4. Zusammenfassung und Ausblick

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1 ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK Zusammenfassung und Ausblick Cryptochrome sind Flavoproteine, die in Vertretern beinahe sämtlicher Organismengruppen vorkommen und eine Vielzahl physiologischer Wachstums- und Anpassungsantworten regulieren [Übersichtsartikel Sancar, 2003]. Phylogenetische Analysen deckten auf, dass Cryptochrome sich evolutiv von den UV-A/Blaulicht-abhängigen DNA-Reparaturenzymen, den Photolyasen, ableiten und demnach einer gemeinsamen Proteinsuperfamilie angehören. Während Photolyasen mit Hilfe eines katalytischen Chromophors, Flavinadenindinukleotid (FAD), und eines Antennenkofaktors, Methenyltetrahydrofolat (MTHF) (meisten Organismen) oder 8-Hydroxy-5-deazariboflavin (8-HDF), ihre enzymatische Reparaturaktivität entfaltet, fehlt diese Aktivität den Cryptochromen, ungeachtet ihrer hohen Sequenzhomologien und strukturellen Ähnlichkeit zu den Photolyasen. Cryptochrome übernehmen je nach Organismustyp unterschiedliche Funktionen. So fungieren sie in Drosophila melanogaster als blaulichtabhängige Photorezeptoren, die die Synchronisation der circadianen Uhren vermitteln. In der Maus beteiligen sich Cryptochrome als integrale weitestgehend lichtunabhängige Komponente der Inneren Uhr. Neben der blaulichtabhängigen Inhibierung der Hypokotyl-Verlängerung üben Cryptochrome in Arabidopsis thaliana eine erdmagnetorientierte Wachstumskontrolle aus und bei den Zugvögeln übernehmen sie die Magnetkompassorientierung bei der saisonbedingten Migration. Um diese unterschiedlichen Aufgaben zu bewältigen, haben Cryptochrome geeignete Mechanismen entwickelt. Diese zu klären, bleibt die Intention der aktuellen Forschung. 4.1 Darstellung und initiale Charakterisierungen der murinen Cryptochrome In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Maus-Cryptochrom-(mCRY1/2)- Fragmente mittels verschiedenen Tags unter Verwendung zweier Expressionssysteme, E. coli und Baculovirus, erstellt und ihre Expression und diverse Reinigungstrategien getestet. Während die heterologe Expression in E. coli entweder in unlöslichen Proteinen oder in stark ausgeprägter Assoziation mit bakteriellen Chaperonen resultierte, konnte im Rahmen der Arbeit ein Expressions-/Reinigungsprotokoll mittels Baculovirusexpression in Insektenzellen Sf21 für sowohl die Photolyase-homologe Domäne als auch die Volllängen-Proteine etabliert werden. Die Ausbeute der rekombinanten mcry1/2-konstrukte lag in den getesteten Medien bei max. 100 µg aus 1 l infizierter Insektenzellkultur, wobei mcry1-his sich durch besseres Löslichkeitsverhalten gegenüber PHR-Fragmenten auszeichnete. Ein initial aufgetretenes Problem der vom C-Terminus progressierenden Degradation der Proteine wurde durch die Fusion mit einem C-terminalen His 6 -Tag gelöst, so dass ein stabiles mcry1-his-protein für

2 ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 162 Charakterisierungen zum ersten Mal zur Verfügung stand. Im Gegensatz zum dcry aus Insektenzellen konnten in mcry1/2 keine inkorporierten Chromophore mittels absorptionsspektroskopischer Methode nachgewiesen werden. Trotz der fehlenden Kofaktoren lieferte die CD-Analyse ein nativ gefaltetes mcry1-his-fusionsprotein, das neben undefinierter Faltung und Turns (zusammen 48%) einen 29% α-helikalen und 23% β- Faltblatt-Anteil aufwies. In der Großenausschlusschromatographie zeigte das mcry-protein ähnlich wie dcry überwiegend das Verhalten eines Monomers. Demnach erfüllen der hohe Reinheitsgrad und die Homogenität der Probe optimale Voraussetzungen für kristallographische Aufklärung der dreidimensionalen Struktur, allerdings blieb die geringe Ausbeute nach der Präparation ein limitierender Faktor. Der Einsatz eines Bioreaktors, der eine Überexpression in einem Suspensionsvolumen von 30 bis 50 l erlaubt, wäre für eine ausreichende Produktion an mcry-volllängenproteinen eine dauerhafte Lösung, die in der Zukunft umzusetzen ist. 4.2 Interaktion der murinen Uhrenproteine Der bhlh-transkriptionsfaktor mbmal1 erwies sich als ein in vitro instabiles Protein sowie dessen Fragmente, so dass kein Material für weitere Experimente bereitgestellt werden konnte. Zur Lösung des Problems wurden die an der mper-interaktion beteiligten PAS- Domänen von mbmal1, die in E. coli in unlöslicher Fraktion verblieben, in geeignete Donorvektoren zur Expression mit Hilfe der baculovirusbasierenden Technologie kloniert. Darüber hinaus wird eine Koexpression des mbmal1/ (pas-domänen)-fragmentes mit dem CLOCK-Protein angestrebt, was zur gegenseitigen Stabilisierung der Transkriptionsfaktoren während der Reinigung führen sollte. Die Darstellung dieser Proteine soll auch die Untersuchung der PAS-Domänen vermittelter Interaktion mit murinen PERs ermöglichen. Im Zuge der in der Arbeitsgruppe gelösten Struktur eins mper2-pas- Domänen-Fragmentes [Hennig et al., Manuskript in Vorbereitung] wird vor allem der Kokristallisation und Strukturaufklärung der mper-mbmal1-komplexe eine vorrangige Bedeutung beigemessen. Die Interaktion der C-terminalen Bereiche der murinen Uhrenproteine mcry1/2 (C-tails) mit dem Transkriptionsfaktor mbmal1 wurde in vivo nachgewiesen [Kiyohara et al., 2006]. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die an der Komplexausbildung beteiligten C-terminalen Bereiche der beiden Uhrenproteine in E. coli zu exprimieren und geeignete Reinigungsprotokolle zu etablieren. Eine Kombination aus Methoden wie Größenausschlusschromatographie (SEC, size exclusion chromatographie), Circulardichroismusspektroskopie (CD) und analytische Ultrazentrifugation (AUZ) (Kollaboration Dr. Holger Strauss, Potsdam) zeigte, dass sowohl die C-tails beider mcry-proteine als auch die C-terminalen Fragmente mbmal und eine anhand der

3 ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 163 Sekundärstrukturvorhersage vermutete intrinsisch ungeordnete Struktur aufweisen. Diese kennzeichnet sich durch gestreckte Molekülformen bzw. durch große hydrodynamische Radien (R H ). Neben der Bestimmung der R H -Werte wurde mit Hilfe der SEC- und AUZ- Analysen gezeigt, dass die einzelnen mcry- und mbmal1-proteinfragmente als Monomere vorliegen. Die größenausschlusschromatographische Analyse und Fluoreszenzpolarisations- Methode erlaubten eine Interaktion zwischen beiden rekombinanten mcryct-proteinen mit den C-terminalen mbmal1-fragmenten zum ersten Mal in vitro eindeutig nachzuweisen und zu quantifizieren. Die relativ hohen Werte der Dissoziationskonstanten (K D ) im mikromolaren Bereich, die auf eine schwache Affinitität der gebildeten Komplexe hindeuten, können auf fehlende Kontaktflächen der zu kleinen Konstrukte sowie auf das Fehlen weiterer Interaktionspartner wie mperiod und mclock zurückzuführen sein. In Zukunft soll eine Validierung der K D -Werte sowie eine Bestimmung der Stöchiometrie der identifizierten Komplexe mittels AUZ-Analyse und einer CD-Titration bzw. eindimensionaler NMR- Technik erfolgen. Des Weiteren kann anhand der Ergebnisse dieser Methoden eine durch Interaktion induzierte Faltung determiniert werden, um diese als einen essentiellen Bestandteil der physiologisch relevanten Wechselwirkung der murinen Uhrenproteinen in der regulatorischen Rückkopplungsschleife hervorzuheben. Einen ersten Hinweis auf eine mögliche kompaktere Faltung des Komplexes, lieferte die in dieser Arbeit durchgeführte SEC-Analyse. Die Bestimmung der richtigen Stöchiometrie und induzierten Faltungsänderung sollen die Strukturaufklärung der nachgewiesenen Komplexe mittels Röntgenstruktur oder NMR-Analyse vorantreiben. Von enormer Bedeutung ist die Identifizierung der Aminosäuren, die zwischen beiden Proteinen Kontakte ausbilden. Zu diesem Zweck wird im Zuge einer Kollaboration (Karsten Marenholz, Berlin) die Kartierung dieser Aminosäuren mittels einer PepScan-Analyse, die seit Jahren mit auf dem Gebiet der Impfstoffentwicklung oder dem Screening nach Hormonanaloga eingesetzt wird, durchgeführt [Geysen et al., 1984, 1985]. Die Herstellung weiterer interagierenden Komponenten wie C-terminale mper1/2/3- Fragmente wurde in der Arbeitsgruppe bereits getestet (Christiane Theiss, Nicole Kucera). A B Abbildung 4.1: Darstellung von mper1/1099-ende aus E. coli. A) SEC-Analyse (75/10/30) und B) dazugehöriges 15% SDS-Polyacrylamidgel.

4 ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 164 In der Abbildung 4.1 ist am Beispiel von mper1/1099-ende, das über eine GSH-Säule gereinigt wurde, eine analytische SEC (75/10/30) dargestellt. Anhand der Retentionsvolumina könnte das mper1/1099-ende-fragment einem Dimer zugeordnet werden (s. Abb. 4.1 A). Dennoch zeigten SEC- Eluate A11-B1 neben hochmolekularen Verunreinigungen auch eine zunehmende Degradation des Fragmentes. Hierbei sollen noch die Expressionsbedingungen zwecks höheren Ausbeuten und Reinigungsprotokolle, die eine auftretende Proteindegradation reduzieren und zugleich einen höheren Reinheitsgrad der Präparationen erzielen, optimiert werden. 4.3 Kristallisation von gwcry1a Im Rahmen der vorliegenden Arbeit und in Kollaboration mit Dr. Miriam Liedvogel (Oxford) konnte eine initiale Analyse der Gartengrasmücken-Cryptochrome (gwcrys) mit Hilfe von Größenausschlusschromatographie und Circulardichroismusspektroskopie durchgeführt werden. In Zusammenarbeit konnte das Reinigungsprotokoll unter dem Aspekt der Steigerung des Reinheitsgrades der Präparationen sowie der Ausbeuten optimiert werden. Die besten Ergebnisse wurden im Falle von gwcry1a erzielt. Anhand den initialen Screens zur Kristallisation des Proteins konnten Mikrokristalle erzeugt werden. Die Reproduktion dieser Kristalle sowie das Auffinden neuer Bedingungen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden, da nicht ausreichend Material vorlag. Die optimierte Präparation bietet jedoch für die zukünftigen Experimente v. a. Kristallisation und Verfeinerung der Bedingungen genug gwcry1a, das mit dem hohen Reinheitsgrad den Aufforderungen der Methode entspricht. 4.4 Spektroskopische und strukturelle Charakterisierung von dcry Die Kombination von HPLC, MALDI-TOF-Massenspektrometrie und UV/VIS- Spektroskopie ermöglichte im Rahmen dieser Arbeit die sowohl qualitative als auch quantitative Bestimmung der an Drosophila-Cryptochrom (dcry) gebundenen Chromophoren. Unter Berücksichtigung dessen, dass Flavinadenindinukleotid (FAD)-Verlust durch eine Fraktion nicht korrekt gefalteten dcry-apoproteins entsteht, ergab die absorptionspektroskopische Analyse eine mit 85% Beladung mit oxidierter FAD-Form (FAD ox ). Die Identifikation des zweiten Chromophors mittels der UV/VIS-Spektren konnte in Kollaboration mit der AG Prof. Penzkofer (Universität Regensburg) sowie mittels MALDI- TOF-MS [Berndt et al., 2007] erfolgreich durchgeführt werden. Des Weiteren ergab die Auswertung der UV/VIS-Spektren, dass 65% der dcry-moleküle einen Methenyltetrahydrofolat (MTHF)-Kofaktor binden, wobei dieser durch seine hydrolysierte

5 ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 165 und oxidierte Form 10-Formyldihydrofolat (10-FDHF) repräsentiert wird. Das Fluoreszenzverhalten beider Chromophore wurde in der dunkel- (ground state) und in der lichtadaptierten (signalling state) Form untersucht. Anhand den Ergebnissen konnten zwei Schemen des Photozyklus vorgeschlagen werden, die die blaulichtabhängige Konversion des FAD ox zum anionischen FAD-Radikal (FAD - ) und seine dunkelinduzierte Rückkehr beschreiben. Dabei wurden charakteristische Parameter wie die Qunateneffizienz der Signalzustandsbildung (φ s 1), Fluoreszenzquantenausbeuten sowie Zeitkonstanten des photoinduzierten Elektronentransfers (1,4 ps) und der Ladungsrekombination bei der Rückkehr in den FAD ox -Grundzustand (12,5 min) ermittelt (s. Berndt et al., 2007; Schirdel et al., Manuskript]. Nach wie vor bleibt das Verständnis dieser lichtabhängigen Prozesse von Cryptochromen auf ihre Kristallstrukturaufklärung angewiesen. Ein wichtiger Schritt in diese Richtung wurde bereits in der Arbeitsgruppe im Rahmen der Dissertation von Alex Berndt unternommen. Ihm ist gelungen das Cryptochrom aus Drosophila melanogaster (dcry) zu kristallisieren. Trotz der Optimierung der Bedingungen und trotz Anwendung verschiedenster Kristallisationstechniken wurden dcry-kristalle nur in Form verwachsener dünner Plättchen erhalten, an denen dennoch native Datensätze an Synchrotronquellen (ESRF, SLS) aufgenommen werden konnten. Zur Aufklärung der Kristallstruktur von dcry wurde die Methode des molekularen Ersatzes (Molecular Replacement) unter Verwendung bekannter Photolyase- und Cryptochrom-Strukturen als Homologiemodelle eingesetzt. Anhand der daraus resultierenden initialen Phasen wurden Elektronendichtekarten berechnet, die jedoch zum Bauen des dcry- Modells noch zu ungenau waren [A. Berndt Dissertation, 2005]. Eine der Möglichkeiten zur Bestimmung experimenteller Phasen stellt die SAD/MAD-( single anomalous diffraction/ multiwavelength anomalous dispersion) Methode dar, die eine SeMet- Substitution (Selenomethionin) des in Insektenzellen exprimierten dcry-proteins benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit und in Kollaboration mit AG Dr. Joop van den Heuvel (HZI, Braunschweig) wurde die Expression von dcry in Methionin-freien Medien getestet. Eine kleinere lösliche dcry-fraktion (His-dCRY) wurde mittels Ni 2+ -NTA-Sepharose im analytische Maßstab isoliert, mittels SDS-PAGE nachgewiesen (s. Abb. 4.2) und im Westernblot verifiziert (Daten nicht gezeigt). Die MALDI-TOF-MS-Analyse zeigte, dass 50% an SeMet im dcry-protein substituiert werden konnte (Daten nicht gezeigt). Abbildung 4.2: 12%ige SDS-Polyacrylamidgel stellt eine Testreinigung des dcry-derivates aus der SeMet Substitution in Insektenzellen dar, wobei das Protein mit ca. 65 kda als eine dominierende Bande im Eluat (E) nach der Ni-NTA-Säule zu erkennen ist.

6 ZUSAMMENFASSUNG & AUSBLICK 166 In künftigen Experimenten soll das für dcry-wt etablierte Präparationsprotokoll an SeMet- Derivaten adaptiert werden. Mit diesem experimentellen Ansatz wird erhofft, dass die Phasenverbesserung erreicht und der Bau des dcry-modells ermöglicht werden könnten. Ein weiterer Ansatz in diese Richtung wäre die Etablierung eines FAD- Rekonstitutionsprotokolls von Cryptochromen mittels CibacronBlue-Sepharose, einem auf der Matrix immobilisierten Farbstoff (Cibacron F3GA) [vgl. A. Berndt Dissertation, 2005]. Cibacron F3GA kann sich über molekulare Mimikry in die nukleotidbindene Tasche von Proteinen einlagern, so dass mit einem FAD-haltigen Puffer eluiert werden kann, um auf diesem Wege den Flavin-Anteil in dcry zu erhöhen. Hierbei bietet sich auch ein Ersatz des Flavins mit einem FAD-Derivat an, das z.b. durch Brom, einem anomalen Streuer, substituiert ist. Auf diese Weise substituiertes dcry könnte zusätzlich dem Phasenproblem entgegenwirken. 4.5 Perspektive für Kristallisation der tierischen Cryptochrome Auf einer Seite bringt die SeMet-Substitution von dcry die Strukturaufklärung näher ans Ziel, auf der anderen Seite erlaubt die Chromophoranalyse durch zusätzliche Rekonstitution mit 10-FDHF die Qualität der dcry-kristalle möglicherweise zu verbessern. Im Falle von Vogel- und Maus- Cryptochrome lassen optimierte Präparationsprotokolle sowie gegebenenfalls der Einsatz eines Bioreaktors höhere Ausbeuten an hochgradig reinem Protein erzielen, um damit die besten Voraussetzungen für die Kristallisation zu erfüllen. Die Etablierung eines FAD-Beladungsprotokolls unter Verwendung einer CibacronBlue- Sepharose könnte für alle drei Cryptochrome von einem enormen Vorteil sein. So könnte ein FAD-Gehalt des dcry-proteins von über 85% erreicht werden, um damit für die Kristallisation eine homogene Spezies zu bilden. Für Maus- und Vogel-Volllängen- Cryptochrome, die ohne gebundenen Flavin isoliert werden, würde die FAD-Beladung nicht nur zur Kristallisation beitragen, sondern diverse spektroskopische Analysen ermöglichen, um neue Erkenntnisse über die Rolle der Chromophore in diesen Proteinen und über die damit assoziierten Mechanismen zu gewinnen.