Identifizierung von Proteinen Genom bekannt, Proteinsequenzen in der Datenbank abgelegt: - Identifizierung von Proteinen mit ilfe der Massenspektrometrie Methode der Wahl, sehr empfindlich, in der egel einige Femtomol eines Proteins ausreichend - -terminale Sequenzierung und/oder Sequenzierung von Peptiden mit Edman-Abbau, nur noch selten durchgeführt in der egel einige picomol eines Proteins erforderlich Genom nicht sequenziert: Aufklärung der kompletten Primärstrukur erforderlich, häufigste Strategie: Peptidsequenzen ligonukleotide P cda-klon Screenen einer Genbank Sequenzieren von cda-klonen Erstellen von Protein-/Peptidsequenzen Edman-Abbau (erste Wahl) Massenspektrometrische Sequenzierung (de novo Sequenzierung, häufig problematisch)
Isolierung und Identifizierung von Proteinen im Mikromaßstab: 1. Anreicherung (Methode abhängig von dem jeweiligen Protein) - Subzelluläre Fraktionierung (z.b. Isolierung von Mitochondrien, Zellkerne durch Zentrifugation) - Differenzielle Extraktion/Fällung - hromatographie 1. Affinitäts-hromatographie 2. Ionenaustausch-hromatographie 3. Adsorptions-/Verteilungschromatographie 4. Gel Filtration 2. Trennung durch Gel-Elektrophorese (universell anwendbar) - SDS- Gel-Elektrophorese - 2D- Gel-Elektrophorese 3. Analyse der Banden / Spots durch Massenspektrometrie
Strategien zur Identifizierung/Sequenzierung von Proteinen und Peptiden Protein-Gemisch Trennung auf SDS-Gel/ 2D-Gel Bande/Spot ausschneiden Blot auf PVDF- Membran In-Gel Verdau mit Proteasen Extraktion der Peptide Massenspektrometrie Datenbanksuche mit MS-/MS/MS-Daten << 1pmol PL-Trennung -terminale Sequenz Edman-Abbau > 5 pmol Peptidsequenzen Edman-Abbau > 50 pmol
Edman-Abbau S Base S 2 + + (wasserfrei) S + S + 2 + Thiazolinon S - + neuer Zyklus S intermediäre ingöffnung Phenylthiohydantoin PT-Aminosäure S
- +
eagents in Glass block Glass fibre filter disc eagents out
häufige -terminale Blockierung von Proteinen: Bildung von Pyroglutamat 2 2 2 2... 3 2 2... Acetylierung/Acylierung 2... 3...
Frequently used enzymes for fragmentation of proteins Enzyms (major sources) E-number Specificity (X- -Y) p optimum Enzymes of high specificity Endoproteinase Arg- 3.4.22.8 Arg- -Y 7-8 (lostridium histolyticum) Endoproteinase Lys- 3.4.21.50 Lys- -Y 8-9 (Achromobacter lyticus, (Lysobacter enzymogenes) Trypsin (Bos taurus) 3.4.21.4 Lys- -Y, Arg- -Y 7-9 Endoproteinase Glu- 3.4.21.19 Glu- -Y, (Asp- -Y) * 8 (4) (Staphylococcus aureus) Endoproteinase Asp- (Pseudomonas fragi) 3.4.24.33 X- -Asp 7-8 Enzymes of lower specificity Major cleaved bonds: hymotrypsin (Bos taurus) 3.4.21.1 X = Tyr, Phe, Trp, (Leu) 7-9 Pepsin (sus scrofa) 3.4.23.1 X,Y = aromatic, large aliphatic aa 1.8-2.5 Elastase (sus scrofa) 3.4.21.36 X = Ala, uncharged, non-aromatic aa, 8-9 Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus) 3.4.24.27 Y = L, F and other aromatic or large hydrophobic aa 8 * Glu- : ammonium bicarbonate, p 7.8, ammonium acetate, p 4.0, Glu-, Asp- :phosphate buffer, p 7.8, (cleavage at Asp often slow) aa = amino acid
Br-Spaltung - 2 2 S 3 Br -Br - - 2 2 + S 3-2 + 2 S 3-2 + 2 - + - + 2 + S 3 2 2-2 2 + 2 omoserin - 2 2 omoserinlacton
eversed-phase-hromatographie Si + l Si ( ) 2 17 3 Si Si - l Silan ( ) 2 17 3 Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: berfläche wird unpolar Si Si stationäre Phase unpolar Si Si ( ) 2 17 3 mobile Phase polar 3 2 ( ) 2 17 3 Analyt / Die Phasen sind im Vergleich zur normalen hromatographie an Kieselgel umgekehrt, daher der ame eversed-phase-hromatogaphie (P-hromatogaphie)
Theorie/Definitionen t 2 Detektor-Signal t 0 t 1 Injektion w 1 w 2 t 0 t 1 t 2 Zeit etentionskoeffizient: k n = Selektivität: = k 2 k 1 - t n t 0 t 0 t 2 - t 1 Auflösung: = w 1 -- w 2 t 2 Bödenzahl: = 16 w Bodenhöhe: = L L = Säulenlänge
Detektor-Signal schlechte Auflösung t 0 t 1 t 2 Zeit Detektor-Signal gute Auflösung aufgrund höherer Bödenzahl t0 t 1 t 2 Zeit Detektor-Signal gute Auflösung aufgrund höherer Selektivität t 0 t 1 t 2 Zeit
Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen Eddy-Diffusion ( A) longitudinale Diffusion ( _ B ) u Massentransport zwischen mobiler und stationärer Phase ( u ) Totvolumina im hromatographie-system van Deemter-Gleichung: h = A + _ B u + u h = theoretische Bodenhöhe u = Flussgeschwindigkeit
Eddy-Diffusion Zeit longitudinale Diffusion Säule Start
Massentransfer zwischen stationärer und mobiler Phase Verteilung zwischen stationärer und mobiler Phase benötigt eine gewisse Zeit mobile Phase stationäre Phase Fluss-ichtung Bandbreite langsame Aquilibrierung Verteilungsgeschwindigkeit variiert mit: - Diffusionskoeffizient des Analyten in der stationären Phase - Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase - Dicke der stationären Phase - Partikelgröße - Verteilungskoeffizient - Flussrate Bandbreite nach einiger Zeit
Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen Eddy-Diffusion ( A) longitudinale Diffusion ( _ B ) u Massentransport zwischen mobiler und stationärer Phase ( u ) Totvolumina im hromatographie-system van Deemter-Gleichung: h = A + _ B u + u h = theoretische Bodenhöhe u = Flussgeschwindigkeit
PL (igh Pressure Liquid hromatography, ochleistungsflüssigkeitschromatographie) ochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe) iederdruckgradientensystem
Isokratische Elution, Gradientenelution A B Fließmittel 1 Absorption D isokratisch: Absorption A B D Fließmittel 2 (höhere Elutionskraft) Die Zusammensetzung des Fließmittels bleibt während der Trennung konstant Zeit A B D Gradient: Absorption Die Zusammensetzung des Fließmittels ändert sich während der Trennung hin zu höherer Elutionskraft Zeit
Funktionsweise eines Injektionsventils Ventilstellung: Load Inject von der Injektionsspritze V zum Abfall- Behälter V V V Probenschleife von der Pumpe V von der Pumpe V V zur Säule V zur Säule
Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durch eversed-phase-hromatographie 0.05 Absorption [220 nm] 0.01 Start 0 20 40 60 etentionszeit [min]