Einfluss technologischer Prozesse auf die Inaktivierung und Tenazität von Norovirus in Lebensmitteln Schrader et al., 2003 B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 1
Foodborne Viruses Virus Spezies Familie Genom Hülle Größe kultivierbar Erkrankung (nm) Norovirus Caliciviridae + ssrna 28 35 Gastroenteritis Sapovirus Caliciviridae + ssrna 28 35 Gastroenteritis Hepatitis A Picornaviridae + ssrna 27 32 + a Hepatitis Virus Hepatitis E + ssrna 32 34 Hepatitis Virus Gattung: Hepevirus Rotavirus Reoviridae dsrna 60 80 + Gastroenteritis Astrovirus Astroviridae + ssrna 28 30 + a Gastroenteritis Enterovirus Picornaviridae + ssrna 28 30 + a Poliomyelitis, Meningitis Adenovirus Adenoviridae dsdna 70 90 + a Gastroenteritis Frühsommer Flaviviridae + ssrna + 45 60 + a Meningoenzephalitis Meningo enzephalitis Virus a nicht alle Isolate sind kultivierbar; Wildstämme sind oftmals schwer zu kultivieren (Greening G.E., 2006) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 2
Caliciviridae Genera Norovirus Sapovirus Vesivirus Lagovirus Spezies: u. a. Humanes Norovirus, Murines Norovirus, Porzines Norovirus Spezies: u. a. Porcines EnteroSapovirus Spezies: u. a. Felines Calicivirus Spezies: u. a. Canines Calicivirus humanpathogen: tierpathogen: Norovirus und Sapovirus z. B. Felines Calicivirus, Porzines Norovirus, Murine Norovirus, Canines Calicivirus Einsatz von Felines Calicivirus und Murines Norovirus als Surrogat für Norovirus, da Zellkultur möglich! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 3
Norovirus Übertragung von Mensch zu Mensch, z. B. durch Aerosole oder fäkaloral durch kontaminierte Speisen z. B. Krabben, Muscheln, Salate, Dessert, Früchte (Himbeeren, Erdbeeren), Gemüse, Schinken, Quellwasser durch Wasser durch kontaminierte Gegenstände Kontamination von Lebensmitteln durch Abwässer (z. B. Muscheln, Früchte) oder durch Menschen Hygienemängel! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 4
Surveillance for Foodborne Disease Qutbreaks CDC, 2006 (MMWR 12. Juni 2009) lebensmittelassoziierte Krankheitsausbrüche 1 270 (foodborne disease outbreaks) Erkrankungen 27 634 Todesfälle 11 B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 5
Surveillance for Foodborne Disease Qutbreaks CDC, 2006 (MMWR 12. Juni 2009) Norovirus 11879 (43 %) Samonella 3393 (13 %) Clostridium perfingens 2077 (8 %) Staphylococcus Enterotoxin 659 (3 %) STEC 470 (2 %) Campylobacter 299 (1 %) Listeria 24 (< 1 %) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 6
Foodborne Viruses in Europe Network (FBVE) (seit 1999) Analysis of Integrated Virological and Epidemiological Reports of Norovirus Outbreaks Collected within the Foodborne Viruses in Europe Network from July 2001 to 30 June 2006 (Journal of Clinical Microbiology, 2008, 29592965) Foodborne NorovirusAusbrüche Deutschland Dänemark Spanien Finland Frankreich England/ Wales 2001 2002 74 21 43 55 9 485 2005 2006 2 135* 18 30 44 31 341 Foodborne NorovirusAusbrüche Ungarn Irland Italien Niederlande Norwegen Schweden Slowakei 2001 2002 92 0 1 59 0 7 6 2005 2006 62 128 3 120 22 26 25 * Es wurden nicht nur lebensmittelassoziierte Ausbrüche registriert! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 7
Gemeldete Viruserkrankungen in Deutschland 2006 2008 (Robert Koch Institut, Berlin) Virus Norovirus Erkrankungen 2006 2007 2008 75.840 201.222 211.250 foodborne 16 20 % (Europa) Hepatitis AVirus 1229 939 1064 5 % Hepatitis EVirus 51 73 101? FSME 546 238 283? Rotavirus 67.030 59.370 77.340 1 % B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 8
Noroviruserkrankungen in Deutschland 2001 2008 (Robert Koch Institut, Berlin, 2008) 250000 NorovirusErkrankungsfälle 200000 150000 100000 50000 0 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Jahr B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 9
4x Tupfer mit Noroviren kontaminiert Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 64 LFGB 00.00 111 Dez. 2007 Untersuchung von Lebensmitteln Qualitativer Nachweis von Noroviren der Genogruppe I und II auf glatten, festen Oberflächen von Lebensmitteln durch realtime RTPCR 5.3 Konventionelle RTPCR (Norovirus MONSystem) 5.1 Elution der Viren vom Tupfer (in 500 µl PBS) 5.2 RNAExtraktion (QIAamp Viral RNA mini Kit) Eluat < 60 µl 20 µl 10 µl 520 µl Thermocycler (Eppendorf) Agarosegelelektrophorese 5.5 Konventionelle RTPCR (Amplifikationskontrolle MS2) LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) oder ABI 7500 (Applied Biosystems) oder 5.4 RealTime RTPCR (Norovirus GII) Rotorgene 3000 (Corbett Research) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 10
AiFVorhabenNr. 15215 (FEI) (2007 2009) Einfluss technologischer Prozesse auf die Inaktivierung und Tenazität von Norovirus in Lebensmitteln B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 11
Aspekte des Forschungsprojektes Einsatz von humanem Norovirus GG II.3 Entwicklung einer realtime RTPCR zum quantitativen Nachweis von Norovirus GG II Nachweis intakter Viruspartikel! Verifizierung falsch negativer und falsch positiver PCR Ergebnisse Vergleichbarkeit der CtWerte verschiedener PCRLäufe durch CAmpER und DARTAlgorithmus Wiederfindung im Lebensmittel (Sensitivität der Methode) Protektive Effekte von Lebensmitteln und dessen Einfluss auf die Inaktivierung Ziel: Aussage zur Inaktivierung von Norovirus in verschiedenen LMn B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 12
Status NV in LM Anzahl inokulierter Viren im LM Lebensmittelspezifische Matrixeffekte Prozesskontrolle mit MS2Phagen (Dreier et al., 2005) Anzahl Viren nach technologischem Prozess Protektive Wirkung der LM Realtime RTPCR Quantifizierung Realtime RTPCR Quantifizierung Inokulation der Lebensmittel mit einem NVIsolat aus Stuhlproben einer erkrankten Person (GGII.3) Lebensmitteltechnologische Prozesse Erhitzung Kühlung Einfrieren Säuerung Reifung B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 13
Inaktivierung freier RNA im Untersuchungsansatz durch RNAse Nachweis intakter Norovirus Capside möglich! Nachweis infektiöser Noroviren nicht möglich! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 14
Inaktivierung / Tenazität von NV: Vergleich von unbehandelten Lebensmittelproben mit behandelten Lebensmittelproben (vor und nach physikochemischer Behandlung) Ketchup Nudelsalat Hackfleisch Apfel Himbeeren Salat Produkt Tiefkühlpizza PizzaBaguette Zigeunersoße Kartoffelsalat Produktbehandlung Erhitzung, 200 C, 12 min Einfrieren, 19 C, 7 d Einfrieren, 19 C, 14 d Erhitzung, 220 C, 15 min Kühlung, 6 C, 58 d, ph = 4.5 Erhitzung, 74 C, 1 min, ph = 5.0 5.5 Kühlung, 6 C, 24 d Kühlung, 6 C, 24 d Erhitzung (braten), 200 C, 30 min Erhitzung (kochen), 100 C, 30 min Einfrieren, 19 C, 8 d Kühlung, 6 C, 2 d Kühlung, 11 C, 7 T Einfrieren, 19 C, 14 T Kühlung, 11 C, 5 T NV Reduktion [log 10 ] (Signifikanz p<0.05) > 4 (s.) 0.4 (n. s.) 1 (n. s.) 0.5 (n. s.) 0.4 (n. s.) 1.7 (s.) 0.5 (n. s.) 1.6 (s.) > 7 (s.) 0.2 (n. s.) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 15 3 (s.) 0 0? 0.1 (n. s.)
The efficacy of preservation methods to inactivate foodborne viruses (L. Baert et al., 2009) Virus Log 10 reduction Reference Hitze HAV Milk 5 Bidawid et al. 2000 Strawberry 1 Deboosere et al. 2004 Poliovirus Milk 3 Strazynski et al. 2002 Calicivirus MNV1 Raspberry puree 1,8; 2,8 Baert et al. 2008 Hochdruck HAV Oysters 3 Calci et al. 2005 Sausage 3,2 Sharma et al 2008 Calicivirus FCV Sausage 2,9 Sharma et al 2008 Bestahlung (UV) HAV Salat, Erdbeeren, Frühlingszwiebeln 4,3; 1,3; 4,2; Fino and Kniel (2008) Calicivirus FCV und CaCV Salat, Erdbeeren Frühlingszwiebeln 3,5; 1,1; 2,5; Fino and Kniel (2008) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 16