pplications Note Oktober 1 Technical Report : Bewertung der rückgewinnung in Tubes und Plates Natascha Weiß 1, Wolf Wente und Philip Müller 1 1 G, Hamburg, Deutschland; Instrumente GmbH, Hamburg, Deutschland Zusammenfassung Einmalartikel wurden speziell dafür entwickelt, Probenverluste durch dsorption an die Gefäßwände zu minimieren. In den hier beschriebenen Experimenten wird nachgewiesen, dass durch Einsatz von Produkten bis zu mehr Probe zurückgewonnen wird als nach Verwendung von Gefäßen aus Standardmaterial. Zusätzlich wurde die srate von Gefäßen mit low binding Gefäßen anderer verglichen. Gefäße zeigten selbst nach 9 h Inkubation noch eine von 9 im hier angewendeten Test. Es wird gezeigt, dass in nachfolgenden nalysen wie z. B. MLDI-TOF bessere Ergebnisse erzielt werden. Die Tubes und Deepwell Plates sind somit hervorragend für nwendungen mit en, Peptiden und Viren geeignet, insbesondere, wenn mit geringen Probenmengen gearbeitet wird. Einleitung Die ufbereitung und Lagerung von Probenmaterial (z. B. Zellen und Gewebe sowie DN, RN und e) stellen häufig die Grundlage für erfolgreiche Experimente dar. Neben der Reinheit der Probe ist dabei auch die Wiedergewinnung nach der Verarbeitung wichtig. Wenn biologische Proben schwer zu isolieren oder aufwändig bzw. teuer in der Herstellung sind, wird häufig mit sehr geringen Mengen bzw. Konzentrationen gearbeitet. Gerade in diesen Fällen sind Verluste kritisch, denn sie können dazu führen, dass nalysen keine oder keine eindeutigen Ergebnisse zeigen. uch der Kostenfaktor darf, z. B. bei Einsatz teurer Reagenzien, nicht unterschätzt werden. Für diese nwendungen ist es vorteilhaft, Produkte zu verwenden, deren Oberflächen so optimiert sind, dass biologische Proben nur mit geringer ffinität binden. Eine besondere Herausforderung stellt in diesem Zusammenhang das rbeiten mit en dar. e weisen sowohl hydrophile als auch hydrophobe Bereiche auf, wobei die letzteren bei globulären en in wässriger Lösung für gewöhnlich im Inneren der struktur angeordnet sind. Feste Oberfläche : Hydrophile Bereiche Hydrophobe Bereiche Wassermoleküle bbildung 1: Darstellung eines globulären s in wässriger Lösung, dessen hydrophobe Ketten unter Veränderung der struktur an eine feste Oberfläche binden.
pplication Note Seite Einleitung Bei Kontakt mit festen Oberflächen kann sich die dreidimensionale Struktur der e so verändern, dass die hydrophoben Regionen nach außen treten und mit den hydrophoben Bereichen der Oberfläche in Kontakt treten [1, ] (siehe bb. 1). ls Resultat denaturieren die e an der Oberfläche, wodurch wertvolles Probenmaterial verloren geht oder, wenn es sich um Enzymlösungen handelt, deren ktivität reduziert wird. Die uswirkungen auf die Probenmenge sind umso größer, je geringer die eingesetzte konzentration ist. Neben speziellen nsätzen im medizinisch/pharmazeutischen Bereich, bei denen die Bindung von en an Oberflächen wie Polypropylen eine Rolle spielt [3,, 5], werden folgende Methoden bei der rbeit mit en und Peptiden im Labor eingesetzt, um die dsorption von Probenmaterial zu reduzieren: 1) Die Verwendung von beschichteten (z. B. silikonisierten) Gefäßen. Es besteht hier jedoch das Risiko, dass sich Bestandteile der Beschichtung lösen und mit der Probe interferieren sowie Folgeanwendungen beeinflussen. ) Eine andere Möglichkeit ist die Zugabe von BS, welches vorrangig an die Gefäßoberfläche bindet und somit die probe schützt. Die dabei verwendeten hohen Konzentrationen an BS beeinträchtigen allerdings unter anderem die Präzision der Pipettierungen und können ebenfalls Folgeanwendungen behindern. verfolgt daher den nsatz, Verbrauchsmaterialien mit proteinabweisenden Oberflächeneigenschaften herzustellen, ohne dass diese eine kontaminierende Beschichtung aufweisen. Die Reaktionsgefäße und in Qualität bestehen aus hochwertigem Polypropylen und werden in einem speziellen Verfahren produziert. Dadurch wird die Bindung von an die Gefäßwand minimiert, so dass nahezu die gesamte Probe für die nalyse zur Verfügung steht. In den folgenden Experimenten werden die Deepwell Plates in Qualität mit Deepwell- Platten anderer bezüglich der Wiederfindungsrate von en verglichen. Desweiteren wird die Wiedergewinnung von en aus Tubes und low binding Gefäßen anderer untersucht. Ein weiterer Versuch verdeutlicht anhand einer massenspektrometrischen Folgeanwendung, wie sich unterschiedliche sraten von en auswirken können. Material und Methoden Bestimmung der Wiederfindungsrate von über Fluoreszenzmessung Die Bindung von en an Polypropylen wurde mittels Fluorescein-markiertem BS getestet. Für den Test mit Platten wurden die Deepwell Plates 9/1 µl und 3/ µl eingesetzt sowie Wettbewerbsprodukte des entsprechenden Formats. Jeweils vier Wells der Platten wurden mit lösung (Fluorescein-BS, 1 µg/ml) befüllt und für h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Gefäßtests wurden jeweils drei 1,5 ml Tubes sowie bzw. 5 Wettbewerbsprodukte des Formats 1,5 oder 1,7 ml verwendet und einmal für h und in einem zweiten nsatz für 9 h inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten während der Inkubation wurden Proben aus jeweils zwei Wells einer Platte bzw. aus allen Gefäßen entnommen und in eine schwarze 9-Well Flachboden-Platte überführt. Gemessen wurden die Proben aus den Platten im Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek) und die Proben aus den Tubes im Safire (Tecan). MLDI-TOF nalyse von Peptiden 1,3 µg/ml (1 pmol) und 13 ng/ml (1 pmol) des Peptids ngiotensin I wurden in H O gelöst und für eine Woche zum einen in Gefäßen und zum anderen in Standard Gefäßen im Kühlschrank gelagert. Danach wurden MLDI-TOF Spektren von jeweils 1 µl Probe aufgenommen.
pplication Note Seite 3 Ergebnisse und Diskussion Die ersten beiden bbildungen zeigen die Ergebnisse der -Inkubationsversuche in. Es ist zu erkennen, dass in den Deepwell Plates (bb. und 3) wesentlich weniger an die Gefäßwände adsorbiert als in Platten anderer aus Standardmaterial. Beispielsweise beträgt der Probenverlust nach h Lagerung in den Deepwell Plates 9/1 µl weniger als 5, während er in der Wettbewerbsplatte bei mehr als 5 liegt. bbildung 5 zeigt, dass die aus Tubes in dem Zeitraum zwischen h bis 9 h relativ stabil bleibt und sich auf einem Level von über 9 bewegt. Mögliche Bindungsstellen scheinen zu diesem Zeitpunkt schon abgesättigt zu sein. Bei den gefäßen S1 und liegt die Wiedergewinnungsrate in diesem Zeitraum um. Bei den weiteren drei getesteten low binding Gefäßtypen ist der nachweisbare anteil nach 9 h auf 3 bei S, bei und 19 bei F gesunken. Hier ist eine bwärtstendenz erkennbar, die darauf hinweist, dass sich die srate nach 9 h noch weiter reduzieren könnte. Der große nteil an, der durch die Bindung an die Gefäßoberfläche verloren geht, steht für die eigentlichen Experimente nicht mehr zur Verfügung. Durch die optimierte Oberfläche der Platten wird hingegen eine hohe der Proben erzielt, die so anschließend für nalysen eingesetzt werden können. Nach dem ersten Inkubationsexperiment für h in Gefäßen liegt die Wiedergewinnung von en aus Tubes bei knapp 9 während sich in den Gefäßen anderer zwischen 13 und 5 BS nachweisen lassen. In einem zweiten Test mit einer Inkubationszeit bis zu 9 h (bb. ) sollte überprüft werden, ob die verfügbare menge nach h weiter abnimmt. - 9-Well 1 µl Tubes - - -Tubes - h h 9-Well 1 µl Tubes h - Tubes - h - Tubes - h 1 1 1 11-9-Well 1 µl - 9-Well 1 µl 1 7 7 7 5 5 5 3 3 3 1 9-9-Well 1 µl - 9-Well 1 µl 9 9 1 1 9 1 7 1 5 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S1 S S1 S S1 S1 S S1 bbildung : srate von en nach Inkubation in 9-Well mit 1 µl Füllvolumen. S S bbildung : srate von en nach Inkubation für h in low binding Gefäßen. - 3-Well µl - Tubes - Tubes - h - h Tubes 9 -htubes - 9 h - Tubes - h 1 1 1 1 3-Well µl 1 1 9 1 9 9 - Tubes - 9 h - 3-Well µl - 9-Well 1 µl 9-Well 1 µl - 9-Well 1 µl 9 - gewinnung - 3-Well µl 1 7 7 7 1-9-Well 1 µl 9 1 1 7 5 5 3 1 7 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 G 5 5 5 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 7 7 1 G S1 S F S1 S G bbildung 3: srate von en nach Inkubation in G 3-Well mit μl Füllvolumen. 1 9 9 1 1 1 7 9 S S1 SS F S1 S1 S Wettbewerbe S1 1 F bbildung 5: srate von en nach Inkubation für 9 h in low binding Gefäßen.
pplication Note Seite Ergebnisse und Diskussion Die uswirkungen von Probenverlusten auf die nalyse von en und Peptiden werden für verschiedene massenspektrometrische Nachweismethoden dargestellt, für die während der Probenvorbereitung bzw. Lagerung Standardgefäße und Gefäße im Vergleich eingesetzt wurden []. In bb. ist ein Beispiel aufgeführt. Bei Einsatz eines Tubes weist a.l. 1 pmol nglotensin l bbildung : MLDI-TOF Massenspektrum nach der Lagerung von zwei unterschiedlichen Peptidkonzentrationen bei. (Quelle: Dr. S. Seeber und Dr.. Humeny, Institut für Biochemie, Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen). Der Pfeil markiert jeweils das Signal. a.l. 1 pmol nglotensin l Standardreaktionsgefäß Standardreaktionsgefäß 11 13 15 m/z 11 13 15 m/z die MLDI-TOF-nalyse von 1 pmol des Peptids ngiotensin I eine deutlich höhere Signalintensität auf als bei Verwendung von Gefäßen aus Standardmaterial. Wird die eingesetzte Peptidmenge auf 1 pmol reduziert, ist bei Verwendung von Standardgefäßen sogar keine nalyse mehr möglich. uch bei Kersten und Halder wurde der Einfluss der Gefäßoberfläche auf die Bindung von Peptiden untersucht. Die MLDI-TOF nalyse eines tryptischen Verdaus verschiedener e ergibt eine höhere Sequenzabdeckung sowie ein besseres Signal-Hintergrund-Verhältnis der Proben, die in den Gefäßen vorbereitet wurden, im Vergleich zu den Präparationen in konventionellen Gefäßen [7]. Die Daten zeigen, dass es sinnvoll ist, oberflächenoptimierte Gefäße einzusetzen, wenn es darum geht, kritische Probenverluste zu vermeiden. Die Produkte sind besonders gut für diese nwendungen geeignet. Die vorteilhaften proteinabweisenden Eigenschaften dieser Produkte zeigen sich auch bei der ufreinigung von Viren, deren Oberfläche mit en bestückt ist. In einer wissenschaftlichen Veröffentlichung ist ein Test beschrieben, bei dem Viren in neun verschiedenen Gefäßtypen bis zu 1 h inkubiert wurden. Dabei kam es bei acht Gefäßen zu einem zum Teil erheblichen Probenverlust durch dsorption, während die Viren nahezu vollständig aus den Gefäßen wiedergewonnen werden konnten []. Fazit Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass die Beschaffenheit der Gefäßoberfläche einen großen Einfluss auf die von proben hat. Der Einsatz der Platten und Gefäße führt zu deutlich verbesserten Wiederfindungsraten, insbesondere wenn nur geringe Mengen an usgangsmaterial zur Verfügung stehen. So können nalysen, die bei Einsatz von herkömmlichen Reaktionsgefäßen keine Ergebnisse erzielen, erfolgreich durchgeführt werden. Darüber hinaus führt die effiziente Nutzung von wertvollem Probenmaterial zur Zeit- und Kostenersparnis im Labor. Literatur [1] ndrade JD. Principles of protein adsorption. In ndrade JD (eds). Surface and interfacial aspects of biomedical polymers Vol.. New York: Plenum Press: 195; 1. [] Norde W, Haynes. S Symposium Series 1995; :. [3] Johnston TP. PD J Pharm Sci Technol 199; 5 (): 3 5. [] Duncan MR, Lee JM, Warchol MP. Int J Pharm 1995; 1:179. [5] Ding YS, Qin, Rabinow BE. Med Plastics Biomate Mag 199 July:. [] Tubes llgemeine technische Daten pplikationshinweise für Tubes (Bestell-Nr. 5.93-/7). [7] Kersten M, Halder T. Bioscience Technology September. [] Triliski EI, Lenhoff M. Journal of hromatography 7; 1: 13.
pplication Note Seite 5 Bestellinformationen Deepwell Plate Bezeichnung Farbe Verpackung Bestell-Nr. Deepwell Plate 3/ µl Normalpackung weiß Platten (5 Beutel à ) 3 5.11 Großpackung weiß 1 Platten (1 Beutel à ) 3 5.17 Deepwell Plate 9/5 µl Normalpackung weiß Platten (5 Beutel à ) 3 5.1 gelb Platten (5 Beutel à ) 3 5.119 Großpackung weiß 1 Platten (1 Beutel à ) 3 5.1 Deepwell Plate 9/1 µl Normalpackung weiß Platten (5 Beutel à ) 3 5. gelb Platten (5 Beutel à ) 3 5.1 Großpackung weiß Platten (1 Beutel à ) 3 5.3 Deepwell Plate 9/ µl Normalpackung weiß Platten (5 Beutel à ) 3 5.35 Safe-Lock Tubes Bezeichnung Bestell-Nr. Tubes PR clean, Beutel à 5 = 1 Stück,5 ml 3.9 1,5 ml 3.11,5 ml 3.13 Your local distributor: www.eppendorf.com/worldwide Vertrieb Deutschland GmbH Peter-Henlein Str. 539 Wesseling-Berzdorf Deutschland Tel: +9 3 - Fax: +9 3-155 E-mail: vertrieb@eppendorf.de www.eppendorf.de ustria GmbH Ignaz Köck Straße 1 1 Wien Österreich Tel: +3 1 913 - Fax: +3 1 9 13 - E-mail: office@eppendorf.at www.eppendorf.at Vaudaux- G Im Kirschgarten 3 1 Schönenbuch Schweiz Tel: +1 1 Fax: +1 1 19 E-mail: vaudaux@vaudaux.ch www.eppendorf.ch pplication Support Tel: +9 3 79 (Preis je nach Tarif im usland; 9 ct/min aus dem dt. Festnetz; Mobilfunkhöchstpreis ct/min) E-mail: support@eppendorf.com Safire ist eine Marke der Tecan Group Ltd. Synergy ist eine Marke von BioTek Instruments, Inc. Tubes, und eppendorf sind eingetragene Marken der G. lle Rechte vorbehalten, einschließlich der Graphiken und bbildungen. opyright 1 by G. Order No. WW 1/DE/PDF/11/NEUH