Expression; Inclusion bodies was nun Löslich, aber auch gefaltet? Inclusion bodies Intrazelluläre Aggregate von missgefaltetem Protein Bilden sich bei Expression, wenn Protein sich nicht richtig faltet.
Inclusion bodies, im Mikroskop erkennbar Inclusion bodies EM Bild
Inclusion bodies Proteine teils gefaltet; oder IB enthalten auch gefaltetes Protein; Bsp Green Fluorescent Protein GFP, leuchte nur wenn es gefaltet ist. Bild C, E, die Punkte sind Inclusion bodies, die gefaltetes GFP enthalten. Cytoplasmatische Expression als lösliches Protein z.b. in Bild B. Inclusion Bodies Sind also eine Mischung aus ungefaltetem Protein, teilgefaltetem Protein und auch gefaltetem Protein.
Inclusion bodies vermeiden Richtiges Expressionskompartiment? Bsp Expression einer Ig Domäne mit essentiellem Disulfid in Origami Stamm (erlaubt Disulfide im Cytoplasma) in Bild A, Gelspur 1, Gesamtzellprotein, Protein wird exprimiert. Gelspur 3, Lösliche Proteine => Protein ist löslich In Bild B, Expression in normalen Stämmen: Gelspur 1 und 3 Gesamtzelllprotein, es wird also Zielprotein exprimiert. Aber die Fraktionen mit löslichem Protein in Gelpsur 2 und in 4 zeigen kein Zielprotein => Inclusion bodies Inclusion bodies vermeiden Optimierung Expressionskonstrukt Verkürzung / Verlängerung um wenige Aminosäuren kann Faltung extrem beeinflussen Verminderung Protein de Novo Synthese durch Induktionsstärke / Tuner B Strains Erniedrigen der IPTG Konzentration Expressionstemperatur Vermindern der Expressionstemperatur auf 30 oder 20 C
Inclusion bodies vermeiden Durch Chaperone Induktion Ethanol 3% Zugabe von Ethanol Induziert Expression von Heat Shock Proteinen= Chaperonen= Faltunsghelfern Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression seit ca 20 Jahren bekannt.
Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression
Inclusion bodies vermeiden Chaperone Co-expression Kombination von Chaperonen ermöglicht auch Expression von Schwierigen Proteinen Refolding
Unfolding Chaotrope Substanzen stören die geordnete Wasserstruktur, => vermindern den hydrophoben Effekt. Dadurch wird der hydophobe Core von Proteinen zerstört, => das Protein entfaltet sich. Kosmotrope Substanzen fördern die geordnete Wasserstruktur, => verstärken den hydrophoben Effekt; z.b. Ammoniumsulfatfällung. Refolding => Es sollten verschiedene Refoldingpuffer probiert werden. Man kann hier auf eien Reihe von Publikationen zurückgreifen. Bsp
Refolding Refolding Während dem Refolding können teils gefaltete Intermediate aggregieren und die vollständige Faltung ins Native Protein verhindern. Abhilfe: Zugabe von Aggregationshemmern, z.b.arginin, Glycerin
CD Spectroscopy Optisch aktive Substanzen können polarisiertes Licht drehen Licht besteht aus E- Vektor und H-vektor. Bei Polarisation werden E- Vektoren ausgeblendet. Polarisationsfilter Proteine sind optisch akive Substanzen Jeder Sekundärstrukturtyp hat charakteristisches CD Spektrum. Aus Kombination von den drei Grundtypen lassen sich CD Spektren von Proteinen fitten => Gehalt an α-helix, β-sheet, random coil. Beispiele
Overlay and elimination of CD bands => β-sheets diffcult to predict Co-factors contribute to CD spectrum => wrong prediction Far UV CD So weit wie möglich CD Spektren sollten soweit wie möglich ins kurzwellige UV aufegnommen werden. Anteile der Spektren mit hohem Anteil and struktureller Informationen befinden sich gerade auch zwischen 200 und 180 nm. Problem: Viele Puffersubstanzen, Salze, etc absorbieren sehr stark ab ca. 210 nm und maskieren so das Spektrum des Peptidbindungen des Proteins. Bsp. Prion Protein im Vergleich zu Mutante: Strukturelle Änderungen erst unter 200 nm im Spektrum dutlich erkennbar.
CD: Nahes und fernes UV Fernes UV: Bereich zwischen 250 und 180 nm Nahes UV zwischen 350 und 250 nm. Nah, wegen Nähe zum sichtbaren Bereich (ca 380-780 nm). CD Signale im nahen UV von den Aromaten ist Fingerprint für gefaltete Proteine FTIR of Proteins Fourier Transformierte InfraRot Spektroskopie Infrared bands of peptide bond (s) : stretch ; (b): bend; (t): torsion Band Wavenumber /cm -1 Origin A 3300 N-H (s) B 3100 N-H (s) I 1690-1600 C=O (s) 80%, N-H (b) 10%, C-N (s) 10% II 1575-1480 N-H (b) 60%, C-N (s) 40% III 1301-1229 C-N (s) 30%, N-H (b) 30%, C=O (s) 10% O=C-N (b) 10%, Bands cm -1 secondary structure in D 2 O 1620-1635 β-sheet, 3 10 helix, α-helix,unordered 1648-1657 α-helix 1644 unordered 1659-1683 turn, β-sheet (s) O (s) N H (s)
FTIR spectra of model peptides IR Absorption of H 2 O Wellenzahl / cm -1 M. Holtzhauer, Methoden in der Proteinanalytik p. 145; p. 150; Experimental setup Measurement in H 2 O => 6-10 µm cell path 10 mg/ml Measurement in D 2 O => 100µM (= 0.1 mm) cell path 1 mg/ml -> complete exchange of H 2 O to D 2 O -> complete exchange of N-H to N-D -> no H 2 O in atmosphere (dry N 2 chamber) -> time expense ~ like in CD spectroscopy Advantage of FTIR over CD: no contribution from cofactors like flavins, heme, Zn 2+, other metals... In region for secondary structure analysis.
Analyse FTIR Analyse mittels Fit der Kurve durch ein Set von Gausskurven. Die Lage der Maxima, die im Gesamtspektrum nur als Schultern sichtbar sind, lässt sich durch die zweite Ableitung der Spektren bestimmen. Analyse FTIR Je mehr Maxima erkennbar sind, desto mehr Gausskurven lassen sich fitten. Der Gesamtfir wird dadurch besser und zuverlässiger.
Analyse FTIR Bsp. Anwendung von FTIR bei Prion Protein Mutante: Die Mutante ΔTM zeigt etwas mehr ß-sheet als der Wildtyp, was zu einer Stabilisierung führt. Thaa et al. BBA Mol Cell Res. 1783, 1076-84.