1 Isolierung und Charakterisierung von DNA (1) Isolierung von Nucleosomenleitern nach Micrococcal Nuclease in situ Verdau von Zellkernen aus Mäuseleber I. Lerninhalt: Isolierung von eukaryotischer, genomischer DNA, Agarose-Elektrophorese, Durchführung eines Zeit-kontrollierten Nuclease-Verdaus (MNase). II. Hintergrund: Das Chromosomenmaterial, Chromatin genannt, besteht aus Fasern, die ungefähr gleiche Massen an Protein und DNA sowie einen kleinen Anteil RNA enthalten. Die DNA ist im Chromatin sehr eng mit Proteinen verbunden, die Histone genannt werden. Sie kompaktieren die DNA und ordnen sie zu Struktureinheiten an, die man Nucleosomen nennt. Ein Nucleosom besteht aus dem Histon-Oktamer (engl. nucleosome core ), um welches sich 146 bp der DNA ( 1.75 turns) winden und der sog. Linker DNA, welche zwei benachbarte Oktamere verbindet. Insgesamt beträgt in Säugetierzellen die Länge der DNA in einem Nucleosom (engl. nucleosomal repeat length) 180 200 bp. Während die 146 bp-länge in einem Oktamer in allen Organismen und Geweben bemerkenswert konstant ist, variiert die Länge der Linker DNA ( in Hefe 20 bp, in Säugetieren 34-54 bp und in Spermien von Seeigeln 115bp). Micrococcal Nuclease (MNase) ist eine Ca 2+ -abhängige Endonuclease ohne ausgeprägte Sequenzspezifität, die bei Verwendung von milden Verdaubedingungen (geringe Enzymmenge, kurze Verdauzeit, Raumtemperatur statt 37 ) bevorzugt in den Linker- DNA-Abschnitten schneidet. Der Praktikumsversuch ist eine Wiederholung des klassischen Experiments, mit dem 1974 erstmals gezeigt wurde, dass Chromatin aus definierten Untereinheiten aufgebaut ist ( Kornberg, R.D. 1974. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science 184, 868-871. ). 1
III. Aufgabenstellungen des Versuchs: Ermittlung der nucleosomal repeat length im Chromatin von Zellkernen aus Mäuseleber; zeitlich kontrollierter in situ Verdau der Kerne mittels MNase, sodaß für das Enzym zugängliche Chromatinbereiche in den Linker-DNA Bereichen geschnitten werden. Das resultierende Bandenmuster - nach Reinigung und elektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente in einem 1.8% Agarose-Gel - sollte neben der Mononucleosomalen DNA-Länge ganzahlige Vielfache davon zeigen (bis etwa n=10; Siehe Abbildung). IV. Durchführung: Wichtig: Schritte 1-12 bei 2-4 C durchführen, Geräte rechtzeitig vorkühlen!!! (1) Präparierte Mäuseleber in kl. Becherglas in Puffer A suspendieren (2) Homogenisieren mittels Potter- Teflon Homogenisator ( schonend, 600-800 2
rpm, max. 5x auf und nieder) Durch schonende Homogenisier-Bedingungen wird eine mechanische Schädigung der Zellkerne minimiert. (3) Filtrieren des Homogenats durch ein Nylongewebe (200 µm Porenweite) Dadurch wird die Kontamination des Filtrats mit Bindegewebe verhindert. (4) Filtrat mit 1 Vol. Zentrifugierpuffer verdünnen. Dadurch wird im Puffer die Sucrosekonzentration und damit die Viskosität erhöht. Siehe Schritt (6) (5) Ultrazentrifugations- Röhrchen mit Z.-Puffer füllen bis diese inkl. Puffer 10 g wiegen. (6) mit Homogenat überschichten bis ca.3 mm unter den Röhrchen-Rand, Phasengrenze durch Umrühren mit einer dünnen Spatel etwas vermischen, dann auf 0.1g austarieren. Durch Schritt (4) und das Umrühren wird verhindert, daß es in der Übergangszone zwischen überschichtetem Homogenat und dem darunter befindlichen viskosen Zentrifugierpuffer im Lauf der Zentrifugation zu einer die Ausbeute signifikant herabsetzenden Ansammlung von Blutzellen kommt. Die Zellkerne können eine solche Schicht von dichtgepackten Blutzellen nicht durchdringen. Bei manchen Rezepten ist das nichtionische Detergens Triton X-100 im Homogenisierpuffer enthalten. Die Membranen der Blutzellen reagieren empfindlicher als die Plasmamembranen und werden dadurch lysiert. Somit vermeidet man das oben beschriebene Problem, handelt sich aber dafür ein anderes ein, das meistens unter den Tisch gekehrt wird: Die Kernausbeute ist signifikant geringer, da unter der Anwesenheit von Triton die Plasmamembranen der mechanischen Beanspruchung durch das Homogenisieren auch nicht so ohne weiters standhalten Ich bevorzuge jedenfalls die Verwendung eines Puffers ohne Triton. (7) 45min bei 20 krpm ( Rotor SW 40, Beckman), 4 C in der UZ zentrifugieren Achtung:Die UZ darf ausnahmslos nur von den Tutoren in Betrieb gesetzt werden!!! Die durchgeführte Zentrifugation ist ein Beispiel für eine sog. differentielle Zentrifugation: Unter obigen Bedingungen können ausschließlich die Zellkerne als die Zellbestandteile mit der größten spezifischen Dichte durch den viskosen Zentrifugier-Puffer wandern ( Sucrosekonz. 2.2 mol/l ) und sedimentieren. 3
(8) Üst. abpipettieren, Röhrchenwand mit Filterpapier auswischen um das Pellet nicht zu kontaminieren. (9) Kerne in 1 ml Puffer A resuspendieren; Konzentration durch Zählen mit Hilfe einer Zählkammer ermitteln ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- (10) Das Kernaliquot (~ 2 x 10 6 Kerne) 3min schonend bei maximal 3000 rpm in Biofuge (oder entsprechender Tischzentrifuge) pelletieren. Aus zeitlichen Gründen erfolgt im Praktikum der Einstieg in das Experiment erst bei dieser Stufe! Schonende Zentrifugierbedingungen verhindern die Desintegration der Kerne (= Platzen ) durch eine zu starke mechanische Beanspruchung. (11) Pellet in 98 µl 1x Micrococcal Nuclease Puffer suspendieren Achtung: Sollte das Resuspendieren der Kerne, also deren gleichmäßige Verteilung in der Lösung, Schwierigkeiten bereiten, haben die Kerne den Zentrifugiervorgang nicht überlebt ; in diesem Fall bilden die lysierten Kerne ein klebriges Pellet (12) Vorbereitung der Nucleaseverdünnung: Konzentration der Ihnen ausgehändigten Stammlösung: 1 Unit/ µl. Sie sollen 2µl so mit 1x MNase-Puffer verdünnen, dass die Konz. der Verdünnung 0.025Unit/ µl beträgt. 2µl dieser verdünnten Lösung geben Sie dann zu Ihren 98µl Kernsuspension. (13) Das Aliquot für die Ihnen angegebene Zeitspanne (TutorIn fragen) bei Raumtemperatur (~25 C) verdauen Das Kontroll-Aliquot (NIE vergessen!!! wird im Praktikum von einer der Gruppen gemacht!) enthält kein Enzym und wird für die maximale Zeitdauer der Zeitreihe inkubiert ( Warum wäre es ein schwerwiegender Fehler diese Kontrolle wegzulassen?) (14) 100 µl 2x Proteinase K Puffer zugeben, mischen durch kurzes Vortexen und das Enzym Proteinase K wie folgt zugeben: Sie erhalten eine Proteinase K- Stammlösung mit einer Konz. von 20mg /ml. Von dieser Lösung sollen Sie so viele µl zu Ihrer nunmehrigen Kernlösung dazugeben, dass die Endkonzentration des Enzyms 200µg/ml beträgt. Die Komponenten EDTA und SDS des Proteinase K-Puffers destabilieren einerseits schlagartig die Kernmembran und inaktivieren andererseits die MNase. Proteinase K dagegen wird durch EDTA und SDS stimuliert! 4
. Die Verdauzeit beträgt 3h bei 50 C. Wegen dieser langen Verdauzeit endet der Versuch vorerst bei diesem Schritt. Die Tutoren werden die Proben aller Gruppen nach den 3h aus dem Gerät nehmen und bis zur weiteren Verwendung bei 4 C lagern. In der darauffolgenden Woche setzen Sie den Versuch beginnend mit Schritt 15 fort. (15) Die Aliquots werden in einem dreiteiligen Arbeitsgang extrahiert: Dabei werden Proteine in die organische Phase gezogen (=extrahiert), während Nucleinsäuren in der wässrigen Phase verbleiben. (a) Zugabe von 200µl Tris-gesättigtem Phenol, Vortexen und kurzes Zentrifugieren ( 1min bei ca. 13 000 rpm ) Durch die Zentrifugation wird lediglich die Phasentrennung beschleunigt.. Überstand abpipettieren, ohne ihn mit der unteren organischen Phase zu kontaminieren. Üst in vorher beschriftetes (!) 1.5ml Schraubverschluß-Eppendorf Reaktionsgefäß transferieren. Langsam pipettieren, besonders wenn DNA hochmolekular ist! Die organische Phase ist durch das dem Phenol als Oxidationsschutz hinzugefügte 8-Hydroxy-Chinolin gelbgefärbt und somit leicht von der wässrigen Phase zu unterscheiden! (b) Zugabe von 200µl PCI (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-25:24:1) Ansonsten Wiederholung des Schritts (a) (c) Zugabe von 200µl CI ( Chloroform:Isoamylalkohol- 24:1 ) Vortexen und Trennen der Phasen durch Zentrifugation wie bei den Schritten (a) und (b). Transferieren des Überstandes in ein neues Eppendorf - Reaktionsgefäß. Für die nachfolgende Ethanolfällung ist es erforderlich das jeweilige Volumen der Überstände zu ermitteln. (16) Zugabe von 3 M NaAcetat, uzw. 1/10 Volumenanteil des jeweiligen ermittelten Üst-Volumens. Damit die Präzipitation quantitativ verlaufen kann, ist eine entsprechende Konzentration an monovalenten Kationen (i.u.f. Na + ) zur Neutralisierung der negativ geladenen Phosphatgruppen erforderlich. (z. Bsp. Wenn Üst.-Vol nach der CI- Extraktion 150µl beträgt, müssen 15µl der 3 M Acetat-Lösung zugegeben werden.) 5
(17) EtOH-Fällung: Zugabe von doppeltem Volumen eisgekühlten Ethanols, bezogen auf das Gesamtvolumen (CI-Überstand + Acetat-Lösung). Kurzes Vortexen. Dicht verschraubtes Reaktionsgefäß etwa ½ Stunde in Eiswasser lagern. (Für DNA-Mengen <5µg ist zum Sichtbarmachen des Pellets die Zugabe eines Carriers empfehlenswert; Details siehe Begleitvorlesung) Die vielfach empfohlene Lagerung bei 20 oder 70 bringt keinen Vorteil, sondern provoziert höchstens die störende Copräzipitation von Salzen! Reaktionsgefäße 10 min bei maximaler Umdrehzahl zentrifugieren. Überstand möglichst vollständig abheben und verwerfen. Das DNA-Präzipitat soll unter keinen Umständen versehentlich in die Pipettenspitze gelangen; d.h. langsam pipettieren unter ständiger Beobachtung des Pellets! (18) EtOH-Pellet ca. 20 min Lufttrocknen dann in 50µl Wasser lösen. (19) Die Qualitätskontrolle und die Quantifizierung der Ausbeute erfolgt mit Hilfe eines UV-Spektralphotometers (Siehe Abbildung ), sofern eine entsprechend kleine Mikroküvette mit Schichtlänge 1cm vorhanden ist. Wir müssen den Schritt (19) leider auslassen (Näheres in der Begleitvorlesung!) Wenn gerätemäßig möglich, das Spektrum zw. 300 und 220 nm ermitteln; das Absorptionsmaximum sollte um 260 nm liegen; Quotient 260/280 nm ermitteln; Absorptionskoeffizient für dsdna beträgt 50µg / ml = OD 260nm 1.0. Abb. aus Lottspeich, Bioanalytik 6
(20) 10µl des Aliquots werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Details werden in der Begleitvorlesung besprochen! (21) Die Sichtbarmachung der DNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid- Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamara-Systems. Achtung: Ethidiumbromid steht im Verdacht karzinogen zu sein!!! Befolgen Sie deshalb strikt die Anweisungen der Lehrpersonen! V. Geräte: Potter-Homogenisator, Homogenisierbecher mit Teflonstab, Ultrazentrifuge mit Ausschwingrotor, Tischzentrifuge mit Festwinkelrotor, Neubauer-Zählkammer, UV- Spektralphotometer mit Quarzküvetten, Elektrophorese-Ausrüstung, Wasserbäder. VI. Benötigte Lösungen: (1) Puffer A, ph 7.4: 60 mm KCl, 15 mm NaCl, 0.15 mm Spermin, 1 mm Spermidin, 15 mm Tris/ Cl, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 15 mm ß- Mercaptoethanol, 0.34 M Sucrose ( für Dichtegradientenzentrifugation) Die Polyamine Spermin und Spermidin stabilisieren die Kernmembran während der Isolierungsprozedur; Sucrose für Dichtegradientenzentrigugation ist speziell gereinigt und DNase-und RNase-frei! (2) Zentrifugierpuffer: Puffer A mit 2.2 M Sucrose ( =Z-Puffer) (3) Tris-äquilibriertes Phenol (4) Tris Puffer ( Tris-Base) 1M, ph 8.0 zum Äquilibrieren von Phenol (5) Tris Puffer 0.1M, ph 8.0 ( Siehe Nr.4) (6) Micrococcal Nuclease Puffer ( 2x ):120 mm KCl, 30 mm NaCl, 30 mm Tris/Cl ( ph 7.4),1 mm DTT, 0.5 mm Sucrose, 2 mm CaCl 2 (7) Proteinase K Puffer ( 2x stock), ph 7.5: 20 mm Tris/Cl, 20 mm EDTA, 0.25 M NaCl, 0.4% SDS. (8) Proteinase K stock: 20 mg / ml in Wasser, Aliquotieren und bei -20 C lagern. (9) 100% EtOH (10) 3 M Natriumacetat ph 5.2 ( ph Wert mit Eisessig einstellen!) (11) Elektrophorese-Puffer: Laufpuffer: 1x TAE ( 50 mm TrisAcetat, 1mM EDTA, ph 8.3 ) Probenpuffer: 5x TAE, 30% Glycerol, Bromphenolblau 7