Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit Einfluss auf Entwicklung und Erhalt des Knorpel-/Knochen-Systems

Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit Einfluss auf Entwicklung und Erhalt des Knorpel-/Knochen-Systems Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen- Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Andreas Tagariello aus Wuppertal Erlangen, 2005

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 21.12.2005 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. A. Winterpacht Zweitberichterstatter: PD Dr. R. Slany

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung.. 1 1.1 Knorpel- und Knochenentwicklung.. 1 1.1.1 Enchondrale Ossifikation am Beispiel von Röhrenknochen.... 2 1.1.2 Desmale Ossifikation am Beispiel der Schädeldachknochen. 7 1.2 Erkrankungen des Knorpel-/Knochen-Gewebes... 10 1.2.1 Chondrodysplasien. 10 1.2.2 Kraniosynostosen... 11 1.2.3 Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis.... 13 1.3 Zielsetzung.. 17 2. Material und Methoden.. 18 2.2 Isolierung von DNA... 18 2.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Blut. 18 2.2.2 Alkalische Lyse zur Mini-Präparation von Plasmid-DNA. 18 2.2.3 Midi- und Maxi-Plasmid-DNA-Präparation mit Hilfe einer Affinitätssäule.. 19 2.3 Isolierung von RNA... 20 2.3.1 Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellkulturen. 20 2.3.2 Isolierung von RNA aus menschlichem und murinem Gewebe.. 20 2.3.3 DNase I-Behandlung von RNA.... 20 2.4 RNA- und DNA-Standardmethoden... 21 2.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen..... 21 2.4.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA und RNA... 21 2.4.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen.... 21 2.4.4 Fällung von DNA und RNA... 21 2.5 Klonierung 22 2.5.1 Klonieren von PCR-Produkten..... 22 2.5.2 Subklonierung von DNA-Fragmenten. 22 2.5.3 Transformation und Selektion positiver Klone... 23 2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR). 23 2.7 RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion).... 24 2.8 RACE (Rapid Amplification of cdna Ends). 24 2.9 Quantitative Real-Time -PCR 24 2.10 Random primed oligo labelling.. 25 2.11 Ligation von T7-Promotoren an PCR-Produkten.. 26 2.12 DIG-RNA-Labelling durch in vitro-transkription... 26 - II -

Inhaltsverzeichnis 2.13 DNA-RNA-Hybridisierung (Northern-Hybridisierung).. 27 2.14 DNA-RNA-Hybridisierung (Dot-Blot-Hybridisierung) 27 2.15 DNA-DNA-Hybridisierung. 27 2.16 DNA-Sequenzierung.. 28 2.17 RNA-in situ-hybridisierung von Gewebeschnitten... 28 2.18 Fluoreszenz-in situ-hybridisierung (FISH).. 29 2.18.1 Nicktranslation für direkt markierte Sonden... 29 2.18.2 Herstellung und Vorbehandlung der Chromosomenpräparate... 30 2.18.3 Denaturierung und Hybridisierung... 31 2.18.4 Posthybridisierungswaschung.. 31 2.19 Zellbiologische Methoden... 31 2.19.1 Kultur von adhärent wachsenden Zellen 31 2.19.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen.... 32 2.19.3 Transfektion von adhärenten Zellen... 32 2.20 Computerauswertungen. 32 2.20.1 Computerauswertung einer cdna-bibliothek.... 32 2.20.2 Computerauswertung von DNA- und Protein-Sequenzen... 33 2.21 Reagenzien und Materialien... 34 2.21.1 Puffer und Lösungen.. 34 2.21.2 Eukaryontische Zellen 36 2.21.3 Chemikalien, Enzyme, Molekulargewichtsstandards, Zellkulturmedien.. 36 2.21.4 Geräte... 38 2.21.5 Kits.... 39 2.21.6 Synthetische Oligonukleotide 39 3. Ergebnisse 45 3.1 Erstellung eines Expressionsprofils fetaler Wachstumsfugenchondrozyten mittels EST-Sequenzierung und funktioneller Charakterisierung ausgewählter Kandidatengene.. 45 3.1.1 Bioinformatische Auswertung von ESTs unter Zuhilfenahme des Datenbankanalysetools ESTsweep.. 3.1.2 Systematische Einteilung der ausgewerteten ESTs. 47 3.1.3 Bioinformatische Auswertung von ESTs der Klasse 1... 49 3.1.3.1 Funktionelle Einteilung der ESTs.. 49 3.1.3.2 Expressionsstärke der Gene. 50 3.1.3.3 Expressionsstärke bekannter Matrix auf- und abbauender Proteine. 51 45 - III -

Inhaltsverzeichnis 3.1.4 Charakterisierung von ESTs der Klasse 2 und Klasse 3.... 54 3.2 Charakterisierung des Klons 68F08.. 55 3.3 Charakterisierung des Klons 19C12.. 58 3.4 Charakterisierung des Klons 86H12 (ECM3)... 61 3.4.1 Sequenzierung der humanen ECM3-cDNA... 62 3.4.2 Analyse der Expression des humanen ECM3-Gens.... 63 3.4.3 ECM3 in anderen Spezies.... 66 3.4.4 ECM3 Expression in Knorpel von Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis. 68 3.4.4.1 Etablierung der Real-Time -PCR.... 69 3.4.4.2 Expressionsanalyse von ECM3 an Knorpelbiopsaten von Osteoarthrose-Patienten.... 71 3.4.4.3 Expressionsanalyse von ECM3 an Knorpelbiopsaten von Patienten mit rheumatoider Arthritis..... 72 3.4.5 ECM3 als positionelles Kandidatengen für die Frontometaphysäre Dysplasie.. 73 3.5 Suche nach Kandidatengenen für Kraniosynostosen..... 75 3.5.1 Patientenbeschreibung.. 75 3.5.2 Zytogenetische Untersuchung.. 77 3.5.3 Bruchpunktbestimmung. 78 3.5.4 Eingrenzung des Bruchpunktes... 78 3.5.5 SOX6 als Kandidat für Kraniosynostosen... 80 3.5.6 ARM1 als Kandidat für Kraniosynostosen.. 84 3.5.7 Bruchpunktcharakterisierung auf Chromosom 9q33.1..... 88 4. Diskussion 91 4.1 Analyse von EST-Klonen aus einer humanen ChondrozytencDNA-Bibliothek. 93 4.1.1 Systematische Einteilung der ausgewerteten ESTs. 93 4.1.2 Detaillierte Analyse und Charakterisierung von ECM3 (86H12).... 102 4.1.2.1 Expression und mögliche Funktion des humanen ECM3. 106 4.1.2.2 ECM3 in anderen Spezies. 107 4.1.2.3 ECM3-Expression in Knorpelbiopsaten von Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis..... 109 4.1.2.4 ECM3 als positioneller Kandidat für Frontometaphysäre Dysplasie... 112 4.2 Kandidatengene für die Kraniosynostose... 113 4.2.1 Bruchpunktregion 11p15.2.... 115 - IV -

Inhaltsverzeichnis 4.2.2 Die Bruchpunktregion 9q33.1... 119 5. Zusammenfassung....... 123 6. Summary.......... 125 7. Literaturverzeichnis 127 8. Anhang.. 149 8.1 mrna-sequenz von Klon 68F08 149 8.2 mrna-sequenz von Klon 19C12... 150 8.3 mrna-sequenz von Klon 86H12 (ECM3). 150 8.4 Sequenz der bruchpunktüberlappenden PCR zur Validierung des Bruchpunktes beim untersuchten Kraniosynostose- Patienten... 151 8.5 Danksagung..... 152 8.6 Lebenslauf 153 8.7 Veröffentlichungen... 154 - V -

Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Abb. 1.1: Schematische Darstellung der enchondralen Ossifikation. 3 Abb. 1.2: Alkalische Phosphatase/Safranin O Färbung und schematische Darstellung der Wachstumsfuge. 5 Abb. 1.3: Schädelformationen. 8 Abb. 1.4: Histologische und schematische Darstellung der Schädelnähte. 10 Abb. 3.1: Exemplarisches ESTsweep -Ergebnis eines ESTs. 46 Abb. 3.2: Übersicht der prozentualen Klassenverteilung der analysierten ESTs. 47 Abb. 3.3: Funktionelle Einteilung der bekannten Gene ( Klasse 1 ). 49 Abb. 3.4: Abb. 3.5: Funktionelle Einteilung und prozentuale Verteilung der ESTs, die der Klasse der bekannten Gene zugewiesen wurden. Häufigkeit der ESTs, die Gene unterschiedlicher extrazellulärer Matrix-Proteine repräsentieren. 50 52 Abb. 3.6: Verteilung der ESTs auf Gene matrixabbauender Proteine. 53 Abb. 3.7: Abb. 3.8: Abb. 3.9: Auswahlkriterien zur Bestimmung der Kandidatengene für weitere experimentelle Analysen. Autoradiogramm eines Human Multiple Tissue Northern-Blots (Clontech), der mit einer radioaktiv markierten 68F08-Sonde hybridisiert wurde. Graphische Auswertung der Dot-Blot-Analysen zur Bestimmung der Expressionsstärke des murinen Gens 68F08. 54 55 56 Abb. 3.10: Putative Proteinstruktur des Gens 68F08. 56 Abb. 3.11: Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des humanen und murinen 68F08-Proteins. 55 Abb. 3.12: Struktur des humanen 19C12-Gens. 59 Abb. 3.13: Abb. 3.14: Das Autoradiogramm eines Human Multiple Tissue Northern- Blots zur Expressionskontrolle von 19C12. Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des humanen und murinen 19C12-Gensproduktes. 60 61 Abb. 3.15: Strategie zur Komplettierung von ECM3 (rot dargestellt). 62 - VI -

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Abb. 3.16: Genomische-Struktur des humanen ECM3-Gens. 63 Abb. 3.17: Abb. 3.18: Abb. 3.19: Abb. 3.20: Abb. 3.21: Abb. 3.22: Abb. 3.23: Autoradiogramm der Hybridisierung eines Human Multiple Tissue Northern (MTN)-Blot, mit einer radioaktiv markierten ECM3-Sonde. Das Autoradiogramm eines humanen Multiple Tissue Expression Array, der mit der radioaktiv markierten ECM3- Sonde hybridisiert wurde. Percent identity plot (PIP). Interspezies-Vergleich mittels PipMaker zur Identifizierung von orthologen Genen zu ECM3. Amplifikationsgraphen, Standardkurven und Effizienzgeraden für ECM3 und B2M. Relative ECM3-Expression in Knorpelgewebe von Patienten mit Osteoarthrose im Vergleich zu Plazenta-Gewebe. Relative ECM3-Expression in Knorpelgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis bezogen auf Plazenta-Gewebe. FISH-Analysen mit den BAC-Klonen RP11-846A22 + RP11-177H12 (linke Seite) und RP11-846A22 + CTD-2565C16 (rechte Seite) an Metaphasen von Fibroblasten der Patientin. 64 65 67 70 72 73 74 Abb. 3.24: Kopfaufnahme des an Kraniosynostose erkrankten Patienten. 76 Abb. 3.25: Schädel-Röntgenaufnahmen des untersuchten Kraniosynostose-Patienten. 76 Abb. 3.26: Karyogramm des am Crouzon-Syndrom erkrankten Patienten. 77 Abb. 3.27: Southern-Blot zur Eingrenzung des Bruchpunktes. 79 Abb. 3.28: Bruchpunktüberspannende PCR an Patienten- (unten) und Kontroll-DNA (oben). 80 Abb. 3.29: Bruchpunktregion im Chromosomenbereich 11p15.2 (Darstellung aus USCS-Datenbank). 81 Abb. 3.30: Abb. 3.31: Abb. 3.32: RNA-in situ-hybridisierung an transversalen Schnitten durch den Schädel einer neugeborenen Maus. Mutiples Alignment der putativen Proteinsequenz von ARM1 und den homologen Proteinen der verschiedenen Spezies. Das Autoradiogramm einer Northern-Analyse mit verschiedenen murinen Geweben zur Expressionskontrolle von Arm1. 83 84 85 - VII -

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Abb. 3.33: Abb. 3.34: Abb. 3.35: RNA-in situ-hybridisierung an transversalen Kopfschnitten einer neuge-borenen Maus. RNA-in situ-hybridisierung an Paraffinschnitten von arthrotischem Gelenkknorpel beim Menschen. Ausschnitt der Bruchpunkt umgebenden chromosomalen Region 9q33.1 (USCS). 87 88 89 Abb. 3.36: Interspezies-Vergleich mittels Percent identity plot (PipMaker). 90 Abb. 4.1: Abb. 4.2: Abb. 4.3: Abb. 4.4: Abb. 4.5: Abb. 4.6: Abb. 4.7: Abb. 4.8: Verteilung der 1693 Gene (EST-Cluster), die der Klasse 1 und der Klasse 2 zugeordnet wurden, in Abhängigkeit ihrer Häufigkeit in den EST-Datenbanken (NCBI, blaue Balken). Graphische Darstellung des Ergebnisses der SignalP 3.0 -Auswertung zur Bestimmung von Signalpeptiden in der Proteinsequenz von ECM3. Multiples Alignment der Leucin-reichen Repeats (LRRs) von ECM3. Graphische Darstellung des Ergebnis der NetNGlyc 1.0 Server (Expasy) Auswertung zur Bestimmung von Bindungsstellen für N-gebundene Oligosaccharide in der Proteinsequenz von ECM3. Alignment der putativen Aminosäuresequenzen von ECM3 zwischen Mensch und Hund. Percent identity plot (PIP). Interspeziesvergleich des ECM3- Gens zwischen Mensch und Rind mittels PipMaker. Evolutionäre Verbindung zwischen einzelnen Spezies der Klasse der Mammalias. Schematische Darstellung der genomischen Organisation und der Proteinstruktur von SOX6 (Spleißvariante 1). 101 103 104 105 108 108 109 116 Verzeichnis der Tabellen Tab. 1.1: Zeitpunkt der Verknöcherung der Schädelnähte und Fontanellen beim Menschen. 8 Tab. 1.2: Übersicht der Häufigsten syndromalen Kraniosynostosen. 12 Tab. 3.1: Exemplarische Darstellung der Auswertung einiger ESTs. 48 - VIII -

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Tab. 3.2: Funktionelle Einteilungen der schwach-, mittel- und hochexprimierten Gene der Klasse 1. 50 Tab. 3.3: Liste der zehn am stärksten exprimierten Gene der Klasse bekannte Gene. 51 Tab. 3.4: ESTs des UniGene-Clusters Hs.442169. 61 Tab. 3.5: Patientenkollektive, die zur Überprüfung einer Beteiligung von ECM3 an der Pathogenese von Osteoarthrose und rheumatoider Arthritis herangezogen wurden. 68 Tab. 3.6: Zusammenfassung der Ergebnisse der Mutationsanalyse. 81 Tab. 4.1: Humane Knorpel-cDNA-Bibliotheken bei UniGene. 92 Tab. 4.2: Prozentuale Anteile der Kollagene in cdna-bibliotheken unterschiedlicher Knorpelstadien. 96 - IX -

Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis C Grad Celsius µ Mikro (10-6 ) 3 -UTR 3 -untranslatierte Region 5 -UTR 5 -untranslatierte Region A Adenin A.bidest Aqua bidestillata Abb. Abbildung AS Aminosäure bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Cytosin c Zenti (10-2 ) cdna komplementäre DNA Ci Curie cpm counts per minute C-terminal carboxy-terminal Cys Cystein ddntp 2,3 -Didesoxynucleosid-5 -triphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dntp 2 -Desoxynucleosid-5 -triphosphat DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EST expressed sequence tag G Guanin g Erdbeschleunigung g Gramm h Stunde H 2 O Wasser His Histidin IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid k Kilo (10 3 ) kb Kilobasenpaare kda Kilodalton l Liter M molar m Meter m Milli (10-3 ) mb Megabasenpaare min Minute mrna messenger Ribonukleinsäure MOPS 3-(N-morpholin)propansulfonsäure n Nano (10-9 ) N-terminal amino-terminal OD optische Dichte - X -

Abkürzungsverzeichnis ORF open reading frame p Piko (10-12 ) PBS phosphate buffered saline -Puffer PCR polymerase chain reaction ph negativer dekadischer Logarithmus der H + -Ionen-Konzentration RACE rapid amplification of cdna ends RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm rounds per minute RT Reverse Transkriptase RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction s Sekunde SDS Natriumdodecylsulfat SSC standard saline citrate -Puffer SSW Schwangerschaftswoche T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer U units (Enzymeinheiten) UV ultraviolett V Volt vgl. vergleiche Vol. Volumen - XI -

Einleitung 1. Einleitung Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts sind verantwortlich für eine Reihe menschlicher Erkrankungen, deren molekulare Ursachen aufgrund des schwer verfügbaren menschlichen Knorpelmaterials nur unzureichend aufgeklärt sind. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die an der Knorpel- und Knochenentwicklung beteiligt sind, sowohl von entwicklungsbiologischer, als auch von medizinischer Seite von großer Bedeutung. Wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese humaner Erkrankungen, sowie zur Aufklärung molekularer Vorgänge bei Entwicklungsprozessen liefert die Identifizierung und Charakterisierung differentiell exprimierter Gene. Zur Identifizierung solcher Gene werden Hochdurchsatzmethoden wie EST- Sequenzierung (Adams et al., 1991), SAGE (Serial analysis of gene expression, Velculescu et al., 1999) oder cdna-mikroarraytechnologie (Schena et al., 1995) angewendet. Während es mit SAGE und cdna-mikroarraytechnologie nur eingeschränkt möglich ist, unbekannte Gene zu charakterisieren, liegt der große Vorteil der EST-Sequenzierung darin, Sequenzinformationen über unbekannte Transkripte zu erhalten und so mögliche neue Gene identifizieren zu können. Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Genen der Knorpel- und Knochenentwicklung ist durch die gezielte Untersuchung von Patienten mit genetisch-bedingten Knorpel-/Knochendeffekten und die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Ursachen möglich. Die Aufklärung der den Genveränderungen übergeordneten Signalkaskaden und komplexer Gennetzwerke, unter Verwendung beider Ansätze, wird nicht nur dazu führen, die genetische Diagnostik für Erkrankungen zu verbessern, sondern wird helfen, Strategien zur Prävention und Therapie von Knorpel- und Knochenerkrankungen zu entwickeln. 1.1 Knochen und Knorpelentwicklung Das Skelettsystem entwickelt sich aus Mesenchymzellen und lässt sich in drei Anteile unterschiedlichen embryonalen Ursprungs aufteilen (Karsenty, 1998). Das kraniofaziale Skelett entwickelt sich u.a. aus Neuralleistenzellen und ist somit neuroektodermaler Herkunft (Helms und Schneider, 2003). Vom Mesoderm hingegen leitet sich sowohl das Achsenskelett (gebildet aus den Sklerotomzellen der Somiten) als auch das Extremitätenskelett (gebildet aus den Zellen des - 1 -

Einleitung Lateralplattenmesoderms) ab. Bei der Entwicklung des Skeletts und dem Aufbau seiner unterschiedlichen Funktionsstrukturen lassen sich mehrere Entwicklungsphasen unterscheiden. In der Phase der Musterbildung kommt es zur Kondensation mesenchymaler Zellen und es entsteht ein Modell des Stützapparates. In der sich anschließenden Phase der Morphogenese, welche die Prozesse der Organogenese und Histogenese umfasst, kommt es zur Gestalt- und Formentwicklung der einzelnen Skelettelemente. Dabei differenzieren sich die mesenchymalen Vorläuferzellen zu Chondrozyten bzw. Osteoblasten und Osteoklasten und es kommt zur Einwanderung von Blutgefäßen in die resultierenden Knorpel- bzw. Knochengewebe. Den Abschluss bildet die Phase der Homöostase, in der die Knochensubstanz durch kontinuierlichen Auf- und Abbau erneuert, ihre Form und Größe im Wesentlichen aber nicht mehr verändert wird. Die Knochenbildung kann durch zwei verschiedene Mechanismen vonstatten gehen: Bei der intramembranösen (desmalen) Ossifikation, die auf die Entstehung der flachen Schädelknochen, der lateralen Clavicula und der Mandibula begrenzt ist, differenzieren die mesenchymalen Vorläuferzellen direkt zu knochenproduzierenden Osteoblasten. Im Gegensatz dazu verläuft im axialen Skelett, sowie in den Extremitäten die Osteogenese über Knorpelanlagen, die ein Modell des späteren Skeletts ausbilden und sekundär durch Knochen und Knochenmark ersetzt werden. Dieser Prozess wird als enchondrale Ossifikation bezeichnet. Nach der Musterbildung die räumlich-zeitliche Anordnung embryonaler Zelltypen, die zu einem Modell des Skelettsystems mit definierter Form, Lage und Zahl der Einzelelemente führt (Coates,1994; DeLise et al., 2000; Pizette und Niswander, 2001; Mariani und Martin, 2003) schließen sich die Morphogenese- und Wachstumsphase an. 1.1.1 Enchondrale Ossifikation am Beispiel von Röhrenknochen Bei der enchondralen Ossifikation kommt es zunächst zu einer Kondensation undifferenzierter mesenchymaler Vorläuferzellen. Ausgelöst wird diese durch den Transkriptionsfaktor SOX9 (Kypriotou et al., 2003), wobei die Randzellen das Perichondrium bilden, das die Knorpelelemente umschließt (Kronenberg, 2003). Die Vorläuferzellen differenzieren zu Chondrozyten (Abb. 1.1), proliferieren und beginnen eine extrazelluläre Matrix (ECM) aus Proteinen wie z.b. Kollagene Typ II, IX und XI, den Proteoglykanen Aggrekan, Decorin und Biglykan, sowie den nicht-kollagenösen - 2 -

Einleitung Proteinen MGP (matrix GLA protein) und COMP (cartilage oligomeric matrix protein) (Mundlos, 1994; de Crombrugghe et al., 2000) auszubilden. Abb. 1.1: Schematische Darstellung der enchondralen Ossifikation. (A, B) Mesenchymale Zellen kondensieren und differenzieren zu Chondrozyten. Die Chondrozyten proliferieren und bilden die extrazelluläre Matrix. (C) Chondrozyten im Zentrum des Schafts werden hypertroph und mineralisieren die extrazelluläre Matrix bis sie durch Apoptose absterben. (D, E, F) In die frei werdenden Lakunen wandern Blutgefäße ein, die von Osteoblasten und Chondro-/Osteoklasten begleitet werden. Chondro- / Osteoklasten resorbieren den Knorpel, Osteoblasten ersetzen ihn durch die primäre Spongiosa. Es bildet sich ein primäres Ossifikationszentrum. (G, H) An den Epiphysen entstehen sekundäre Ossifikationszentren. Das Längenwachstum der Röhrenknochen wird durch die dazwischenliegende Wachstumsfuge reguliert. Verändert nach: Gilbert, Developmental Biology, 6th Edition, Sinauer Associates, 2000, Seite 456. Die extrazelluläre Matrix besitzt primär mechanische Funktionen und bildet ein Grundgerüst zur Anheftung der Zellen. Darüber hinaus ist dieses Netzwerk aus Makromolekülen gerade während der Entwicklung wichtig für den komplexen Wachstums- und Differenzierungsprozess (Adams und Watt, 1993; Hay, 1993; Lin und Bissell, 1993). Im weiteren Verlauf der Entwicklung gehen die Chondrozyten in den hypertrophen Zustand über (Abb. 1.1), beenden die Proliferation und beeinflussen die Mineralisierung der Knorpelmatrix, die Angiogenese und die chemotaktische Anziehung von Osteoklasten und Osteoblasten, bis sie letztendlich in die Apoptose übergehen (Gerber et al., 1999, Gerber und Ferrara, 2000). Durch diese Prozesse bildet sich in der Diaphyse (Knochenschaft) unterstützt durch eine sich kontinuierlich verdickende Knochenmanschette (perichondrale Ossifikation) ein primäres Ossifikationszentrum (Abb. 1.1), und später in der Embryonalentwicklung in den Epiphysen je ein weiteres sekundäres Ossifikationszentrum. Zwischen den beiden Ossifikationszentren werden die Stadien - 3 -

Einleitung der Chondrozytendifferenzierung in einem immer schmaler werdenden Streifen (Wachstumsfuge) konzentriert, die im Weiteren das Längenwachstum der Röhrenknochen reguliert. Der Aufbau der Wachstumsfuge kann in klar definierte Zonen eingeteilt werden (Abb.1.2), die durch Chondrozyten in verschiedene Differenzierungsstadien in distalproximaler Richtung definiert werden (Abb. 1.2). Distal liegt die Ruhezone. Die Chondrozyten dieser Zone dienen als Reservoir für die nachfolgende Proliferationsund Differenzierungszone (Abad et al., 2002). In der Proliferationszone teilen sich die Chondrozyten, ordnen sich säulenförmig an und beginnen mit der Expression und Sekretion von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (Ballock und O'Keefe, 2003). Im weiteren Verlauf der Differenzierung nimmt die Teilungsfähigkeit der Chondrozyten ab, diese hypertrophieren (hypertrophe Zone) und beginnen Kollagen Typ X, alkalische Phosphatase, Annexin II, V, und VI und die Matrix Metalloproteinase-13 zu sezernieren (Anderson, 1995; Kirsch et al., 1997; Johansson et al., 1997; Kirsch et al., 2000; Pfander et al., 2001). Weiter proximal wird die Interzellulärmatrix durch aktiven Kalziumtransport aus den Zellen mineralisiert (Wu et al., 1997). Diese Mineralisation findet nicht diffus statt, sondern beginnt an membranumhüllten Matrixvesikeln, die sich in den longitudinalen Septen befinden. Die Membranen platzen daraufhin auf und es kommt zu weiteren Anlagerungen von Mineralsalzen bis die gesamten Septen mineralisiert sind. Diese Septen bilden die Grundlage der ersten Spongiosabälkchen. Nun beginnt das Einwandern von Gefäßen. Durch die Kapillarwand dieser Gefäße gelangen Makrophagen, die noch nicht mineralisierte longitudinale Septen abbauen. Gleichzeitig werden zwei Drittel der schon mineralisierten Septen durch Chondroklasten abgebaut. An den Rest der longitudinalen Septen lagern sich Osteoblasten an, die sich aus dem perivaskulären Bindegewebe differenzieren. Dieser Prozess führt zum kontinuierlichen Längenwachstum des Knochens. Im Laufe der Pubertät nimmt die Proliferationsrate der Chondrozyten immer weiter ab (Weise et al., 2001) und die Wachstumsfuge wird schmaler, bis die Epiphyse und die Metaphyse verschmelzen und das Längenwachstum abgeschlossen ist. Der zentrale Regulationsmechanismus der Chondrozytendifferenzierung basiert wesentlich auf der Indian-hedgehog-(Ihh)/parathyroid-related-Protein-(PTHrP)- Feedback Schleife (Shum und Nuckolls, 2002; Ballock und O Keefe 2003; Kronenberg, 2003). Das von den Zellen der periartikulären Zone der Röhrenknochen und des Perichondriums sezernierte PTHrP wird über dessen Rezeptor (PTHrP1) - 4 -

Einleitung von Chondrozyten der prähypertrophen- und der proliferierenden-zone erkannt (Lanske et al., 1996). Dies wirkt der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten entgegen (Vortkamp et al., 1996). Ruhezone proliferierende Chondrozyten prähypertrophe Chondrozyten hypertrophe Chondrozyten terminale hypertr. Chondrozyten Knochen Abb. 1.2: Alkalische Phosphatase/Safranin O Färbung und schematische Darstellung der Wachstumsfuge. Linke Abbildung modifiziert nach Shum und Nuckolls, 2002; rechte Abbildung modifiziert nach Zabel und Winterpacht, 2002. Reicht die PTHrP-Konzentration aufgrund zunehmender Distanz zu der periartikulären Region nicht mehr aus, differenzieren die prähypertrophen Zellen zu hypertrophen Chondrozyten und exprimieren IHH. IHH wirkt über seine Rezeptoren (patched und gli), die überwiegend im Perichondrium exprimiert werden, wieder expressionsaktivierend auf PTHrP (Vortkamp et al., 1996). Ein Repressor der Wirkung von IHH ist TGF-ß, welches in der periartikulären Zone der Röhrenknochen und des Perichondriums exprimiert wird und die Synthese von PTHrP steigert (Serra et al., 1999; Alvarez et al., 2001). TGF-ß kann jedoch auch direkt die Hypertrophie der Chondrozyten verhindern (Ballock et al., 1993), indem es die Expression von Kollagen Typ X und der alkalischen Phosphatase inhibiert (Ballock et al., 1993; Bohme et al., 1995; Ferguson et al., 2000; Pateder et al., 2001). Es gibt darüber hinaus eine Reihe weiterer Signalmoleküle, die die Chondrozytendifferenzierung entweder direkt oder indirekt über die IHH/PTHrP-Feedbackschleife modulieren. Ein Beispiel stellen die FGFs (fibroblast growth factors) mit ihren vier FGF-Rezeptoren (FGFR1-4) dar. Eine über FGF3 und der JAK-STAT1- Signaltransduktionskaskade getriggerte Inhibition von IHH beschleunigt die Proliferation der Chondrozyten und dadurch die Hypertrophie der Chondrozyten - 5 -

Einleitung (Sahni et al., 1999). Antagonistisch zu den FGFs wirken die BMPs (bone morphogenetic proteins), die die Chondrozyten-Proliferation direkt aktivieren und somit der terminalen Differenzierung entgegenwirken, was zusätzlich durch eine BMP-induzierte Expressionssteigerung von IHH unterstützt wird (Minina et al., 2001; Minina et al., 2002). Noggin und Chordin fördern durch die Blockierung von BMP wiederum die terminale Differenzierung der Chondrozyten (Pathi et al., 1999; Zhang et al., 2002). In den verschiedenen Phasen der Skelettentwicklung (mesenchymale Kondensation) spielen Mitglieder der SOX (Sry-related HMG Box)-Familie ein wichtige Rolle. Die SOX-Proteine gehören zu einer Klasse von Transkriptionsfaktoren, der eine HMG (high-mobility-group)-domäne gemeinsam ist. Bis heute wurden ca. 30 SOX- Proteine identifiziert (Wegner, 1999). Es hat sich gezeigt, dass neben SOX9, das die Differenzierung der kondensierten mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten einleitet (Ng et al., 1997), die Proliferation der Chondrozyten steigert und Elemente der PTHrP-IHH-Signaltransduktion moduliert (Bell et al., 1997; Lefebvre et al., 1998; Smits et al., 2001), auch L-SOX5 und SOX6 essentielle Funktionen bei der Chondrozytendifferenzierung innehaben (Smits et al., 2001). L-SOX5 und SOX6 werden gemeinsam mit SOX9 während der Differenzierung der kondensierten mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten co-exprimiert und aktivieren gemeinsam die Expression von Kollagen Typ II (Lefebvre et al., 1998, Smits et al., 2001). Sox6 oder L-Sox5 defiziente Mäuse (L-Sox5 -/- oder Sox6 -/- ) zeigen nur minimale Knorpeldefekte, wohingegen L-Sox5 -/- -Sox6 -/- -Doppel-knockout-Mäuse im Embryonalstadium 16,5 (E16,5) mit schweren Knorpel/-Knochendeffekten sterben (Smits et al., 2001). Anhand von 3NA-Mäusen (Mäuse mit drei Null-Allelen, L-Sox5 -/-, Sox6 +/- oder L- Sox5 +/-, Sox6 -/- ) konnte die Funktion von L-Sox5 und Sox6 an der Chondrozytendifferenzierung in der Wachstumsfuge teilweise geklärt werden (Smits et al., 2004). Ohne die Modellierung durch L-Sox5 und Sox6 gehen die Chondrozyten der prähypertrophen Zone direkt in die Phase der terminalen Hypertrophie über. Da weder L-Sox5 noch Sox6 in den hypertrophen oder terminalen Chondrozyten exprimiert werden, wird davon ausgegangen, dass die Fähigkeit von L-Sox5 und Sox6, die Chondrozyten vom prähypertrophen Zustand in den hypertrophen Zustand zu führen, durch eine matrixvermittelte Steigerung der Expression von Fgfr3 und eine Verminderung der Expression des Transkriptionsfaktors Runx2 ausgelöst wird (Inada et al., 1999; Takeda et al., 2001; Ueta et al., 2001; Komori, 2003; Otto et al., 2003). Trotz aller Bemühungen sind bis - 6 -

Einleitung heute aber dennoch die molekularen Prozesse, die während der enchondralen Ossifikation ablaufen, nur zum Teil verstanden. 1.1.2 Desmale Ossifikation am Beispiel der Schädeldachknochen Der Schädel entwickelt sich aus Mesenchym, welches das sich entwickelnde Gehirn umschließt, und setzt sich aus dem Viszerokranium (Gesichtsschädel) und dem Neurokranium, das eine schützende Kapsel um das Gehirn bildet, (Rohen und Lütjen-Drecoll, 2004) zusammen. Das Neurokranium wird weiter in das enchondral verknöchernde Chondrokranium (aus dem die Schädelbasis entsteht) und den desmal verknöchernden Schädeldachknochen unterteilt. Die flachen Schädeldachknochen entwickeln sich direkt aus dem mesenchymalen Bindegewebe, das die Anlagen des Gehirnes umgibt (desmale Ossifikation). Aus sich verdichtenden Mesenchymzellen differenzieren Osteoblasten, die sich vom primären Ossifikationszentrum strahlenförmig in die Peripherie ausbreiten. Ausgehend von vier solchen Ossifikationszentren vergrößern sich die entstehenden Schädeldachknochen durch appositionelles Wachstum, wobei sich durch die Osteoblasten an der äußeren Oberfläche neue Knochenschichten bilden (Schumacher und Christ, 1993). Über die desmale Ossifikation bilden sich insgesamt vier Schädeldachknochen, die an der Gestaltung des Schädeldaches beteiligt sind: die paarig angeordneten Os frontale (vorne) und die beiden Os parietale (seitlich). Der unpaare Os occipitale, der ebenfalls an der Schädeldachbildung beteiligt ist, entsteht über enchondrale Ossifikation. Während der Embryonalentwicklung wachsen die Schädeldachknochen immer näher zusammen, bis sie schließlich nur noch durch dünne Bindegewebsnähte (Schädelnähte) voneinander getrennt sind. Je nachdem welche Schädelknochen die Schädelnähte flankieren, spricht man von der Stirnnaht, Koronar-, Sagital- oder Lambdanaht (Abb. 1.3). Treffen mehr als zwei Schädelplatten aufeinander, so erweitern sich die Schädelnähte zu Fontanellen. Die Schädelnähte erfüllen als flexible Verbindungen zwischen den einzelnen Schädelknochen wichtige Aufgaben: während des Geburtsvorgangs erlauben die Nähte eine Kompression des Schädels mit teilweisem Überlappen der einzelnen Komponenten des Schädeldaches im Geburtskanal. Diese Kompression und die übereinander geschobenen Knochen gehen in den ersten Lebenswochen wieder in ihre Ausgangsposition zurück. - 7 -

Einleitung Koronarnaht Lambdanaht Stirnnaht Sagitalnaht Anteriorfontanelle Posteriorfontanelle Abb. 1.3: Schädelformationen. Modifiziert nach Cohen und MacLean, 2000. Im weiteren Verlauf des Wachstums passt sich das Schädeldach dem stetig zunehmenden Platzbedarf des wachsenden Gehirns an. In den Schädelnähten wird, auf das Wachstum des Gehirn abgestimmt, neuer Knochen durch appositionelles Wachstum gebildet: der Schädel wächst. Verlieren die Schädelnähte ihre Wachstumsaktivität, verknöchern sie. Die Knochen fusionieren und der Schädel hört auf zu wachsen. Der Zeitpunkt der Verknöcherung der einzelnen Schädelnähte beim Menschen ist in Tabelle 1.1 dargestellt. Schädelnaht/Fontanelle Zeitpunkt der Verknöcherung Stirnnaht 9 Monate bis 2 Jahre Koronarnaht 40 Jahre Sagittalnaht 40 Jahre Lambdanaht 40 Jahre Anteriorfontanelle Posteriorfontanelle Anterolateralfontanelle Posterolateralfontanelle 15-18 Monate 3-6 Monate 3 Monate 2 Jahre Tab. 1.1: Zeitpunkt der Verknöcherung der Schädelnähte und Fontanellen beim Menschen. Modifiziert nach Aviv et al., 2002. Die Schädelnähte unterscheiden sich jedoch nicht nur in dem Zeitpunkt ihrer Verknöcherung, sondern auch in ihrer Morphologie. Während die Mittelnähte (Sagital- und Stirnnaht) von angrenzenden Knochen flankiert werden, überlappen die Knochen der Transversalnähte (Koronar- und Lambdanaht) (Abb. 1.4). Diese unterschiedliche Morphologie liegt wahrscheinlich im unterschiedlichen embryonalen - 8 -

Einleitung Ursprung der Nähte und Knochen begründet. Während die Gesichtsknochen in allen Vertebraten einschließlich des Menschen eindeutig aus der Neuralleiste abgeleitet werden können (Noden, 1983; Couly und Le Douarin, 1985; Noden 1986; Couly und Le Douarin, 1987; Couly et al., 1992), werden die embryonalen Ursprünge der Knochen und Nähte des Schädeldaches in der Literatur unterschiedlich diskutiert (Noden 1986, Couly et al., 1992; Couly et al., 1993). Vor wenigen Jahren konnte Jiang et al. (2002) über transgene Mäuse mit einem permanenten Neuralleisten- Marker (Wnt1-Cre/R26R) zeigen, dass sich die Schädelknochen und -nähte aus unterschiedlichem embryonalen Ursprung ableiten (Jiang et al., 2002; Cohen, 2005). So stammen die Koronarnaht und Stirnnaht von Zellen der Neuralleiste ab und sind somit ektodermalen Ursprungs, während die Sagital- und Lambdanaht aus dem paraxialen Mesoderm ableiten. Auch die Knochen, die das Schädeldach bilden, gehen von unterschiedlichen embryonalem Geweben aus: so entwickelt sich die Os frontale aus Zellen der Neuralleiste, wohingegen die Os parietale und der Os occipitalis paraxial mesodermalen Ursprungs sind (Jiang et al., 2002). Allen Nähten ist jedoch gemeinsam, dass sie von zwei Gewebeschichten umgeben sind: dem Periost (Knochenhaut) und der Dura mater, die der äußeren Hirnhaut entspricht (Abb. 1.4). Inwieweit diese Schichten die Bildung der Nähte und deren Aufrechterhaltung unterstützen, ist zurzeit noch nicht komplett verstanden. So scheint die Dura mater zwar nicht für die Bildung der Schädelnähte selber verantwortlich zu sein (Oppermann et al., 1993). Roth et al. (1996) konnten jedoch nachweisen, dass das Einführen einer Silikonbarriere zwischen Schädelnaht und Dura mater bei neugeborenen Ratten zu einer verzögerten Schließung der Schädelnähte führt, und die Dura mater somit am Erhalt der Schädelnähte beteiligt ist. Weitere Experimente zeigten, dass die Dura mater im mesenchymalen Gewebe die Osteogenese induziert (Yu et al., 1997; Greenwald et al., 2000). - 9 -

Einleitung A uos Pe B uos Pe Dm mo Dm mo a uos Pe b uos Pe mo mo Abb. 1.4: Histologische und schematische Darstellung der Schädelnähte. A und a zeigen die Koronarnaht einer 6 Tage alten Ratte. B und b stellen die Stirnnaht einer 6 Tagen alten Ratte dar. Die violetten Punkte kennzeichnen die Schädelnähte; Dm, Dura mater; mo, mineralisierter Knochen; Pe, Periost; uos, unmineralisierte Knochenmatrix (osteoid) und Osteoblasten. Modifiziert nach Greenwald et al., 2000. 1.2 Erkrankungen des Knorpel-/Knochen-Gewebes 1.2.1 Chondrodysplasien Bei der Krankheitsgruppe der Osteochondrodysplasien handelt es sich um genetisch bedingte, generalisierte Entwicklungsstörungen des Knorpel-Knochen-Gewebes. Ihre Gesamthäufigkeit liegt bei etwa 4:10000-10:10000 (Zabel und Winterpacht, 2000), wobei die Gruppe hunderte z.t. sehr seltene Krankheiten umfasst, zu denen unter anderem die Frontometaphysäre Dysplasie (FMD, MIM305620) gehört. Die FMD ist eine seltene Erkrankung des knöchernen Schädels und der Röhrenknochen. Charakteristische Merkmale zeigen das Gesicht (mit prominenten Supraorbitalleisten, Hypertelorismus, antimongoloiden Lidachsen, breiter Nasenwurzel und Mikrognathie (kleiner Oberkiefer) mit Zahnanomalien) und das Skelett (Fusion von Mittelhandknochen, vermehrte Knochendichte entlang der Metaphysen, ausgeweitete Metaphysen, Skoliose). Als zusätzliche Symptome werden eingeschränkte Gelenkbeweglichkeit, Fingerkontrakturen und teilweise auch Hörverlust gefunden. Seltener haben die Patienten Atemprobleme (Luftröhrenstenosen unterhalb der Glottis, rezidivierende Infekte) und urologische - 10 -

Einleitung Störungen. Etwa 30 Fälle von FMD sind bisher beschrieben worden. Robertson et al. (2003) zeigten, dass gain of function -Mutationen in Filamin A (FLNA) zur FMD führt. Die FMD wird zum Spektrum der Fronto-oto-palato-digitalen Osteodysplasien gezählt, zusammen mit dem Melnick-Needles-Syndrom (MIM 309350) und den Otopalato-digitalen Syndromen Typ 1 (MIM 311300) und Typ 2 (MIM 304120). Alle diese Syndrome werden X-chromosomal-rezessiv vererbt wobei heterozygoten Frauen sind nur minimal betroffen sind. Die Heterogenität der Osteochondrodysplasien erklärt sich aus der Vielzahl von involvierten Genen, Molekülen, Proteininteraktionen, Zellen und Gewebebereichen, die an der Bildung, dem Wachstum und der Homöostase des Skeletts beteiligt sind, und deren Störung zu einem jeweils anderen Krankheitsbild führen kann. Das Spektrum schließt alle Schweregrade ein: von pränatal letalen Formen bis hin zu sehr leicht betroffenen, fast symptomfreien Patienten. 1.2.2 Kraniosynostosen Kraniosynostosen sind Entwicklungsstörungen, die auf einem frühzeitigen Verschluss einer oder mehrerer Schädelnähte zurückzuführen sind. Die Prävalenz beträgt 1:2100-1:3200 Neugeborenen (Hunter und Rudd, 1976; Lajeunie et al., 1995). Kraniosynostosen treten sowohl isoliert (nicht-syndromal; ca. 15-20% aller Kraniosynostosen), als auch mit anderen Fehlbildungen assoziiert auf (syndromal, 80-85% aller Kraniosynostosen). Die Äthiologie der Kraniosynostosen ist sehr heterogen. Syndromale Formen zeigen in der Regel einen autosomal-dominanten Erbgang und eine hohe intra- und interfamiliäre Variabilität, wohingegen bei den nicht-syndromalen Kraniosynostosen sowohl genetische als auch Umweltfaktoren diskutiert werden (Cohen und MacLean, 2000). Syndromale Formen können anhand ihrer phänotypischen Merkmale in etwa 100 Syndrome unterteilt werden (Winter und Baraitser, 1994). Sie unterscheiden sich durch die Art der betroffenen Schädelnaht, craniofaziale Anomalien, assoziierte Extremitätenanomalien und Fehlbildungen anderer Organsysteme. Erkenntnisse über die molekularen Ursachen, sowie die Pathomechanismen der Kraniosynostosen stammen weitestgehend von Untersuchungen an einigen Kraniosynostose-Syndromen. Eine Übersicht der häufigsten syndromalen Kraniosynostosen ist in Tab. 1.2 dargestellt. - 11 -

Einleitung MIM Inzidenz Veränderungen des (Gesichts)-Schädels weitere Merkmale Gene Referenzen 123500 1:61000 Brachyzephalie, Strabismus, Schallleitungsfehler FGFR2 [1] Papageiennase, Optikusatrophie, Mentale Erhöhtes [2] Exophthalmus (flache Orbitae) Retardierung (bei erhöhtem Vateralter [3] Hypertelorismus, Hirndruck durch räumliche [4] Buphthalmus, Behinderung des [5] Mittelgesichtshypoplasie, Hirnwachstums), Maxillenhypoplasie seltene zusätzliche Merkmale: Anfallsleiden Choanalatresie, Hydrozephalus Hyperkeratose mit FGFR3 [6] Hyperpigmentierung, [7] Symptome stärker ausgeprägt als beim klassischen M. Crouzon Erkrankung betroffene Schädelnaht Crouzon- Syndrom mit Acanthosis nigricans Apert- Syndrom Pfeiffer- Syndrom Saethre- Chotzen- Syndrom Jackson- Weiss- Syndrom Muenke- Syndrom S. coronalis (S. sagittalis S. lambdoidae) bilateral S. coronalis bilateral S. coronalis bilateral S. coronalis (S. lambdoidae S. metopica) bilateral Mehrere Schädelnähte S. coronalis Uni- und bilateral 101200 1:65000 Turmschädel, Brachyzephalie, Protosis, Exophtalmus (flache Orbitae), Hypertelorismus, Mittelgesichtshypoplasie, Maxillenhypoplasie, Antimongoloide Lidspalte, Choanalatresie, Gaumenspalte 101600 1:200000 Turmschädel, Brachyzephalie, Selten Kleeblattschädel, Proptosis, Hypertelorismus, flache Orbitae Maxillenhypoplasie, Mittelgesichts-hypoplasie, Antimongoloide Lidspalte Choanalatresie, kleine Nase 101400 1:25000-50000 Strabismus, Hörfehler, Bilaterale knochige Syndaktylie der Hände und Füße Mentale Retardierung (abhängig vom Hirndruck) Strabismus, breite Daumen und Großzehen, selten geistige Retardierung Akrozephalie, Brachyzephalie, Milde bis mittlere geistige Hohe und flache Stirn, schmale Retardierung, Brachydaktylie, und lange Nase Häutige Syndaktylie (Papageiennase), Klinodaktylie Gesichtsasymmetrie, Seltene zusätzliche Merkmale: Buphthalmus, Strabismus, Ptosis, tief liegende Hypertelorismus, und kleine Ohren Hörprobleme, Maxillenhypoplasie, Herzdefekte Gaumenspalte, verzögerter Verschluss der Fontanelle 123150 Turmschädel, Mittelgesichtshypoplasie 602849 0,8-1:10000 In der radiologischen Untersuchung Tarsus- Metatarsus-Koaleszenz Seltene zusätzliche Merkmale: Mentale Retardierung, Häutige Syndaktylie der 2. und 3. Zehe Plagiozephalie, Makrozephalie Seltene zusätzliche Merkmale: Strabismus, In der radiologischen Untersuchung fingerhutförmige Fingerknochen, Zapfenförmige Epiphysen, Hand- bzw. Fußwurzelknochenfusionen Brachydaktylie FGFR2 Erhöhtes Vateralter FGFR1 FGFR2 TWIST FGFR2 FGFR3 [3] [8] [10] [3] [5] [9] [11] [12] [13] FGFR2 [14] [15] FGFR3 [13] [16] [17] [18] Boston Typ Kleeblattschädel MSX2 [19] [20] Beare- Stevenson Cutis gyrata Mehrere Schädelnähte FGFR2 Erhöhtes Vateralter [21] [22] [23] 123790 sporadisch Kleeblattschädel, Proptosis, Mittelgesichtshypoplasie, antimongoloide Lidspalte, Hypertelorismus, Choanalatresie Hydrozephalus Cutis Gyrata, Acanthosis nigricans, Häutige Genitalveränderungen, Missbildungen der Finger und Zehen, Tief liegende vorgedrehte Ohren, Wachstumsverzögerungen, Balkenmangel, Früher Tod (bei Kleeschädel) Tab 1.2: Übersicht der Häufigsten syndromalen Kraniosynostosen. Modifiziert nach Preising et al., 2005. [1] Crouzon, 1912; [2] Oldbridge et al., 1995; [3] Meyers et al., 1997; [4] Glaser et al., 2000; [5] Renier et al., 1991; [6] Meyers et al., 1995; [7] Tavormina et al., 1999; [8] Apert, 1906; [9] Pfeiffer, 1964; [10] Wilkie et al., 1995; [11] Muenke et al., 1994; [12] Saethre, 1931; [13] Znekas et al., 1998; [14] Jackson et al., 1976; [15] Park et al., 1995; [16] Graham et al., 1998; [17] Muenke et al., 1997; [18] Reardon et al., 1997; [19] Li et al., 1993; [20] Jabs et al., 1993; [21] Beare et al., 1969; [22] Stevenson et al., 1978; [23] Przylepa et al., 1996. - 12 -

Einleitung Mutationen in FGFR 1-3, die zu einer konstitutiven Aktivierungen der Gene führen, sind ursächlich für diverse syndromale Kraniosynostosen (dominant negativer Effekt; Neilson et al., 1995; Robertson et al., 1998; Anderson et al., 1998; Yu et al., 2000; Oldridge et al., 1999; Hajihosseini et al., 2001). Im Gegensatz zu den FGFRs führen bei Patienten mit dem Saethre-Chotzen-Syndrom und dem Bosten-Typ Syndrom Mutationen in TWIST (Johnson et al., 1998; el Ghouzzi et al., 2001) und MSX2 (Li et al., 1993; Jabs et al., 1993) zum Funktionsverlust der Gene (loss of function). Interessanterweise wurden für TWIST nicht nur Mutationen in der kodierenden Sequenz von TWIST, sondern auch Translokationen beschrieben, die sich mehrere Kilobasen distal von TWIST befinden (Krebs et al., 1997; Rose et al., 1997). Hier gehen die Autoren von positionellen Effekten aus, welche die Expression von TWIST beeinflussen und somit zu Kraniosynostosen führen. 1.2.3 Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis Nach Abschluss des Längenwachstums sind die auf den Knochen aufliegenden Gelenkknorpel die einzigen Bestandteile der Röhrenknochen, die nicht verknöchern. Ein Gelenkknorpel ist eine nur wenige Millimeter dicke, amorph erscheinende Gewebeschicht, der Blut- und Lymphgefäße sowie Nerven fehlen. Die einzigen zellulären Elemente im erwachsenen Gelenkknorpel sind Chondrozyten, wobei extrazelluläre Matrixbestandteile über 95% des Gewebevolumens repräsentieren. Die häufigste Ursache für das Versagen der funktionellen Gelenkeinheiten (Knorpel, subchondraler Knochen, Synovia, Synovialis, Gelenkkapsel, Muskulatur) sind chronische Gelenkerkrankungen wie Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis. Bei der Osteoarthrose, der häufigsten altersbezogenen Skeletterkrankung, kommt es zu einer chronisch fortschreitenden Zerstörung des Gelenkknorpels und damit zu einem Funktionsverlust des Gelenksystems. Charakteristische Merkmale der Osteoarthrose sind der kontinuierliche Knorpelverlust, die strukturellen Veränderungen des subchondralen Knochens und die Formation von osteophytären Randanbauten. Nach einer initialen Knorpelerweichung (Chondromalazie) entstehen Einrisse im Knorpel, die immer tiefer werden. Der kontinuierliche Knorpelabrieb führt zur so genannten Knochenglatze. Klinisch wird das Endstadium der Erkrankung dominiert von Schmerzen, massiver Einschränkung der Funktionalität und der zwingenden Erfordernis eines künstlichen Gelenkersatzes. Die Progression der Erkrankung lässt sich nach Fassbender (1975) histologisch in - 13 -

Einleitung vier Stadien unterteilen: im Stadium I bilden sich in der oberen Knorpelschicht kleine Fissuren, verbunden mit oberflächlichem Proteoglykan-Verlust. Stadium II ist gekennzeichnet durch tiefergehende Fissuren, proliferierenden Chondrozyten, die so genannte Brutnester ausbilden und allmählichem Knorpelverlust. Im Stadium III reichen die Fissuren und Defekte bis in den kalzifizierenden Knochen hinein. Vollständiger Knorpelverlust mit Knorpelglatze kennzeichnet das Stadium IV. Die komplexe Pathogenese der Osteoarthrose umfasst verschiedene Risikofaktoren wie Übergewicht, Östrogenmangel, Unterversorgung mit Antioxidantien, Gelenküberbeanspruchung oder -verletzung, sowie Geschlecht und Alter des Patienten (Felson et al., 2000), die zusammen mit einer genetischen Prädisposition die Erkrankung hervorrufen (Brandi et al., 2001; Spector und MacGregor, 2004). Die fortschreitende Zerstörung des Knorpels beruht auf einem Ungleichgewicht anaboler und kataboler Prozesse in der extrazellulären Knorpelmatrix (Lohmander, 2000; Fernandes et al., 2002; Martel-Pelletier, 2004). Im gesunden Knorpel wird der Abbau der Knorpelmatrix durch proteolytische Enzyme, vorrangig Metalloproteinasen (MMPs und ADAMTS; Shlopov et al., 1997; Tortorella et al., 1999, 2001, 2002), durch Synthese von anabolen extrazellulären Matrixbestandteilen kompensiert. Diese komplexe Balance wird durch ein streng kontrolliertes Netzwerk aus Zytokinen und Wachstumsfaktoren reguliert. Unter den katabolen, proinflammatorischen Zytokinen, die von Synoviozyten, mononukleären Zellen und Chondrozyten sezerniert werden, bilden Interleukin-1ß und TNF-α, unterstützt durch IL-6, LIF, IL-17, IL-8 und IL-18, die Schlüsselmediatoren (Martel-Pelletier et al., 1999). In synergistischer Wirkung steigern sie die Synthese proteolytischer Enzyme und hemmen die Synthese von Enzyminhibitoren wie TIMP (tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases), SERPINs (serine proteinase inhibitors) oder α2- Makroglobulin. Ihre Wirkung wird im gesunden Gelenk durch kompetitive Hemmung inhibiert. Rezeptorantagonisten wie IL-1Ra konkurrieren mit der Bindung der Zytokine an ihren Rezeptor und inhibieren die katabole Funktion der löslichen Zytokine und antiinflammatorischen Zytokine wie IL-4, IL-10 oder IL-13 und reduzieren damit die Expression, Synthese oder Aktivität der proinflammatorischen Zytokine (Martel- Pelletier, 2004). Ferner stimulieren die anabolen Mediatoren IGF-1, TGF-1, 2, und 3, FGF-2, 4 und 8, und BMPs die extrazelluläre Matrix-Synthese (Sandell und Aigner, 2001), sowie möglicherweise eine Reihe weiterer Genprodukte, die eine Funktion bei Knorpelaufbau bzw. Knorpelentwicklung spielen bisher jedoch unbekannt sind. - 14 -

Einleitung Durch Überexpression bzw. vermehrter Aktivität der proinflammatorischen Zytokine und durch verringerte Expression bzw. Wirkung der physiologischen Inhibitoren, werden katabole Vorgänge gefördert und das Gleichgewicht zugunsten der Knorpeldegradation verschoben. Durch gesteigerte Synthese von ECM- Komponenten und Erhöhung der mitotischen Teilungen kompensieren Chondrozyten diesen Degradationsprozess. Die Syntheseaktivität der Chondrozyten reicht allerdings häufig nicht aus, um die Degradation des Knorpels anzugleichen (Sandell und Aigner, 2001). Dennoch sind gerade Gene, die an der Knorpelregeneration beteiligt sind, von großer medizinischer Bedeutung. Osteoarthrotischer Knorpel weist phäntotypische Veränderungen der Chondrozyten auf (Pullig et al., 2001; Sandell und Aigner, 2001). Adulte Chondrozyten, die im gesunden Gelenk einen stabilen Phänotyp zeigen, dedifferenzieren im osteoarthrotischen Knorpel, beenden die Expression von Aggrekan und Kollagen Typ II und beginnen - ähnlich wie hypertrophe Chondrozyten - Kollagen Typ I, III, V und X zu sezernieren (Girkontaite et al., 1996; Oganesian et al., 1997; Lefkoe et al., 1997). Diese eher knorpeluntypischen Matrixkomponenten können nicht in eine funktionsfähige Knorpelarchitektur integriert werden und sind zusammen mit der oben beschriebenen Knorpelmatrixdegradation für die Ausbildung der Osteoarthrose verantwortlich. Trotz erster Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Osteoarthrose und dem Vitamin D-Rezeptor (VDR; Keen et al., 1997), Kollagen Typ IX (COL9A1; Mustafa et al., 2000), Typ I (COL1A1: Loughin et al., 2000) und Typ II (COL2A1; Uitterlinden et al., 2000) sowie TGF-ß1 (Keen et al., 2001) sind die Pathomechanismen der Osteoarthrose weitgehend unverstanden. Eine weitere Gelenkerkrankung, deren Pathomechanismus sich von der Osteoarthrose unterscheidet, ist die rheumatoide Arthritis (Bresnihan, 1999). Die rheumatoide Arthritis ist eine häufige, chronisch verlaufende, entzündliche Autoimmunerkrankung, die - ähnlich der Osteoarthrose - in der Regel mit Knorpelund Gelenkzerstörung einhergeht (Lee und Weinblatt, 2001). Kennzeichnend für die rheumatoide Arthritis sind Entzündungsvorgänge in den Gelenken, ein gestörtes Immunsystem und eine Hyperplasie der Synovia (Gay, 1998). Die Prävalenz der rheumatoiden Arthritis beträgt weltweit etwa 1%, wobei Frauen dreimal häufiger betroffen sind (Lipinsky, 1994). In finnischen und britischen Studien konnte gezeigt werden, dass bei eineiigen Zwillingen eine Konkordanz von ca. 12-15% für die rheumatoide Arthritis vorliegt, bei zweieiigen Zwillingen liegt diese bei ca. 4% (Aho et al., 1986; Silman et al., 1993). Auch ein Studie von MacGregor et al. (2000) konnte - 15 -

Einleitung zeigen, dass genetische Faktoren bei einer Prädisposition zur rheumatoiden Arthritis eine bedeutende Rolle spielen. Bei der rheumatoiden Arthritis handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung. Am Anfang der Immunantwort steht die Präsentation eines Antigens auf den HLA- Molekülen von antigenpräsentierenden Zellen an die T-Lymphozyten. Dabei werden CD4+ Lymphozyten (T-Helfer Zellen) durch HLA-Moleküle der Klasse II (z.b. HLA- DR, -DQ) aktiviert (Lang, 1991). Assoziationen zwischen rheumatoider Arthritis und den humanen Lymphozyten-Antigenen HLA-DR1, HLA-DR4 und HLA-DR14 (Nepom et al., 1989; Newton et al., 2004), sowie auffälligen T-Zell-Infiltraten, lassen eine Schlüsselfunktion von T-Lymphozyten an der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis vermuten. Dabei werden extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen Typ II, IX und XI, Aggrekan, cartilage link protein oder Hitzeschockproteine als mögliche Zell- Autoantigene diskutiert (Verheijden et al., 1997; Li et al., 2000). Nach Aktivierung der T-Lymphozyten kommt es zur Stimulierung von Plasmazellen, Mastzellen, Makrophagen und Synovialzellen und zur Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie z.b. Interleukin-1 (IL-1), Tumor-Nekrose-Faktor-α, sowie von matrixabbauenden Enzymen (z.b. Kollagenasen). Diese tragen zur Zerstörung der Matrix, sowie der Resorption von Knorpel und Knochen bei (Breedveld, 1998). Trotz intensiver Bemühungen sind auch bei der rheumatoiden Arthritis die Pathomechanismen nicht verstanden. Assoziationsstudien geben zwar erste Hinweise auf die mögliche Beteiligung verschiedener genetischer Faktoren, aufgrund der Komplexität beider Erkrankungen konnten jedoch noch keine eindeutigen molekularen Auslöser der Osteoarthrose und der rheumatoiden Arthritis aufgezeigt werden. - 16 -