNA- Expression bei Tieren der Gruppen G40 und G60 erfolgte 24 Stunden vor und sieben Tage nach der Ovulation. 54

63 Material und Methoden Die Studie wurde zunächst bis zu einer vorübergehenden Auswertung, welche vom bis zum andauerte, mit insgesamt 19 Tieren durchgeführt. Neun Tiere wurden nach dem Hormonschema der Gruppe G40 und zehn Tiere nach dem Hormonschema der Gruppe G60 behandelt. Aufgrund der ersten Ergebnisse wurde in den darauf folgenden Untersuchungen bei drei Tieren der Gruppe G40 und fünf Tieren der Gruppe G60 die Bestimmung der uterinen Durchblutung und der endometrialen Steroidhormonrezeptorexpression nicht mehr durchgeführt. Zum Vergleich des Einflusses der OvSynch Programme auf den follikulären und lutealen Blutfluss gegenüber spontan ovulierenden Kühen, wurde zusätzlich eine Kontrollgruppe von neun Tieren aufgenommen. 55

64 Material und Methoden B-Bild Sonographie Endometriumsbiopsie Dopplersonographie des Follikels/CL Östrogen/Progesteronbestimung Dopplersonographie der A. uterina 1.GnRH PGF2α 2.GnRH 7d 7d 40h 24h Tag G40 G60 1.GnRH PGF2α 7d 60h 2.GnRH 7d 24h Tag S GnRH Ovulation PGF2α 7d 60h 12h 12h 12h 7d Tag Abb. 3.1: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufes der Hormoninjektionen und der Untersuchungen der Kühe der Gruppen G40 (zweite GNRH Injektion 40h nach PGF 2α ), G60 (zweite GNRH Injektion 60h nach PGF 2α ) und S (keine GNRH Injektion nach PGF 2α ). 56

65 Material und Methoden 3.4 Klinische Untersuchung Die Allgemeinuntersuchung wurde am Tag der ersten Hormonapplikation in Anlehnung an das Untersuchungsschema von STÖBER (1990) durchgeführt (Befundbogen siehe Anhang Kapitel 8). Zusätzlich wurde jedes Tier speziell gynäkologisch nach dem Schema von GRUNERT (1990) untersucht. Das äußere Genitale wurde adspektorisch und palpatorisch beurteilt, während das innere Genitale mittels transrektaler Palpation und vaginaler Inspektion bewertet wurde. An den übrigen Untersuchungstagen wurde anhand der rektalen Körperinnentemperatur die Allgemeingesundheit beurteilt. 3.5 Sonographische Untersuchungen Für die transrektalen sonographischen Untersuchungen wurden die Tiere in einen Untersuchungsstand verbracht. Alle Studien erfolgten durch denselben Untersucher. Zur Verhinderung von starken Bauchpressen erhielten die Tiere eine kleine Epiduralanästhesie (60 mg Procain, Procasel 2%, Selectavet, Weyarn-Holzollig, D). Für die einzelnen Untersuchungsmodi wurden zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten jeweils die gleichen Geräteeinstellungen gewählt (siehe Tabellenverzeichnis, Tabelle 9.5). Die farbdopplersonographischen Studien dauerten jeweils etwa 30 Minuten pro Untersuchungszeitpunkt. Für die übrigen sonographischen Untersuchungen im B- Modus wurden etwa weitere 15 Minuten benötigt Verwendete Geräte und Sonden Die sonographischen Untersuchungen erfolgten mit dem Farbdopplersonographen LOGIQ TM Book XP der Firma GE Medical Systems (General Electrics Medical Systems, China), welcher mit einer 7,0 bis 10,0 MHz Linearsonde ausgestattet war. Es wurden über eine USB-Schnittstelle Videosequenzen sowie Standbilder der sonographischen Aufnahmen für die späteren Analysen im DICOM-Format auf einer externen Festplatte (Firma Freecom; Freecom Classic SL Hard Drive, 250GB) gespeichert. 57

66 Material und Methoden B-Bild-Sonographie Morphologische Befunde an den Ovarien An allen Untersuchungstagen wurden die Ovarien im B-Modus dargestellt. Dabei wurden alle Follikel ab einem mittleren Durchmesser von 10 mm sowie alle sonographisch abgrenzbaren Gelbkörper dokumentiert. Zur späteren Flächenberechnung wurde von diesen Funktionsgebilden jeweils ein Standbild gespeichert (Abb. 3.2). Zur Messung der Größe der Funktionsgebilde wurden die Ovarien in unterschiedlichen Ebenen dargestellt. Die maximale Querschnittsfläche (Follikelquerschnittsfläche: Afol, Gelbkörperquerschnittsfläche: Acl) wurde an einem IBM kompatiblen Laptop mit Hilfe der Software PixelFlux (Chameleon-Software, Leipzig, D) bestimmt. Dazu wurde die gesamte Querschnittsfläche der Funktionsgebilde durch Umfahren mit dem Cursor als Region of Interest (ROI) markiert (Abb. 3.2). Aus der so erhaltenen Querschnittsfläche wurde über die Formel: d = 2. Fläche π der mittlere Durchmesser (d) ermittelt. Wiesen Gelbkörper einen Hohlraum auf, wurde die Querschnittsfläche des Hohlraums zur Ermittlung der Lutealgewebefläche (Alut) von der Gelbkörpergesamtquerschnittsfläche abgezogen (Abb. 3.2). Abb. 3.2: links: Maximale Querschnittsfläche eines Corpus luteum im B-Modus an Tag sieben post ovulationem; rechts: Markierung der maximalen Querschnittsfläche und des Hohlraumes zur Kennzeichnung der Lutealgewebefläche (Alut). 58

67 Material und Methoden Farbdopplersonographie Bestimmung der follikulären und lutealen Durchblutung Zur Bestimmung der Durchblutung wurden die Follikel und Gelbkörper in unterschiedlichen Ebenen im Color-Angio-Modus dargestellt. Dabei wurde versucht, die größtmögliche farbige Fläche darzustellen. Zunächst wurden im Color-Angio Modus von jedem Follikel sowie von den Corpora lutea drei Videosequenzen aufgezeichnet. Im Anschluss daran wurde auf einem IBM kompatiblen Laptop mit Hilfe der Software PixelFlux (Chameleon-Software, Leipzig, D) aus jeder Sequenz das Standbild mit der größtmöglichen Pixelfläche pro Analysenfläche ausgewählt und im DICOM-Format gespeichert. Anhand dieser Standbilder (Abbildung 3.3) wurde die Analyse der follikulären und lutealen Durchblutung durchgeführt. 59

68 Material und Methoden Abbildung 3.3: oben links: Farbdopplersonographie eines Follikels im Bereich seiner maximalen Fläche 24 Stunden vor der Ovulation im Color-Angio- Modus; oben rechts: markierte Analysenfläche unter Aussparung der versorgenden Gefäße; unten links: Farbdopplersonographie eines Corpus luteum im Bereichs seiner maximalen Fläche sieben Tage post ovulationem im Color-Angio-Modus; unten rechts: markierte Analysenfläche unter Aussparung der versorgenden Gefäße. Die zu analysierende Fläche entsprach nicht der Fläche der Funktionsgebilde. Daher wurde durch Umfahren des Querschnitts der ovariellen Funktionskörper mit dem Cursor die Analysenfläche als Region of Interest (ROI) festgelegt (Abbildung 3.3), wobei die versorgenden Randgefäße nicht miteingeschlossen wurden. Als Maß für die absolute follikuläre (folbl) und absolute luteale Durchblutung (lutbl) wurde die durchblutete Fläche innerhalb der markierten Analysenfläche herangezogen: folbl bzw. lutbl = Farbpixelfläche in cm 2 60

69 Material und Methoden Die relative follikuläre (relfolblfl) und die relative luteale Durchblutung (rellutblfl) wurde als Verhältnis zwischen Farbpixelfläche und Gesamtquerschnittsfläche der Funktionsgebilde berechnet: relfolblfl bzw. rellutblfl = Farbpixelfläche in cm 2 Funtionskörperquerschnittsfläche in cm 2 Als Maß für die relative luteale Durchblutung des Lutealgewebes (rellutbllut) wurde die Fläche der Farbpixel in Relation zur Fläche des Lutealgewebes betrachtet: rellutbllut = Farbpixelfläche in cm 2 Lutealgewebequerschnittsfläche in cm 2 Aus den so erhaltenen Perfusionsparametern der drei Standbildauswertungen wurden jeweils die Mittelwerte berechnet und diese für die weiteren Auswertungen herangezogen Bestimmung des uterinen Blutflusses Die Aa. uterinae der rechten und linken Körperseite wurden mittels der von BAUMGARTNER (1998) beschriebenen Methode dargestellt. Zur eindeutigen Identifikation der Gefäße wurde zunächst im B-Modus die A. iliaca interna, ausgehend von der Aorta abdominalis, aufgesucht. In weiter distalem Verlauf wurde die abzweigende A. umbilicalis mit ihren zwei Aufzweigungen aufgesucht. Dabei handelte es sich bei dem weiter kaudal ziehenden Anteil um den verödeten Stumpf der ursprünglich zum Nabel ziehenden V. umbilicalis. Dieser wies im B-Modus zentrale hyperechogene Massen auf und ließ im CF-Modus keine Durchblutung darstellen. Der weiter kranial verlaufende Anteil wies, neben einem anechogenen Lumen im B-Modus, eine farbdopplersonographisch darstellbare Durchblutung auf. Hierbei handelte es sich um die A. uterina, die sich bis zum Uterus verfolgen ließ. Die Ultraschallsonde wurde jeweils so an der A. uterina platziert, dass die Ultraschallwellen in einem Winkel zwischen 30 und 60 (siehe Abb. 3.4) zum Blutstrom der A. uterina auftrafen. Die Winkelmessung erfolgte während der Untersuchung in der 61

70 Material und Methoden linken Bildhälfte im CF-Modus. Das Farbdopplerfenster wurde über dem Gefäß positioniert und die Dopplerwellen durch den zugeschalteten pulsed-wave-modus abgeleitet (Abb. 3.4). Alle Untersuchungen wurden in Form von Videosequenzen digital aufgezeichnet. 62

71 Material und Methoden S D Abb. 3.4: Farbdopplersonographie der A. uterina dextra eines Tieres 24 Stunden vor Ovulation; links: A. uterina (rot) im Farbdopplerfenster mit Winkelvoreinstellung 60, rechts: Dopplerwellen der A. uterina, bestehend aus systolischem (S) und diastolischem Blutfluss (D). Die Videosequenzen der abgeleiteten Dopplerwellen wurden im DICOM-Format auf einer externen Festplatte (Firma Freecom; Freecom Classic SL Hard Drive, 250GB) gespeichert. Die Auswertung der Dopplerwellen erfolgte mit Hilfe der computergestützten Software PixelFlux (Chameleon-Software, Leipzig, D). Dazu dienten pro Gefäß jeweils zwei Videosequenzen mit homogen erscheinenden Dopplerwellen und einem maximalen Verhältnis von Systole zu Diastole. Es wurden zwei aufeinander folgende, möglichst ähnliche Dopplerwellen ausgemessen und für jeden Parameter jeweils die Mittelwerte beider Dopplerwellen errechnet. Aus der maximalen systolischen (S), der minimalen diastolischen Frequenzverschiebung (D m ) und der mittleren maximalen Frequenzverschiebung (TAMF) erfolgte die Ermittlung (siehe Kapitel 2.4.3) des uterinen Blutflusswiderstandes anhand des winkelunabhängigen Pulsatily Index (PI). Aus dem Winkel α zwischen Dopplerstrahl und Blutflussrichtung und der mittleren maximalen 63