Regulation der Genexpression. Überwiegend Prokaryonten

Regulation der Genexpression Überwiegend Prokaryonten Dezember 2009 Elmar Schiebel

Was versteht man unter Regulation der Genexpression?

Was versteht man unter Regulation der Genexpression? Jeder Organismus verfügt über zuverlässige Mechanismen zum An- und Abschalten von Genen. Die in einer Zelle jeweils hergestellten RNA- Moleküle und Proteine sind nur eine Teilmenge aller möglichen Genprodukte eines Genoms. Beispiel Bäckerhefe: 5800 Gene; 1183 der Gene sind essentiell; 975 sind wichtig für das Wachstum auf Glukosemedium; 800 Gene werden zellzyklusabh. transkribiert, ungefähr 600-1000 Gene werden entwicklusabhängig (Meiose) reguliert.

Manche Gene sind konstitutiv exprimiert, andere reguliert, z.b. Phosphatabhängige Regulation von Genen in E.coli. in Anpassung an die jeweiligen Umweltbedingungen. 1. Mangel an Pi. 2. Konformationsänderung von PhoR. Proteinkinase-Transmitterdomäne von PhoR wird aktiviert. 3. Phosphate wird auf ein Histidine von PhoR übertragen. 4. Von dort wird das Phosphate auf ein Asparaginsäurerest von PhoB übertragen. Aktiviertes PhoB stimuliert die Transkription. Fig. 10-21, Lodish, Molecular Cell Biology

oder in verschiedenen Zelltypen von Mehrzellern Rot: sind Proteine, die in beiden Proben vorhanden sind. Blau: unterschiedliche Proteine.

Massenspektrometrie Moleküle können sehr empfindlich detektiert werden: 1 : 10 12 in einer komplexen Mischung

SILAC: Stable isotope labeling with amino acids in cell culture 12 C 13 C

Moderne Array - Methoden erlauben die Darstellung von komplexen Genexpressionsmustern. Genexpressionsmuster von Tumorzellen haben große diagnostische Bedeutung. Die Expression von 1800 Genen wurde untersucht. Rot: überdurchschnittliche Expression; grün: unterdurchschnittliche Expression.

Regulation der Genexpression -- Grundprinzipien Ansatzpunkte Mechanismen Transkription (Initiation, Termination) RNA-Prozessierung Translation (Initiation) regulatorische Proteine erkennen spezifische DNA- Sequenzen --> Schalter ; Attenuation; Verpackungszustand der DNA Modifikation, Spleissen, Transport, Stabilität, sirna, mirna Bindung von Proteinen oder kleinen RNAs an mrna; Sekundärstruktur der mrna

Regulation der Transkription Für die regulierte Genexpression sind Schalter im Promotorbereich der Gene von fundamentaler Bedeutung. Diese Schalter bestehen aus zwei Komponenten: 1.) kurze (ca. 20nt) DNA-Abschnitte definierter Sequenz 2.) regulatorische Proteine, die diese Sequenzen erkennen

Wie erkennen Proteine regulatorische DNA-Sequenzen? Der Rand eines jeden Basenpaars ragt über die Oberfläche der Doppelhelix hinaus. Dies erzeugt ein spezifisches Muster an Wasserstoffbrücken (Donatoren und Akzeptoren) und hydrophylen Resten. Diese werden von Bindeproteinen Sowohl in der grossen als auch in der kleinen Furche erkannt. Nur in der grossen Furche sind die Muster für jede der vier möglichen Basenpaaranordnungen merklich verschieden. Aus diesem Grund binden Regulatorproteine im Allgemeinen an Basenpaare in der grossen Furche.

Eine Wasserstoffbrückenbindung resultiert aus einer Dipol-Dipol-Kraft zwischen einem elektronegativen Atom (O, S, N = Akzeptor) und einem Wasserstoffatom (Donator), das an N, O oder F gebunden ist. Die Energie einer Wasserstoffbrückenbindung liegt zwischen 5-30 kj/mol und ist damit niedriger als eine kovalente Bindung (155 kj/mol). F H...:F (155 kj/mol or 40 kcal/mol) O H...:N (29 kj/mol or 6.9 kcal/mol) O H...:O (21 kj/mol or 5.0 kcal/mol) N H...:N (13 kj/mol or 3.1 kcal/mol)

A A D H A D A M Blau: Wasserstoffbindungs-Donatoren Rot: Wasserstoffbindungs-Akzeptoren Gelb: Methylgruppe = hydrophobe Stelle.

Blau: Wassterstoffbindungs-Donatoren Rot: Wasserstoffbindungs-Akzeptoren Gelb: Methylgruppe = hydrophobe Stelle.

DNA-Erkennungs-Code Individuelle Muster für alle Paarungen. In der kleinen Furche gleichen sich die Muster für G-C und C-G bzw. A-T und T-A.

Bindung eines Genregulatorproteins an die grosse Furche der DNA Gezeigt ist nur eine einzelne Kontaktstelle. Normalerweise bilden sich zwischen 10-20 Kontaktstellen aus.

Strukturen von DNA-bindenden Regulatorproteinen - Zink Finger - Helix-Turn-Helix Motiv

Zinkfinger-Motive sind wichtige DNA- Bindungsmotive. beta-faltblattstruktur H Zn C H C Gezeigt sind Zinkfinger der Cys-Cys-His-His-Familie, die in direkter Wiederholung angeordnet sind. Zn ist als grüne, rote oder blaue Kugel dargestellt.

Das Helix-Turn- Helix-Motiv findet sich in vielen DNA- Bindungsdomänen. Beispiel: Lac-Repressor; Helix II ist die Erkennungshelix. Knippers, Abb. 5.32

Kurze DNA-Sequenzen sind die Grundkomponenten genetischer Schalter - sie sind weniger als 20 Nucleotidpaare lang - sie dienen sequenzspezifischen Genregulatorproteinen als Erkennungsstelle. - bisher wurden über 1000 DNA-Sequenzen identifiziert, die als Erkennungsstelle für Transkriptionsfaktoren dienen.

DNA-bindende Regulatorproteine Sigma-Faktoren Repressor Co-Repressor Aktivator

Alternative Sigma-Faktoren Erinnerung: bei der Initiation der Transkription vermittelt die Sigma-Untereinheit die hochaffine Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor (-35 und -10-Region). -->> es gibt Gene mit speziellen Promotor-Regionen, die nur durch besondere (alternative) Sigma-Faktoren erkannt werden können, Bsp. Hitzeschock-Promoter. Knippers, Abb 5.19

Knippers

Wie wird das Regulon (eine Gruppe von Genen, die gemeinsam reguliert werden) als spezifische Antwort auf entsprechende Umweltbedingungen aktiviert? Konzentration von 32 σ (Hitzeschock-Reaktion) steigt aufgrund: 1.) verstärkter Transkription des 32 σ codierenden Gens: mrna steingt von 30 auf 500 Sigma-32 Moleküle pro Zelle an. 2.) verstärkter Translation der 32 σ mrna. 3.) erhöhter Stabilität des 32 σ Proteins: bei erhöhter Temperatur steigt die Stabilität des Proteins um das zehnfache an.

Folge: Innerhalb weniger Minuten nach Erhöhung der Temperatur von 30ºC auf 42-45ºC werden in E.coli mehr als 40 verschiedene Proteine mit zum Teil stark erhöhter Rate synthetisiert. Eigenregulation: Bei 23ºC bewirkt die Interaktion von 32 σ mit DnaJ den Abbau von 32 σ. Nach einem Hitzeshock bindet DnaJ-DNA-K and entfaltete Proteine. 32 σ wird stabilisiert. Wenn die Menge des Hitzeschock-Proteins DnaJ (co-chaperon, das mit DNA-K zusammenwirkt) einen kritischen Wert überschreitet, bindet wieder DnaJ an den Sigma-32 Faktor. Dadurch kommt es zu einer Blockade der Wechselwirkung von Sigma-32 mit RNA-Polym. und zu einer Beschleunigung des Abbaus von Sigma-32.

Regulation durch Repressoren und Aktivatoren Repressoren binden an eine regulatorische Sequenz in der Nähe des Promotors (in der Regel zwischen -50 und +30): -->> Gen wird abgeschaltet (negative Regulation). Aktivatoren binden an eine regulatorische Sequenz in der Nähe des Promotors (in der Regel zwischen -65 und -30): -->> Gen wird angeschaltet (positive Regulation).

Promotorregion Operator 1 codierender Bereich - 50 + 30 (negative Regulation) - 65-35 (positive Regulation) -35-10 (Sigma-Factor) Der Operator ist eine kurze DNA-Sequenz in Promotornähe, an die regulatorische Proteine binden und so die Transkription beeinflussen.

Negative Regulation: Das Tryptophan-Operon Die fünf Gene des Tryptophan Operons werden als eine mrna transkribiert. Warum? Gen-Cluster, die als eine mrna transkribiert werden, sind bei Bakterien häufig und werden als Operon bezeichnet.

Ist die Tryptophankonzentration in der Zelle gering, bindet die RNA- Polymerase an den Promotor und transkribiert die fünf Gene des Tryptophan-Operons. Ist die Trptophankonzentration hoch, wird der Tryptophan-Repressor aktiviert und bindet an den Operator, wodurch die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor blockiert wird. Was ist Tryptophan in diesem Fall?

Helix-Turn-Helix-Familie Durch die Bindung von Tryptophan an das Tryptophan-Repressorprotein wird die Konformation des Repressors verändert. Die Bindung von Tryptophan vergrößert den Abstand zwischen den beiden Erkennungs- Helices in dem Homodimer, wodurch der Repressor genau auf den Operator passt.

Bakterielle Genetik - F. Jacob and J. Monod (1959) entdeckten eine E.coli Mutante, die auch in Abwesenheit des Induktors max. Mengen an beta-galactosidase produzierten.

Negative und positive Regulation: Das lac-operon von E.coli Wird wichtig beim Mangel an Glucose - aber nur dann, wenn Lactose im Wachstumsmedium vorhanden ist.

Wachstum von E. coli in Gegenwart von: Glucose + + - - Lactose + - - + Lac Operon - - - + Wie kommt dieses Regulationsmuster zu Stande? Das lac-operon ist ein Beispiel für die Integration von verschiedenen Signalen.

Im lac-operon werden drei Gene koordiniert exprimiert Das lacz Gen codiert für das Enzym β-galactosidase (LacZ). Sie hydrolysiert, das heißt spaltet Lactose in Galactose und Glucose, kann aber auch Lactose in Allolactose umwandeln. Das lacy Gen codiert für das Transportprotein β-galactosid-permease (LacY), welches die zelluläre Aufnahme von Lactose ermöglich. Das laca Gen codiert für das Enzym β-galactosid-transacetylase. Es ist für den Lactoseabbau nicht notwendig. Seine Funktion ist bisher unklar. Lodish, Fourth Edition

Funktion der Genprodukte des Lac-Operons

Die beta-galactosidase katalysiert folgende Reaktion: LacZ/beta-Galactosidase ist ein tetrameres Protein mit ca. 1000 AS je Untereinheit! Stryer, Fifth Edition

12 Transmembranhelices Röntgenkristallstruktur der Galactosid-Permease = LacY (Abramson et al., Science, August 2003)

Die beta-galactosidase ist ein induzierbares Enzym Eine E.coli-Zelle, die auf Lactose wächst, enthält mehrere tausend Moleküle beta-galctosidase. Im Gegensatz dazu hat eine E.coli Zelle weniger als 10 beta-galctosidase Moleküle beim Wachstum in Glucosemedium.

Auf der Ebene der Transkription! Lodish, Fourth Edition Schnell Induktion der lacz mrna nach Zugabe des künstlichen Induktors IPTG (Isopropylthiogalactosid). Die Induktion erreicht nach nur 2 min Sättigung. Wie funktioniert das?

F. Jacob and J. Monod (1959) entdeckten E.coli Mutanten, die auch in Abwesenheit des Induktors max. Mengen an beta-galactosidase produzierten. 2 Klassen von Mutanten: laci - und O c.

Induktion des lac-operons - Charakterisierung von Mutanten Ausgangspunkt: Mutanten, die immer lacz exprimiert, also keine Regulation mehr haben. Werkzeuge - Methoden: 1) Induktor IPTG (100 µm) 2) Blautest (X-Gal) 3) F -Plasmid LacZ/beta-Galactosidase wandelt das chromogene Substrat X-Gal in ein blaues Produkt um. Knippers, Abb 5.27

F Plasmid Als seltenes Ereignis kann ein integriertes Plasmid wieder aus dem E.coli Genom geschnitten werden. Gelegentlich verläuft dieser Vorgang ungenau. Dann werden benachbarte chrom. DNA-Abschnitte gemeinsam mit den F-Plasmid- Sequenzen ausgeschnitten. Dabei entsteht das F Plasmid, das zusätzliche chromosomale Gene trägt. F -Plasmide können in andere Bakterien übertragen werden. Diese Zellen sind dann diploid in Bezug auf die chromosomalen Gene im F Plasmid.

1. Die laci - Mutante: Lodish, Fourth Edition Schlussfolgerung: Das laci + -Gen wirkt in trans. Es handelt sich also um einen frei diffundierbaren Repressor des lac Operons.

2. O c -Mutationen: LacZ Expression selbst wenn LacI vorhanden. Welches LacZ Gen? Lodish, Fourth Edition Schlussfolgerung: O c sind Mutationen im Operator, die in cis wirken und die die Bindung des LacI Repressors verhindern.

Negative Regulation: Der Lac-Repressor (LacI) a) In Abwesenheit eines Induktors (IPTG oder Allolactose) bindet der Repressor an die Operator-Sequenz und blockiert damit den Zugang der RNA-Polymerase zum Promotor. b) Der Induktor bindet an den LacI Repressor, der dabei die Konformation ändert und die Fähigkeit zur DNA-Bindung verliert.

Struktur des Lac-Repressors tetrameres Protein mit 360 AS je Untereinheit Kopfstück: DNA-Bindung (Helix- Turn-Helix) Scharnier Zentrale Domäne: IPTG-Bindung, Dimerisierung C-terminale Helix: Tetramerisierung Knippers, Abb 5.31

Bindung des Lac- Repressors an die Operator-DNA Helix-Turn-Helix-Motiv Erkennung der großen Furche. Spezifität durch Wasserstoffbrückenbindungen: Arg, Gln, Ser, Tyr. Kopfstücke des Dimers binden palindromische Operator-Sequenz Knippers, Abb 5.32

Der lac Operator besteht aus 21 palindromisch angeordneten Basenpaaren. Also umfasst ein Operatorbereich zwei komplette Doppelhelix-Drehungen. Demnach existieren im Operator zwei Bindestellen, je eine für ein Kopfstück in einem der beiden Dimer-Partner. Warum? Jedes Kopfstück bindet als Helix-Turn-Helix an seine Stelle, aber gemeinsam ändern sie den Lauf der DNA, indem sie eine Beugung von 60º in der Mitte des Operators induzieren.

Untersuchung von laci Mutanten: Der Austausch des Tyr 17 oder des Gln 18 von LacI (Kopfstück, das an die DNA bindet) durch andere Aminosäuren führt zu einem Verlust der spezifischen DNA-Bindung und zum Phänotyp einer konstitutiven lac-gen-expression.

Kopfstück: DNA-Bindung (Helix-Turn-Helix) Stryer, Fifth Edition

In Wirklichkeit ist alles komplizierter Warum ist LacI ein Tetramer? Knippers, Abb 5.29

Es gibt drei lac- Operatoren im Genom von E. coli! Der lac Repressor bindet mit höchster Affinität an das fast perfekte Palindrom des LacO1 Operators. laco3 90 bp stromabwärts und laco2 400 bp stromaufwärts. Drei Opereatorseq.: LacZ sinkt nach Entzug des Induktors auf 0.1%. Dagegen, wenn nur laco1 vorhanden ist, auf nur 2.5%. Die Bindung eines Pre-ressor- Tetramers erzeugt eine DNA Schleife. Knippers, Abb 5.33

Welche Parameter beeinflussen das quantitative Verhalten des Schalters? Repressor + Operator Repressor Operator Repressor + DNA Repressor DNA 1. Bindungskonstanten für die relevanten Bindungsvorgänge. 2. Spezifität und Menge des DNA-bindenden Proteins 3. Größe des Genoms (Verhältnis von unspezifischen zu spezifischen Bindungsstellen)

Es gibt keine freien Repressor-Moleküle in der Zelle! Repressor + DNA Repressor DNA K A = [Repressor DNA] [Repressor] [DNA] Mit DNA ist nicht die Operator-Sequenz gemeint, sondern alle anderen möglichen Bindungsstellen (4*10 6 ), eine E. coli Zelle hat ein Volumen von ca. 10-15 l, K A ist 2 * 10 6 M -1 [Repressor] [Repressor DNA] = 1 [DNA] K A = 10-4 N A = 6,022 10 23 mol 1 ; d.h. [DNA] = 0.5 10-2 M.

Vergleich von K A für die Bindung des Operators oder Nicht-Operator-DNA (Spezifität der Interaktion) Repressor + Operator Repressor Operator K A = [Repressor Operator] [Repressor] [Operator] Operator DNA Spezifität Repressor 2 * 10 13 M -1 2 * 10 6 M -1 10 7 Repressor + Induktor 2 * 10 10 M -1 2 * 10 6 M -1 10 4

Wachstum von E. coli in Gegenwart von: Glucose + + - - Lactose + - - + Lac Operon - - - +? Wie kommt dieses Regulationsmuster zu Stande?

Warum gibt es keine Expression von LacZ wenn Glucose und Lactose im Medium vorhanden sind? Positive Regulation durch das CAP (catabolite activator protein)-protein = Aktivator! ist notwendig für die Expression des Lac Operons. Signaltransduktion koppelt Verfügbarkeit von Glucose an camp-spiegel (im Rahmen der Katabolit-Repression). Glucose hoch: camp niedrig Glucose niedrig: camp hoch camp aktiviert das CAP-Protein, das als Transkriptions- Aktivator agiert.

camp ist ein wichtiges Signalmolekül bei Pround Eukaryoten. Die Adenylat-Cyclase erzeugt camp. Die camp-phosphodiesterase baut camp ab.

Lodish, Fourth Edition

Promotorregion LacI CAP (positive Regulation) 1 codierender Bereich (negative Regulation)

Negative und positive Regulation: Das lac-operon Das lac-operon ist ein Beispiel für die Integration von verschiedenen Signalen. Glucose hoch (Setty et al., PNAS 100, 7702, 2003). Glucose niedrig

Positive Regulation: Das CAP-Protein Das CAP Protein ist ein Dimer. Es induziert eine kräftige Beugung der DNA um 90º bis 130º. Stryer, Fifth Edition CAP interagiert mit dem RNA Polymerase-Sigma-70 Komplex und stimuliert dadurch stark die Transktiptionsrate.

Zusammenfassung:

Gemeinsamkeiten? Stryer, Fifth Edition

Interaktion von kleinen Molekülen mit Repressoren und Aktivatoren Induktor: Bindung eines kleinen Moleküls inaktiviert die DNA-Bindedomäne eines Repressors (Bsp. Lac-Repressor). Co-Repressor: Bindung eines kleinen Moleküls aktiviert die DNA-Bindedomäne eines Repressors (Bsp. Trp-Repressor). Co-Aktivator: Bindung eines kleinen Moleküls aktiviert den Aktivator. (Bsp. camp im Fall von CAP). In allen Fällen spricht man von einer allosterischen Konformationsänderung.

Allolactose oder IPTG = Induktor camp = Co-Aktivator Tryptophan = Co-Repressor

Aus dem lac-operon abgeleitete Werkzeuge: LacI und lac Operator! für Expression genutzte E. coli Stämme überexprimieren LacI.

Aus dem lac-operon abgeleitete Werkzeuge: LacI 1 2 3 4 5 6 7 Analyse der Proteinzusammensetzung verschiedener Bakterienstämme durch SDS-Gelelektrophorese und Anfärbung der Banden durch Coomassie: * 1: Ausgangstamm 2-7: Stämme, die verschiedene rekombinante Proteine (*) produzieren. * * * * * Induktion des rekombinant exprimierten Proteins mit IPTG!

Aus dem lac-operon abgeleitete Werkzeuge: α-komplementation oder Blau/Weiß-Selektion Bei dieser Grundstrategie zum Klonieren eines DNA- Fragmentes wird nur indirekt auf den Einbau des Inserts selektioniert.

α-komplementation oder Blau/Weiß-Selektion lac Promotor und erste 150 Codons von lacz auf Plasmid 3 -Ende des Gens im Genom des verwendeten E. coli-stamms funktionelle beta-galactosidase wird aus alpha-fragment und genomischem Fragment gebildet Selektion auf LB-AMP + IPTG + X-Gal -->> religiertes Plasmid gibt blaue Kolonien Stratagene- Katalog Insert unterbricht den lacz Leserahmen -->> weiße Kolonie

Regulation der Genexpression -- Grundprinzipien Ansatzpunkte Mechanismen Transkription (Initiation, Termination) RNA-Prozessierung Translation (Initiation) regulatorische Proteine erkennen spezifische DNA- Sequenzen --> Schalter ; Attenuation; Verpackungs- Zustand der DNA Modifikation, Spleissen, Transport, Stabilität Bindung von Proteinen oder kleinen RNAs an mrna; Sekundärstruktur der mrna

Attenuation ist ein Mechanismus, bei dem die Transkription durch alternative Sekundärstrukturen der entstehenden mrna reguliert wird. Attenuation beruht auf der Translation von entstehenden Transkripten und kommt daher nur bei Prokaryoten vor. Attenuation ist eine typische Form der Regulation bei Operons, die für Enzyme der Aminosäure-Biosynthese codieren, Bsp. trp-operon. Leader: Mutationen führen zur gesteigerten mrna Synthese in Gegenwart von Trp.

Die leader -Sequenz misst die Verfügbarkeit der entsprechenden Aminoacyl-tRNA: Stryer, Fifth Edition Weitere Beispiele:

Der Attenuator ist der direkt auf das Leader-Peptid folgende mrna-abschnitt. Er bildet je nach Position des Ribosoms alternative Sekundärstrukturen aus. Eine davon fungiert als Terminationsschleife für die Transkription. Sie bildet sich, wenn das translatierende Ribosom schnell durch das Leader-Peptid hindurchkommt.

Erinnerung Termination der Transkription: Die Termination der Transkription kann durch zwei Mechanismen erfolgen. Rho- abhängig oder Rho-unabhängig. Bei der (einfacheren) Rho-unabhängigen Termination wird die Transkription an einem sogenannte Terminator beendet. Die Terminatorsequenz wird noch transkribiert. Der entstandene RNA-Abschnitt (siehe Bild) bewirkt aber eine Konformationsänderung der RNA-Polymerase, die dadurch von der Matrize abfällt.

Wenig Tryptophanbeladene trna: Ribosom pausiert, Attenuator bildet Sekundärstruktur aus, die NICHT zur Termination der Transkription führt. Lewin, genes VII

Viel Tryptophanbeladene trna: Ribosom kommt schnell voran, Attenuator bildet Terminationsschleife aus, die zur Termination der Transkription führt! Die gelbe Region ist nicht mehr für Basenpaarungen verfügbar! Terminationsschleife Lewin, genes VII

Prinzip: Protein bindet an seine eigene mrna und reguliert so seine eigene Translation negativ (autogene Regulation). Sinnvolles Regulationsprinzip für makromolekulare Komplexe, z.b. das Ribosom. Das ribosomale Protein S8 bindet normalerweise an rrna. Wenn die fehlt, bindet es an die mrna des eigenen Operons. S8 Bindestellen Knippers, Abb 5.26 S8 mrna