Proteine: Das Faltungsproblem

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1 Proteine: Das Faltungsproblem Wie findet die Faltung statt? Wie findet das Protein so schnell die eine native Raumstruktur? Motivation Krankheitsbekämpfung: Fehlfaltung (=> Aggregation) führt zu zahlreichen Krankheiten (z.b. Alzheimer, Creutzfeld-Jacob (BSE), Huntington) Lösung von Problemen bei Überexpression rekombinanter Proteine ( inclusion bodies ) Erhöhung der Proteinstabilität bei extremen Bedingungen: Biotechnologische Anwendungen (z.b. Hitzestabilität) Strukturvorhersagen: Die Faltung ist das missing link im Informationsfluss von der genetischen Sequenz zur 3D - Struktur und zur Funktion Biospektroskopie 113

2 Anfinsens Experimente Ribonuclease A Refolding Entfaltung - Rückfaltung Reversibilität der Proteinfaltung in vitro Viele Proteine falten spontan in vitro ohne Hilfe anderer Proteine. Die native Struktur ist vollständig durch die Aminosäuresequenz (+ Solvenseigenschaft) gegeben. Biospektroskopie 114

3 Beobachtung der Faltungsübergänge in Proteinen Induzierte Entfaltung Temperatur ph Harnstoff, GdmHCl mechanische Kraft FI [a.u.] Fluorezenzemission bei 342 nm 1.25 T m : 76.3 C T [ C] Technik Zeitbereich Strukturparameter Fluoreszenzspektroskopie CD-Spektroskopie FTIR Kalorimetrie (DSC) NMR H/D-Austausch Kraftmikroskopie (AFM) ns - s ns - s ns - s min - h ms-s, µs ms - Monate s Trp-, Tyr- Umgebung sekund. Strukt. sekund. Strukt. globale Struktur ortsaufgel. Strukt. Seitengr. Zuordnung globale Struktur (Einzelmol.) fraction of folded state Biospektroskopie 115

4 Optische Aktivität Einige Stoffe haben bei Durchgang von linear polarisiertem Licht die Eigenschaft die Polarisationsrichtung zu ändern (=> optische Aktivität). Die dabei entstehende Drehung des Lichts um den Winkel α mit α = α s d hängt vom spezifischen Drehvermögen α s und der Länge des Lichtweges d ab. Man unterscheidet rechtsdrehende (d; +) oder linksdrehende (l; ) Stoffe. Die Fähigkeit der Stoffe Licht zu drehen hängt mit der Symmetrie der Strukturen (Kristalle oder Moleküle) zusammen (z.b. chirale ( händige ) Moleküle: Zucker). Linear polarisiertes Licht zirkular polarisiertes Licht E E x y = E e 0 = E e 0 i ( ωt kz) i( ωt kz+ π / 2) elliptisch polarisiertes Licht E x = E 0 x e i( ωt kz) E E x y = E = E 0 x 0 y e e i( ωt kz) i( ωt kz) } schwingen in Phase E y = E 0 y e i( ωt kz+ π / 2) mit E 0x E 0y Biospektroskopie 116

5 Optische Aktivität Verschiedene Strukturbestandteile von Proteinen können auch optisch aktiv sein (z.b. Helices). In der Praxis werden bei Untersuchungen an Proteinen zwei Techniken eingesetzt, die durch Messung der optischen Aktivität (bzw. der Chiralität) Informationen und Struktureigenschaften von Proteinen liefern. Polarimetrie / ORD (Optical Rotary Dispersion): Die Probe wird mit linear polarisiertem Licht bestrahlt und die Rotation der Polarisierungsebene wird als Funktion der Wellenlänge gemessen (=> wird seltener angewandt). CD (Circular Dichroism): Die Probe wird mit rechts und links zirkular polarisiertem Licht bestrahlt. Dann wird der Unterschied in der Absorption zwischen beiden Polarisationsrichtungen gemessen. Deshalb muss die Absorption in der Nähe des Chiraltätszentrum relativ groß sein (z.b. π-elektronen im Proteinrückgrad oder in Chromophoren). reiner elektronischer Übergang reiner magnetischer Übergang optische Aktivität Biospektroskopie 117

6 CD-Spektrometrie Schematischer Aufbau eines CD-Spektrometers (Jasco-810): Eigenschaften des Spektrometer Probe Xenon-Lichtquelle M 1 -M 2 : => linear polarisiertes Licht CD-Modulator: Piezoelastischer Modulator (50 khz) linear => zirkular polarisiertes Licht Messsignal: S/I A Messgrößen: A = A L A R = Θ /32980 A: Absorptionsänderung in [OD] Θ: Elliptizität in [mdeg] typische Werte (Beispiel): Θ = 10 mdeg => A = OD Biospektroskopie 118

7 CD-Spektren von Proteinen fernes UV CD-Spektrometrie Information über Sekundärstruktur (Proteinrückgrad; Peptidbindung) Messbereiche fernes UV ( nm) Random coil: positive Bande bei 212; negative Bande um 195 β-faltblatt: negative Bande bei 218 nm (π=>π*); positive Bande bei 196 nm (n=>π*) α-helix: negative Bande bei 222 nm (n=>π*), bei 206 nm (π=>π*) und positiv bei 196 nm (π=>π*) Information über Tertiärstruktur (AS-Seitengruppen: Tyr, Trp, Phe) Messbereiche nahes UV ( nm) Signale im Bereich der starken Absorption der Ringstrukturen ( nm) => siehe auch Fluoreszenzspektroskopie Biospektroskopie 119

8 Untersuchung der Proteinfaltung nahes UV Tertiärstruktur CD-Spektrometrie Beispiel: RNase: 20 C durchgezogene Linie (gefaltet) gestrichelte Linie (entfaltet) bei 6 M GdmCl Bereich der aromatischen Ringe und der Disulfidbrücken: Quenching Effekte durch Auffaltung der Tertiärstruktur Charakteristische Signale der Peptidbindung: 15 % α-helix dominieren das Spektrum für den gefalteten Zustand (222 und 208 nm) fernes UV Sekundärstruktur Einflüsse auf CD-Spektren viele Puffersubstanzen (z.b. Salze) absorbieren stark im UV-Bereich Sauerstoff absorbiert bei ~200 nm schwache Temperaturabhängigkeit der Spektren Biospektroskopie 120

9 Fluoreszenzspektroskopie in Proteinen Fluoreszenz der aromatischen Ringe (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan) Absorption Emission Tryptophan dominiert das Fluoreszenzemissionsspektrum bei λ abs : ~295 nm F.X. Schmidt, Bayreuth Biospektroskopie 121

10 Fluoreszenzspektroskopie in Proteinen Fluoreszenzemissionsspektrum von RNase T1 Pace, Scholtz Umgebungseinflüsse auf die Fluoreszenz starke Abhängigkeit der Emission von der Temperatur moderater Einfluss durch hohe Konzentrationen von Harnstoff, GdmCl gefaltete => entfaltete Proteinstruktur Die Fluoreszenzemission nimmt in ihrer Intensität stark ab und wird zu größeren Wellenlängen verschoben. Dieser Effekt wird durch die veränderte Umgebung der aromatischen Ringe (unpolar => polar) hervorgerufen (bimolekulare Desaktivierung: Löschprozess; Quenching). T-Abhängigkeit der Fluoreszenzemission Biospektroskopie 122

11 Untersuchung von Faltungsübergängen in Proteinen Messung der Spektren bei Variation des Parameters der die Entfaltung induziert. Fluoreszenzemission als Funktion der Harnstoffkonzentration Faltungsübergang der RNase T1 Faltungsübergang sigmoider Kurvenverlauf relativ steiler Abfall ( Alles oder nichts -Prozess) Bestimmung der Fraktionen (gefaltet /entfaltet) => Bestimmung thermodynamischer Größen!! Pace, Scholtz Übergang sieht für alle Messmethoden sehr ähnlich aus! Biospektroskopie 123

12 Thermostabilität von Proteinen Sowohl H, als auch S sind im Falle von Proteinen für den Übergang unfolded folded stark Temperaturabhängig. G unf [kj/mol] G(T) H(T) T S(T) T [ C] G unf [kj/mol] Kälte- Denaturierung G(T) H(T) S(T) T S(T) T [ C] Hitze- Denaturierung Gibbs-Helmholz Gleichung G unf (T) = G U G F = H(T) T S(T) = -RTlnK eq entfaltet gefaltet mit K eq = [U]/[N] Parabolischer Verlauf von G unf mit der Temperatur im Falle von 2-Zustandsübergang keine Intermediate Übergang reversibel Biospektroskopie 124

13 Thermostabilität von Proteinen Bestimmung von H 0 und S 0 aus der Van`t Hoff Gleichung ( H 0, S 0 Werte bei der Übgangstemperatur T 0 ) Aus G unf (T) = H(T) T S(T) = -RTlnK eq kann die Van`t Hoff Gleichung hergeleitet werden: Es gilt: d H(T) = c p dt und d S(T) = c p /T dt ln (1/ K T) H = R 0 lnk Steigung: - H 0 /R 1/T So über die Steigung ermittelte Enthalpien H 0 sind die sogenannten Van t Hoff Entalphien H vh FI [a.u.] Intensity Floureszenzemmision α-amylase ca mg / ml λ exc. : 290 nm BAA ph 13 (U) 30 C BAA standard (F) 30 C BAA standard (F) 70 C Buffer only wavelength [nm] Fluorezenzemission bei 342 nm T m : 76.3 C T [ C] Biospektroskopie 125 fraction of folded state

14 Die thermische und thermodynamische Stabilität von Proteinen Für die Schmelztemperatur T m gilt: G unf (T m ) = H m T m S m = 0 H m = T m S m G unf (T) = H(T) T S(T) = H m + c p (T-T m ) - T [ H m /T m + c p ln(t/t m )] = H m (1-T/T m ) + c p [T-T m -T ln(t/t m )] mesophil thermophil_1 thermophil_2 thermophil_3 Für alle T bestimmt durch die Messgrößen:T m, H m, c p => z.b. Kalorimetrie G unf 0 T m meso T m thermo Schmelztemperaturen für Proteine Mesophile Thermophile (20-50 C) (60 90 C) steigende Temperatur Biospektroskopie 126

15 Proteinstabilität - Kalorimetrie The Differential Scanning Calorimeter (DSC) Cp = d H/dT H = T 2 T 1 CpdT 5 10 Probenkammer mit Puffer Probenkammer mit Puffer + Protein Beim Heizen beider Probenkammern wird ein Unterschied in der Wärmeaufnahme gemessen C P = Q/ T H cal = H vh weist auf 2-Zustandsübergang hin Kalorimetrische Messparameter ( H cal, Cp) für einen Übergang(hier Proteinentfaltung bei der Schmelztemperatur T d = T m ) Biospektroskopie 127

16 Proteinstabilität G unf (T) = G U G F = H(T) T S(T) Beiträge von der Proteinstruktur und vom Solvens (Hydratwasser): Beispiel Entropie konformelle Entropie der Proteinstruktur Im entfalteten Zustand hat die Struktur mehr Bewegungsfreiheitsgrade S > P unf S P S > 0 P fol destabilisiert den gefalteten Zustand Entropischer Beitrag des Hydratwassers Im entfalteten Zustand sind hydrophobe Residuen polaren Wassermolekülen ausgesetzt, eingeschränkte Beweglichkeit des Wassers S < H unf S H stabilisiert den gefalteten Zustand, kompensiert Beispiel Lysozym (T=25 C) -T S = -184 kcal/mol H = +198 kcal/mol G = +14 kcal/mol => Thermodynamische Methoden (z.b.kalorimetrie) können nicht zwischen den beiden Beiträgen unterscheiden, sie messen die Summe aller Beiträge! S < 0 H fol S Biospektroskopie 128 P

17 absorbance 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Bac. Lich. Proteinstabilität: H/D Austausch beobachtet mit FTIR FT-IR Spektren (30 C) amide II amide I H/D-exchange wavenumber [cm -1 ] => Das hitzestabiles Enzym ist flexibler!! kinetics fraction of non-exchanged H fraction of exchanged H 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 BLA (thermo) H/D Austauschkinetik (30 C) BLA (thermo) BAA (meso) exchange rates [10-2 * min -1 ] time [min] fraction of exchanged H BAA (meso) fast medium slow : exchange rates [10-2 * min -1 ] Biospektroskopie 129

18 Modelle zur Hierachie der Faltung 1 2 (1) Hydrophober Kollaps: Seitengruppen orientierter Ansatz (hydrophob, hydrophil) (2) Hierachie: 1. Ausbildung von Sekundärstrukturelementen 2. dreidimensionale Raumstruktur 3 4 (3) Lokale Ausbildung eines kleinen Strukturelementes um das herum die komplette Struktur aufgebaut wird. Radford 2000 (4) Parallele Faltungswege; Kombination verschiedener Modelle Biospektroskopie 130

19 Der Faltungstrichter Radford 2000 Heterogenität des entfalteten Zustandes => parallele Faltungswege!? Einzelmolekültechniken! Biospektroskopie 131