Warum bekommen Pflanzen keinen Sonnenbrand? Why do plants not get sunburn? Holzwarth, Alfred R.; Miloslavina, Yuliya; Müller, Marc G.; Szczepaniak, Malwina; Ostroumov, Evgenyi; Slavov, Chavdar Max-Planck-Institut für chemische Energiekonversion, Mülheim an der Ruhr Korrespondierender Autor E-Mail: holzwarth@mpi-muelheim.mpg.de Zusammenfassung Pflanzen besitzen sehr effiziente regulierende Schutzmechanismen, die sie gegen die schädigenden Einflüsse von zu hohen Lichtintensitäten schützen. Dabei wird überschüssige absorbierte Lichtenergie in den Lichtsammelkomplexen der Photosysteme in Wärme umgewandelt. Diese Prozesse konnten einzelnen Komponenten des Photosynthese-Apparates zugeordnet werden. Um Einblicke in die molekularen Zusammenhänge bei diesen Schutzmechanismen zu gewinnen, spielte die Entwicklung von Methoden der ultraschnellen Fluoreszenzspektroskopie an intakten Blättern in Verbindung mit dem Einsatz von Mutanten eine zentrale Rolle. Summary Plants exhibit highly efficient protection mechanisms that prevent the damaging influence of high excessive light intensities. In these processes the excess energy absorbed in the light-harvesting complexes of the photosystems is converted into heat. Recent studies allowed to assign these protection mechanisms to specific components of the photosynthetic apparatus. In order to gain insight into these regulation mechanisms special methods of ultrafast fluorescence spectroscopy were developed which in combination with the use of mutants allowed to study molecular details of the protection mechanisms. Pflanzen sind an ihren Standorten extremen Schwankungen der Lichtintensität, der Temperatur, und der Wasser- bzw. Nährstoffversorgung ausgesetzt. Insbesondere die Lichtintensität, aber auch die Lichtqualität (d.h. die Farbe des Lichtes), kann sich innerhalb von Sekunden um bis zu zwei Größenordnungen ändern, wenn sich z.b. eine Wolke verschiebt oder sich der Schattenwurf ändert. Die Photosysteme (Photosystem I und II), die in Pflanzen die lichtgetriebene Umwandlung von Sonnenenergie in chemische Energie bewirken (siehe Abb. 1), können jedoch nur in einem relativ engen Bereich der eingefangenen Lichtenergie die Pflanze optimal mit Energie versorgen. Da die Größe der Antennensysteme, die das Licht einfangen, nicht kurzfristig geändert werden kann (Änderungen der Gesamtgröße der Antennensysteme benötigen Tage bis Wochen), weisen Pflanzen eine Anzahl effizienter Regelungssysteme auf, die es ihnen ermöglicht, sich kurzfristig an rasch ändernde Lichtbedingungen anzupassen. Dies ist notwendig, da es sonst, z.b. bei einer starken Zunahme der Lichtintensität innerhalb kurzer Zeit, zuerst zu einer extremen Schädigung des Photosyntheseapparates (die Pflanze bekäme Sonnenbrand ) und darauf folgend einer extremen Schädigung 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 1/7
Photosyntheseapparates (die Pflanze bekäme Sonnenbrand ) und darauf folgend einer extremen Schädigung der gesamten Pflanze sowie Wachstumsstörungen kommen würde [1]. Pflanzen können tatsächlich unter bestimmten Bedingungen einen solchen Sonnenbrand entwickeln, wenn sie nach sehr langer Anpassung an niedrige Lichtintensitäten sehr schnell dem intensiven direkten Sonnenlicht ausgesetzt werden. Dies passiert z.b. im Frühjahr, wenn im Schwachlicht vorgezogene Pflanzen an einem sonnigen Tag plötzlich dem direkten Sonnenlicht ausgesetzt werden. Schem atische Darstellung der Kom ponenten der Photosynthese-Mem bran (Thylakoidm em bran). Die Lichtreaktionen finden in den Proteinkom plexen Photosystem (PS) I und Photosystem (PS) II statt. Die beiden hintereinander geschalteten Photosystem e pum pen lichtgetrieben in einem sog. Z-Schem a Elektronen über die Mem bran. Die Photosystem e sind aus den sog. Kern- Kom plexen bestehend aus dem eigentlichen photosynthethischen Reaktionszentrum und der sog. Kern- Antenne gebildet. Darum herum sind die peripheren Lichtsam m elkom plexe LHC II und LHC I angeordnet. Photosystem II, in dem die photosynthetische Wasserspaltung auf der Lum en-seite der Mem bran stattfindet, reagiert besonders em pfindlich auf zu hohe Lichtintensitäten. Daher spielt der gebundene LHC II-Kom plex bei der Photoprotektion eine besondere Rolle. Der Cytochrom - b6f-kom plex pum pt Protonen (H+) über die Mem bran. Der entstehende Protonengradient wird von der ATP-Synthase benutzt, um das energiehaltige ATP zu erzeugen, während PS I NADPH, die sog. Reduktionsäquivalente der Zelle, bildet. Die Regelungssysteme zum Schutz gegen Überanregung wirken dabei auf verschiedene Teile (siehe Abb. 1) der photosynthetischen Energieumwandlungskette. Das auf Über-Anregung besonders empfindlich reagierende Photosystem II, das für die photosynthetische Wasserspaltung verantwortlich ist, muss daher mittels eines effizienten Regelmechanismus ganz zu Anfang der Energieumwandlungskette, d.h. im Bereich des Antennensystems, besonders geschützt werden. Um dies zu bewirken, wird die von den Antennensystemen eingefangene überschüssige Strahlungsenergie (siehe Abb. 2A) kontrolliert in Wärme umgewandelt und dadurch dem System entzogen. Diesen Prozess nennt man Nicht-photochemische Löschung bzw. Quenching der Anregungsenergie (abgekürzt NPQ), im Gegensatz zu der normalen und gewünschten Photosynthese-Reaktion, der sog. Photochemischen Löschung [2]. Das Ziel dieses Regelungs- Systems ist es, immer gerade so viel Energie ( Überschussenergie ) zu vernichten, dass der gesamte Photosynthese-Apparat optimal versorgt wird und bei einem Rückgang der Lichtintensität unter den Schwellwert die Energievernichtung ganz abzustellen. 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 2/7
(A ) Schem atische Darstellung der Abhängigkeit der tatsächlich von den Photosystem en verwendeten Energie von der eingestrahlten Lichtintensität. Die absorbierte Energie weicht bei höheren eingestrahlten Lichtintensitäten von der tatsächlich verwendeten Energie im m er m ehr ab. Die Differenz ist die Überschussenergie. Diese m uss in den Antennen durch Löschung vernichtet (d.h. von elektronischer Energie in Wärm e überführt) werden. (B) Darstellung des sog. Xanthophyll- Zyklus, d.h. der Um wandlung zwischen verschiedenen Carotinoiden in den Antennen. Bei Starklicht wird die Um wandlung von Violaxanthin in Zeaxanthin induziert, das eine zentrale Rolle bei der Löschung der Anregungsenergie in den inneren Antennenkom plexen von PS II spielt. Bei Rückgang der Lichtintensität entsteht wieder Violaxanthin, d.h. die Löschung wird wieder abgeschaltet. In den letzten Jahren wurde beobachtet, dass in diesem Regelungsprozess sowohl Carotinoide (chemische Verbindungen ähnlich dem Farbstoff, der Karotten ihre gelb-rote Farbe verleiht) als auch ein kleines Membranprotein ( PsbS ) eine zentrale Rolle spielen. Die Rolle dieser entscheidenden Spieler im NPQ- Prozess, und ihre Funktion bei der Regelung und Lichtanpassung von Pflanzen, ist jedoch noch weitgehend unbekannt [3, 4]. Eine genaue Kenntnis dieser Regelungsprozesse und der nicht-photochemischen Löschmechanismen könnte dazu beitragen, Pflanzen besser an extreme Lichtbedingungen anzupassen. Weiterhin könnte von solchen Kenntnissen auch die Entwicklung zukünftiger artifizieller Photosysteme profitieren, die für die direkte Umwandlung von Sonnenenergie in chemische Energie benötigt werden. Solch artifizielle Systeme müssten sicherlich ebenfalls mit Schutzmechanismen gegen zu hohe Lichtintensitäten ausgerüstet werden. In der Arbeitsgruppe wurden in den letzten Jahren Methoden entwickelt, die es erlauben, die NPQ-Regelungs- Mechanismen mittels ultraschneller Fluoreszenz-Spektroskopie direkt an intakten Blättern von Pflanzen zu untersuchen (Abb. 3). Als Untersuchungsobjekt kann im Prinzip jede Pflanze genommen werden. Jedoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die spektroskopischen und kinetischen Untersuchungen, die Einblick in die Regelmechanismen auf molekularer Ebene geben sollen, mit molekularbiologischen Methoden und der Erzeugung gezielter Mutationen zu verbinden. Solche Mutanten, bei denen im vorliegenden Fall gezielt die Reaktionen der licht-induzierten Carotinoid-Umwandlung (der Xanthophyll-Zyklus, siehe Abb. 2B) an- bzw. abgestellt werden können, oder durch die eine Bildung des Proteins PsbS verhindert werden kann, sind besonders leicht in einer schnell wachsenden Modellpflanze mit bekanntem Genom zu studieren. Dies ist die sog. Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana), ein weithin verbreitetes Ackerunkraut aus der Familie der Kreuzblütler, das ganz allgemein als Modell-Organismus in der Pflanzenforschung eine große Verwendung findet. Für unsere spektroskopischen Untersuchungen werden die Blätter des Wildtyps (oder von Mutanten dieser Pflanze) in einer Rotationsküvette zwischen zwei Glasscheiben gepresst (Abb. 3A). Die geeigneten Lichtbedingungen zur Kontrolle des NPQ-Zustandes werden mit Licht aus Leuchtdioden eingestellt (Abb. 3B). Das eigentliche Messlicht stellen ultrakurze Lichtblitze mit einer zeitlichen Breite von einigen Pikosekunden (dies ist der Millionste Teil einer Millionstel Sekunde) dar. Es wird dann die Energiewanderung, deren Kinetik und die Löschung der mittels der Laserblitze erzeugten elektronischen Anregungszustände in den Farbstoffen (Chlorophylle und Carotinoide) der Photosysteme mithilfe der ultraschnellen Fluoreszenz-Detektion im 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3/7
Pikosekundenbereich verfolgt. Die Analyse und Interpretation der sehr komplexen kinetischen Daten erfordert äußerst leistungsfähige und umfangreiche mathematische Datenanalysemethoden. Insgesamt stellt die optische Messung ultraschneller Signale an einem so komplexen System, wie es ein intaktes Blatt darstellt, eine enorme Herausforderung dar. Die dazu notwendigen technischen Entwicklungen der Mess-Apparatur werden daher mittelfristig auch anderen Bereichen der Biologie und Biophysik zu Gute kommen, in denen an komplexen intakten biologischen Geweben molekulare Einsichten mittels Spektroskopie gewonnen werden sollen. (A ) Für die Messung der ultraschnellen Fluoreszenz-Kinetik werden intakte Blätter der Pflanze Arabidopsis thaliana verwendet, die zwischen zwei Glasplatten gehalten werden. Die gesam te Küvette wird schnell rotiert und seitwärts bewegt. Dadurch überstreicht der anregende Laser, der aus hochfrequenten ultrakurzen (Pikosekunden) Im pulsen besteht, die gesam te Fläche der eingelegten Blätter. Dies ist erforderlich um den Einfluss des Messstrahles auf den physiologischen Zustand der Blätter zu m inim ieren. (B) Blick in den Messaufbau im ultraschnellen Laser-Experim ent. Im Zentrum die Rotationsküvette m it eingestrahltem Starklicht (orangerot und blau) zur Erzeugung von Hoch- Intensitätsbedingungen (NPQ-Löschung) in den Blättern. Das aktinische Licht wird durch licht-em ittierende Dioden (LEDs) erzeugt. In einem so komplexen System wie der Pflanze treten die Signale verschiedener, teilweise interagierender Zellbestandteile gleichzeitig auf. Um die Trennung und zuverlässige Zuordnung dieser überlappenden Signale zu den einzelnen Systemen zu ermöglichen, waren als Vorarbeiten zu den Messungen an den intakten Blättern mehrjährige Untersuchungen von isolierten Teilsystemen des Photosynthese-Apparates (d.h. Messungen an isolierten Antennensystemen, an isolierten ganzen Photosystemen, etc.) erforderlich [5-9]. Die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass es im Antennensystem von Photosystem II zwei verschiedene Orte für die Löschung und damit wohl auch zwei ganz verschiedene Löschmechanismen gibt. Dies ist in Abbildung 4 dargestellt. Als Ergebnis des erhöhten Protonen-Gradienten über die photosynthetische Membran der eine direkte Folge einer Überanregung von Photosystem II ist wird das kleine Protein PsbS, das an seiner Oberfläche ph-sensoren trägt, aktiviert. Dieses bewirkt, dass sich ein Teil der Antennensysteme von Photosystem II ablöst (die so genannten peripheren Lichtsammelkomplexe LHC II ) und in der Membran höhere Aggregate bilden. Die elektronischen Anregungszustände in diesen LHC II-Aggregaten werden nahezu vollständig gelöscht, d.h. in Wärme umgewandelt. In Konsequenz wird durch die so verkleinerte Antenne von Photosystem II eine entsprechend verringerte Anregung dieses Photosystems erreicht. Diese Reaktionskette stellt die erste, schnelle Stufe des NPQ-Schutzmechanismus dar, die im Bereich von einigen Sekunden an- bzw. wieder abgestellt werden kann (Löschung 1, Abb. 4B). Es konnte gezeigt werden, dass diese Regelung in einer Mutante, die kein PsbS-Protein enthält, nicht mehr auftritt. Dieser Regelungsmechanismus ist jedoch alleine nicht ausreichend, um Photosystem II bei sehr hohen Lichtinte nsitä te n vor Schädigung zu bewahren. Die Pflanzen verfügen daher über einen weiteren 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 4/7
Schutzmechanismus. Dieser wird über die im starken Licht einsetzende Umwandlung des Carotinoids Violaxanthin in Zeaxanthin, den sog. Xanthophyll-Zyklus (Abb. 2B) gesteuert. Nach Bildung von Zeaxanthin wird durch dieses Carotinoid ein weiterer effizienter Löschmechanismus der angeregten Zustände in den am Photosystem II verbliebenen Antennenkomplexen eingeschaltet (Löschung II, Abb. 4B). Die Umwandlung von Violaxanthin in Zeaxanthin verläuft im Bereich von 30 Minuten. Dieser Mechanismus stellt daher einen langsameren Regelmechanismus dar. (A ) Strukturelle Anordnung der Kom ponenten von Photosystem II in der Mem bran (von oben betrachtet) im Schwachlicht. Im Zentrum das eigentliche Reaktionszentrum m it den Proteinen D1 und D2 und den um gebenden Kern- Antennen CP43 und CP47. Die gebundenen Pigm ente und Kofaktoren bewirken den Lichteinfang und die photosynthetische Ladungstrennung im Reaktionszentrum. Darum herum angeordnet sind die sog. m inoren Antennenkom plexe (CP24, CP26, CP29). Den peripheren Abschluss bilden die m ajoren Antennenkom plexe, die aus Trim eren des Kom plexes LHC II bestehen. Bei Schwachlicht- Bedingungen übertragen alle angebundenen Antennenkom plexe ihre Anregungsenergie zum Reaktionszentrum von PS II. In den Antennenkom plexen ist kein löschendes Zeaxanthin gebildet. (B) Im Starklicht kom m t es zu zwei Veränderungen der Antennen-Anordnung und der Funktion: Die peripheren LHC II-Kom plexe werden bei Aktivierung des PsbS-Proteins von PS II abgekoppelt (sie übertragen keine Anregungsenergie m ehr zu PS II) und durch die Anordnung in Aggregaten wird die Anregungsenergie in den LHC II-Kom plexen auf bisher unbekannte Weise gelöscht. In einem zweiten Mechanism us wird in den an PS II weiterhin gebundenen m inoren Antennenkom plexen Zeaxanthin gebildet (angedeutet durch den gelb gehaltenen Hintergrund), das in diesen Antennen direkt die Überschuss- Energie in PS II löscht. Mit diesen Untersuchungen konnten erstmals die NPQ-Löschmechanismen im Photosynthese-Apparat lokalisiert und ganz bestimmten Antennenkomplexen zugeordnet werden was andere, frühere Hypothesen hinfällig machte. Weiterhin konnten diese Mechanismen bezüglich ihrer Abhängigkeit vom Xanthophyll-Zyklus und von der Wirkung von PsbS differenziert werden. Damit ist ein entscheidender Durchbruch zum Verständnis der NPQ-Löschung gelungen. Gleichzeitig ergeben sich daraus neue Fragen, zum Beispiel: Aufgrund welcher photochemischer bzw. photophysikalischer Prozesse und molekularer Mechanismen werden die elektronischen Anregungszustände in diesen beiden Löschzentren in Wärme umgewandelt? Bisher gibt es auf darauf noch keine befriedigende Antwort. Eine Weiterentwicklung der spektroskopischen Methoden, in Verbindung mit der Untersuchung von Mutanten, lässt uns jedoch hoffen, zukünftig auch diese Fragen beantworten zu können und so zu einem vollständigen Verständnis des Problems zu gelangen, wie sich Pflanzen vor Sonnenbrand schützen. Hinweis: Die direkten Arbeiten zum NPQ-Mechanismus wurden im Rahmen eines DFG- Sonderforschungsbereiches (SFB 663, Heinrich-Heine-Universität und Max-Planck-Institute Mülheim a.d. Ruhr) 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 5/7
gemeinsam mit der Arbeitsgruppe von Peter Jahns, Institut für Biochemie der Pflanzen, Heinrich-Heine- Universität Düsseldorf, durchgeführt. Originalveröffentlichungen Nach Erweiterungen suchenbilderweiterungchanneltickerdateilistehtml- ErweiterungJobtickerKalendererweiterungLinkerweiterungMPG.PuRe-ReferenzMitarbeiter (Employee Editor)PersonenerweiterungPublikationserweiterungTeaser mit BildTextblockerweiterungVeranstaltungstickererweiterungVideoerweiterungVideolistenerweiterungYouTube- Erweiterung [1] J. Barbel, B. Andersson: Too much of a good thing - Light can be bad for photosynthesis. Trends in Biochemical Sciences 17, 61-66 (1992). [2] P. Horton, A. V. Ruban: Molecular design of the photosystem II light-harvesting antenna: Photosynthesis and photoprotection. Journal of Experimental Botany 56, 365-373 (2005). [3] X.-P. Li, P. Müller-Moule, A. M. Gilmore, K. K. Niyogi: PsbS-dependent enhancement of feedback de-excitation protects photosystem II from photoinhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99, 15222-15227 (2002). [4] P. Horton, M. Wentworth, A. V. Ruban: Control of the light harvesting function of chloroplast membranes: The LHCII-aggregation model for nonphotochemical quenching. FEBS Letters 579, 4201-4206 (2005). [5] A. R. Holzwarth: Ultrafast Primary Reactions in the Photosystems of Oxygen-Evolving Organisms. In: "Ultrashort Laser Pulses in Biology and Medicine", Series: Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering. (Eds.) Braun, Markus; Gilch, Peter; Zinth, Wolfgang. Springer, Berlin 2008, pp. 141-164. [6] C. Slavov, T. Morosinotti, R. Bassi A. R. Holzwarth: Trap-limited charge separation kinetics in photosystem I complexes from higher plant. Biophysical Journal, doi: 10.1529/biophysj.107.117101 (2008). [7] A. R. Holzwarth, M. G. Müller, J. Niklas, W. Lubitz: Ultrafast transient absorption studies on photosystem I reaction centers from Chlamydomonas reinhardtii. 2. Mutations around the P700 reaction center chlorophylls provide new insight into the nature of the primary electron donor. Biophysical Journal 90, 552-565 (2006). [8] A. R. Holzwarth, M. G. Müller, M. Reus, M. Novaczyk, J. Sander, M. Rögner: Kinetics and mechanism of electron transfer in intact photosystem II and in the isolated reaction center: Pheophytin is the primary electron acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 103, 6895-6900 (2006). 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 6/7
[9] Y. Miloslavina, M. Szczepaniak, M. G. Müller, J. Sander, M. Novaczyk, M. Rögner, A. R. Holzwarth: Charge separation kinetics in intact photosystem II core particles is trap-limited. A picosecond fluorescence study. Biochemistry 45, 2436-2442 (2006). 2008 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 7/7