Salmonellen-Ident-Agar (I)/XLD-Agar (II) Artikel-Nummer 149152e Anwendung Zur Isolierung von Salmonellen aus Stuhlproben, Lebensmitteln, Futtermitteln, Wasser, Umweltproben nach üblicher Anreicherung entsprechend MIQ, DIN EN ISO 6579 und 35 LMBG. Typische Zusamensetzung pro l Salmonellen-Ident-Agar (I. Plattenhälfte) Pepton NaCl Dikaliumhydrogenphosphat Gallensalz Chromogene Antbiotika-Supplement Agar 13,0 g 2,0 g 0,2 g 10 ml 14,0 g ph 7,7 ± 0,2 Der Nährboden ist weißlich-trüb. XLD-Agar (II. Plattenhälfte) Hefeextrakt L-Lysin Saccharose Xylose Lactose Natriumdesoxycholat Ammoniumeisen(III)-citrat Natriumthiosulfat Natriumchlorid Phenolrot Agar ph 7,4 ± 0,2 3,0 g 7,5 g 3,5 g 7,5 g 2,5 g 0,8 g 6,8 g 80 mg 13,5 g oberes Bild: Salmonella Enteritidis unteres Bild: Escherichia coli Der Nährboden ist klar und himbeerrot gefärbt. Seite 1 von 5
Beschreibung Salmonellen-Ident-Agar: Eine ausgewogene Nährstoffbasis und ein ausbalanciertes Hemmstoffsystem gestatten allen Salmonella entericaund Salmonella bongori-stämmen zu wachsen. Das auf Spaltung durch die C8-Esterase der Salmonellen beruhende Anzeigesystem führt zu charakteristischen mintgrünen Salmonella-Kolonien. Das nach C8-Esterase-Spaltung ausgefallene grüne Chromophor verbleibt ausschließlich in den Salmonellenkolonien und diffundiert nicht in die Nährbodenumgebung. Salmonellen enthalten die C8-Esterase zu mehr als 99 %, die Spezifität beträgt nach verschiedenen Autoren (s. Literatur) über 90 %. Ein weiterer wesentlicher Vorteil von Salmonellen- Ident-Agar besteht im guten Anwachsen von S. Typhi, S. Gallinarum und S. Pullorum. Salmonella IIIa- und S. IIIb- (früher S. arizonae und S. diarizonae) Stämme wachsen ebenfalls typisch als mintgrüne Kolonien. Dadurch lassen sich Salmonellen auch nach Überwachsen mit Begleitflora sehr gut erkennen. Die Wiederfindungsrate (bestimmt für S. Typhimurium und S. Enteritidis) liegt in der gleichen Größenordnung wie bei XLD-Agar. Da aber die Differenzierungsreaktionen des Salmonellen- Ident-Agar nicht auf den herkömmlichen Stoffwechselleistungen wie H 2 S-Bildung und fehlender Säurebildung aus Lactose basieren, können mit diesem Medium auch Salmonellen eindeutig erkannt werden, die z. B. auf XLD- und MacConkey- Agar schwach oder untypisch reagieren. C. amalonaticus zeigt reduziertes Wachstum mit kleinen blau-türkisen Kolonien, wobei ein blautürkiser Hof um die Kolonie entstehen kann. Serratia marcescens und Hafnia alvei wachsen elfenbeinfarben bis rosa. Nach selektiver Anreicherung, besonders geeignet ist hierbei Rappaport-Vassiliadis-Bouillon, sind die Kolonien der Kontaminanten auf Salmonellen- Ident-Agar stark reduziert oder nicht mehr sichtbar. Zu Wachstum und Koloniemorphologie von Salmonellen und Bakterien der Begleitflora auf Salmonellen-Ident-Agar siehe die folgende Tabelle 1: XLD-Agar: Salmonella spp. und Edwardsiella spp. wachsen als blaßrosa bis farblose Kolonien auf rotem Medium, meist mit schwarzem Eisensulfid-Zentrum. Die durch die Lysin-Decarboxylase der Salmonellen hervorgerufene Alkalisierung (Cadaverin) führt zu einer rotvioletten Nährbodenfarbe. Abbau von Xylose zu Säure durch E. coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp. führt zu gelben Kolonien, letztere auch mit schwarzem Zentrum. Hinweis: Proteus spp. bilden Kolonien mit schwarzem Zentrum, allerdings mit gelbem Hof. Shigellen, Providencia spp. und H 2 S-negative Salmonellen wachsen als rote, transparente Kolonien. Von der potentiellen Begleitflora sind Aeromonaden, Acinetobacter spp., Pseudomonaden, Enterokokken und Staphylokokken meist vollständig gehemmt oder zeigen stark reduziertes Wachstum (Stecknadelkolonien). E. coli, Citrobacter freundii, Citrobacter werkmannii, Shigella spp. (S. sonnei, S. flexneri, S. boydii, S. dysenteriae), Bakterien der Proteus-/Providencia-/Morganella-Gruppe, Y. enterocolitica sowie Candida albicans wachsen als helle bis elfenbeinfarbene Kolonien. Enterobacter agglomerans, E. aerogenes, E. cloacae, Klebsiella pneumoniae und K. ozaenae erscheinen als helle bis rotviolette, manchmal auch blauviolette Kolonien. E. taylorae und E. gergoviae wachsen als blaue Kolonien. Seite 2 von 5
Tab. 1: Wachstum und Koloniemorphologie von Salmonellen und Bakterien der Begleitflora auf Salmonellen-Ident-Agar Bakterienspezies Salmonella enterica subsp. I (einschl. S. Paratyphi, S. Dublin), II, IIIa, IIIb (einschl. O:61-Isolaten von Schafen), IV und VI sowie S. bongori Größe, Koloniemorphologie mintgrüne Kolonien mit kleinem hellen Saum, bis 2 mm im Durchmesser S. Typhi, S. Gallinarum, S. Pullorum mintgrüne Kolonien bis 1 mm E. coli, C. freundii hell bis elfenbeinfarben, bis 2 mm E. coli mit H 2S-Bildung hell bis elfenbeinfarben, bis 2 mm Shigella spp. (S. sonnei, S. flexneri, S. boydii, S. dysenteriae) Proteus spp., Providencia spp., Morganella morganii Yersinia enterocolitica Hafnia alvei, Serratia marcescens Klebsiella pneumoniae, K. ozaeanae Enterobacter aerogenes, E. agglomerans hell bis elfenbeinfarben, bis 2 mm gehemmtes Wachstum, hell bis elfenbeinfarben, bis 1 mm gehemmtes Wachstum,hell bis elfenbeinfarben, bis 0,5 mm elfenbeinfarben oder rotviolett, bis 2 mm rotviolett bis blauviolett, bis 2 mm rotviolett bis blauviolett, bis 2 mm E. gergoviae, E. taylorae blauviolett, bis 2 mm E. cloacae elfenbeinfarben bis blauviolett C. amalonaticus blau-türkis, bis 0,5 mm, blau-türkiser Hof um die Kolonie Pseudomonas spp., Aeromonas hydrophila, Acinetobacter spp. Enterococcus faecalis Staphylooccus aureus, S. epidermidis Candida albicans oder im Anstrich mit türkiser Nährbodenverfärbung oder rotviolette bis blauviolette Stecknadelkolonien Kulturbedingungen Salmonellen-Ident-/XLD-Agar wird aus Anreicherungskulturen z. B. in Selenit-Bouillon (Heipha Art.- Nr. 215r), Tetrathionat-Bouillon (218r), Tetrathionat- Bouillon MKTTn (Art.-Nr. 2182r) oder Rappaport- Vassiliadis-Medium (RVS, Art.-Nr. 392r) beimpft, dann aerob für 20-24 Stunden bei 36 ± 1 C inkubiert. Bei Verdacht auf S. Typhi, S. Gallinarum oder S. Pullorum empfiehlt sich eine Weiterbebrütung bis 40 Stunden. Seite 3 von 5
Qualitätskontrolle Salmonellen-Ident-Agar (I. Plattenhälfte) Teststämme Salmonella Typhi klin. Isolat Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus* ATCC 6538 Inkubationsbedingungen: 22 ± 2 Stunden bei 36 ± 1 C XLD-Agar (II. Plattenhälfte) Teststämme Salmonella Typhi klein. Isolat Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli ATCC 8739 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Inkubationsbedingungen: 22 ± 2 Stunden bei 36 ± 1 C Weiterführende Identifizierung Wachstumsergebnisse / Koloniemorphologie gutes Wachstum; kleine, grüne Kolonien, ggf. mit hellem Saum gutes Wachstum; mittelgroße, grüne Kolonien, ggf. mit hellem Saum Wachstum gehemmt; farblose Kolonien Wachstum stark gehemmt Wachstumsergebnisse / Koloniemorphologie gutes Wachstum, mittelgroße, weißgelbliche Kolonien, vereinzelt dunkles Zentrum gutes Wachstum, Kolonien blassrosa mit großem schwarzen Zentrum, Nährboden unverändert Wachstum gehemmt, Kolonien weißlich opaque mit gelbem Präzipitathof gutes Wachstum, farblose Kolonien Kein Wachstum Serologische Prüfung verdächtiger Kolonien mit omnivalentem Anti-Salmonella-Serum (z. B. SIFIN GmbH, Berlin), dann mit poly-, gruppen- und monospezifischen Seren. Biochemische Prüfung z. B. mit Kligler-Schrägagar ohne oder mit Harnstoff (Heipha Art.-Nr. 1222r oder 1220r); Urease-Test (Harnstoffabbau), z. B. mit Harnstoff-Agar nach Christensen (Heipha Art.-Nr. 398r); Lysin-Decarboxylase-Bouillon (Heipha Art.-Nr. 2251r); Indolbildung, z. B. mit dem MIO-Medium (Heipha Art.-Nr. 2260r). Eine weitergehende Differenzierung und Typisierung kann im Nationalen Referenzzentrum für Salmonellosen und andere Enteritiserreger am Robert Koch- Institut, Bereich Wernigerode oder am Hygiene- Institut Hamburg vorgenommen werden. Literatur Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG (September 1998). L 00.00-20: Untersuchung von Lebensmitteln. Horizontales Verfahren für den Nachweis von Salmonellen. DGHM (1983): Verfahrensrichtlinien für die mikrobiologische Diagnostik, Kap. 2.1. DIN 38414 (März 1992). Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung. Schlamm und Sedimente (Gruppe S). Nachweis von Salmonellen im entseuchten Klärschlamm (S13). DIN EN ISO 6579 (2003-03): Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln. Horizontales Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp. Deutsche Fassung EN ISO 6579:2002. Seite 4 von 5
Kist, M., Bockemühl, J. et al.: Infektionen des Darmes. MIQ (Qualitätsstandards in der mikrobiologischinfektiologischen Diagnostik 9 (2000). Urban & Fischer, München Jena. Manafi, M. (2000): New developments in chromogenic and fluorogenic culture media. Int. J. Food Microbiol. 60, 205-18. Olsson, M., Syk, A., Wollin, R. (1991): Identification of Salmonella with the 4-methylumbelliferyl caprylate fluorescence test. J. Clin. Microbiol. 29, 2631-2632. Ruiz, J., Sempere, M. A.,Varela, M. C., Gomez, J (1992). Modification of the methodology of stool culture for Salmonella detection. J. Clin. Microbiol. 30, 525-527. Ruiz, J., Varela, M. C., Sempere, M. A. et. al. (1991): Presumptive Identification of Salmonella enterica using two rapid tests. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 10, 649-651. Taylor, W.I. (1965): Isolation of Shigellae. I. Xylose- Lysine Agar. New media for the isolation of enteric pathogens. Am. J. Clin. Pathol.; 44: 471-475. heipha Dr. Müller GmbH Tel. +49 (0) 62 21-7 59 01-0 Lilienthalstraße 16 Fax +49 (0) 62 21-7 59 01-9 90 D-69214 Eppelheim e-mail info@heipha.de A member of the Biotest Group www.heipha.de Seite 5 von 5