BVDV-Diagnostik Diagnostik anhand von Ohrstanzproben ELISA und Real time RT-PCR im Vergleich R. Fux 1, C. Baudy 1, I. Moßbrugger 1, M. Hellwig 2, R. Birlbauer 2 und G. Wolf 1 1 Institut für Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenmedizin, LMU München 2 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL), Oberschleißheim
BVDV-Diagnostik Diagnostik anhand von Ohrstanzproben ELISA und Real time RT-PCR im Vergleich Münchener Modell zur BVDV-Tilgung Warum Ohrstanzen? Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR im Laborversuch (definiertes Probenmaterial) im Feldversuch (Bayerische Pilotstudie 06/07) Fazit
BVDV-Infektionen Postnatale Infektionen Intrauterine Infektionen Persistente Infektionen (PI) fetale Infektion im ersten Trimester Immuntoleranz & lebenslange Virämie Kümmern Mucosal Disease meist aber völlig unauffällig llig!!! lebenslange Ausscheidung des BVDV wichtigste Transmissionsquelle
Münchener I. Modell: Leipziger Labor Diagnostik Symposium BVDV-Nachweis im neugeborenen Kalb als einziges Primärdiagnostikum rdiagnostikum für r eine Tilgung! NPI NPI Untersuchung der Mutter negativer BVDV-Nachweis: Kalb und Mutter lebenslang NPI Info über Datenbank/Tierpass positiver BVDV-Nachweis: vorläufig PI, Verbringungsregelung, PI-Bestätigung, Schlachtung GW 1/04
Voraussetzungen I. Leipziger Labor Münchener Diagnostik Symposium nchener Modell Jedes neugeborene Kalb ist zu testen, BVDV-PI Tiere werden sicher erkannt und Mütter positiver Kälber sind zu testen (korrekte HI-Tier Zuordnung). absolute Handelsrestriktion für PI-Tiere (Schlachtung oder TBA) freier Handel nur für NPI-Tiere
100 I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium Tilgungsfortschritt Münchener Modell %PI % definierte NPI-Rinder 80 60 40 20 0 0,8 0,6 0,4 0,2 Tilgung Überwachung. Start 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Jahre
Warum Ohrstanzen? Statusdefinition (PI/NPI) bevor Kälber K in den Handel kommen innerhalb der ersten 14 Lebenstage frühe und günstige g Probennahme durch den Landwirt im Rahmen der Tiermarkierung Diagnostische LückeL Versagen von klassischen Nachweisverfahren (VI, AG-ELISA, IF) bei der Testung von Blutproben junger PI KälberK bedingt durch die Aufnahme kolostraler Antikörper
BVDV-PI: Diagnostische Lücke bei Blutproben 0 1 2 3 4 5 6 7.10...14...30..40...60...90.. p.p. E rns 1------------------------------------------------60 NS2/3 (1)..3---------------------------------------------------90..(200) BVDV-Isolierung 10-----------30 PCR Serum?3--------------------------------40? PCR Leukos keine Lücke bei Einzelproben
Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR Entwicklung und Prüfung einer Analytik zum Nachweis BVDV-infizierter Kälber K mittels Ohrstanzproben, die im Rahmen der Tiermarkierung gewonnen werden Projekt: 04HS040, BMELV
Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR homologe Probenserien genau definierter PI Tiere (Stamm, Infektionszeitpunkt, kolostrale AK ) Untersuchungen von: NS3 ELISAs E rns ELISAs Real time RT-PCR (5 UTR) Untersuchungsschwerpunkte: Gewebelyse,, Freisetzung des Analyten, Isolierung Analytische Sensitivität Einfluss kolostraler Antikörper Stabilität t der nachzuweisenden Viruskomponenten
Sensitivität t der ELISAs 70 60 50 AG-Titer 40 30 20 10 0 NS2/3 NS2/3 NS2/3 AG-Mix polyklonal Erns
Sensitivität t der Real time RT-PCR RNA-Freisetzung enzymatisch mechanisch 40 enzymatisch Ct-Wert 35 30 25 20 B C D E K PI-Tiere mechanisch
Sensitivität t der Real time RT-PCR RNA-Freisetzung RNA-Isolierung 40 35 Ct-Wert 30 25 20 A J A J A J A J A J A J A J H igh P ure R N A Iso latio n Kit (R oche) High P ure Viral R N A Kit (R o che) High P ure R N A T issue Kit (R o che) RN easy M ini Kit (QIA GEN ) R N easy F ibro us T issue Kit (QIA GEN ) RN easy Lipid T issue Kit (QIA GEN) peqgold T rif ast (peqlab) RNA-Isolierungs-Kit
Sensitivität t der Real time RT-PCR RNA-Freisetzung RNA-Isolierung 35 PCR-Assay C t-w ert 30 25 Hoffmann, 2006 Gaede, 2005 20 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 B C E K PI-Tier / PCR
PI-Tiere in der kolostralen Phase Kalb präkolostrale postkolostrale Blutprobe Euthanasie Blutprobe NS2/3-positive Tag NS2/3-positive SNT-Titer Lym. Mye. Lym. Mye. A 35% 30% 9 0,7% 0,2% > 2900 B 56% 46% 13 0,3% 0,4% > 2900 C 57% 48% 5 6,5% 9,0% 2299 D 60% 49% 8 3,3% 3,5 724 E 49% 42% 7 37% 67% < 10 F 43% 38% 9 39% 47% < 10
PI-Tiere in der kolostralen Phase 2.0 NS2/3 1.5 AK-Titer <10 AK-Titer >2900 OD-Wert 1.0 0.5 0.0 uv 1:4 1:16 1:64-0.5
160 I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium PI-Tiere in der kolostralen Phase Erns 120 AG-Titer 80 40 0 AK-Titer >2900 AK-Titer 2900 bis 10 AK-Titer < 10 PI Tiere
PI-Tiere in der kolostralen Phase Real time RT-PCR 40 30 Ct-W ert 20 10 0 AK-Titer >2900 AK-Titer 2900 bis 10 AK-Titer < 10 PI Tiere
Kolostrale Phase bei Ohrstanzen/Hautbiopsie 0 1 2 3 4 5 6 7.10..14...30...40...60...90.. p.p. NS2/3 1-------------------------------------------------------90..(200) E rns?keine Lücke? PCR keine Lücke Immunhistologie keine Lücke
Lagerungstemperaturen NS3 1.5 Kurvenmittel (n=8) OD-Wert 1 0.5 50 C 37 C RT -20 C positiv negativ 0 uv 1:4 1:16 1:64
Lagerungstemperaturen Erns 2.0 Kurvenmittel (n=8) OD-Wert 1.5 1.0 0.5 50 C 37 C RT -20 C positiv negativ 0.0 uv 1:4 1:16 1:64
Lagerungstemperaturen Real time RT-PCR 40 Ct-Wert 35 30 25 20 50 C 37 C 23 C 4 C -20 C
Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR NS3 Erns 5 UTR Sensitivität: +/- + +++ Freisetzung: + +++ + Stabilität: - + +++ kolostrale AK: - + +++
Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR Studie zur Eignung der "Ohrstanzmethode" bei neugeborenen Kälbern zur Bekämpfung der BVD/MD (Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease) (1205 54761-05 05-10)
Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR Diagnostische Sensitivität und Spezifität BVDV-E rns ELISA und BVDV-PCR im Poolverfahren Präanalytik Gewebegewinnung durch Landwirte Probenqualität Akzeptanz des Verfahrens Rückmeldungen Abgabe frühzeitig definierter PI-Tiere
Feldstudie I. Leipziger Labor Bayern Diagnostik Symposium 2006/07 ~ 300 PI, 100% detektiert >Sensitivität >99% (α=5%) Betriebsauswahl > Angebot an Hoftierarzt / Landwirt EDTA-Blut HOFTIERARZT LGL + + + + + + LMU Untersuchung im Alter von über 90 Tagen mit EDTA-Blut
Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR Feldstudie Bayern 2006/07 LGL Oberschleißheim heim HerdChek BVDV Antigen/Serum Plus (IDEXX) automatisiertes Verfahren Antigen-Solubilisierung im Stanzgefäß Kontrolle der Probe nur bedingt möglichm Institut für f r Medizinische Mikrobiologie, LMU mechanische Freisetzung mittels Laborschwingmühle hle RNA Isolierung mit Fibrous Tissue Mini Kit (QIAGEN) Primer und Sonde nach Hoffmann, 2006: 5 UTR 5 als Zielstruktur RT-PCR mit QuantiTect Probe RT-PCR Kit (QIAGEN)
Öffnen des Probengefäß äßes I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium Durchführung hrungpcr
Öffnen des Probengefäß äßes I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium Durchführung hrungpcr
Öffnen des Probengefäß äßes Entnahme und Begutachtung der Probe I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium Durchführung hrungpcr
Durchführung hrungpcr Öffnen des Probengefäß äßes Entnahme und Begutachtung der Probe Überführung in Collection Microtube (enthält bereits Puffer und Stahlkugel)
Durchführung hrungpcr Öffnen des Probengefäß äßes Entnahme und Begutachtung der Probe Überführung in Collection Microtube Probenzerkleinerung Laborschwingmühle hle
Durchführung hrungpcr Öffnen des Probengefäß äßes Entnahme und Begutachtung der Probe Überführung in Collection Microtube Probenzerkleinerung in Laborschwingmühle hle Poolung des Homogenats (12er Pool)
Durchführung hrungpcr Öffnen des Probengefäß äßes Entnahme und Begutachtung der Probe Überführung in Collection Microtube Probenzerkleinerung in Laborschwingmühle hle Poolung des Homogenats (12er Pool) RNA-Isolierung
Ohrgewebe: I. Leipziger Labor Diagnostik E rns Symposium ELISA 70 Tierstatus (Blut) Anzahl Proben 60 50 40 30 persistent infiziert: 156 nicht PI (transient inf.): 19 nicht PI: 3121 86 20 Cut off 10 0,015,06,105,15,195,24,285,40,55,70,85 1,0 1,6 2,2 2,8 3,4 >3,5 OD Stand: 18.6.07
Ohrgewebe: I. Leipziger Labor Diagnostik 5 UTR 5 Symposium PCR N=8665; 7220 über 12er Pools negativ; Einzelproben: 635 kein Ct; 310 Ct 25 20 persistent infiziert 147 Kälber nicht PI (transient inf.) 16 Kälber nicht PI 106 Kälber Anzahl Proben 15 10 5 0 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Ct-Wert PI Tiere mit negativem PCR-Ergebnis (Pool & einzeln): 0 Stand: 18.6.07
Ohrgewebe: I. Leipziger Vergleich Labor Diagnostik E rns Symposium ELISA / PCR >=3,5 OD Erns (IDEXX) 1,0 0,1 Cut off,01 BVDV PCR Ct-Wert<42: n= 310 Ohrgewebe: N= 8665 18 23 28 33 38 42 Ct-Wert persistent infiziert nicht PI (transient inf.) nicht PI infiziert, weitere Probe erforderlich bisher keine Blutprobe nicht definierbar (verendet/export) Stand: 18.6.07
Sensitivität I. Leipziger t und Labor Spezifität Diagnostik Symposium t ELISA / PCR Tierstatus ( Goldstandard Blut) persistent BVDV infiziert nicht-pi Sensitivität PI-prädiktiver Wert Spezifität NPI (ca.) Sensitivität Ohrgewebe A E rns ELISA POS NEG 151 5 13 3109 96,8% 92,1% 99,8% (93,1-98,7) Berechnung nach der Binomialverteilung 100% 99% 98% 97% 96% 95% 94% 93% 92% 91% 90% 89% 88% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 OGW-Test negativ bei 150 PI-Kälbern Ohrgewebe B Pool-PCR POS NEG 147 0 122 2820 100% (>98,0) 55% 98,5% obere Grenze rel. Häufigkeit untere Grenze Stand: 18.6.07
Sensitivität und verbleibende PI t und verbleibende PI-Kälber 1 Mio. Geburten (~Bayern); 0,5% BVDV PI-Kälber: N=5000 ELISA PCR Sensitivität des Tests 0% 96,5% 99,9% nicht detektierte PI s 5000 175 5 weibliche Zuchtkälber 1350 47 1 weibliche Mastkälber 1150 40 1 männlich Kälber 2500 88 3
ELISA: I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium Fazit gut automatisierbar (zu) geringe diagnostische Sensitivität? t? PCR: aufwendiger in der Probenaufbereitung durch Pooluntersuchung kostengünstig nstig höchste diagnostische Sensitivität vergleichsweise viele positive Ergebnisse von NPI transiente Infektionen Kontaminationen durch Kontakt mit PI Laborkontaminationen Impfungen
Herzlicher Dank gilt den Landwirten und Tierärzten rzten der Ohrgewebsstudie den Mitarbeitern von: den Sponsoren: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim Institut für Medizinische Mikrobiologie, Infektionsund Seuchenmedizin, Tierärztliche Fakultät, LMU Bay. Staatsministerium für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz Bayerische Tierseuchenkasse