Einsatz der LC-MS im klinisch-toxikologischen Labor: Bestimmung von Sirolimus und Tacrolimus im Rahmen des Therapeutischen Drug Monitoring

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1 Ausgabe 11/2003 Einsatz der LC-MS im klinisch-toxikologischen Labor: Bestimmung von Sirolimus und Tacrolimus im Rahmen des Therapeutischen Drug Monitoring Zusammenfassung Für eine sichere medikamentöse immunosuppressive Therapie bei organtransplantierten Patienten, d.h. Vermeidung sowohl von Abstoßungsreaktionen als auch von unerwünschten Wirkungen, ist es zur Zeit in den meisten Fällen erforderlich, die Konzentration der eingesetzten Wirkstoffe im Rahmen des Therapeutischen Drug Monitoring im Blut zu kontrollieren. Es wird eine semi-automatische HPLC- MS-Methode zur simultanen Bestimmung von Sirolimus und Tacrolimus vorgestellt. Ergebnisse der Qualitätssicherung und des routinemäßigen Einsatzes in einem Servicelabor belegen auf der Basis von mehr als 1000 Analysen die Leistungsfähigkeit des dargestellten Verfahrens. 1 Einleitung Die Macrolide Sirolimus (Rapamycin) und Tacrolimus (FK506) (Abb.1) werden als Immunosuppressiva nach Organtransplantation zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen eingesetzt [1,2]. Die geringe therapeutische Breite der beiden Substanzen erfordert in klinisch akuten Situationen ebenso wie in der Langzeitbehandlung die Einhaltung definierter Konzentrationsbereiche, um einen ausreichenden therapeutischen Effekt unter Vermeidung unerwünschter Wirkungen zu gewährleisten. Ein Therapeutisches Drug Monitoring (TDM), basierend auf Konzentrationsbestimmungen, ist daher unerläßlich. Beide Arzneimittel haben sehr hohe Konzentrationen in den Erythrozyten, so daß die Untersuchung im Vollblut durchgeführt werden muß [3]. Häufig werden Sirolimus (SRL) und Tacrolimus (TRL) zur nebenwirkungsarmen, synergistischen Immunosuppression kombiniert [4]. Nicht selten ist bei immunsupprimierten Patienten die (vorübergehende) gleichzeitige Anwendung anderer Medikamente erforderlich. Arzneimittelwechselwirkungen (Induktion oder Inhibition) insbesondere am Enzymsystem P450 und P-Gycoprotein können in erheblichem Ausmaß die Pharmakokinetik der Immunosuppressiva und damit ihre Konzentration im Blut verändern, so daß auch aus diesem Grund ein TDM zwingend erforderlich ist. Abbildung 1: Strukturformeln von Sirolimus und Tacrolimus Shimadzu Deutschland GmbH Seite 1 von 6

2 Die Konzentration am Ende des jeweiligen Applikationsintervalls (trough level) sollte für SRL im Bereich von 4-12 µg/l, für TRL etwas höher (6-15 µg/l) liegen. (Die therapeutisch angestrebten Konzentrationen unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Art des transplantierten Organs, der Zeitspanne nach der Transplantation und der individuellen Pathophysiologie.) Im Gegensatz zu TRL, für das es einen von der FDA-zugelassenen Immunoassay gibt, steht z.zt. für SRL kein geeigneter, kommerziell verfügbarer Assay zur Verfügung. Es bedarf daher einer schnellen, einfachen, chromatographischen Analysenmethode, die bei Einhaltung der erforderlichen Qualitätsstandards für den Routineeinsatz im Servicelabor geeignet ist. Herkömmliche HPLC-UV-Methoden (z.b. [5]) erwiesen sich unter diesen Gesichtspunkten als ungeeignet. Wir setzten daher die HPLC mit einem massenselektiven Detektor ein, um eine Methode zur gleichzeitigen Analyse von SRL und TRL mit einer den wechselnden (und wachsenden) therapeutischen Erfordernissen adäquater Sensitivität und Spezifität bereitzustellen. Um eine effektive und sichere Therapie für die Patienten zu gewährleisten, kommt der externen Qualitätssicherung der am TDM beteiligen Laboratorien eine besondere Bedeutung zu. Die entwickelte Methode wurde daher einem "proficiency testing scheme" bei ASL International, London, UK) [6] unterworfen, um für unser Labor den Status eines "Referenzlabors" zu erhalten (ca. 100 unbekannte Proben mußten unter Einhaltung definierter Qualitätskriterien innerhalb von 5 Tagen untersucht werden). Nach erfolgreich absolviertem Test wurde die vorgestellte Methode im März 2002 in den Routinebetrieb übernommen und seit dem durch monatliche Ringversuche bei der gleichen Institution extern kontrolliert. 2 Methode 2.1 Probenvorbereitung und Extraktion Zu 500 µl EDTA-Vollblut werden durch Zusatz von 1 ml 0,1 M Zinksulfat/Methanol (70:30 v/v) die Zellen lysiert und die Proteine gefällt. Die Mischung enthält 100 µl 32-desmethoxysirolimus (DM-SRL, c= 1 µg/l) als Interner Standard 1 für die Bestimmung von SRL und 50 µl Ascomycin (ASC, c= 1 µg/l) als Interner Standard 2 für die Bestimmung von TRL. Nach maschinellem Schütteln (10 min) werden die Proben zentrifugiert (10 min bei 10,000 g) und der Überstand (1 ml) in ein 1,5 ml Röhrchen (Sarstedt) für die automatische Extraction (Zymark Rapid Trace) überführt. Die Extraktionssäulen (C18, Separtis) werden wie folgt kondioniert: 2 ml Methanol, 2 ml Ameisensäure (0,1 %). Nach der Probenaufgabe (1 ml) werden die Säulen mit 3 ml Ameisensäure (0,1 %) und einem Gemisch aus Methanol und Ameisensäure (0,1 %) (50:50, v/v) gewaschen. Die Elution der Analyte erfolgt mit 1,6 ml 2-Propanol/ Ameisensäure (0,1 %). Das Elutionsmittel wird anschließend bei 30 C im Stickstoffstrom entfernt, der trockene Rückstand in 120 µl Acetonitril gelöst und ein Aliquot (50 µl) in das HPLC-MS system injektiert. 2.2 HPLC Die HPLC besteht aus einem binären Pumpensystem (LC-10 ADVP), einem System Controller (SCL-10 A), einem Lösungsmitteldegasser (DGU-14A), einem Autosampler (SIL-10 ADVP), einem Ofen (CTO-10 ASVP) und einem UV-Detektor (SPD-10 AVP, alles Shimadzu, Abb 2). Zur Trennung dient eine analytische Trennsäule vom Typ Discovery C18 (150 x 2,1 mm, 5 µm), die mit einer Vorsäule gleichen Typs (C18, 20 x 2,1 mm, 5 µm, beides Supelco) verbunden ist. Die Ofentemperatur liegt bei 40 C. Die Mobile Phase setzt sich folgt zusammen: A: Methanol and B: Methanol / Wasser (20/80, v/v) mit einem Zusatz von 100 µmol/l Natriumformiate. Der Gradient ist: min: 95-6 % B linear, min: 6 % B, min: 6-95 % B linear, min: 95 % B (Zeit: 15 min). Die Mobile Phase wird vor Beginn der Analyse durch eine 0.22 µm Membran (Millipore) filtriert. Die Flußrate der Mobilen Phase liegt bei 0,3 ml/min. 2.3 ESI-MS Für die Massenspektrometrie dient ein MS-2010-System der Fa. Shimadzu. Alle Messungen erfolgen mit dem ESI-Interface im positiven Modus (schematischer Aufbau s. Abb. 3). Als Nebulizer Gas dient Stickstoff, mit einer Flußrate von 4.5 ml/min. Block- und CDL-Temperatur sind auf 300 C eingestellt. Alle anderen Parameter entsprechen den Einstellungen aus dem Standard-Tuning. Der Massendetektor arbeitet im Selected Ion Monitoring Modus (SIM) mit Fokussierung auf folgende Natrium Adukkte: [M+Na]+ von SRL (m/z 936.6), DM-SRL (m/z 906.3), TRL (m/z 826.3) and ASC (m/z 814.3). Shimadzu Deutschland GmbH Seite 2 von 6

3 Abbildung 2: LCMS 2010 (Shimadzu) Abbildung 3: Schematischer Aufbau MS 2010 (Shimadzu) 3 Ergebnisse und Diskussion Die vorgestellte HPLC-MS Methode erlaubt die gleichzeitige Bestimmung von Sirolimus (SRL) und Tacrolimus (TRL). Die Kalibriergerade und die Bestimmungsgrenzen sind den erwarteten Konzentrationen im Vollblut angepaßt. Für die Quanifizierung wurde eine 8-Punkt Kalibrierung von SRL und TRL (0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 30 and 40 µg/l) durchgeführt. Beide Kalibrationen waren in dem getesten Bereich linear (r2 > 0.998). Die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ) lag bei 0.5 µg/l (TRL) und 1 µg/l (SRL). Präzision und Genaugigkeit wurden durch die Analyse von in-house Qualitätskontrollproben (QC)-Proben (4 verschiedene Konzentrationen innerhalb des linearen Meßbereiches) ermittelt. Alle Werte lagen innerhalb des vordefinierten Akzeptanzkriteriums von ± 15 %. Durch den Austausch des üblichen Vacuum-Manifolds (Baker) für eine manuelle Festphasenextraktion durch eine automatische Festphasenextraktion (Zymark Rapid Trace) konnte die Präzision gesteigert werden. Ein Verschleppungseffekt, konnte durch die Analyse von aufgestockten Vollblutproben (c= 200 µg/l) und Leerproben (c= 0 µg/l) ausgeschlossen werden. Für die QC Proben wurden folgende Vk-Werte bestimmt: SRL 12.5 % für 3 µg/l, 9,7 % für 6 µg/l, 6.8 % für 12 µg/l; TRL 10.5 % für 3 µg/l, 7.0 % für 6 µg/l, 5.0 % für 15 µg/l. Die Richtigkeit wird zusätzlich durch die Teilnahme an monatlichen Ringversuchen (ASL International, London, UK) [6] kontrolliert. Die Ergebnisse, die mit dieser Methode innerhalb der ersten 6 Monate erzielt worden sind, befinden sich in Abb. 5 und 6. Shimadzu Deutschland GmbH Seite 3 von 6

4 Abbildung 4: Repräsentatives UV und SIM Chromatogramm einer Vollblutprobe. Sirolimus (4,8 µg/l), Tacrolimus (5,1 µg/l). Durch die Verringerung der Säulentemperatur von ursprünglich 75 C [7] bzw. 60 C [4] auf 40 C konnte die Standzeit der analytischen Säule deutlich verlängert werden. Mit dem vorliegenden Analysenverfahren können bis zu 100 Proben/Tag analysiert werden, ohne Wechsel der Säule oder der Mobilen Phase. Insgesamt können mehr als 1000 Proben auf SRL/TRL mit der gleichen Ver- und Hauptsäule und ohne Verlust an Sensivität, Genauigkeit oder Präsizion untersucht werden. In der Tabelle 1 sind die zur Zeit der Verfasssung dieses Manuskripts aktuell gemessene SRL- und TRL- Konzentrationen bei verschiedenen Gruppen organtransplantierter Patienten (Alter: Jahre) zur Demonstration des beobachteten Konzentrationsbereiches zusammengefaßt. Bei alle Patienten wurde mindestens ein Organ transplantiert. Ein repräsentatives UV and Ionenchromatogramm einer Patientenprobe zeigt Abb. 5. Shimadzu Deutschland GmbH Seite 4 von 6

5 Abbildung 5: Sirolimus Konzentrationen aus dem monatlichen Ringversuchen (International Proficiency Testing Scheme) - eine repräsentative Periode (6 Monate). Tabelle 1: Jeweils letzte gemessene Sirolimus und Tacrolimus Konzentrationen bei verschiedenen Gruppen organtransplantierter Patienten zur Demonstration des beobachteten Konzentrationsbereiches Patienten (stationär) Patienten (ambulant)* Organ c Sirolimus C Tacrolimus c Sirolimus C Tacrolimus Leber 8,0 ± 2,9 (n=16) 5,9 ± 3,5 (n=14) Bereich: 3,1 15,2 Bereich: < 1 11,6 4,4 ± 4,0 (n=32) 8,6 ± 4,6 (n=33) Niere 6,0 ± 2,8 (n=27) 8,0 ± 3,1 (n=23) Bereich: < 1 14,8 Bereich: 1,4 21,1 Bereich: 1,6 12,2 Bereich: 2,6 16,6 * = keine näheren Informationen, daher keine Differenzierung möglich Die vorgestellte HPLC-MS Methode erweist sich als eine einfache und sensitive Analysentechnik für die Bestimmung von SRL und TRL aus Vollblut die den internationalen Qualitätsstandards entspricht. Die Probenvorbereitung erlaubt die gleichzeitige Analyse beider Analyte. Aufgrund der therapeutischen Konzentrationen der Immunosuppressiva von 3-10 µg/l und der häufigen erforderlichen Komedikation erweist sich eine chromatographische Analysenmethode in Kombination mit einem MS-Detektor als das zu bevorzugende Analysenverfahren. Derzeit wird versucht, die Methode weiter zu optimieren, um andere Arzneimittel, die ein TDM in dieser Patientengruppe erfordern (z. B. Ciclosporin), bei gleicher Probenaufarbeitung im selbem Lauf zu quantifizieren. Die Autoren Dr. rer. nat. Thomas Grobosch, PD Dr. med. Dagmar Lampe, Dr. rer. nat. Gerhard Smettan Shimadzu Deutschland GmbH Seite 5 von 6

6 Literatur [1] Sehgal, S.N.: Rapamune: Mechanismn of action immunosuppressive effect results from blockade of signal transduction and inhibition of cell cycle progression. Clin Biochemistry 1998;31(5): [2] Iwasaki K.; Shiraga, T.; Nagase, K.; Tozuka, Z. et al.: Isolation, identification, and biological activities of oxidative metabolites of FK 506, a potent immunosuppressive macrolide lactone. Drug Metab. Dispos. 21(6):971-7 (1993). [3] Holt, D.W.; Marwaha, G.; Jones, K.; Johnston, A.: Quality assurance programs for immunosuppressive drugs: cyclosporine and beyond. Ther. Drug Monit. 15:472-7 (1993) [4] Shapiro, A.M.; Suarez-Pinzon, W.L.; Power, R; Rabinovitch, A.: Combination therapy with low dose sirolimus and tacrolimus is synergistic in preventing spontaneous and recurrent autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice. Diabetologia 45(2): (2002) [5] Napoli, K.L.; Kahan, B.D.: Routine clinical monitoring of sirolimus (rapamycin) whole-blood concentrations by HPLC with ultraviolet detection. Clin. Chem. 42: (1996) [6] Analytical Services International. International Proficiency Testing Scheme. [7] Lensmeyer, G.L.; Poquette, M.A.: Therapeutic Monitoring of Tacrolimus Concentrations in Blood: Semi- Automated Extraction and Liquid Chromatography-Electrospray Ionisation Mass Spectrometry. Ther. Drug Monit. 23: (2001) Artikel erschienen in: GIT Separation,(22) September 2003; S & LaborMedizin & Diagnostik,(1) November 2003; S Shimadzu Deutschland GmbH Seite 6 von 6