Einfluss der Konzentration unterschiedlicher Zellpopulationen auf die Vitalität kryokonservierter Stammzellkonzentrate

Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. W. Hohenberger durchgeführt in der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Leiter: Prof. Dr. R. Eckstein Einfluss der Konzentration unterschiedlicher Zellpopulationen auf die Vitalität kryokonservierter Stammzellkonzentrate Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Afif Dlimi aus Al Bokmal

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler Priv.-Doz. Dr. J. Zingsem Prof. Dr. Eckstein Tag der mündlichen Prüfung: 01.August 2012 2

FÜR MEINE LIEBEN ELTERN

GLIEDERUNG 1. ZUSAMMENFASSUNG 6 1.1 deutsche Zusammenfassung 6 1.2 englische Zusammenfassung / Summary 8 2. EINLEITUNG 10 2.1 Stammzellen 10 2.2 Nabelschnurrestblut (CB) 13 2.3 Einlagerung des CBs 16 2.4 Lagerung der CB-Präparate 17 2.4.1 Grundlagen der Kryokonservierung 18 2.4.2 Zusatz von Gefrierschutzlösung 20 2.4.3 Ablauf der Kryokonservierung 20 2.4.4 Dauer der Lagerung 21 2.4.5 Wiederauftauen 21 2.4.6 Zielsetzung der Arbeit 22 3. PATIENTEN UND METHODEN 24 3.1 Patienten 24 3.2 Methoden 25 3.2.1 Herstellung von Stammzellen aus CB 25 3.2.1.1 Blutbestandteilsauftrennung 25 3.2.1.2 Kryokonservierung 27 3.2.2 Zellzählung 29 3.2.3 CD34 Messungen am Durchflusszytometer 29 3.2.3.1 Prinzipien der Durchflusszytometrie 29 3.2.3.2 Testprinzip 32 3.2.3.3 Testdurchführung 32 3.2.4 CFU-Testungen 35 3.2.4.1 Prinzip 35 3.2.4.2 Testdurchführung 36 3.2.5 Statistik 38 4. ERGEBNISSE 39 4.1 Statistische Daten 40 4.1.1 Statistische Daten vor dem Einfrierprozess 40 4.1.2 Gesamtmenge im Leukozytenkonzentrat (LK) 41 4.1.3 Gesamtmenge im LK-Beutel 42 4.1.4 Statistische Daten nach dem Auftauen 43

4.1.5 Gesamtmenge im LK nach dem Auftauen 44 4.1.6 Gesamtmenge im LK-Beutel nach dem Auftauen 45 4.2 Vergleich der Vitalität mit den unterschiedlichen Zellpopulationen 46 4.2.1 Vergleich der CD34-positiven Leukozyten mit der Vitalität 46 4.2.2 Vergleich des Thrombozytengehaltes mit der Vitalität 47 4.2.3 Vergleich des Erythrozytengehaltes mit der Vitalität 49 4.2.4 Vergleich der mononukleären Zellen mit der Vitalität 51 4.2.5 Vergleich des Volumens des LKs mit der Vitalität 53 4.3 Analyse der Präparate mit mehr als 2,50 x 10 6 CD34- positiven Leukozyten je Beutel 55 4.3.1 Mittelwerte in den 6 Gruppen 55 4.3.2 Korrelationen zwischen den Zellzahlen in den 6 Gruppen und den vitalen Leukozyten in % 57 4.3.3 Vergleiche der Vitalität zwischen den 6 Gruppen 58 4.4 Korrelationen der unterschiedlichen Zellpopulationen mit der Vitalität der Leukozyten 58 4.4.1 vor dem Auftauen 58 4.4.2 nach dem Auftauen 62 4.5 Ausbeute an CFUs und Erythroblasten in % 65 5. DISKUSSION 72 6. LITERATURVERZEICHNIS 80 7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 89 8. DANKSAGUNG 91 5

ZUSAMMENFASSUNG 1. ZUSAMMENFASSUNG 1.1 deutsche Zusammenfassung Hintergrund und Ziele: Nabelschnurrestblut kann neben Knochenmark und dem peripheren Blut als Quelle für hämatopoetische Stammzellen dienen. Da der Bedarf weltweit steigend ist, besteht die Notwendigkeit, Verfahren zur Aufbereitung und Lagerung zu optimieren, um Ressourcen zu sparen. In der vorliegenden Arbeit soll betrachtet werden, ob es bei Stammzellpräparaten aus Nabelschnurrestblut, die stärker konzentriert sind, also eine höhere Anzahl an Leukozyten, mononukleären Zellen und CD34-positiven Leukozyten besitzen, zu einem nachteiligen Effekt auf die Vitalität und das Überleben der Stammzellen nach dem Auftauen kommt. Methoden: Die statistische Auswertung der Daten von 5520 Spenderinnen, von denen in den Jahren von 2003 bis 2011 Plazentarestblut aufbereitet und nach Kryokonservierung eingelagert wurde, erfolgte mittels SPSS (SPSS Inc., Chicago IL, USA) in der Version 19 und Microsoft Office Excel 2007. Die Konzentrationen der Leukozyten, Thrombozyten, Erythrozyten, CD34-positiven Leukozyten, vitalen Leukozyten und mononukleären Zellen wurden mittels Zellzahlbestimmung an einem Blutbildautomaten sowie mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Das Proliferations- und Differenzierungsvermögen der Stammzellen wurde mittels Zellkultur überprüft. Ergebnisse und Beobachtungen: Nach dem Wiederauftauen zeigte sich ein absoluter Verlust an Leukozyten, CD34-positiven Leukozyten und mononukleären Zellen. Die gemittelte Ausbeute an koloniebildenden Einheiten betrug 29,05 %. Beim Vergleich der mittels der Zahl an CD34-positiven Leukozyten, Thrombozyten und mononukleären Zellen gebildeten Gruppen zeigte sich bei jeweils höheren Zellkonzentrationen eine erhöhte Vitalität der Leukozyten in %. Lediglich bei höheren Erythrozytenzahlen kam es zu einem nicht signifikanten Abfall. Bei Gruppenvergleichen von Präparaten mit mehr als 2,5 x 10 6 CD34-positiven Leukozyten konnte ein nichtsignifikantes Ansteigen der Vitalität beobachtet werden. Der Gehalt an Leukozyten, Thrombozyten, CD34-positiven Leukozyten und mononukleären 6

ZUSAMMENFASSUNG Zellen korrelierte signifikant positiv mit der Ausbeute an koloniebildenden Einheiten, die Erythrozytenzahlen zeigten eine signifikante negative Korrelation. Die Gesamtzellzahlen an Leukozyten, Thrombozyten, CD34-positiven Leukozyten und mononukleären Zellen pro Beutel vor Kryokonservierung korrelierten signifikant mit der Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in %. Nach dem Auftauen zeigte sich ebenfalls eine signifikante Korrelation zwischen der Vitalität der Leukozyten in % und dem Gehalt an Leukozyten, CD34-positiven Leukozyten und mononukleären Zellen. Praktische Schlussfolgerung: Höhere Zellkonzentrationen im Nabelschnurrestblutpräparat zeigten keinen negativen Effekt auf die Zahl der CD34-positiven Leukozyten, die Vitalität der Leukozyten und die Zahl der koloniebildenden Zellen nach dem Wiederauftauen. Die hochkonzentrierten Gruppen schnitten im Gegenteil sogar besser ab, als die Gruppen mit den niedrigeren Zellkonzentrationen. Lediglich die Erythrozytenzahlen bedingten nachteilige Effekte und sollten im Präparat so gering wie möglich gehalten werden. 7

ZUSAMMENFASSUNG 1.2 englische Zusammenfassung / Summary Background and aims: Cord blood is beside bone marrow or stem cells from peripheral blood a viable source of hematopoietic stem cells. The need for cord blood is increasing worldwide therefore it is necessary to improve techniques of preparation and storage. This report shows the impact of higher cell concentration of leukocytes, mononuclear cells and CD34-positive cells viability of stem cells after cryopreservation. Methods: Statistical analysis of data from 5520 donors of cord blood, prepared and cryopreservated in the years 2003 through 2011 have been performed with SPSS (SPSS Inc., Chicago IL, USA) version 19 and Microsoft Office Excel 2007. Cell concentrations for leukocytes, platelets, red blood cells, CD34-positive leukocytes, vitale leukocytes and for mononuclear cells have been determined by a blood cell counter and flow cytometry. The proliferation and differentiation capacity was assessed in cell culture. Results: The content of leukocytes, CD34-positive leukocytes and mononuclear cells were decreased after thawing. Recovery of colony forming units was 29.05 %. After building different collectives (total leukocytes, platelets, CD34-positive leukocytes and mononuclear cells) a correlation between increasing cell levels and increasing postthawing viability could be shown. Only increasing levels of red blood cells led to a decrease in viable leukocytes. Comparing groups with more than 2.5 x 10 6 CD34-positive leukocytes a non significant increase in vitale leukocytes could be shown. Numbers of leukocytes, platelets, CD34-positive leukocytes and mononuclear cells correlated significantly with the recovery of colony forming units. Red blood cells showed a significant negative correlation. The content of leukocytes, platelets, CD34-positive leukocytes and mononuclear cells correlated significantly with the viability before cryopreservation. A significant correlation between the numbers of leukocytes, CD34-positive leukocytes and mononuclear cells and the viability could also be shown after thawing. 8

ZUSAMMENFASSUNG Conclusion: Increased cell concentrations in cord blood do not limit the recovery of CD34- positive leukocytes, nor the viability of leukocytes or the number of colony forming units after thawing. On the contrary, cord blood units with high cell concentrations show a better outcome than units with low cell concentrations. Only red blood cells seem to have a negative influence on CB quality and should be removed as stringent as possible. 9

EINLEITUNG 2. EINLEITUNG 2.1 Stammzellen Hämatopoetische Stammzellen (HSC) sind die Vorläuferzellen des myeloiden und des lymphoiden Systems. Zu den myeloiden Blutzellen gehören die Granulozyten, die Monozyten, die Erythrozyten und die Megakaryozyten. Die lymphoide Zelllinie besteht aus natürlichen Killerzellen, T- und B-Zellen. Alle diese Blutzellen haben nur eine begrenzte Lebensdauer: einige Stunden für Granulozyten, einige Wochen für Erythrozyten und bis zu einigen Jahren für T-Gedächtnis-Zellen (Gunsilius et al., 2001). Das heißt, die Mehrzahl der Blutzellen muss kontinuierlich nachgebildet werden, im Durchschnitt werden jeden Tag mehr als hundert Billionen neue hämatopoetische Zellen benötigt (Gunsilius et al., 2001, Domen et al., 2006). Die pluripotenten HSCs, die beim gesunden Erwachsenen hauptsächlich im Knochenmark (KM) sitzen, sind die einzige Quelle für die benötigten Blutzellen (Domen et al., 2006). Die hämatopoetische Differenzierung ist in Abbildung 2.1 dargestellt. Nur unter pathologischen Bedingungen kann es beim Erwachsenen zur Blutbildung außerhalb des KMs - in Leber oder Milz - kommen (Gunsilius et al., 2001). Abbildung 2.1: Hämatopoetische und stromale Zelldifferenzierung aus HCS (Abbildung aus Domen et al., 2006) 10

EINLEITUNG Die HSC hat nach der Zellteilungen zwei Möglichkeiten, zum einen kann sie eine Stammzelle bleiben und sich sozusagen selbst erneuern, oder sie differenziert sich zu einer reifen hämatopoetischen Zelle der unterschiedlichen Zelllinien (Domen et al., 2006). Die Möglichkeit zur Selbsterneuerung ist eine essentielle Eigenschaft der HSCs, nur so kann die kontinuierliche, wahrscheinlich lebenslange Produktion der unterschiedlichen Blutzellen gewährleitet werden. Hat die HSC durch die Stimulation mit verschiedenen Wachstumsfaktoren und Zytokinen die Differenzierung begonnen, ist es nicht möglich, dass sie erneut zur Selbsterneuerung übergeht (Domen et al., 2006). Die Möglichkeit zur Selbsterneuerung und die Möglichkeit zur Differenzierung in verschiedenste Blutzellen definieren die HSC. Es gibt zwei Arten von multipotenten HSCs. Die einen erneuern sich über eine längere Zeit, möglicherweise über die Lebenszeit des Menschens selbst (englisch: long-term=lt), die anderen betreiben diese Selbsterneuerung nur über kurze Zeit (englisch: short-term=st) (Weissman, 2000, Morrison et al., 1997). Die Reihenfolge in der Entwicklung beginnt bei den LT- HSCs. Diese entwickeln sich zu ST-HSCs, die sich wiederum zu multipotenten Vorläuferzellen entwickeln. Aus der multipotenten Vorläuferzelle entwickeln sich die lymphoide Vorläuferzelle, aus der natürliche Killerzellen, B- und T- Lymphozyten entstehen und die myeloide Vorläuferzelle, aus der die Granulozyten, Monozyten, Thrombozyten und Erythrozyten hervorgehen (siehe auch Abbildung 2.1)(Weissman, 2000). Um die HSCs von anderen Zellen unterscheiden zu können, bedient man sich verschiedener Möglichkeiten. Eine weit verbreitete ist es, in vitro in Kulturen die Fähigkeit der Stammzellen, reife Blutzellen zu bilden, nachzuweisen. Die Entwicklung der verschiedenen Kultivierungsansätze erlaubte die Identifikation und Quantifizierung von verschiedenen Vorläuferzellen, die sich zu einer bestimmten Zelllinie differenzieren (Gunsilius et al., 2001). Durch einen bestimmten Ansatz ist es möglich, die reifen Vorläuferzellen zu zählen, die unter bestimmten Kultivierungsbedingungen in der Lage sind, Kolonien zu bilden (Gunsilius et al., 2001). Dabei werden die Zellen auf ausgewählten Medien, wie Methylzellulose, Agar, Plasma Gel, oder Fibringerinnseln über 7 bis 14 Tage kultiviert. Werden anschließend über 50 Zellen gezählt, spricht man von einer Kolonie. Diese Kolonien sind die Nachkommen von einzelnen Zellen, die man koloniebildende Zellen (englisch: colony forming units=cfu) nennt (Gunsilius et al., 2001). Durch die Arten der entstandenen Kolonien gelingt eine Differenzierung der zugrunde 11

EINLEITUNG liegenden CFUs. Dieser Ansatz kann modifiziert mit verschiedenen Kulturmedien und Inkubationszeiten durchgeführt werden. Eine weitere Möglichkeit HSCs von anderen Zelltypen zu differenzieren, ist der Einsatz von Oberflächenmarkern. Eine HSCs ist unter anderem definiert durch das Vorliegen der Oberflächenantigene CD34 und CD133, hingegen kommen die Antigene CD38 und HLA-DR nicht auf ihrer Oberfläche vor. Unter physiologischen Bedingungen tragen im peripheren Blut nur 0,1 bis 0,2 % der mononukleären Zellen (MNC) das CD34-Antigen. Im KM sind es 1 bis 3 %, im Nabelschnurblut (englisch: cord blood: CB) 0,8 bis 1,2 %. Durch den Einsatz einer Chemotherapie und bestimmter Zytokine, wie dem Granulozyten-Kolonie-stimulierenden-Faktor (G-CSF), dem Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden-Faktor (GM-CSF), dem Stammzellfaktor (SCF) oder Interleukin-3 (IL-3), können die HSCs aus dem KM in den peripheren Blutstrom mobilisiert werden (Gunsilius et al., 2001). Beim KM-Versagen, das aus unterschiedlichsten Gründen, wie z. B. der aplastischen Anämie oder gewollt iatrogen bedingt auftreten kann, ist es nötig, zu Transplantationszwecken HSCs entweder von einem Spender (allogen) oder dem Patienten selbst (autolog) zu gewinnen. Die möglichen Quellen sind das KM, das periphere Blut nach Stimulation (englisch: Peripheral blood derived stem and progenitor cells: PBSPC) und das CB. KM wird mittels Punktion des Beckenkammes unter Anästhesie entweder von einem möglichst humane leukozytäre Antigen (HLA)-identischen, gesunden Spender oder autolog vor geplanter myeloablativer Chemoradiotherapie gewonnen. Das entnommene Volumen beträgt hierbei bei Erwachsenen ungefähr 1000 ml. Mindestens 24 Stunden nach Beendigung der zytotoxischen Therapie werden dem Patienten die hämatopoetischen HSCs über einen zentralen Venenzugang infundiert. In der Regel 2 bis 3 Wochen nach der Infusion können die infundierten HSCs eine ausreichende Zahl an reifen Blutzellen produzieren. Die Entnahme der HSCs aus dem peripheren Blut erfolgt erst nach Stimulation mit den oben genannten Zytokinen. Diese sorgen dafür, dass die Konzentration der HSCs im Blut bis über das 100 fache des physiologischen Wertes ansteigen. Unter dem Einsatz eines Zellseparators gelingt es in 1 bis 3 aufeinander folgenden Tagen in je 4- bis 5-stündigen Sitzungen die gewünschte Zahl an HSCs (nicht weniger als 2 x 10 6 CD34 positive Zellen/ kg Körpergewicht des Patienten) zu sammeln. Der Einsatz von mobilisierten Stammzellen hat gegenüber dem KM den 12

EINLEITUNG Vorteil der schnelleren Wiederherstellung der Hämatopoese (Gunsilius et al., 2001). Die dritte Möglichkeit der HSC-Gewinnung, die Entnahme von CB, wird in den folgenden Abschnitten genauer erläutert. 2.2 Nabelschnurblut (CB) Nabelschnurblut dient als Quelle für hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen und kann auch für die Transplantation von Stammzellen anstelle vonkm oder PBSC genutzt werden (Meyer et al., 2006). Beim Feten zirkulieren die Stammzellen noch im peripheren Blut, erst postpartal siedeln sie sich im KM an (Gluckman 2005). Die Transplantation von CB wird bereits routinemäßig und erfolgreich eingesetzt, um eine Vielzahl von malignen Erkrankungen bei Erwachsenen und Kindern, wie Leukämie, Thalasämie, Sichelzellanämie oder auch immunologische Defekte zu behandeln (Meyer et al., 2006, Gluckman et al., 1989, Gluckman er al., 1997, Butler et al., 2011). Die erste in der Literatur veröffentlichte Transplantation von CB wurde 1988 in Paris bei einem Patienten mit Fanconi Anämie durchgeführt (Gunetti et al., 2008, Gluckman et al., 1989), seither wurden weltweit mehr als 25.000 solcher Transplantationen durchgeführt (Butler et al., 2011). Der Einsatz von CB als Quelle für Stammzellen anstelle von KM oder Blutstammzellen birgt den Vorteil, dass weniger stringent auf ein Übereinstimmen der HLA-Merkmale zwischen Spender und Empfänger geachtet werden muss (Meyer et al., 2006), was die Suche nach einem passenden Spender erleichtert. Immerhin werden weltweit für ein Drittel der Patienten, die ein Stammzelltransplantat benötigen, keine HLA-kompatiblen Spender gefunden (Butler et al., 2011). Ein weiterer Vorteil eines CB-Präparates gegenüber einem Präparat aus dem KM ist das höhere Wachstumspotential der CFU (Gunetti et al., 2008), außerdem können die Zellen ohne Risiko für den Spender gesammelt werden. Zudem können sie - meist in flüssigem Stickstoff - gelagert werden und stehen damit sofort zur Verfügung, wenn sie gebraucht werden (Zingsem et al., 2003, Rubinstein et al., 1998, Gluckman et al., 2001, Madrigal et al., 1997). In der Regel kommt es außerdem bei dem Einsatz von Stammzelltransplantaten aus CB, auch wenn sie nicht HLA-identisch ausgewählt wurden, zu einer niedrigeren Rate an Transplantat-Wirt-Reaktionen (GvHD) (Meyer et al., 2006, Gluckman et al., 2005, Laughlin et al., 2001, Madrigal et al., 1997). Diese stellt die Hauptursache für Mortalität und Morbidität beim stammzelltransplantierten Patienten dar 13

EINLEITUNG (Rubinstein, 1995). Die Gefahr einen Infektionerreger, wie z. B. das Cytomegalievirus, zu übertragen, ist beim Einsatz von CB geringer als bei Stammzellen aus dem KM oder dem peripheren Blut (M-Reboredo et al., 2000). Eine Gegenüberstellung von Stammzellen aus CB und Stammzellen aus dem peripheren Blut, bzw. dem KM, zeigt die folgende Tabelle 2.1 (Ballen, 2005): CB Stammzellen aus dem KM / PBSCs (nicht T-Zell depletiert) Transplantat Verfügbarkeit uneingeschränkt Eingeschränkt Übereinstimmung der 4/6 oder besser am besten 10/10 oder 9/10 HLA-Merkmale Risiko einer GvHD reduziertes Risiko hohes Risiko Infektionsrisiko des vorhanden Hoch Empfängers Spender Lymphozyten keine Erhältlich Infusion Risiko für Spender keins Vorhanden Wiederholte Sammlung nicht möglich Möglich Tabelle 2.1: Vergleich Stammzellen aus PBSC und KM mit CB Um eine ausreichende Zellkonzentration für Transplantate für größere Kinder oder Erwachsene zu erreichen, ist es auch möglich, CB-Präparate von zwei oder mehreren Spendern zu einem Transplantat zusammenzufassen (Butler et al., 2011, Eapen et al., 2010, Brunstein et al., 2011, Verneris et al., 2009). Dies ist wichtig, da Untersuchungen gezeigt haben, dass der Erfolg der Transplantation von der Zahl der transplantierten nukleären Zellen abhängt und Einzel-CB- Präparate nicht genügend Stammzellen enthalten, um eine erfolgreiche hämatologische und immunologische Rekonstitution beim Erwachsenen zu gewährleisten (M-Reboredo et al., 2000, Gluckman et al., 1997). Allerdings ist bekannt, dass beim Transplantieren von gleichzeitig 2 CB-Präparaten das GvHD- Risiko ansteigt (Butler, 2011). Leider ist eine erneute Sammlung von CB im Gegensatz zu KM oder PBSC nicht möglich. Ein anderer Weg, um trotz der geringeren Zellzahl erfolgreiche Transplantationen zu erreichen, ist die Transplantation direkt ins KM, bzw. den Knochen (Gunetti et al., 2008, Castello et 14

EINLEITUNG al., 2004). Zur Frage des Erfolges von Stammzelltransplantationen bei Leukämiepatienten untersuchten Eapen et al. 1525 Patienten, die älter als 16 Jahre waren und zwischen den Jahren 2002 und 2005 Stammzellen aus CB, KM- Transplantate oder PBSC erhielten, im Hinblick auf Leukämie-freies Überleben (Butler, 2011, Eapen et al., 2010). Die Erfolge von CB-Transplantationen, bei denen 94 % der Patienten Präparate mit ein oder zwei ungleichen HLA-Merkmalen erhielten, waren vergleichbar mit Transplantationen von PBSPC oder KM, bei denen die Patienten Transplantate erhielten, die je 8 von 8 oder 7 von 8 passenden HLA-Allelen aufwiesen (Butler, 2011, Eapen et al., 2010). Bei den CB- Transplantaten war die Rate der Transplantatabstoßungen höher, dafür kam es im Vergleich zu KM- oder PBSPC-Transplantaten seltener zur akuten oder chronischen GvHD (Butler, 2011, Eapen et al., 2010). Das Auftreten einer chronischen GvHD war außerdem bei CB seltener, als bei PBSPC oder KM (Butler, 2011, Eapen et al., 2010). Diese Untersuchungen zeigen, dass es auf jeden Fall vertretbar ist, CB-Transplantationen in Situationen, in denen kein HLApassender Spender zur Verfügung steht, durchzuführen (Butler, 2011, Eapen et al., 2010). Neben der Gabe bei onkologischen Erkrankungen wurden Stammzellen aus CB bereits bei Patienten mit angeborener Immunschwäche eingesetzt (Butler, 2011, Frangoul et al., 2010). Auch hier fiel auf, dass die Verwendung von CB zu einer verminderten Rate an GvHD führte und dass es ein geringeres Risiko einer viralen Kontamination gab. Auch bei der Behandlung der angeborenen Immunschwäche konnte bei dem Einsatz von CB auf eine HLA-Identität zwischen Spender und Empfänger verzichtet werden (Butler, 2011, Frangoul et al., 2010). Bei metabolischen Erkrankungen, wie dem Hurler Syndrom, der Krabbe Erkrankung, dem Sanfilippo Syndrom, der metachromatischen Leukodystrophie und der Adrenoleukodystrophie, wurden bereits ebenfalls erfolgreich Stammzellen aus CB transplantiert (Butler, 2011, Prasad et al., 2008). CB-Zellen haben das Potential sich durch den Einsatz verschiedener Zellmedien in unterschiedliche Zelltypen zu entwickeln und sogar organspezifisches Gewebe zu produzieren. Neben den hämatopoetischen Stammzellen enthält CB auch endotheliale Zellen, mesenchymale Stromazellen, T-regulatorische Zellen, dendritische Zellen und natürliche Killerzellen (Butler, 2011, McKenna, 2011). Diese verschiedenen Zelltypen werden in der künftigen Forschung zur Reparatur von Gewebeschäden, wie sie beispielweise bei einer Herzkrankheit, nach einem Herzinfarkt, beim Diabetes mellitus, nach Schlaganfällen oder posttraumatischen 15

EINLEITUNG Rückenmarksschädigungen entstehen können, eine wichtige Rolle spielen (Butler, 2011, Lauber et al. 2010, Sanfilippo et al., 2007, Navarrete et al., 2009, Hollands et al., 2009). 2.3 Einlagerung des CBs Nachdem die Möglichkeit der Stammzellgewinnung aus CB erkannt wurde, wurden weltweit CB-Banken gegründet. Diese sind in der Lage, den Transplantationseinrichtungen eine hohe Anzahl an qualtitativ hochwertigen CB- Präparaten zur Verfügung zu stellen. Die ersten CB-Banken wurden in den frühen 90er Jahren in New York, Mailand und Düsseldorf gegründet (Ballen, 2005). Die Transfusionsmedizinische und Hämostaseologische Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen betreibt seit 1999 eine CB-Bank, in der seither lokal entnommene, sowie mit Hilfe eines Kooperationspartners bundesweit gesammelte CB-Präparate eingelagert werden. Prinzipiell gibt es für die Einlagerung von CB zwei Möglichkeiten: die öffentliche, allogene Spende und die private, autologe Einlagerung. Die öffentliche Spende steht prinzipiell für alle Spender unter gewissen medizinischen Voraussetzungen und dem Einverständnis der werdenden Eltern offen. Genauso ist ein allogen, also für die Allgemeinheit gespendetes Transplantat, prinzipiell jedem Empfänger zugänglich. Das Einverständnis der werdenden Eltern beinhaltet das Abtreten der Rechte am gespendeten Präparat, diese gehen auf die Betreiber der CB-Bank über. Von der CB-Bank werden die Präparate auf HLA-Merkmale, Infektionen und beinhaltete Zellzahlen untersucht. Diese werden, wie auch das Volumen des Präparates, an ein zentrales nationales oder internationales Register gemeldet, das diese Informationen zu Transplantationszwecken jederzeit abrufen kann. Vor allem für die Parameter Zellzahl und Volumen gibt es Grenzwerte, die erfüllt sein müssen, damit es überhaupt zur Einlagerung des allogenen CB kommt. Nur ca. 25 % der gesammelten Präparate erfüllen diese Anforderungskriterien (Butler, 2011). Auf der anderen Seite gibt es die CB-Banken, die CB privat, also für die autologe, bzw. familiäre Verwendung einlagern. Diese Präparate sind nicht für die Allgemeinheit zugänglich, das Eigentum wird vom Spender unter der Vormundschaft der Eltern behalten (Butler, 2011). Die autologen CBs müssen keine Qualitätsansprüche erfüllen, vielmehr entscheiden die Eltern, ob das CB eingelagert werden soll, weshalb die Qualitäten der CB-Präparate in den privaten CB-Banken meist unter denen der öffentlichen Banken liegen (Butler, 2011, Sun et 16

EINLEITUNG al., 2010). Ein großer Kritikpunkt an der autologen Einlagerung ist, dass das Kind, dessen CB eingelagert wurde, voraussichtlich das eingelagerte Präparat nie selber benötigen wird, es aber auch nicht für die Allgemeinheit durch die autologe Einlagerungsform zur Verfügung steht (Butler, 2011). So liegt die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kind bis zu seinem 21. Lebensjahr eine Krankheit aus dem hämatopoetischen Formenkreis bekommt, die die Transplantation seines eigenen CB-Präparates erforderlich macht, bei nur geschätzten 0,005 bis 0,04 % (Butler, 2011, Ballen et al., 2008). Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Geschwisterkind von dem CB profitiert, liegt bei 0,04 bis 0,07 % (Butler, 2011, Johnson, 1997). Die Amerikanische Akademie der Pädiater und die Amerikanische Gesellschaft für Blut und Knochenmarktransplantation unterstützen trotz dieser geringen Wahrscheinlichkeit die gerichtete Einlagerung von CB, also die Einlagerung von CB des einen Kindes für ein Geschwisterkind, wenn dieses Geschwister eine medizinische Beeinträchtigung (maligne oder genetisch) aufweist und deshalb von einer Transplantation profitieren könnte (Butler, 2011, Ballen, 2008, American Academy of Pediatrics 2007). Für die Beurteilung des künftigen Bedarfs des spendenden Kindes am eigenen CB darf nicht vergessen werden, dass bei akuten Leukämien bereits prä-leukämische, mutierte Zellen im CB gefunden wurden, so dass die autologe Verwendung hier mehr als fraglich ist und sogar eine Kontraindikation darstellen könnte (American Academy of Pediatrics 2007, Rowley, 1998). Dasselbe ist auch bei anderen malignen Erkrankungen zu diskutieren (Butler, 2011). In den letzten 15 Jahren wurde die Einlagerung von CB immer populärer, was an der besseren Verfügbarkeit und auch an dem verbesserten Potential, Krankheiten zu heilen, liegt (Butler, 2011). Für die Mehrzahl der Familien kommt allerdings aus Kostenoder anderen Gründen vor allem die öffentliche Spende in Frage (Butler, 2011). 2.4 Lagerung der CB-Präparate Die meisten CB-Präparate werden weltweit in flüssigem Stickstoff oder der Gasphase über flüssigem Stickstoff gelagert und erst kurz vor der Transplantation aufgetaut (Timeus, 2003). Bereits 1955 konnten Barnes et al. nachweisen, dass bei einer Maus, die zuvor einer tödlichen Bestrahlungsdosis ausgesetzt wurde, implantierte, vorher kryokonservierte Milzzellen, wieder hämatologische Zellen produzieren konnten (Hubel, 1997, Barnes et al., 1955). Ungefähr 40 Jahre später war die Kryokonservierung von KM eine Standardprozedur bei der autologen 17

EINLEITUNG Transplantation (Hubel, 1997, Areman et al., 1990, Rowely 1992). Auch bei der allogenen Transplantation wurde sie erfolgreich eingesetzt, allerdings war der Einsatz diesbezüglich nicht so weit verbreitet (Hubel, 1997; Lasky et al., 1989). 2.4.1 Grundlagen zur Kryokonservierung Für das Überleben von Zellen nach dem Einfrieren und Wiederauftauen spielen unterschiedliche Einflüsse eine Rolle (Hubel, 1997). Abbildung 2.2 zeigt schematisch die Antwort einer Zelle auf das Einfrieren (Hubel, 1997). Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Zellantwort auf das Einfrieren (Abbildung aus Hubel, 1997) Zunächst befinden sich die Zellen in einer Kryokonservierungs-Lösung bei Raumtemperatur (oder darunter). Wenn das Präparat abgekühlt wird, beginnt die Eisbildung. Durch die Eisbildung wird Wasser aus der Lösung, in der sich die Zellen befinden, entzogen. Dieser Wasserentzug bewirkt eine plötzliche Veränderung der Konzentration der bisher nicht gefrorenen extrazellulären Lösung. Um den Gleichgewichtszustand zwischen extra- und intrazellulärer Flüssigkeit zu erhalten, kommt es zum Austritt von intrazellulärer Flüssigkeit. Bei hohen Abkühlgeschwindigkeiten kann dieses Gleichgewicht nicht aufrecht erhalten 18

EINLEITUNG werden, da die Geschwindigkeit, in der das chemische Potential in der extrazellulären Lösung vermindert wird, viel größer ist, als die Geschwindigkeit mit der intrazelluläres Wasser aus den Zellen nachströmen kann. Das Resultat dieses Ungleichgewichtes ist, dass sich intrazelluläres Eis im Zytoplasma bildet, was potentiell tödlich für die Zellen ist (Hubel, 1997, Toner, 1993). Bei steigenden Abkühlgeschwindigkeiten steigt die Prozentzahl von Zellen mit intrazellulärem Eis von 0% auf 100%. Bei niedrigeren Abkühlgeschwindigkeiten stellt sich das Ganze anders dar. Die Zellen sind zunächst über längere Zeit Temperaturen über dem Gefrierpunkt und damit einem hohen extrazellulären Flüssigkeitsanteil ausgesetzt. Dadurch kommt es wegen des angestrebten Gleichgewichtes auch zu einer hohen intrazellulären Flüssigkeitskonzentration, die sich potentiell zellschädigend auswirkt (Hubel, 1997, Lovelock, 1953). Beim langsamen Einfrieren erfahren die Zellen einen hohen Flüssigkeitsverlust. Es kommt zu Interaktionen mit dem entstehenden Eis in der Nachbarschaft der Zellen, wodurch es wieder zu einer Zellschädigung kommen kann (Hubel, 1997, Hubel, 1992, Mazur, 1984). Je länger dieser Einfriervorgang andauert, desto höher ist der intrazelluläre Flüssigkeitsverlust und die extrazelluläre Eisbildung und desto niedriger ist die Zahl der überlebenden Zellen (Hubel, 1997). Aus der Abbildung 2.2 ist ersichtlich, dass sich das Überleben der Zellen zu der Einfriergeschwindigkeit in einer umgekehrten U-Kurve darstellen lässt, was bedeutet, dass die optimale Einfriergeschwindigkeit zwischen den beiden Extremen liegt. Auch das Wiederauftauen hat einen Einfluss auf das Überleben der kryokonservierten Zellen. Bei Zellen, die während des Einfrierens intrazelluläres Eis gebildet haben, d. h. Zellsuspensionen, die schnell eingefroren wurden, sorgt ein langsames Auftauen dafür, dass sich die Eiskristalle vergrößern und damit die Zellen weiter schädigen (Hubel, 1997, Mazur, 1977). Eine erhöhte Auftaugeschwindigkeit führt in diesen Fällen dagegen zu einer erhöhten Zellüberlebensrate (Hubel, 1997, Mazur, 1968). Hingegen ist es anders bei Zellsuspensionen, die langsam eingefroren wurden, hierzu existieren unterschiedliche Angaben. Mazur und Schmidt zeigten am Beispiel von Hefen, dass die Auftaugeschwindigkeit von langsam eingefrorenen Zellen keinen Einfluss auf die Zellüberlebensrate zu haben scheint (Hubel, 1997, Mazur, 1968). Leibo et al. zeigten hingegen, dass das schnelle Auftauen für langsam eingefrorene Zellen und Embryonen gefährlicher ist, als das langsame Auftauen (Hubel, 1997, 1974). 19

EINLEITUNG 2.4.2 Zusatz von Gefrierschutzlösung In den frühen Jahren der CB-Kryokonservierung (1993-1996) wurde das CB als gesamtes Vollblut mit 10 % Gefrierschutzlösung Dimethylsulphoxid (DMSO) kryokonserviert (Ballen, 2005). In späteren Jahren wurde und wird bis heute zunächst das Blutvolumen durch den Entzug von Plasma und Erythrozyten reduziert (Ballen, 2005, Armitage et al., 1999), um die Menge des zuzusetzenden DMSO geringer halten zu können, anschließend erfolgt die Zugabe von DMSO. Der Zusatz von Gefrierschutzlösung ist nötig, da diese die intra- und extrazelluläre Kristallbildung unterbindet und deshalb den durch Kristalle verursachten Zelltod verhindert (Berz et al., 2007, Loveluck, 1959). DMSO ist die weitest verbreitete Gefrierschutzlösung für die Kryokonservierung von Stammzellpräparaten. Genutzt werden können aber auch noch hochmolekulare, nicht permeable Gefrierschutzlösungen wie Dextran oder Hydroxyethylstärke (HES) (Woods et al., 2007). DMSO, das in die Zellmembran eindringen kann, wurde ursprünglich in der Medizin als antiinflammatorisches Reagens eingesetzt, bis heute wird es zur Behandlung von bestimmten Autoimmunkrankheiten genutzt (Berz et al., 2007, Eberhardt et al., 1995, Albanell et al., 2000). Normalerweise wird es zur Aufbereitung von CB in Konzentrationen von 10 % in Kombination mit Salinen und Serumalbumin eingesetzt (Berz et al., 2007, Katayama et al., 1997, Branch et al., 1994). Diese Konzentration wird als nicht toxisch für die Stammzellen angenommen (Berz et al., 2007, Branch et al., 1994), wenn die Kryokonservierung in den nächsten 2 Stunden erfolgt (Katayama et al., 1997). Allerdings kann das zugesetzte DMSO zu Nebenwirkungen beim Empfänger des Transplantates führen (Berz et al., 2007). Dazu zählen neben Übelkeit, Erbrechen und Bauchkrämpfen, die in über der Hälfte der Fälle auftreten (Berz et al., 2007, Zambelli et al., 1998), auch kardiovaskuläre (Berz et al., 2007), respiratorische (Berz et al., 2007, Benekli et al., 2000), renale und hepatische Beeinträchtigungen, sowie Hämolyse (Berz et al., 2007, Burger et al., 1991). 2.4.3 Ablauf der Kryokonservierung Das Einfrieren geschieht in der Regel kontrolliert, die Angaben hierzu können je nach CB-Bank variieren. Beispielsweise wird hierzu der auf +4 C gekühlte Beutel in einen Einfrierautomaten gestellt und darin kontrolliert auf -100 C tiefgefroren. Da es beim unkontrollierten Einfrieren am eutektischen Punkt bei ca. 4 C zur thermodynamisch bedingten Hitzefreisetzung kommt, die schädlich für die 20

EINLEITUNG Stammzellpopulation ist, hat sich das kontrollierte Einfrieren als Standardmethode etabliert, weil so die Abkühlung derart gesteuert wird, dass die Hitzefreisetzung vermieden wird (Berz et al., 2007). Allerdings werden für diese Prozedur Zeit und geschultes Personal benötigt (Berz et al., 2007). Für die Lagerung ist eine Endtemperatur von unter -150 C erforderlich, die sowohl in der Gasphase, als auch in flüssigem Stickstoff erreicht wird. Bei der Lagerung in der flüssigen Phase in Stickstofftanks wurde die Übertragung von Pilzen (z.b. Aspergillus) und einigen Viren beobachtet, weshalb die aktuell empfohlene Lagerung die Lagerung in der Gasphase bei unter -150 C ist (Berz et al., 2007). 2.4.4 Dauer der Lagerung Die Zeitspanne über die Stammzellen in Stickstoff gelagert werden können, ist bisher noch weitestgehend unklar (Berz et al., 2007). Kobylka et al. und Mugishima et al. zeigten eine Haltbarkeit von Stammzellpräparaten nach Kryokonservierung von 12 und 15 Jahren mittels Durchflusszytometrie und der Anzucht von Stammzellen (Berz et al., 2007, Kobylka et al., 1998, Mugishima et al., 1999). Eine Haltbarkeit von 15 Jahren wurde außerdem durch hämatopoetische Rekonstitution bei Mäusen gezeigt (Berz et al., 2007). Zudem wurde der Erfolg von Stammzellpräparaten, die 11 Jahre, bzw. 7,8 Jahre kryokonserviert waren und anschließend transplantiert wurden, retrospektiv gezeigt (Berz et al., 2007, Aird et al., 1992, Attarian et al., 1996). 2.4.5 Wiederauftauen Zum Auftauen haben sich Automaten (z.b. Plasmotherm) bewährt, in denen das Präparat zwischen Plastikkissen, die mit auf 37 C erwärmtem Wasser gefüllt sind vorsichtig erwärmt wird, bis die enthaltenen Eiskristalle verschwinden. In manchen Ländern wird hierzu noch eine Wasserbad verwendet (Berz et al., 2007, Katayama et al., 1997). Hierzu existiert eine Untersuchung einer Arbeitsgruppe der Technischen Universität Dresden, die das Auftauen von kryokonservierten Stammzellpräparaten im warmen Wasserbad mit dem Auftauen in einem Automaten verglich. Das Überleben der Stammzellen war bei beiden Methoden gleichwertig, allerdings wurde eine Tendenz zu einer niedrigeren bakteriellen Kontamination bei der Verwendung des Automaten festgestellt (Berz et al., 1997, Röllig et al., 2002). Es existiert außerdem eine Vorgehensweise, die vor allem von Transplantationszentren in den USA durchgeführt wird, den DMSO-Gehalt beim 21

EINLEITUNG Auftauen durch Waschen oder Verdünnen im Endprodukt zu verringern, bisher wurde nur ein geringer bis gar kein Effekt auf das Überleben der Stammzellen festgestellt (Berz et al., 1997, Syme et al., 2004, Moroff et al., 2004). Allerdings sinkt so die DMSO-Belastung und damit das Risiko der unerwünschten Wirkungen für den Empfänger. Generell werden die Präparate relativ schnell aufgetaut, im Gegensatz zum langsamen Einfrieren. Damit versucht man das Umformen jeglicher kleiner intrazellulärer Eiskristalle, die während des Einfrierens entstanden sind, zu großen intrazellulären Eiskristallen, die die Zelle zerstören könnten, zu vermeiden (Woods, 2007, Mazur, 1990). 2.4.6 Zielsetzung dieser Arbeit Ein möglicher Einflussfaktor auf die Zellüberlebensrate nach dem Auftauen ist die Gesamtkonzentration an Zellen im CB-Präparat. Frühere Studien zeigten, dass mehr Erythrozyten beim Auftauen hämolysierten, wenn die Zellkonzentration im Präparat vor dem Einfrieren hoch war. Insbesonders bei der Kryokonservierung von Erythrozyten stellten die Arbeitsgruppen fest, dass es bei steigenden Erythrozytenkonzentrationen zu einem Abfall der Zellüberlebensrate kam (Hubel, 1997, Nei, 1967, Pegg et al., 1989). Der Grenzwert des Zytokrits, der mit Zellschädigung assoziiert ist, liegt nach Hubel annähernd bei 20 %. Für Stammzellen würde ein solcher Grenzwert von 20 % für eine Zellkonzentration von ungefähr 6 x 10 8 Zellen pro Milliliter sprechen (Hubel, 1997). Allerdings bedeutet das aus diesen Beobachtungen resultierende Einfrieren von geringeren Zellmengen pro Präparat, dass für das Einfrieren einer Spende mehrere Beutel verwendet werden müssen. Dies stellt einen erhöhten Mehr- und natürlich auch Kostenaufwand dar, da pro Präparat mehrere Beutel aufbereitet und in flüssigem Stickstoff gelagert werden müssen. Für eine geplante Transplantation hat die Lagerung in mehreren Beuteln zwar den Vorteil, dass es noch einen Ersatzbeutel gibt, falls ein Beutel beim Auftauen oder der Lagerung beschädigt werden sollte, fraglich ist aber, ob die Zellzahl im verbleibenden Beutel überhaupt für Transplantationszwecke ausreichend ist. Ein Nachteil für den Empfänger ergibt sich aus der höheren DMSO-Menge, die ihm durch die Gabe von mehreren Präparatebeuteln zugeführt wird. Nachdem bereits andere Studien gezeigt haben, dass es im Gegensatz zu früheren Vorstellungen bei dem Einfrieren von Stammzellpräparaten aus KM und PBSC in höheren Zellkonzentrationen nicht zur Schädigung der Stammzellen kommt, soll die hier vorliegende Arbeit nun klären, 22

EINLEITUNG ob sich höhere Zellkonzentrationen nachteilig auf die Vitalität der Stammzellen im CB-Präparat nach dem Wiederauftauen auswirkt (Rowley et al., 1994, Cabezudo et al., 2000). Im Einzelnen sollen hierbei folgende Fragen geklärt werden: - Welche durchschnittlichen Zellzahlen finden sich in den CB-Beuteln, die in den Jahren 2003-2011 in der Universitätsklinik Erlangen eingefroren wurden vor und nach dem Auftauen? - Kommt es durch den Kryokonservierungs- und Auftauprozess per se zum Verlust an Zellen? - Wie ist die durchschnittliche Ausbeute an Leukozyten, CD34-positiven Leukozyten, CFUs und Erythroblasten vor und nach dem Auftauen und gibt es einen Zusammenhang mit den Begleit-Zellpopulationen? - Gibt es einen Zusammenhang zwischen der Zahl der Begleitpopulationen (Thrombozyten, Erythrozyten, MNC) im CB-Beutel und der Vitalität der Stammzellen aus dem CB nach dem Wiederauftauen? - Beeinträchtigt ein höheres Präparatevolumen im CB-Beutel die Vitalität der Stammzellen nach dem Wiederauftauen? 23

PATIENTEN UND METHODEN 3. PATIENTEN UND METHODEN 3.1 Patienten Die Daten von 5520 Spenderinnen, von denen in den Jahren von 2003 bis 2011 CB zur allogenen und autologen Verwendung in der Plazentarestblutbank der transfusionsmedizinischen und hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen eingelagert wurden, wurden untersucht. Vor jeder Spende wurde mittels eines standardisierten Fragebogens die Eigen- und Familienanamnese der Spenderin abgefragt. Die Spenderinnen wurden außerdem über die Plazentarestblutspende aufgeklärt und ihre Einwilligung schriftlich erfasst. Zudem bestand für die Spenderinnen noch die Möglichkeit, das Blut zu wissenschaftlichen oder Qualitätskontrollzwecken freizugeben, falls das entnommene CB den Qualitätsanforderungen nicht entsprach. Grundlagen für die Spenderauswahl sind die Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapierichtlinien) (Wissenschaftlicher Beirat 2005) und die Richtlinien zur Transplantation von Stammzellen aus CB (Wissenschaftlicher Beirat, 1999). Diese sind in der Standard Operation Procedure (SOP) Beurteilung der Eignung von Spenderinnen zur Plazentarestblutspende der Abteilung in ihrer jeweiligen Fassung zusammengefasst. Durch die Besonderheiten der CB-Spende ergeben sich allerdings einige Abweichungen von den genannten Regelwerken, da diese sich hauptsächlich auf Fremdblutspender beziehen. Außerdem bestehen auch Unterschiede in der Spenderauswahl zwischen allogenen und autologen Spenderinnen. Die folgenden Faktoren führen zu einem Ausschluss von der autologen CB-Spende: - kein schriftliches Einverständnis der Mutter zur Gewinnung von CB - bekannte Positivität der Mutter für Hepatitis B Virus (HBV)s-Antigen, Anti- Hepatitis C Virus (HCV), Anti-Humanes Immundefizienz Virus(HIV)1/2, positive HIV-, HCV-, HBV-Nukleinsäureamplifikations-Testung (NAT) - Infektionskrankheiten der Schwangeren, die zur peripartalen Infektion des Neugeborenen führen können - schwere perinatale Asphyxie des Neugeborenen - Frühgeburtlichkeit, beziehungsweise pränatale Dystrophie mit einem Geburtsgewicht unter 1500 g 24

PATIENTEN UND METHODEN - Hinweise für schwere hämatologische, immunologische oder infektiologische Erkrankung des Neugeborenen - relevante Fehlbildungen des Neugeborenen Die Ausschlussgründe zur allogenen CB-Spende unterscheiden sich nicht von den Dauerausschlussgründen, die für Fremdblutspender, definiert durch die Hämotherapierichtlinien, gelten. Die bei Fremdblutspende durch die Schwangerschaft gegebene Nicht-Eignung fällt in diesem Fall natürlich weg. 3.2 Methoden 3.2.1 Herstellung von Stammzellen aus CB Die Herstellung von Stammzellen aus Plazentarestblut erfolgte nach den SOPs Herstellungsanweisungen für Stammzellen aus Plazentarestblut in der jeweils gültigen Fassung. Die Aufbereitung erfolgte entsprechend den Richtlinien zur Transplantation von Stammzellen aus CB (Wissenschaftlicher Beirat, 1999) so, dass das Präparat spätestens 48 Stunden nach der Entnahme tiefgefroren war. Die Gesamtdauer der Bearbeitung (Auftrennung der Blutbestandteile und Kryokonservierung) betrug ungefähr 2 Stunden. Der Zeitpunkt der ersten Punktion der Nabelschnur galt im Herstellungsprozess als Zeitpunkt 0. Zunächst erfolgte die Blutbestandsteilauftrennung, anschließend die Kryokonservierung. 3.2.1.1 Blutbestandteilsauftrennung Der Inhalt des Entnahmeschlauchs wurde mit einer Rollenzange mit dem Beutelinhalt vermischt. Nach Versiegelung des Restschlauches auf einer Entfernung von ca. 5 cm vom Beutel wurde der Inhalt zu Qualitätskontrollen verwendet. Das Füllgewicht der mit CPD antikoagulierten Vollblutkonserve wurde auf einer geeichten Waage kontrolliert. Das Gewicht des Beutelystems wurde vom Füllgewicht abgezogen, das Füllvolumen durch Division durch die Dichte berechnet. Der Sollbereich (Volumen mit CPD) war festgelegt auf: - allogen: Mindestvolumen: 60 ml Volumenbereich: 60 bis 150 ml - autolog: Mindestvolumen: nicht festgelegt Volumenbereich: 30-150 ml 25

PATIENTEN UND METHODEN Aus der CB-Vollblutkonserve erfolgte die Entnahme von Blutproben zur Sterilkontrolle des Ausgangsmaterials, zur molekularbiologischen HLA-Klasse I/II- Typisierung, zur Zellzahlbestimmung (Blutbild), zur CD34-Bestimmung und, bei allogenen Präparaten zur Erythroblastenbestimmung Im Sterillabor wurde der Vollblutkonserve 6%-ige HES, MW 450.000 nach der folgenden Formel hinzugefügt: Zugabemenge HES = Volumen CB x 23,8%. Das HES wurde mittels Spritze steril unter Kontrolle des Gewichts in den Vollblutbeutel transferiert. Anschließend wurde das freie Schlauchende eines Doppel-Leerbeutels mit einem Sterilschweißgerät an das freie Schlauchende des CB-Vollblutbeutels angeschweißt. Es erfolgte eine Zentrifugation bei 20 C über 5 Minuten, bei maximaler Beschleunigung und 30 g. Nach Entnahme des Blutbeutelsystems aus der Zentrifuge wurde dieses in einen manuellen Separator eingelegt. Das leukozytenreiche Plasma wurde nach Eröffnen der Schweißnaht in den dafür vorgesehenen Leerbeutel abgeleitet und anschließend der Beutel mit dem Erythroytenkonzentrat (EK) abgeschweißt. Der Beutel mit dem leukozytenreichen Plasma wurde gewogen, das Gewicht vom Beutelsystem subtrahiert und das Nettogewicht durch die Dichte von leukozytenreichem Plasma dividiert, um das Volumen zu ermitteln. Zur Bestimmung des Beutelvolumens des EKs wurde dieses gewogen, das Gewicht des Beutelsystems subtrahiert und das Nettogewicht durch die Diche des EK dividiert. Das EK war ein Abfallprodukt der Herstellung. Aus dem EK wurden Proben zur Blutgruppenbestimmung entnommen. Der Doppelbeutel mit dem leukozytenreichen Plasma wurde anschließend bei 20 C für 10 Minuten bei maximaler Beschleunigung und 400 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das Beutelsystem erneut in den manuellen Separator eingelegt. Das leukozytenarme Plasma wurde in den Leerbeutel abgeleitet. Zur Bestimmung des Volumens wurde der leukozytenarme Plasmabeutel gewogen, das Gewicht des Beutels substrahiert und anschließend durch die Dichte von Plasma dividiert. Dieser Überstand diente für die Kryokonservierung als Suspensionsmedium und war somit ein Zwischenprodukt der Herstellung. Aus dem leukozytenarmen Plasma wurden Proben für eine Testung auf Parvovirus-B19 entnommen. Anschließend wurde das Leukozytenkonzentrat (LK) mit einer Spritze in einen Einfrierbeutel transferiert. Das LK war ein Zwischenprodukt der Herstellung, ging aber vollständig in das Endprodukt über. Aus dem LK wurde eine Probe entnommen, um eine Zellzahlbestimmung, eine CFU-Testung und eine CD 34-Bestimmung 26

PATIENTEN UND METHODEN durchzuführen. Der Konzentratbeutel wurde mit Plasma gefüllt und durchmischt, anschließend wurde das Plasma ebenfalls in den Einfrierbeutel transferiert. Dieser Schritt wurde mit weiterem leukozytenarmen Plasma wiederholt. Es entstand ein Zwischenprodukt des verdünnten LKs, dem jetzt noch Kryokonservans zugesetzt werden musste. Das Ziel-Volumen vor Kryokonservans-Zugabe betrug 30 bis 75 ml, im Mittel 50 ml. Hier kam es aber zu erheblichen Schwankungen. Die Volumenbestimmung des Endproduktes erfolgte aus der Addition des Volumens des Zwischenproduktes LK und dem zugegebenen Volumen Kryokonservans. Aus dem LK nach DMSO-Zugabe wurden jetzt noch folgende Proben zur Sterilkontrolle und zur Befüllung der Pilotröhrchen, die zusammen mit dem Endprodukt eingefroren wurden (1 für Viabilitätstestungen nach Auftauen, 3 für ergänzende HLA-Nachtypisierungen)entnommen. Das Füllvolumen wurde mittels der Formel: Volumen LK + Menge zugegebenes DMSO Proben berechnet. 3.2.1.2 Kryokonservierung Der etikettierte Einfrierbeutel wurde auf einen Kühlakku mit 4 C gelegt. Die Temperatur des Akkus durfte während des Prozesses auf 10 C ansteigen. Die zuzugebende Kryokonservans-Menge (33 % DMSO) wurde nach folgender Formel berechnet: Menge Kryokonservans = Volumen des LKs / 2,333 Der erste Einfrierbeutel enthielt somit eine Suspension aus LK und Kryokonservans. Im Folgenden erfolgte die Aufteilung auf 2 oder 3 Endproduktbeutel. Die genauen Volumina wurden dokumentiert. Die Beutel wurden mit Schweißzangen dicht verschlossen. Bei jedem Beutel wurde durch doppeltes Schweißen ein Schlauchsegment von ca. 2 cm Länge hergestellt. Anschließend wurden die Beutel in die Einfrierkassetten gelegt, diese verschlossen und in den auf 4 C vorgekühlten Einfrierbehälter gestellt. Es folgte die kontrollierte Kryokonservierung der Leukozytensuspension. Dabei musste die Temperatur in der Kammer nach 62 Minuten -100 C betragen. Der Einfrierprozess hatte folgenden Ablauf: 27

PATIENTEN UND METHODEN Einfrierrate ( C/min) Dauer (min) Endtemperatur ( C) vor dem Bestücken, vorkühlen auf 4 C, Temperatur halten +4-1 4 0 0 15 0-0,83 12-10 -50 0,6-40 4 5-20 -1 15-35 -6,5 10-100 bei -100 C Kammertemperatur bis zur Entnahme des Gefriergutes halten Tabelle 3.1: Ablauf des Einfrierprozesses Nach der Einfrierprozedur wurden die Beutel im Quarantänetank für Stammzellpräparationen in der Gasphase über Flüssigstickstoff gelagert. Wenn die Ergebnisse der Infektionstestungen (Infektionsserologie und NAT) und der Sterilkontrolle vorlagen und die Produkte wurden, wurden sie in einen Lagertank für freie Arzneimittel überführt und dort ebenfalls in der Gasphase über Flüssigstickstoff zusammen mit den 4 Pilotröhrchen und je 2 Plasmaröhrchen der Mutter gelagert. Verwendete Geräte und Materialien: Entnahme-Blutbeutel MSE2204D, MacoPharma GmbH, Robert-Bosch-Str. 11, 63225 Langen Doppel-Leerbeutel VDC 1000 XC oder VDC 1001 XC, MacoPharma Einfrierbeutel R4R9951, Nexell Therapeutics, Inc., 9 Parker Irvine, CA 92618, USA GSR 1000 AU, GDR 1000 AK, MacoPharma GmbH OriGen Cryostore CS50, OriGen Biomedical Inc., 1.7000 Burleson Rd, Bldg D Austin, TX USA 78744-3202 Sterilschweißgerät Terumo SCD 312, Terumo Medical Corporation, Elkton MD 21921, USA; Composeal progress Universal NPBI, Model F3006, Emmer-Compascuum, 7881 HM, Niederlande 28

PATIENTEN UND METHODEN Blutbeutelzentrifuge Hettich Rotixa 630 RS, Andreas Hettich GmbH, Gartenstr. 100, 78532 Tuttlingen Waage Ohaus Precision Standard, OHAUS GmbH, Ockerweg 3a, 35396 Giessen Stickstoff (N 2 )-Einfrier- Consartic Biofreeze BV50, Consartic Biofreeze BV40, gerät Consartic GmbH, Postfach 1133, 63821 Schöllkrippen N 2 -Lagertank Consartic Flüssig N 2 Behälter BSD 750 HES z.b. HES Grifols, S.A. Can Guasch, 2 Parets del Vallés, 08150 Barcelona, Spanien Kryokonservierungs- 33 Volumen-% DMSO und 67 Volumen-% PBS, Apothlösung eke des Universitätsklinikums Erlangen, in Gebinden je 20 ml, Haltbarkeit ab Herstellung in ungeöffneten Gefäßen je 2 Jahre 3.2.2 Zellzählung Die Zellzahlbestimmung wurde im Vollblut am Blutbildautomaten Sysmex KX1000 (TOA Medical, Kobe, Japan) durchgeführt. Dieser misst folgende Parameter: Leukozyten x 10 3 /µl, Erythrozyten (RBC) x 10 6 /µl, Hämoglobin (Hgb) in g/dl, Hämatokrit (HKT) in %, Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (MCV) in fl, Mittlereskorpuskuläres Hämoglobin (MCH) in pg, Mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) in g/dl und Thrombozyten x 10 3 /µl 3.2.3 CD34 Messungen am Durchflusszytometer Mittels durchflusszytometrischer Messungen wurden die Zahl der CD34-positiven Zellen, die Leukozytenzahlen, die MNCs sowie die Zahl an vitalen Leukozyten und vitalen CD34-positiven Zellen in Anlehnung an das ISHAGE-Protokoll (Sutherland et al., 1996) gemäß einer SOP der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung gemessen. 3.2.3.1 Prinzipien der Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie, die auch als Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) bezeichnet wird, ist als lasergesteuertes Verfahren in der Lage, verschiedene Zellen in Lösung durch die Bindung von spezifischen fluoreszierenden Antikörpern und das Erkennen von verschiedenen Zelleigenschaften voneinander zu unterscheiden (siehe Abbildung 3.1). 29

PATIENTEN UND METHODEN Zur Analyse werden die Zellen einzeln (perlschnurartig) in relativ hohem Tempo über eine Kapillare an einem monochromatischen Laserstrahl vorbei geführt. Ein typisches Durchflusszytometer Computer System Detector & Mechanical Fluidics Die mit Antikörpern "angefärbten" Zellen werden aus der Zellsuspension aufgesaugt und jede einzelne in einem Hüllstrom im Laserlicht analysiert... 10 000 Zellen in wenigen Minuten! Abbildung 3.1: Der typische Aufbau eines Durchflusszytometers. (Schütt C. Eine kurze Einführung in die Durchflusszytometrie. http://www.medizin.unigreifswald.de/immun/weiterbildung.html vom 14.02.2012) cs895e Die perlschnurartige Anordnung wird durch eine Verminderung der Querschnittsfäche der Messküvette erreicht. Die die Zellen umgebende Flüssigkeit ist eine isotonische Lösung, die dafür sorgt, dass es nicht zu Verwirbelungen kommt und die Zellen einzeln an dem Laser vorbeigeführt werden. Durch diesen werden die Zellen, an die die fluoreszierenden Antikörper gebunden sind, zur Emission von elektrischen Signalen, die sich direkt proportional zu den angelagerten Antikörpern pro Zelle verhalten, angeregt (siehe Abbildung 3.2). Auch die Lichtbeugung, die Lichtbrechung und die Lichtstreuung der einzelnen Zellen spielen eine Rolle. Die Lichtbeugung, das Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter), hängt von dem Volumen der Zellen ab, die Lichtbrechung im rechten Winkel, das Seitwärtsstreulicht (SSC = Sidewards Scatter), wird von der Granularität der Zellen bestimmt und die Lichtstreuung korreliert mit der Komplexität und Größe der untersuchten Zellen (siehe Abbildung 3.3). 30

SSC (granularity) Log fluorescence (red) PATIENTEN UND METHODEN Charakterisierung einer Zellpopulation mittels Zweifarbenfluoreszenz z.b.aktivierte T Zellen: CD3+CD69+ ruhende T Zellen: CD3+CD69 - A +(%) A + B +(%) Laser FSC FL2 FL1 neg. (%) Log fluorescence (green) B +(%) cs895d FACS Abbildung 3.2: Differenzierung von Zellen durch den Einsatz von fluoreszensmarkierten Antikörpern (Schütt C. Eine kurze Einführung in die Durchflusszytometrie. http://www.medizin.unigreifswald.de/immun/weiterbildung. html vom 14.02.2012) Größe und Granularität FSC Granulozyten Laser SSC FSC (cell size) Monozyten Lymphozyten FSC- Vorwärtsstreuung; SSC- Seitwärtsstreuung cs895a Abbildung 3.3: Beipielhafte Darstellung der Differenzierung von Zellen über ihre unterschiedliche Größe und Granulität mit FSC und SSC. (Schütt C. Eine kurze Einführung in die Durchflusszytometrie. http://www.medizin.uni-greifswald.de/immun/weiterbildung.html vom 14.02.12) 31

PATIENTEN UND METHODEN So gelingt es durch den Einsatz eines Computerprogrammes, in dem die Messergebnisse als Punktewolken (siehe Abbildungen 3.2 und 3.3) dargestellt werden, die Blutzellen relativ sicher voneinander zu unterscheiden. 3.2.3.2 Testprinzip Die Untersuchung wurde als Ein-Röhrchen-Test durchgeführt. In ein BD Truecount-Röhrchen (TC-Röhrchen) wurde ein Reagenz gegeben, in dem sich die fluorochrom-markierten Antikörper Anti-CD45 FITC und Anti-CD34 PE befanden, sowie der Nukleinsäurefarbstoff 7-Aminoactinomysin (7-AAD). Anschließend wurde die zu analysierende Probe hinzu pipettiert. Die Antikörper binden sich spezifisch auf die Antigene auf den Zellen, während der Farbstoff, der nicht durch die intakte Zellmembran dringen kann, die DNA und RNA der toten, kernhaltigen Zellen anfärbt. Zur Lyse der Erythrozyten vor der Messung wurde Amonium Chloride Lysing Solution verwendet. Das lyophilisierte Sediment im TC-Röhrchen löste sich auf und setzte eine bekannte Anzahl an fluoreszierenden Mikropartikeln frei. Bei der anschließenden Analyse im Durchflusszytometer FACSCalibur erhielt man die absolute Zahl an CD34-positiven Zellen je µl Probe durch: (gemessene Zahl an CD34-positiven Zellen / Anzahl der fluoreszierenden Mikropartikel) x Mikropartikelkonzentration / eingesetztes Blutvolumen pro Röhrchen). 3.2.3.3 Testdurchführung Der Ansatz wurde wie folgt durchgeführt: - für jede Probe 1 TC-Röhrchen beschriften - 5 µl 7-AAD Reagenz in Röhrchen pipettieren - 20 µl des fluorochrom-markierten Antikörpergemisches in Röhrchen pipettieren - 50 µl gut gemischtes antikoaguliertes Blut in das TC-Röhrchen pipettieren - Proben sorgfältig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren - 1000 µl Lysing Solution hinzugeben (1:10 mit Aqua destilata verdünnt) - Proben vorsichtig mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren 32

PATIENTEN UND METHODEN Anschließend erfolgte die Messung am Durchflusszytometer. Dies musste innerhalb 6 Stunden nach Präparation geschehen. Vorher wurde erneut gründlich gemischt. Die relevanten Werte (siehe Beispielbild 3.4) waren: - Zahl der weißen Blutzellen / µl: CD45 + Zellen - Vitalität der CD45-positiven Zellen in %: CD45 Viability - CD34-positive Zellen in % aller CD45-positiven Zellen: CD34 in % der CD45 - Vitalität der CD34-positiven Zellen in %: CD34 Viability - Vitale CD34-positive Zellen / µl: viable CD34 - MNCs in % aller CD45-positiven Zellen: total MNC 33

PATIENTEN UND METHODEN - - Abbildung 3.4: Beispiel des Ergebnisses einer Messung am Durchflusszytometer 34

PATIENTEN UND METHODEN 3.2.4 CFU-Testungen 3.2.4.1 Prinzip Die hämatologischen Stamm- und Vorläuferzellen sind, wie unter 2.1 beschrieben, in der Lage, sich auch in Kulturansätzen zu vermehren und zu differenzieren. Sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung geben Aufschluss über die Vitalität, die Reife und die Wachstumsfähigkeit dieser Zellen. Bei geeigneten Kulturbedingungen zeigt dieser Test nach ca. 2 Wochen das Wachstum von Granulozyten- und Makrophagen- bildende Zellkolonien (CFU-GM), Granulozyten-, Erythrozyten-, Makrophagen und Megakaryozyten- bildende Zellkolonien (CFU- GEMM) und Erythrozytenkolonien (englisch: burst forming units = BFU-E) (siehe Abbildung 3.5). Der Anteil an Vorläuferzellen kann durch die Bestimmung der einzelnen CFUs im Verhältnis zu den in Kultur gebrachten Leukozyten berechnet werden. Hierbei stellt jede Kolonie eine Vorläuferzelle dar. Abbildung 3.5: links oben: CFU-GM, rechts oben: CFU-GEMM, links unten: BFU-E 35

PATIENTEN UND METHODEN 3.2.4.2 Testdurchführung Als Probenmaterial kommt frisches CB, CB nach den einzelnen oben beschriebenen Herstellungsschritten, oder wieder aufgetautes CB in Frage. Prinzipiell kann diese Testung natürlich auch mit allen anderen Zellarten durchgeführt werden. Als Arbeitsanleitung existiert eine SOP der Abteilung, die in ihrer aktuell gültigen Form herangezogen wurde. Es folgen die verschiedenen Arbeitsschritte, die an einer Laminar-Flow-Bank durchgeführt wurden: - Die nötige Menge an Methocult-Medium wurde aufgetaut und ein 2 %-iges fötales Kälberserum (FCS)-Medium (2 ml FCS in 98 ml Iscove s Medium) angesetzt. - Die Zellen wurden in dem 2 %-igen FCS-Medium auf eine Konzentration von 1 x 10 5 /ml eingestellt. Bei CD34-Zellkonzentrationen von mindestens 1 % der CD45 positiven Zellen wurde die Konzentration auf 1000 CD34 positive Zellen pro ml eingestellt. 1 x 10 6 /ml eingestellt. Bei CD34-Zellkonzentrationen von mindestens 1 % der CD45 positiven Zellen wurde die Konzentration auf 10000 CD34 positive Zellen pro ml eingestellt. - 0,3 ml der verdünnten Zellsuspension wurden in 3 ml Methocult aufgenommen und gut vermischt (durch mehrmaliges Aufziehen und Entleeren der Spritze). - Nach dem Mischen sollte das Röhrchen ungefähr 30 Minuten ruhig stehen, damit größere Luftblasen aufsteigen konnten. - Von diesen in Methocult vermischten Zellen wurden je 1,1 ml in 35 mm große, sterile Petrischalen pipettiert und durch leichtes Rotieren in der Schale verteilt. Eine Schale enthielt also beim ersten Ansatz 1 x 10 4 WBCs oder MNCs, beziehungsweise 100 CD34 positive Zellen und im zweiten Ansatz 1 x 10 5 WBCs oder MNCs, beziehungsweise 1000 CD34 positive Zellen. - Auf eine Kulturschale passten je 2 Ansätze, in die beiden mittleren Schalen wurden jeweils 10 ml Wasser gegeben. - Die Platten wurden im Brutschrank bei 37 C mit einem 5 %igen CO 2 -Anteil für 14 bis 16 Tage bebrütet. - Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die CFU-GM, CFU-GEMM und 36

PATIENTEN UND METHODEN BFU-E unter einem inversen Mikroskop mit Zuhilfenahme des Atlas of Human Hematopoietic Colonies ausgewertet. Dabei wurden Populationen mit mehr als 30 Zellen (CFU-GM), mit mehr als 40 Zellen (CFU-GEMM) und mit mehr als 50 Zellen (BFU-E) als Kolonien gewertet. Da jede Kolonie aus einer einzigen Zelle durch mehrfache Teilung hervorgegangen ist, entspricht die Zahl der Kolonien der Zahl der zur Teilung befähigten Zellen, die in Kultur gebracht wurden. - Je Ansatz wurden 2 Schalen ausgezählt, von den Ergebnissen wurde der Mittelwert errechnet. Wurden zuvor kryokonservierte Proben untersucht, kamen folgende Arbeitsschritte hinzu: - Auftaulösung vorbereiten: 9 Teile Dextran 40 mit 1 Teil 5 %igem Humanalbumin mischen und auf 4 C kühlen. - Zentrifuge auf 4 C vorkühlen. - Pilotröhrchen aus dem N 2 -Tank entnehmen und bei 33 bis 37 C auftauen lassen, bis noch ein kleiner Rest Eis im Röhrchen verbleibt. - 2 Teile Auftaulösung mit 1 Teil aufgetauter Zellsuspension vermischen. - Anschließend CFU-Ansatz wie oben beschrieben durchführen. Verwendete Reagenzien: Methocult Medium Iscove`s Medium FCS Stem Cell Technologies, 40 Rues de Berges, 38000 Grenoble, France Stem Cell Technologies, 40 Rues de Berges, 38000 Grenoble, France oder Gibico, Invitrogen GmbH, Frankfurter Str. 129B, 64293 Darmstadt Stem Cell Technologies, 40 Rues de Berges, 38000 Grenoble, France oder Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St Louis, MO 63103, USA 37

PATIENTEN UND METHODEN 3.2.5 Statistik Insgesamt wurden 5520 Proben aus der Datenbank des Universitätsklinikums Erlangen ausgewertet. Dafür wurde das Statistikprogramm SPSS für Windows (SPSS Inc., Chicago IL, USA) in der Version 19 und Microsoft Office Excel 2007 verwendet. Zunächst wurden Umrechnungen der zugrunde liegenden Zahlen vorgenommen, um jeweils die Gesamtzellzahl auf je einen Beutel Leukozytenkonzentrat zu erhalten. Hierbei wurde die Zugabe von DMSO beachtet. Von den gewonnenen Werten wurde jeweils der Mittelwert, der Median, die Standardabweichung sowie der Minimum- und der Maximum-Wert berechnet. Außerdem wurde ein Test auf Normalverteilung durchgeführt. Da die untersuchte Probenanzahl mehr als 50 betrug, wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test verwendet. Bei Signifikanzwerten < 0,05 wurde von normalverteilten bei > 0,05 von nicht normalverteilten Parametern ausgegangen. Aufgrund des Ergebnisses des Kolmogorov-Smirnov-Testes erfolgte die Auswahl der weiteren statistischen Tests. Für die Korrelation, also dem Vergleich der gleichen Variable zwischen zwei Gruppen, wurde bei normalverteilten Daten der Test nach Pearson herangezogen, unterlagen die Daten keiner Normalverteilung, erfolgte die Berechnung mit dem Test nach Spearman. Für den Vergleich von Stichproben wurde bei normalverteilten Daten der t-test benutzt. Dieser prüft, ob der Unterschied zwischen den Mittelwerten zufällig oder statistisch signifikant ist. Sind die Daten nicht normalverteilt, wird die Berechnung nicht über den Mittelwert, sondern über den Median durchgeführt. Hierfür kommt der nicht parametrische U-Test nach Man und Whitney zum Einsatz. Zur Überprüfung der Signifikanz wird der p-wert genutzt. Ist dieser < 0,05, liegt ein statistisch signifikantes Testergebnis vor, man kann davon ausgehen, dass der Unterschied nicht zufällig zustande gekommen ist. 95 % der Ergebnisse liegen somit im Vertrauensbereich. Signifikante Ergebnisse wurden mit * gekennzeichnet, liegt der p-wert <0,001, wurde dies extra erwähnt. Um die Ausbeute, also die Wiederfindungsrate der CFUs und der Erythroblasten zu berechnen, wurde nach Katayama et al. die Formel: Ausbeute in %=Zahl an CFUs, bzw. Erythroblasten nach dem Auftauen / Zahl an CFUs, bzw. Erythroblasten vor der Kryokonservierung verwendet (Katayama et al., 1997). 38

ERGEBNISSE 4. ERGEBNISSE Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Konzentrationen verschiedener Zellpopulationen auf die Vitalität der Stammzellen nach dem Auftauen zu untersuchen. Als Grundlage hierfür dienten die Daten von 5520 allogenen und autologen Nabelschnurrestblutpräparaten, die in der Zeit zwischen 20.06.2003 und 03.07.2011 in der Nabelschnurrestblutbank der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung der Universitätsklinik Erlangen eingelagert wurden. 39

ERGEBNISSE 4.1 Statistische Daten 4.1.1 Statistische Daten vor dem Einfrierprozess Nach Entnahme des Plazentarestblutes wurden sowohl die Leukozyten als auch die Thrombozyten und die Erythrozyten je µl LK gemessen. Außerdem erfolgte eine Bestimmung der CD 34-positiven Leukozyten, der MNC und der Erythroblasten in % der Leukozyten im LK. Die CFU wurden auf 1000 Leukozyten im LK berechnet. Mittelwert Median Standard- Minimum Maximum Abweichun g (SD) Volumen des LK 33,78 34,00 4,03 11,00 76,00 (in ml) Leukozyten je µl 20463,60 18800,00 10854,81 1000,00 97700,00 im LK Thrombozyten x 280,84 275,00 97,51 6,00 946,00 1000 je µl LK Erythrozyten (in 2,11 2,05 0,91 0,14 6,37 Millionen) je µl LK CD34 in % der 0,29 0,25 0,18 0,01 2,00 Leukozyten im LK MNC in % der 41,39 41,20 7,65 0,10 77,60 Leukozyten im LK CFU je 10000 21,63 16,00 19,11 0,00 200,00 Leukozyten im LK Erythroblasten in % der Leukozyten im LK 5,02 3,00 6,11 0,00 86,00 Tabelle 4.1: Zellkonzentrationen vor dem Einfrierprozess (Volumen /ml, Leukozyten /µl, Thrombozyten x 1000 /µl, Erythrozyten x 10 6 /µl, CD34 in % der Leukozyten, MNC in % der Leukozyten, CFU je 10 4 Leukozyten) im LK 40

ERGEBNISSE Vor dem Einfrierprozess wurde dem LK 33,3 % DMSO in PBS als Einfriermedium zugesetzt und 3 ml Proben entnommen. 4.1.2 Gesamtmenge im LK Zur weiteren Beurteilung der Zellmengen erfolgte eine Umrechnung der Werte auf das gesamte LK. Mittelwert Median SD Minimum Maximum Leukozyten x 6,98 6,41 3,82 0,23 31,82 10 8 im LK Thrombozyten x 9,56 9,36 3,52 0,23 26,47 10 9 im LK Erythrozyten x 71,34 67,90 32,61 4,76 248,43 10 9 im LK CD34 positive 2,11 1,53 2,05 0,01 22,42 Leukozyten x 10 6 im LK MNCs x 10 8 im 2,90 2,66 1,57 0,00 12,10 LK CFU je 0,18 0,11 0,21 0,00 0,32 Leukozyt x 10 8 im LK Erythroblasten x 10 8 im LK 0,39 0,18 0,65 0,00 12,85 Tabelle 4.2: Zellkonzentrationen vor dem Einfrierprozess (Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, CD34-positive Leukozyten x 10 6, MNC x 10 8, CFU je Leukozyt x 10 8, Erythroblasten, CD34-positive Leukozyten in % der Leukozyten) im LK 41

ERGEBNISSE 4.1.3 Gesamtmenge im LK-Beutel Je Plazentarestblutbeutel wurden also folgende Zellmengen eingefroren: Mittelwert Median SD Minimum Maximum Leukozyten x 3,49 3,20 1,88 0,16 15,63 10 8 im Beutel Thrombozyten x 4,78 4,67 1,73 0,11 13,23 10 9 im Beutel Erythrozyten x 35,79 34,17 16,01 2,38 124,22 10 9 im Beutel CD34 positive 1,05 0,76 1,01 0,01 11,21 Leukozyten x 10 6 im Beutel MNCs x 10 8 im 1,44 1,32 1,78 0,00 6,05 Beutel CFU je Leukozyt x 10 8 im eutel Tabelle 4.3: Zellgehalt im LK-Beutel vor dem Einfrierprozess (Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, CD34-positive Leukozyten x 10 6, MNC x 10 8, CFU je Leukozyt x 10 8 ) 42

ERGEBNISSE 4.1.4 Statistische Daten nach dem Auftauen Nach dem Wiederauftauen des Plazentarestblutes wurden die Leukozyten je µl LK gemessen. Außerdem erfolgte eine Bestimmung der CD34-positiven Leukozyten, der MNC, der Vitalität der Leukozyten und der Erythroblasten in % der Leukozyten im LK. Die CFU wurden auf 1000 Leukozyten im LK berechnet. Mittelwert Median SD Minimum Maximum Volumen des LK 45,25 45,57 5,75 12,71 105,57 (in ml) Leukozyten je µl 10342,04 9100,00 6675,24 100,00 77200,00 im LK CD34 in % der 0,29 0,25 0,18 0,00 1,83 Leukozyten im LK MNC in % der 37,53 37,50 9,23 0,10 98,00 Leukozyten im LK CFU je 10000 9,64 7,00 8,72 0,00 100,00 Leukozyten im LK Erythroblasten 0,19 0,00 0,87 0,00 46,00 in % der Leukozyten im LK Vitalität der Leukozyten in % 85,17 93,10 17,39 3,70 100,00 Tabelle 4.4: Zellkonzentrationen nach dem Wiederauftauen (Volumen /ml, Leukozyten /µl, CD34 in % der Leukozyten, MNC in % der Leukozyten, CFU je 10 4 Leukozyten, Erythroblasten in % der Leukozyten, Vitalität in %) im LK 43

ERGEBNISSE 4.1.5 Gesamtmenge im LK nach dem Auftauen Das LK nach dem Auftauen enthielt folgende Volumina und Zellmengen: Mittelwert Median SD Minimum Maximum Volumen des LK (in ml) 45,25 45,57 5,75 12,71 105,57 Leukozyten x 10 8 im LK 4,72 4,15 3,10 0,06 28,56 CD34 in % der Leukozyten im 0,29 0,25 0,18 0,00 1,83 LK MNC x 10 8 im LK 1,80 1,58 1,23 0,00 13,85 CFU je Leukozyt x 10 8 im LK 0,005 0,003 0,007 0,000 0,080 Erythroblasten x 10 8 im LK 0,009 0,000 0,038 0,000 1,140 Vitale Leukozyten x 4,21 3,67 3,00 0,02 25,11 10 8 im LK CD34+ Leukozyten x 10 6 im LK 1,45 0,98 1,60 0,00 24,44 Tabelle 4.5: Zellgehalt nach dem Wiederauftauen (Volumen /ml, Leukozyten x 10 8, CD34 in % der Leukozyten, MNC x 10 8, CFU je Leukozyt x 10 8, Erythroblasten x 10 8, vitale Leukozyten x 10 8, CD34-positive Leukozyten x 10 6 ) im LK 44

ERGEBNISSE 4.1.6 Gesamtmenge im LK-Beutel nach dem Auftauen Die Zellmengen je LK nach dem Auftauen entsprachen je Beutel folgenden Mengen: Mittelwert Median SD Minimum Maximum Leukozyten x 2,36 2,07 1,54 0,03 14,28 10 8 im Beutel MNC x 10 8 im 0,90 0,79 0,61 0,00 6,93 Beutel Vitale 2,10 1,83 1,50 0,01 12,56 Leukozyten x 10 8 im Beutel CD34+ 0,73 0,49 0,79 0,00 12,22 Leukozyten x 10 6 im Beutel CFU je Leukozyt x 10 8 im Beutel Tabelle 4.6: Zellgehalt je Beutel nach dem Wiederauftauen (Leukozyten x 10 8, CD34-positive Leukozyten x 10 8, MNC x 10 8, vitale Leukozyten x 10 8, CFU je Leukozyt x 10 8 ) Die folgende Abbildung 4.1 zeigt die graphische Darstellung der unterschiedlichen Zellpopulationen im LK vor und nach dem Auftauen. Abbildung 4.1: Vergleich des Zellgehaltes im Beutel jeweils vor und nach dem Einfrieren 45

ERGEBNISSE 4. 2 Vergleich der Vitalität mit den unterschiedlichen Zellpopulationen Für die Zellpopulationen CD34 positive Leukozyten, Thrombozyten, Erythrozyten und MNCs vor dem Auftauen im Beutel wurden jeweils Gruppen gebildet, die dann mit der Prozentzahl der vitalen Leukozyten nach dem Auftauen mittels statistischer Tests verglichen wurden. Mit dem Beutelvolumen des LKs nach dem Auftauen wurde auf dieselbe Art verfahren. 4.2.1 Vergleich der CD34-positiven Leukozyten mit der Vitalität Für die Suche nach einem möglichen Einfluss des Gehaltes an CD34-positiven Leukozyten auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen wurden 4 Gruppen gebildet: Gruppe 1 (n=5000): bis 2,50, Gruppe 2 (n=212): 2,51-3,50, Gruppe 3 (n=107): 3,51-4,50 und Gruppe 4 (n=34): ab 4,51 CD34 positive Leukozyten (x 10 6 ) absolut pro Beutel. Die p-werte der Gruppenvergleiche sind in der folgenden Tabelle abgebildet: Gruppen 1 2 3 4 1 0,004 * 0,005 * 0,014 * 2 0,004 * 0,386 0,520 3 0,005 * 0,386 0,876 4 0,014 * 0,520 0,876 Tabelle 4.7: Vergleiche unter den Gruppen der CD34-positiven Zellen bezogen auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in % Die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen stieg signifikant mit zunehmendem Gehalt an CD34-positiven Zellen, was in der folgenden Abbildung graphisch dargestellt ist: Abbildung 4.2: Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozyten in den Gruppen sortiert nach CD34- Zahl 46

ERGEBNISSE Die Mittelwerte, Medianwerte und die SD der Zellpopulationen Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, MNCs x 10 8 im Ausgangsprodukt sowie der Gesamtzahl der vitalen Leukozyten x 10 8 im Beutel in den unterschiedlichen Gruppen sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Gruppe 1 Leukozyten Thrombozyten Erythrozyten Vitale MNC Leukozyten Mittelwert 3,24 4,69 35,71 1,95 1,34 Median 3,06 4,59 34,24 1,73 1,27 SD 1,60 1,70 15,91 1,32 0,67 Gruppe 2 Mittelwert 6,03 5,92 37,97 3,81 2,47 Median 5,89 5,81 35,35 3,81 2,39 SD 1,80 1,58 16,88 1,76 0,68 Gruppe 3 Mittelwert 7,18 6,19 36,49 4,37 2,93 Median 6,98 6,13 33,99 4,40 2,73 SD 2,30 1,82 18,00 1,91 0,97 Gruppe 4 Mittelwert 7,65 6,04 36,92 5,02 3,21 Median 7,08 5,87 32,01 4,63 2,91 SD 2,5 1,96 17,82 2,37 1,07 Tabelle 4.8 Darstellung der Mittelwerte, Mediane und SD von Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 8 im LK-Beutel und den vitale Leukozyten x 10 8 im Beutel nach dem Auftauen in den CD34-Gruppen 4.2.2 Vergleich des Thrombozytengehaltes mit der Vitalität Für die Untersuchung des Einflusses verschieden hoher Thrombozytenzahlen im Ausgangs-LK auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen erfolgte ebenfalls die Bildung von 4 Gruppen: Gruppe 1 (n=252): bis 2,00, Gruppe 2 (n=1589): 2,01-4,00, Gruppe 3 (n=2395): 4,01-6,00 und Gruppe 4 (n=1249): ab 6,01 Thrombozyten x 10 9 pro LK-Beutel. Es ergaben sich folgende signifikante Ergebnisse: 47

ERGEBNISSE Gruppen 1 2 3 4 1 0,004 * <0,001 * <0,001 * 2 0,004 * <0,001 * <0,001 * 3 <0,001 * <0,001 * 0,004 * 4 <0,001 * <0,001 * 0,004 * Tabelle 4.9: Vergleiche unter den Gruppen sortiert nach Thrombozytenzahlen bezogen auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in % Aus Abbildung 4.3 ist ersichtlich, dass auch steigende Thrombozytenkonzentrationen einen höheren Gehalt vitaler Leukozyten nach dem Auftauen mitbedingen: Abbildung 4.3: Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozyten in den Gruppen sortiert nach Thrombozytenzahl Auch für die Gruppierung Thrombozyten sind die Mittelwerte, Medianwerte und die SD der Zellpopulationen Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, MNCs x 10 8 sowie der Gesamtzahl der vitalen Leukozyten x 10 8 im Beutel in der folgenden Tabelle dargestellt: 48

ERGEBNISSE Gruppe 1 Leukozyten Thrombozyten Erythrozyten Vitale MNC Leukozyten Mittelwert 1,02 1,46 31,28 0,62 0,40 Median 0,86 1,55 29,75 0,47 0,33 SD 0,63 0,44 12,13 0,58 0,26 Gruppe 2 Mittelwert 2,29 3,22 38,68 1,37 0,93 Median 2,05 3,30 38,55 1,21 0,84 SD 1,11 0,54 14,75 0,92 0,47 Gruppe 3 Mittelwert 3,70 4,93 36,32 2,19 1,52 Median 3,42 4,90 34,35 2,07 1,41 SD 1,53 0,56 16,40 1,33 0,62 Gruppe 4 Mittelwert 5,11 7,16 32,01 3,17 2,11 Median 4,78 6,85 29,60 3,09 1,98 SD 1,92 1,05 16,55 1,74 0,79 Tabelle 4.10 Darstellung der Mittelwerte, Mediane und SDen von Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 8 im LK-Beutel und den vitale Leukozyten x 10 8 im Beutel nach dem Auftauen in den Thrombozyten-Gruppen 4.2.3 Vergleich des Erythrozytengehaltes mit der Vitalität Um den Einfluss des Erythrozytengehaltes im Ausgangsprodukt auf die Vitalität der Leukozyten im Endprodukt zu untersuchen, wurden 4 Gruppen gebildet, wobei Gruppe 1 (n=926) aus den Erythrozytenwerten 0-20,00, Gruppe 2 (n=2526): 20,01-40,00 Gruppe 3 (n=1644): 40,01-60,00 und Gruppe 4 (n=394) aus den Werten ab 60,01 x 10 9 gebildet wurden. Die p-werte sind in der folgenden Tabelle dargestellt: 49

ERGEBNISSE Gruppen 1 2 3 4 1 <0,001 * 0,002 * 0,445 2 <0,001 * 0,697 0,097 3 0,002 * 0,697 0,149 4 0,445 0,097 0,149 Tabelle 4.11: Vergleiche unter den Gruppen sortiert nach Erythrozytenzahlen bezogen auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in % Die folgende Abbildung zeigt, dass der Gehalt vitaler Leukozyten nach dem Auftauen mit steigendem Erythrozytengehalt zunächst ansteigt um bei hohem Erythrozytengehalt wieder abzufallen: Abbildung 4.4: Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozyten in den Gruppen sortiert nach Erythrozytenzahl Es folgt eine tabellarische Darstellung der Mittelwerte, Medianwerte und der SD der Zellpopulationen Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, MNCs x 10 8 sowie der Gesamtzahl der vitalen Leukozyten x 10 8 im Beutel: 50

ERGEBNISSE Gruppe 1 Leukozyten Thrombozyten Erythrozyten Vitale MNC Leukozyten Mittelwert 3,50 5,26 14,51 2,01 1,47 Median 3,22 5,29 15,30 1,80 1,39 SD 1,85 1,84 3,97 1,40 0,75 Gruppe 2 Mittelwert 3,39 4,79 29,99 2,10 1,39 Median 3,13 4,71 29,97 1,87 1,27 SD 1,85 1,82 5,66 1,49 0,77 Gruppe 3 Mittelwert 3,41 4,50 48,45 2,06 1,41 Median 3,09 4,37 47,73 1,71 1,30 SD 1,82 1,53 5,61 1,45 0,75 Gruppe 4 Mittelwert 4,42 4,77 69,64 2,57 1,81 Median 4,02 4,67 66,64 2,18 1,66 SD 2,15 1,41 9,68 1,85 0,90 Tabelle 4.12 Darstellung der Mittelwerte, Mediane und SDen von Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 8 im LK-Beutel und den vitale Leukozyten x 10 8 im Beutel nach dem Auftauen in den Erythrozyten-Gruppen 4.2.4 Vergleich des MNC-Gehaltes mit der Vitalität Zum Vergleich der MNCs im LK mit der Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen wurden nach Menge an MNCs 4 verschiedene Gruppen gebildet: Gruppe 1 (n=1628): 0,00 bis 1,00, Gruppe 2 (n=2392): 1,01-2,00, Gruppe 3 (n= 966): 2,01-3,50 und Gruppe 4 (n=80): ab 3,51. In allen Gruppen unterscheidet sich die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen signifikant voneinander. Gruppen 1 2 3 4 1 <0,001 * <0,001 * <0,001 * 2 <0,001 * 0,001 * 0,002 * 3 <0,001 * 0,001 * 0,033 * 4 <0,001 * 0,002 * 0,033 * Tabelle 4.13: Vergleiche unter den Gruppen sortiert nach MNCs bezogen auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in % 51

ERGEBNISSE Die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen stieg signifikant mit zunehmendem Gehalt an. Die Mittelwerte dieses Gruppenvergleiches sind im Folgenden graphisch dargestellt: Abbildung 4.5: Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozyten in den Gruppen sortiert nach MNC- Zahl Auch für die nach MNCs gruppierten Werte erfolgt eine tabellarische Darstellung der Mittelwerte, Medianwerte und der SD der Zellpopulationen Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, MNCs x 10 8 sowie der Gesamtzahl der vitalen Leukozyten x 10 8 : 52

ERGEBNISSE Gruppe 1 Leukozyten Thrombozyten Erythrozyten Vitale MNC Leukozyten Mittelwert 1,72 3,40 35,07 1,06 0,66 Median 1,71 3,39 34,02 1,00 0,69 SD 0,66 1,26 13,94 0,68 0,23 Gruppe 2 Mittelwert 3,56 5,10 35,13 2,17 1,45 Median 3,48 4,95 33,98 2,27 1,43 SD 0,89 1,35 15,97 1,04 0,27 Gruppe 3 Mittelwert 5,87 6,27 38,11 3,66 2,48 Median 5,66 6,17 35,02 3,81 2,39 SD 1,26 1,50 18,26 1,55 0,37 Gruppe 4 Mittelwert 9,68 7,08 40,39 6,25 4,23 Median 9,42 6,76 36,58 6,39 4,05 SD 1,90 1,81 20,71 1,99 0,62 Tabelle 4.14 Darstellung der Mittelwerte, Mediane und SDen von Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 8 im LK-Beutel und den vitale Leukozyten x 10 8 im Beutel nach dem Auftauen in den MNC-Gruppen 4.2.5 Vergleich des Volumens des LKs mit der Vitalität Das Volumen im LK-Beutel nach dem Auftauen wurde mit der Vitalität der Leukozyten in % nach dem Auftauen verglichen. Das Beutelvolumen diente als Grundlage zur Aufteilung in 4 Gruppen: Gruppe 1 (n=1118): bis 21,00, Gruppe 2 (n=1159): 21,01-22,50, Gruppe 3 (n=1420): 22,51-24,00 und Gruppe 4: ab 24,01 ml. Gruppen 1 2 3 4 1 <0,001 * <0,001 * <0,001 * 2 <0,001 * 0,483 0,591 3 <0,001 * 0,483 0,894 4 <0,001 * 0,591 0.894 Tabelle 4.15: Vergleiche unter den Gruppen sortiert nach Volumen des LK-Beutels nach dem Auftauen bezogen auf die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in % 53

ERGEBNISSE Die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen stieg von Gruppe 1 zu 2 stark an und sank von Gruppe 3 zu 4 wieder ab. Es folgt die graphische Darstellung der vitalen Leukozyten in % nach dem Auftauen bezogen auf die Gruppen 1 bis 4. Abbildung 4.6: Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozyten in den Gruppen sortiert nach Volumen im Beutel nach dem Auftauen Nach der Einteilung in die oben genannten Gruppen je nach Volumen des LK- Beutels nach dem Auftauen wurden die Mittelwerte, Medianwerte und die SD der Zellpopulationen Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9, MNCs x 10 8 sowie der Gesamtzahl der vitalen Leukozyten x 10 8 bestimmt: 54

ERGEBNISSE Gruppe 1 Leukozyten Thrombozyten Erythrozyten Vitale MNC Leukozyten Mittelwert 2,73 3,84 30,36 1,51 1,10 Median 2,39 3,78 29,57 1,11 0,98 SD 1,77 1,71 12,81 1,27 0,73 Gruppe 2 Mittelwert 3,35 4,61 35,49 2,09 1,38 Median 3,07 4,50 35,20 1,85 1,27 SD 1,81 1,57 14,31 1,40 0,75 Gruppe 3 Mittelwert 3,72 4,96 38,33 2,31 1,54 Median 3,48 4,80 37,74 2,11 1,41 SD 1,80 1,62 15,98 1,44 0,74 Gruppe 4 Mittelwert 3,87 5,34 37,35 2,33 1,60 Median 3,55 5,23 34,80 2,08 1,50 SD 1,91 1,68 17,95 1,63 0,79 Tabelle 4.16 Darstellung der Mittelwerte, Mediane und SDen von Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 8 im LK-Beutel und den vitale Leukozyten x 10 8 im Beutel nach dem Auftauen in den CD34-Gruppen 4.3 Analyse der Präparate mit mehr als 2,50 x 10 6 CD 34-positiven Leukozyten je Beutel Zu dieser Auswertung wurden nur Präparate hinzugezogen, die mindestens 2,50 x 10 6 CD 34-positive Leukozyten enthielten. Aus diesen wurden je nach Gehalt an CD 34-positiven Zellen 6 Untergruppen gebildet: Gruppe 1 (n=507): 2,50-3,24 x 10 6, Gruppe 2 (n=233): 3,25-3,74 x 10 6, Gruppe 3 (n=338): 3,75-4,99 x 10 6, Gruppe 4 (n=251): 5,00-7,49 x 10 6, Gruppe 5 (n=99): 7,5-9,99 x 10 6 und Gruppe 6 (n=51): ab 10 x 10 6 CD 34 positive Leukozyten. Für die Berechnung wurden die Daten aus dem gesamten LK vor dem Auftauen herangezogen, lediglich die Vitalität der Leukozyten bezieht sich auf das Gesamt-LK nach dem Auftauen. 55

ERGEBNISSE 4.3.1 Mittelwerte in den 6 Gruppen Für die 6 Gruppen wurden die Mittelwerte der Leukozyten x 10 8, der Thrombozyten x 10 9, der Erythrozyten x 10 9, der MNCs x 10 8 und der Zahl der vitalen Leukozyten x 10 9 nach dem Auftauen berechnet. Diese sind mit Median und SD in der folgenden Tabelle dargestellt: Gruppe 1 Leukozyten Thrombozyten Erythrozyten Vitale MNC Leukozyten Mittelwert 9,03 10,98 75,95 5,56 3,68 Median 8,80 10,53 74,68 5,63 3,47 SD 2,91 3,15 33,10 2,87 1,15 Gruppe 2 Mittelwert 9,29 11,28 72,28 5,62 3,82 Median 8,90 11,30 67,14 5,52 3,70 SD 2,86 3,05 33,74 2,93 1,18 Gruppe 3 Mittelwert 10,58 11,59 72,67 6,58 4,34 Median 10,20 11,47 66,09 6,75 4,30 SD 3,14 3,30 36,38 3,10 1,31 Gruppe 4 Mittelwert 12,43 12,08 74,76 7,76 5,07 Median 12,12 11,88 69,08 7,67 4,88 SD 3,83 3,32 36,04 3,67 1,47 Gruppe 5 Mittelwert 14,13 12,30 77,56 8,61 5,86 Median 13,65 11,97 71,68 8,39 5,48 SD 4,53 3,41 37,01 3,46 1,93 Gruppe 6 Mittelwert 16,90 12,33 79,97 11,00 7,04 Median 15,44 11,75 65,10 10,21 7,00 SD 5,60 4,09 47,79 5,08 2,24 Tabelle 4.17 Darstellung der Mittelwerte, Mediane und SDen von Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 8 im Beutel nach dem Auftauen und den vitale Leukozyten x 10 8 im Beutel in den >2,5 x 10 6 -CD34-Gruppen 56

ERGEBNISSE Abbildung 4.7 zeigt, dass der Erythro- und Thrombozytengehalt in den sechs nach CD34-Zellgehalt gebildeten Gruppen nahezu unverändert linear bleibt, während mit zunehmendem CD34-Zellgehalt auch der Gehalt an Leukozyten, MNCs und vitalen Leukozyten nach dem Auftauen steigt.. Abbildung 4.7: Mittelwerte der Leukozyten x 10 8, der Thrombozyten x 10 9, der Erythrozyten x 10 9, der MNCs x 10 8 und der vitalen Leukozyten x 10 8 in den >2,5 x 10 6 -CD34-Gruppen Die Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen stieg von Gruppe 1: Abbildung 4.8: Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozyten in den Gruppen sortiert nach CD34- positive Zellen >2,5 x 10 6 57

ERGEBNISSE 4.3.2 Korrelationen zwischen den Zellzahlen in den 6 Gruppen und der vitalen Leukozyten in % Schließlich wurden die Korrelationen zwischen den Zellzahlen im Ausgangsbeutel und der Zahl der vitalen Leukozyten nach dem Auftauen berechnet. Dabei wurden die nach CD 34-positiven Leukozytenzahlen gebildeten Gruppen verwendet. P- Werte von <0,05 wurden als signifikant eingestuft. Die Ergebnisse und der Korrelationskoeffizient (r) sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Vitale Leukozyten Gruppe 1 Vitale Leukozyten Gruppe 2 Vitale Leukozyten Gruppe 3 Vitale Leukozyten Gruppe 4 Vitale Leukozyten Gruppe 5 Vitale Leukozyten Gruppe 6 Leukozyten x 10 8 r=0,581 p<0,001 * r=0,510 p<0,001 * r=0,572 p<0,001 * r=0,643 p<0,001 * r=0,600 p<0,001 * r=0,650 p<0,001 * Thrombozyten x 10 9 r=0,369 p<0,001 * r=0,319 p<0,001 * r=0,341 p<0,001 * r=0,243 p<0,001 * r=0,413 p<0,001 * r=0,440 p<0,05 * 8 Erythrozyten MNCs x 10 x 10 9 r=-0,070 p=0,118 r=-0,003 p=0,962 r=0,077 p=0,158 r=0,155 p<0,05 * r=0,093 p=0,361 r=0,111 p=0,439 r=0,530 p<0,001 * r=0,397 p<0,001 * r=0,597 p<0,001 * r=0,559 p<0,001 * r=0,639 p<0,001 * r=0,582 p<0,001 * Tabelle 4.18: Korrelation zwischen Leukozyten x 10 8, Thrombozyten x 10 9, Erythrozyten x 10 9 und MNCs x 10 9 im Ausgangsbeutel mit den vitalen Leukozyten x 10 9 in den Gruppen >2,5 x 10 6 CD34- positive Leukozyten 58

ERGEBNISSE 4.3.3 Vergleiche der Vitalität zwischen den 6 Gruppen Der Vergleich der Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen zwischen den nach CD 34-Zahlen (siehe 4.3) gebildeten Gruppen zeigte keine signifikanten Unterschiede. Die p-werte sind in Tabelle 4.18 aufgezeigt. Vitalität Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gruppe 5 Gruppe 6 in % Gruppe 1 0,851 0,483 0,303 0,290 0,261 Gruppe 2 0,851 0,606 0,397 0,309 0,289 Gruppe 3 0,483 0,606 0,725 0,506 0,420 Gruppe 4 0,303 0,397 0,725 0,650 0,589 Gruppe 5 0,290 0,309 0,506 0,650 0,749 Gruppe 6 0,261 0,289 0,420 0,589 0,749 Tabelle 4.18: Vergleich der Vitalität der Leukozyten in den Gruppen >2,5 x 10 6 CD34-positive Leukozyten 4.4 Korrelationen der unterschiedlichen Zellpopulationen mit der Vitalität der Leukozyten 4.4.1 vor dem Auftauen Der Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen wurde mit den unterschiedlichen Zellpopulationen vor dem Auftauen korreliert. Dabei ergaben sich signifikante Korrelationen zu der Menge der Gesamtleukozyten, zu den Thrombozyten, der Gesamtzahl der CD34-positiven Leukozyten und der Gesamtzahl der MNCs im LK vor dem Auftauen. Die Gesamtzahl der im Beutel befindlichen Erythrozyten korrelierte nicht mit der Vitalität der Leukozyten. In der folgenden Tabelle sind der Korrelationskoeffizient und der p-wert dargestellt, in den folgenden Graphen die signifikanten Korrelationen. 59

ERGEBNISSE Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozytenzahl Korrelationskoeffizient p-wert Leukozyten im LK x 10 8 0,121 <0,001* Thrombozyten im LK x 10 9 0,126 <0,001* Erythrozyten im LK x 10 9 0,023 0,091 CD34-positive Leukozyten im LK 0,132 <0,001* x 10 6 MNCs im LK x 10 8 0,145 <0,001* Tabelle 4.19: Korrelation der Vitalität in % mit den Erythrozyten x 10 9, den Leukozyten x 10 8, den Thrombozyten x 10 9, den CD34-positiven Leukozyten x 10 6 und den MNCs x 10 8 im LK-Beutel vor dem Auftauen Abbildung 4.9: Die Menge der Leukozyten im LK-Beutel korreliert signifikant mit dem Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen. 60

ERGEBNISSE Abbildung 4.10: Die Menge der Thrombozyten und der CD34-positiven Leukozyten im LK- Beutel korreliert signifikant mit dem Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen 61

ERGEBNISSE Abbildung 4.11: Die Menge der MNCs im LK-Beutel korreliert signifikant mit dem Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen. 4.4.2 nach dem Auftauen Der Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen wurde mit der Leukozytenzahl, der Anzahl an MNCs und der Gesamtzahl der CD34-positiven Leukozyten nach dem Auftauen korreliert, wobei sich in allen Fällen signifikante Korrelationen fanden. Diese sind in der nachfolgenden Tabelle und den folgenden Diagrammen dargestellt. Außerdem wurde noch eine Korrelation mit dem Volumen des LK nach dem Auftauen durchgeführt, wobei sich ebenfalls eine signifikante Korrelation (Korrelationskoeffizient: 0,081; p-wert: <0,001*) fand. 62

ERGEBNISSE Vitale Leukozyten in % der Gesamtleukozytenzahl Korrelationskoeffizient p-wert Leukozyten im LK x 10 8 0,407 <0,001* CD34-positive Leukozyten im LK 0,314 <0,001* x 10 6 MNCs im LK x 10 8 0,381 <0,001* Tabelle 4.20: Korrelation zwischen Vitalen Leukozyten in % und Leukozyten x 10 8, CD34-positiven Leukozyten x 10 6 und MNCs x 10 8 nach dem Auftauen im LK-Beutel Abbildung 4.12: Das Beutel-Volumen nach dem Auftauen und die Prozentzahl der vitalen Leukozyten korrelieren signifikant. 63

ERGEBNISSE Abbildung 4.13: Die Menge der Leukozyten und CD34-positiven Leukozyten im LK-Beutel nach dem Auftauen korreliert signifikant mit dem Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen. 64

ERGEBNISSE Abbildung 4.14: Die Menge der MNCs im LK-Beutel nach dem Auftauen korreliert signifikant mit dem Anteil vitaler Leukozyten nach dem Auftauen. 4.5 Ausbeute an CFUs und Erythroblasten in % Vor dem Einfrierprozess betrug die Zahl der CFUs bezogen auf 10000 Leukozyten im Mittel 18,07 x 10 8 bei einem Median von 11,77 x 10 8 und einer SD von 21,42 x10 8. Nach dem Auftauen fanden sich 4,96 x 10 8 CFUs bezogen auf 10000 Leukozyten bei einem Median von 2,75 x 10 8 und einer SD von 6,55 x 10 8. Daraus ergab sich ein Mittelwert der Ausbeuten von 29,05 % (Median: 19,67 %, SD: 30,92). Diese Ausbeute korrelierte signifikant mit der Leukozyten-, der Thrombozyten- und der Erythrozytenzahl, ebenso wie mit der Zahl der CD 34- positiven Leukozyten, der Anzahl an MNCs, der Zahl der vitalen Leukozyten nach dem Auftauen sowie der Vitalität in % nach dem Auftauen im Gesamt-LK (p=<0,001). Diesbezügliche Diagramme folgen. Bei einer getrennten Berechnung für allogene und autologe Präparate zeigte sich eine mittlere CFU-Ausbeute von 22,9 % für die private und 33,64 % für die öffentliche Einlagerung. 65

ERGEBNISSE Abbildung 4.15: Die Leukozyten und Thrombozyten im Beutel korrelieren signifikant mit der CFU- Ausbeute 66

ERGEBNISSE Abbildung 4.16: Die Erythrozyten und die CD34-positiven Leukozyten im Beutel korrelieren signifikant mit der CFU-Ausbeute 67

ERGEBNISSE Abbildung 4.17: Die MNCs und die Gesamtzahl der vitalen Leukozyten im Beutel korrelieren signifikant mit der CFU-Ausbeute 68

ERGEBNISSE Abbildung 4.18: Die vitalen Leukozyten in % korrelieren signifikant mit der CFU-Ausbeute Die Zahl der Erythroblasten betrug vor dem Einfrierprozess im Mittel 0,39 x 10 8 bei einem Median von 0,18 x 10 8 und einer SD von 0,65 x 10 8 im gesamten LK. Nach dem Einfrieren und Wiederauftauen verringerte sich der Mittelwert auf 0,09 x 10 8 bei einem Median von 0,00 x 10 8 und einer SD von 0,38 x 10 8. Die berechnete Ausbeute betrug im Mittel 3,33 % (Median: 0,00 x 10 8, SD: 17,05 x 10 8 ). Die Ausbeute an Erythroblasten korrelierte signifikant mit der Zahl der Leukozyten, der CD 34-positiven Leukozyten, der MNCs und der Vitalität der Leukozyten nach dem Auftauen in % (p=<0,05). Diesbezügliche Diagramme folgen. Keine signifikante Korrelation zeigte sich mit der Ausbeute an CFU in % (p=0,966), der Thrombozyten- (p= 0,062) und Erythrozytenzahl (p=0,226). Bei einer getrennten Berechnung für allogene und autologe Präparate zeigte sich eine mittlere Erythroblasten-Ausbeute von 3,38 % für die private und 3,13 % für die öffentliche Einlagerung. 69

ERGEBNISSE Abbildung 4.19: Die Leukozyten und die CD34-positiven Leukozyten im Beutel korrelieren signifikant mit der Erythroblasten-Ausbeute 70

ERGEBNISSE Abbildung 4.20: Die MNCs und die vitalen Leukozyten in % korrelieren signifikant mit der Erythroblasten-Ausbeute 71