7. Zusammenfassung und Ausblick 7.1 Die Mitglieder der Rag-Familie Die verschiedenen Isoformen der Rag-Familie lagen, sofern sie rekombinant löslich isoliert wurden, als Dimer oder höhere Oligomere vor. Im Gegensatz zu dem Gtr1p Gtr2p-Komplex aus S. cerevisiae war eine Reinigung des Komplexes aus RagA RagC (R. norwegicus H. sapiens) aus diesen Gründen nicht möglich. Auch die G Domänen von Gtr1p und Gtr2p, die beide jeweils die Aminosäuren 1-189 umfassen, lagen als Dimere, Tetramere und hochmolekulare Homomere vor, so dass für die Bildung der Multimere die C-terminale helikale Domäne nicht essentiell ist. Eine Interaktion zwischen den G Domänen von Gtr1p und Gtr2p sowohl nach rekombinanter Koexpression in E. coli als auch durch Zusammenfügen der einzeln isolierten G Domänen in Abhängigkeit verschiedener Nukleotide konnte nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der durchgeführten Analysen ist eine hohe Affinität (bis ~ 10 µm) zwischen den G Domänen von Gtr1p und Gtr2p auszuschließen, wobei eine schwach-affine Interaktion weiterhin möglich ist und fluoreszenzspektroskopisch in Zukunft untersucht werden sollte. Dabei sollte die Abhängigkeit von verschiedenen Nukleotiden (GTP, GDP und GDP+AlF x ) getestet werden, um festzustellen, ob sich beispielsweise nur ein Komplex der G Domänen im Übergangszustand bilden kann. Verschiedene Nukleotide (GTP, GDP und GDP+AlF x ) hatten keinen Einfluss auf das Vorliegen als Monomer/Dimer bzw. Dimer/Tetramer der G Domäne von Gtr2p. Im Gegensatz dazu war das Verhältnis Monomer zu Dimer der G Domäne von Gtr1p in Anwesenheit von GDP und Aluminiumfluorid am größten. Eine Dimerisierung der G Domäne in Abhängigkeit von GTP oder GDP und Aluminiumfluorid, wie es für andere G Domänen beschrieben wurde, war hingegen nicht zu beobachten. Die einzeln isolierte G Domäne von Gtr1p bzw. Gtr2p wies keine GTP- Hydrolyseaktivität in den HPLC-Messungen auf. Im Gegensatz dazu war für den vollständigen Komplex aus Gtr1p und Gtr2p eine sehr geringe Hydrolyserate im Vergleich zu den Einzelproteinen detektierbar, die jedoch so langsam war, dass keine Rate bestimmt werden konnte, da der Fehler aufgrund der Länge der Messung zu groß wurde. Der Versuch, die Hydrolyse fluoreszenzspektroskopisch durch tamragtp zu verfolgen, führte zu einer Signaländerung, die nicht mit der detektierten Hydrolyserate der HPLC-Messung -165-
übereinstimmte. Hierfür kann z.b. eine artifizielle tamragtp-hydrolyse oder eine Konformationsänderung nach der erfolgten Assoziation angenommen werden. Die Affinitäten des Gtr1p Gtr2p-Komplexes sowie der einzelnen G Domänen von Gtr1p bzw. Gtr2p zu verschiedenen mant-markierten G-Nukleotiden wurden bestimmt und miteinander verglichen. So wurde für die G Domäne von Gtr1p für mgtp und mgdp zu mgtp mit 2,1 und 2,5 µm ein ähnlicher Wert für die Dissoziationskonstante erhalten. Auch der Wert für die G Domäne von Gtr2p zu mgtp entspricht dem der G Domäne von Gtr1p (2,1 µm), wobei die Affinität zu mgdp dieses Proteins noch bestimmt werden muss. Im Gegensatz dazu wurde für den vollständigen Komplex aus Gtr1p und Gtr2p eine 5fach erhöhte Affinität zu mgtp sowie eine 10fach reduzierte Affinität zu mgdp nachgewiesen. Der vollständige Gtr1p Gtr2p-Komplex bevorzugt somit GTP gegenüber GDP im Gegensatz zu der G Domäne von Gtr1p. Ob diese Unterschiede durch die C-terminale helikale Domäne, durch eine geringere Affinität von Gtr2p zu mgdp oder durch die Komplexbildung hervorgerufen werden, muss noch nachgewiesen werden. Das hydrolysierte GDP wird im vollständigen Gtr1p Gtr2p-Komplex schneller freigesetzt und aufgrund der höheren Affinität wiederum zu GTP ausgetauscht. Die generell niedrigen Affinitäten zu GTP und GDP, die im mikromolaren Bereich liegen, stehen im Einklang mit der Tatsache, dass kein GEF für die Rag-Proteine bekannt ist und anhand der bestimmten Nukleotidaffinitäten auch nicht notwendig ist. 7.2 Die Untereinheiten des Nup84p-Komplexes Auch durch unterschiedliche Kombination von Vektoren, Promotoren und Fusionsanteilen war es nicht möglich, die Ausbeute des trimeren Komplexes aus Nup120p Nup85p Seh1p zu erhöhen. Der dimere Komplex Nup85p Seh1p lag hauptsächlich als Oligomer vor und auch die gereinigte dimere Population bildete zudem zeitabhängig hochmolekulare Multimere, die einen negativen Einfluss auf die Kristallisation haben können. Die Trypsin-Sensitivität von Nup85p und Seh1p war abhängig von Nup120p, da in Anwesenheit von Nup120p beide Proteine nicht degradiert wurden. Ein identifiziertes Fragment von Nup120p führte jedoch zu einem unlöslichen Protein. Drei Fragmente von Nup145pC mit einem Molekulargewicht von 69 kda, 66 kda und 33 kda wurden identifiziert und kloniert, wobei das letztere ein instabiles Fragment als Resultät hatte, so dass Nup145pC 258-545 (33 kda) nicht zusammen mit dem potenziellen -166-
Bindungspartner Sec13p isoliert werden konnte. Die anderen beiden Fragmente (66 kda oder Nup145pC 106-683 ; 69 kda oder Nup145pC 106-712 ) interagierten hingegen weiterhin mit Sec13p und wurden mit hoher Reinheit wie der Komplex mit dem vollständigen Nup145pC- Protein erhalten. Proteinkristalle bildeten sich jedoch nur mit Nup145pC 106-683 im Komplex mit Sec13p. Diese Kristalle wiesen ein Beugungsmuster bis zu einer Auflösung von maximal 8,6 Å auf, was durch Microseeding und Crystal Engineering nicht wesentlich verbessert werden konnte. Eine Mutation in Sec13p (L22A) von Sec13p führte zu einer Inhibierung der Komplexbildung mit Nup145pC, wohingegen die Mutation G176R zu einer Oligomerisierung von Sec13p allein sowie des Komplexes von Nup145pC Sec13p G176R führte. Interaktionsstudien mit dem trimeren Komplex Nup120p Nup85p Seh1p ergaben, dass die letzten 30 Aminosäuren von Nup145pC für die Interaktion mit Nup120p essentiell sind, da Nup145pC 106-683 Sec13p im Gegensatz zu Nup145pC 106-712 Sec13p nicht mehr an Nup120p gebunden wurde. In dieser Arbeit zeigte sich, dass Sec13p ein außerordentlich lösliches und stabiles Protein ist. Um das Ziel der Strukturbestimmung zu erreichen, wurde neben verschiedenen Salzkonzentrationen und des Einflusses des Hexahistidinanteils ein homologes Protein getestet (A. t. Sec13p), Oberflächenmutationen eingefügt (Crystal Engingeering) sowie die Oberfläche durch Methylierung verändert, nachdem die Kristallisation des ursprünglichen Sec13p-Proteins nicht möglich war. Letztendlich ermöglichte die Methylierung von Sec13p, Bedingungen für die Kristallisation des Sec13p-Proteins zu finden. Der erhaltene Datensatz wurde bis zu einer Auflösung von 2,9 Å ausgewertet. Ob die gefundene Lösung, die durch molekularen Ersatz gefunden wurde, richtig ist, kann derzeit nicht beurteilt werden, da die Datenqualität eine weitere Verfeinerung nicht erlaubt. Methionin-Mutationen wurden in die Sec13p-Sequenz eingeführt, um Selenomethionin in Sec13p inkorporieren zu können und experimentelle Phasen für die Strukturbestimmung zu erhalten. Dies war notwendig, da Sec13p außer dem Startmethionin kein weiteres Methionin enthält. Diese Strategie wurde gewählt, da Schweratomderivate einen negativen Einfluss auf das Kristallgitter hatten. Testweise kristallisierte Sec13p L11M K65M L115M bzw. Sec13p L11M L17M K65M L115M im unmethylierten Zustand und ohne Inkorporation von Selenomethionin, jedoch nicht. Deswegen sollte das Protein mit vier Methionin-Mutationen nach der Proteinsynthese mit Selenomethionin-Einbau methyliert -167-
werden und anschließend auf Kristallisationsbedingungen getestet werden. Unter der Voraussetzung, dass die Kristalle ein hochauflösendes Beugungsmuster aufweisen, könnten experimentelle Phasen erhalten werden, die die erhaltene Lösung durch den molekularen Ersatz entweder bestätigen oder widerlegen würden. Im Fall einer Bestätigung könnten die Daten miteinander kombiniert werden. 7.3 Ran Nup153-ZnF-Komplex Die Kristallstruktur des zweiten Zinkfingers von Nup153 in Komplex mit Ran GDP war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, wobei eine Auflösung von 2,1 Å erreicht wurde. Die Analyse der Komplexstruktur zeigte eine neue Interaktionsart zwischen Ran und einem seiner Bindungspartner, dem Zinkfingermotiv, da sie nicht mit einer der anderen bekannten Ran- Strukturen in Komplex mit anderen Interaktionspartnern vergleichbar und verwandt ist. Die Komplexstruktur ermöglichte, Schlussfolgerungen auf die Funktion der Interaktion und auf die Regulation des Kerntransportes zu ziehen (6.2.3). Durch Pulldown-Experimente wurde gezeigt, dass der C-Terminus einen Einfluss auf die Interaktion mit dem Zinkfinger von Nup153 hat, was durch die Kristallstruktur jedoch nicht direkt erklärbar ist und durch die Stabilität sowie die Flexibilität von RanΔC begründet sein kann. Die strukturelle Analyse gab Aufschluss darüber, warum die Interaktion unabhängig vom an Ran-gebundenen Nukleotid ist: Außer Threonin 42 der Switch I-Region von Ran ist keine weitere Aminosäure an der Bindung von Nup153-ZnF beteiligt, die in Abhängigkeit von GTP und GDP ihre Position ändert. Die Mutation der Position 42 von Ran zu Alanin hatte entsprechend keinen Einfluss auf die Interaktion zwischen Ran und Nup153. Die Unabhängigkeit der Interaktion von den Schalterregionen von Ran ist eine charakteristisches Merkmal der Interaktion zwischen dem Zinkfingermotiv und Ran. Die Komplexbildung zwischen Ran und Nup153 erfolgt durch hydrophobe Wechselwirkungen und polare Kontakte über Wasserstoffbrückenbindungen. Als Aminosäuren, die wichtige Kontakte vermitteln, wurden anhand der Struktur die Glutamine an den Positionen 82 und 84 von Ran identifiziert. Im Gegensatz dazu hatte die Mutation jeweils eines Restes zu Alanin in der Affinitätpräzipitation keinen Einfluss auf die Interaktion. Daher muss in weiteren Experimenten zum einen der Einfluss der Doppelmutante Q82A und Q84A und zum anderen der Einfluss einer Ladungsreversion -168-
durch Mutation zu einer positiv geladenen Aminosäure wie Arginin untersucht werden, um den Anteil dieser Aminosäuren von Ran an der Interaktion zu Nup153-ZnF bestimmen zu können. Da Glutamat 733 sowohl mit seiner Amid- und Carbonylgruppe des Peptidrückrats als auch mit der Seitenkette an Ran bindet, ist diese Aminosäure für die Komplexbildung höchstwahrscheinlich sehr wichtig. Auch wenn diese Aminosäure in den Zinkfingern des RanBP2-Typs nicht konserviert ist, so ist an dieser Position doch immer ein polarer Rest vorhanden, der weiterhin Wasserstoffbrückenbindungen zu Ran ausbilden könnte. Die Struktur der Peptidkette des zweiten Zinkfingers von Nup153 weist in Abhängigkeit der Ran-Bindung keine große Veränderungen auf, wenn die Kristallstruktur des Ran Nup153-Komplexes mit der NMR-Struktur dieses Zinkfingers von Nup153 verglichen wird (Higa et al., 2007; Abbildung 6.9). Die Überlagerung mit Ran-Molekülen anderer Komplex-Strukturen zeigt, dass eine gleichzeitige Bindung von Importin β bzw. RanBD und dem Zinkfingerpeptid auszuschließen ist, wohingegen NTF2, RCC1 oder RanGAP zusammen mit Nup153 gebunden werden können (Abbildung 6.10). -169-