74 PLATZ 3: VERDAUUNG An diesem Platz wird die Aktivität von Verdauungsenzymen mit einfachen Experimenten aufgezeigt. Es handelt sich durchwegs um enzymkatalysierte Hydrolysen verschiedener chemischer Bindungen. Die Experimente zeigen, dass Enzymreaktionen anhand der Abnahme der ubstratkonzentration oder der Zunahme der Produktkonzentration verfolgt werden können. Die hier nur qualitativ verwendeten Methoden können auch zur quantitativen Messung der einzelnen Enzymaktivitäten benutzt werden. Theoretische Grundlagen: Kohlenhydrate (. 7) Benedictsche Probe (. 9) Aminosäuren und Proteine (. 10) Lipide (. 16) und Nucleinsäuren (. 20) Photometrie (. 31) Bezug zu anderen Plätzen: pezifität von Proteasen, Exp. 10.4 UV-pektren von Nucleotiden, Exp. 1.6 Colorimetrischer Nachweis von Peptidbindungen, Exp. 4.1 EXPERIMENT 3.1: Verdauung von Eieralbumin durch Pepsin chwerlösliches, hitzekoaguliertes Eieralbumin wird durch Pepsin in lösliche Peptide aufgespalten. Diese werden im Überstand, nach Abzentrifugieren von noch ungelöstem Eieralbumin, mit dem Biuret-Test nachgewiesen (Exp. 4.1). Lösungen: Pepsin (4 mg/ml) in 0.1 M HCl, 0.1 M HCl, Biuret-Reagens. Ausführung: 2 vorbereitete RG, die je 70 mg hitzekoaguliertes Eieralbumin enthalten, beschriften. Zu RG I 5 ml 0.1 M HCl zugeben, zu RG II 5 ml Pepsinlösung. ofort gut mischen und 30 min ins 40EC-Wasserbad stellen. Alle 10 min RG schütteln. Menge unlösliches Eieralbumin abschätzen (0 bis ++++). I II Ansatz Eieralbumin Eieralbumin + 0.1 M HCl +Pepsinlösung Resultat......
75 Anschliessend beide RG in der Tischzentrifuge bei höchster Tourenzahl 5 min zentrifugieren. Zum Nachweis löslicher Peptide 4 RG beschriften und mit folgenden Volumina beschicken: A B C D HCl, 0.1 M (Blindwert I) Überstand RG I Pepsin in 0.1 M HCl (Blindwert II) Überstand RG II Zu jedem Röhrchen 4 ml Biuret-Reagens zufügen, mischen und 5 min stehenlassen. Extinktion bei 546 nm messen (Nullwert mit Luft abgleichen) und in folgende Tabelle eintragen: A B C D E 546............ E 546 minus Blindwert...... EXPERIMENT 3.2: Aktivierung von Chymotrypsinogen Trypsin aktiviert Chymotrypsinogen durch limitierte Proteolyse zu Chymotrypsin. Das gebildete Chymotrypsin katalysiert die Hydrolyse von N-Benzoyl-L-tyrosinethylester. Die entstehende Carbonsäure N-Benzoyl-L-tyrosin wird mit einem ph-indikator nachgewiesen. Künstliche Estersubstrate werden häufig zur Aktivitätsmessung von Proteasen benutzt. Bei der Esterhydrolyse wird eine saure Gruppe allein freigesetzt, nicht gleichzeitig zusammen mit einer basischen Gruppe, wie das bei der Hydrolyse einer Peptidbindung der Fall ist. Lösungen: Tris-HCl, 4 mm, ph 9.0 (Tris = Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, häufig gebrauchte Pufferbase für ph-bereich 7-9) N-Benzoyl-L-tyrosinethylester, 8 mm, in 50 % Methanol Phenolrot als Indikator (sauer: gelb; alkalisch: rot; pk a = 7.9)
76 Chymotrypsinogen, 40 µg/ml Trypsin, 40 µg/ml Ausführung: 4 RG vorbereiten und mit folgenden Volumina (ml bzw. Tropfen) beschicken: A B C D Tris-HCl 2 2 2 2 Tyrosinester 2 2 2 2 Wasser 1.0 0.5 0.5 - Phenolrot 2 Tr. 2 Tr. 2 Tr. 2 Tr. Chymotrypsinogen - 0.5-0.5 Trypsin - - 0.5 0.5 Röhrchen gut mischen, ins 40EC-Wasserbad stellen und Farbänderungen beobachten. (Proben müssen am Anfang rötlich gefärbt sein, andernfalls muss der Versuch mit frischer Tris-Lösung wiederholt werden.) Farbe nach Ablauf von etwa 5 min feststellen und Ergebnisse in Tabelle eintragen. A Blindwert... B Chymotrypsinogen... C Trypsin... D Chymotrypsinogen + Trypsin... Weitere Zymogene, die durch limitierte Proteolyse aktiviert werden? EXPERIMENT 3.3: Löslichkeit der Lipide Freie Fettsäuren: Eine patelspitze Na-tearat (eife) unter leichtem Erwärmen in ca. 6 ml Wasser auflösen und zu gleichen Teilen in 3 RG verteilen. Es bilden sich Mizellen. Bei hoher Konzentration der Mizellen können sie sich zu grösseren Gebilden zusammen lagern, wodurch die Lösung trüb wird. Was sind Mizellen? Zur Lösung in einem RG mit Pasteurpipette etwas verdünnte H 2 0 4 zusetzen. Freie Fettsäure fällt aus. Nun das gleiche Volumen (ca. 2 ml) Chloroform zugeben und gut mischen. Es entstehen zwei nichtmischbare Phasen. Der Niederschlag löst sich in der Chloroform-Phase. Weshalb? Dieser Vorgang wird in der Lipidextraktion in Exp. 11.1 angewandt.
77 chwerlösliche alze von Fettsäuren: Zu restlichen RG mit Lösung von eife in Wasser einige Tropfen einer Lösung von CaCl 2 oder BaCl 2 zusetzen. Es tritt Fällung ein: Ca- und Ba-alze der Fettsäuren sind schwerlöslich. Triacylglycerine: In 3 RG (A,B,C) je 2 Tropfen Olivenöl geben. Zu (A) 2 ml H 2 0, zu (B) 2 ml 20 % Natriumcholat- Lösung und zu (C) 2 ml Chloroform zufügen. Die 3 RG kräftig schütteln und Löslichkeit vergleichen. Wichtig: Nach Beendigung, alle Chloroform enthaltenden Lösungen im dafür vorgesehenen Behälter sammeln. EXPERIMENT 3.4: Verdauung von Triacylglycerinen mit Lipase und Nachweis der entstandenen Verdaungsprodukte Pankreas-Lipase katalysiert die partielle Hydrolyse von Triacylglycerinen. Die entstehenden freien Fettsäuren werden mit einem ph-indikator nachgewiesen. Tetrahydrolipstatin hemmt die Pankreas- Lipase (Wirkstoff des Medikaments Xenical). Ausführung: Die Lipase wird mit oder ohne Tetrahydrolipstatin bei Raumtemperatur vorinkubiert. Zu diesem Zweck drei kleine Plastikröhrchen vorbereiten (Vol. in ml): A B C Na-Cholat in Wasser 0.2 0.2 0.2 Ethanol 0.2-0.2 TH-Lipstatin in Ethanol - 0.2 - Lipase (Pankreas-Extrakt) 0.2 0.2 - Mischen und 5 Minuten stehen lassen. In der Zwischenzeit 3 grosse RG für die Verdauung
78 vorbereiten: A B C Lipase Lipase + Kontrolle TH-Lipstatin Ethanol 2 ml 2 ml 2 ml Olivenöl 1 Tr. 1 Tr. 1 Tr. RG mit Parafilm verschliessen und mit chüttelmischer gut mischen (bis Olivenöl gelöst ist). Wasser 2 ml 2 ml 2 ml Phenolrot*) 100 µl 100 µl 100 µl NaOH, 0.025 M 50(-100) µl 50(-100) µl 50(-100) µl (Lösung muss nach rot-violett umschlagen) *)sauer: gelb; alkalisch: rot; pk a = 7.9 RG mit Parafilm verschliessen und auf chüttelmischer gut mischen. Die vorinkubierten Lösungen zu den entsprechenden Verdauungsansätzen zugeben (A zu A, etc.). Farbe......... Mischen, ins Wasserbad stellen (40EC) und Farbänderungen nach 20-30 Minuten beobachten. Auftrennung und Nachweis der während der Verdauung entstandenen Produkte durch Dünnschichtchromatographie Aus zeitlichen Gründen sind die während der Verdauung mit pankreatischer Lipase entstandenen Produkte analog zu Exp. 11.1. bereits extrahiert worden. Eine Probe wurde ca. 5 Minuten (Probe A5) und eine weitere Probe ca. 60 Minuten (Probe A60) nach Zugabe der Lipase aus dem RG A entnommen und für die Extraktion der Lipide verwendet (Exp. 11.1) Die Auftrennung der Lipide erfolgt durch Dünnschichtchromatographie (DC) auf Kieselgel analog zu Exp. 11.1 mit Laufmittel A. Die Identifizierung der aufgetrennten Lipide geschieht durch Vergleich mit gereinigten Lipiden, die als Referenzsubstanzen dienen. Die Lipide wandern um so langsamer, je polarer sie sind. Referenzsubstanzen: F = Fettsäure (Oelsäure) mdg = Gemisch von Mono- und Diacylglycerin (Diacylglycerin wandert schneller; nur eine polare Hydroxylgruppe) Vorgehen: Auf einem DC-Plättchen mit Bleistift eine Linie im Abstand von 0.5 cm vom unteren Rand als Auftragungsort fein einzeichnen und vier Punkte als Auftragungsort der Proben wie beim aufgestellten Muster markieren. Mit Glaskapillar-Pipetten je 5 µl von Lösung A5, A60, F und mdg portionen-
weise als möglichst kleiner Fleck auftragen (das Lösungsmittel durch Blasen verdampfen lassen). Für jede Probe eine frische Kapillare verwenden! DC-Plättchen mit einer Pinzette (keine Fingerabdrücke!) vorsichtig ins Chromatographiegefäss stellen und mit dem Laufmittel entwickeln, bis die Laufmittelfront annähernd den oberen Rand erreicht hat (auf keinen Fall länger im Chromatographiegefäss lassen). DC-Plättchen in der Kapelle trocknen lassen. Anfärbung: Der Nachweis mit Jod färbt Lipide an, die mindestens eine Kohlenstoff-Doppelbindung haben. Trockenes DC-Plättchen einer Atmosphäre mit Jodgas aussetzen (Jodkristalle in geschlossenem Tank, in Kapelle) bis die Lipidflecken gut sichtbar werden (ca. 2-5 min.). Position der Flecken mit Bleistift fein markieren, da die Reaktion reversibel ist und die Färbung nach einiger Zeit wieder verschwindet. Intensität der Flecken abschätzen und notieren (+ bis ++++). Welches sind die hauptsächlichen Endprodukte bei der Verdauung von Triacylglycerinen mit pankreatischer Lipase? Welche der Verdauungsprodukte werden im Dünndarm resorbiert. Welche physiologisch wichtigen Unterschiede bestehen zwischen der pankreatischen Lipase und der Triacylglycerin-Lipase im Fettgewebe? Weshalb wird Ölsäure und nicht tearin- oder Palmitinsäure als Referenzsubstanz für Fettsäure in der Dünnschichtchromatographie in diesem Experiment verwendet? 79 EXPERIMENT 3.5: Abbau von tärke durch Amylase tärke wird durch Amylase zu Oligosacchariden, Maltose und Isomaltose abgebaut. Diese Reaktionsprodukte sind reduzierend und werden mit dem Benedict-Test (Exp. 3.6) nachgewiesen. Mit der Jodprobe kann gleichzeitig das Verschwinden der tärke gezeigt werden. Diese Probe beruht auf der Einlagerung von Jodmolekülen in die zu Helices aufgewundenen Polysaccharidketten der tärke. Das eingelagerte Jod ist tiefblau. Die Farbe verschwindet beim Auffalten der Helixstruktur durch Erwärmen. Im folgenden Experiment wird tärkelösung mit Amylase (A) und mit peichel (B) behandelt. Nach 0, 5 und 15 min werden Proben von A und B entnommen. In den entnommenen Proben wird das Verschwinden der tärke mit der Jodprobe, das Entstehen von reduzierender Maltose und Isomaltose mit dem Benedict-Test nachgewiesen. Lösungen: tärkelösung 0.2 % in 0.05 M Natriumphosphatpuffer, ph 7.0, 0.015 M NaCl (Cl - aktiviert die Amylase); Amylase aus chweinepankreas, 0.5 U/ml; Jod-KaliumJodid; Benedict-Reagens.
80 Vorbereitung: In zwei RG (A,B) je 5 ml tärkelösung geben und mindestens 10 min im 40EC-Wasserbad vorwärmen. In der Zwischenzeit in ein anderes RG etwa 0.5 ml eigenen peichel und 5 ml destilliertes H 2 0 geben und mischen. Für den tärkenachweis mit Jod zweimal 3 RG beschriften (AJ 0, AJ 5, AJ 15 ; BJ 0, BJ 5, BJ 15 ), mit je 5 ml H 2 0 beschicken und ins Eisbad stellen. Für den Benedict-Test ebenfalls zweimal 3 RG vorbereiten (A0, A5, A15; B0, B5, B15) und mit je 2 ml Benedict-Reagens beschicken. Ausführung des Versuchs: - Für den Nachweis von tärke und reduzierenden Zuckern je 0.5 ml aus der vorgewärmten tärkelösunge A in die RG AJ 0, A0 und je 0.5 ml aus B in BJ 0, B0 geben. - Dann zu tärkelösung A 0.25 ml Amylase und zu B 0.25 ml peichel geben und im 40EC- Wasserbad inkubieren. - Nach 5 min Reaktionsdauer je eine Probe von 0.5 ml aus A in die RG AJ 5, A5 und aus B in die RG BJ 5,, B5 geben. - Nach 15 min wiederum je eine Probe von 0.5 ml aus A in die RG AJ 15, A15 und aus B in die RG BJ 15, B15 geben. Für den tärkenachweis zu den in Eis gekühlten RG (AJ 0, AJ 5, AJ 15 ; BJ 0, BJ 5, BJ 15 ) je 0.25 ml Jod- Jodkaliumlösung geben, mischen und Farbänderung beobachten. Für die Reduktionsprobe die mit Benedict-Reagens beschickten RG (A0, A5, A15; B0, B5, B15) 5-10 min ins 95EC-Wasserbad stellen. Farbe beurteilen. Dieser Versuch weist den tärkeabbau nur qualitativ nach. Wie müsste das Experiment ausgebaut werden, um die Enzymaktivität der Amylase quantitativ bestimmen zu können? Wie könnten aus dem tärkeabbau entstandene Produkte anders nachgewiesen werden? EXPERIMENT 3.6: Nachweis reduzierender Zucker nach Benedict Fünf RG mit je 0.5 ml einer Zuckerlösung (1 %) und 3 ml Benedict Reagens beschicken und für 2 Minuten ins siedende Wasserbad stellen. Das Resultat wird beurteilt, nachdem die Reagenzgläser einige Minuten bei Zimmertemperatur gestanden sind. Die Reduktionsprobe soll mit Lösungen von Fructose, Glucose, accharose, tärke und Ascorbinsäure durchgeführt werden. Worauf ist die grüne Farbe der Lösung und die gelbe oder rote Farbe des ediments zurückzuführen? Wie müsste der Test geändert werden, um reduzierende Zucker quantitativ bestimmen zu können?