Elektrophorese Teil 1 Skript zur Vorlesung Grundlagen der Analytik I im MSc-Studiengang Analytik Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 11.1.2007
Literatur Analytical Isotachophoresis P. Bocek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, VCH, Weinheim, 1988 Gelelektrophorese R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin Isoelektrische Fokussierung R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin Capillary Electrophoresis: Principle and Practice R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn, Springer Laboratory, Berlin, 1993 Handbook of Capillary Electrophoresis Ed. J. P. Landers, CRC Press, Boca Raton, 1997 Advances in Electrophoresis, Serie, Band 1, 2 und 6 Eds. A. Chrambach, M. J. Dunn, B. J. Radola, VCH, Weinheim, 1987-1993
Gliederung Grundlagen geschichtlicher Überblick wichtige Größen Trennprinzipien Zonenelektrophorese (ZE) Isotachophorese (ITP) Isoelektrische Fokussierung (IEF) technische Realisierungen Kapillarelektrophorese Aufbau, apparative Komponenten Puffersysteme und Additive Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC) Gelelektrophorese
Historische Entwicklung 1791 Faraday Elektrolysegesetze 1853 Hittorf Überführungszahlen 1877 Helmholtz Elektroosmose 1887 Arrhenius Dissoziationstheorie 1897 Kohlrausch Regulierungsfunktion 1930 Tiselius Versuche zur Elektrophorese der wandernden Grenzflächen / erste reproduzierbar arbeitende Apparatur durch Kühleinheit / 1948 Nobelpreis 1960 Hjerten Elektrophorese der wandernden Grenzflächen erstmals in Kapillaren (i.d. 0,3 cm) 1967 Hjerten Theorie der trägerfreien Zonenelektrophorese 1968 Everaerts erste kommerzielle Isotachophoreseapparatur 1979 Mikkers Kapillarzonenelektrophorese 1987 Fa. Beckman erste kommerzielle Kapillarzonenelektrophoreseapparatur
Elektrophoretische Trennverfahren Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld Mobilität eines Teilchens hängt von Ladung und Radius ab Analyten mit unterschiedlichen Mobilitäten im Feld wandern unterschiedlich schnell und werden dadurch getrennt Trenneffekte sind vom Medium (Trennpuffer) abhängig Möglichkeit der Analyse neutraler Verbindungen durch WW mit geladenen Pufferzusätzen
Einteilung elektrophoretischer Verfahren Einteilungskriterium Getrennte Stoffmenge Trennprozess Stabilisierungsmethoden Trennprinzip Potentialgradient Trenntechnik analytisch, mikropreparativ, preparativ kontinuierlich, Stufenweise tragerfrei, mit Trägermedium, Kapillare, Gele nur Migration Migration und WW mit Trägermedium Migration, WW mit Trägermedium und Diffusion Migration und Verteilung Hochspannung, Niederspannung Zonen wandernde Grenzflächen Isotachophorese Fokussierung
Einteilung elektrophoretischer Verfahren Zonenelektrophorese Methode der wandernden Grenzflächen / Isotachophorese Isoelektrische Fokussierung Kombinationen mit weiteren Trenneffekten Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie Gelelektrophorese
Trennprinzipien Zonenelektrophorese (C)ZE Isoelektrische Fokussierung IEF Puffer homogene ZSS Gemisch von Ampholyten E / ph homogen Kontinuierlicher Gradient Isotachophorese ITP Zwei Elektrolyte Stufenförmiger Gradient Probe Keine Begrenzung Für Molekulargewicht Kationen, Anionen, Neutralverbindungen Ampholyte, pi µ T < µ S < µ L nur eine Ionenart Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen: Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC), Kapillargelelektrophorese (CGE)
Zonenelektrophorese Trägermaterial Papier oder Dünnschicht Celluloseacetat (Filterpapier) Nitrocellulose Ionenaustauscher Aluminiumoxid, Titaniumoxid Trägerfrei Kapillare eindimensional / zweidimensional vom Trägermaterial verursachte Effekte Joul sche Wärme Elektroosmose Adsorption Diffusion
Trägermaterialien für die Zonenelektrophorese Papier Filme Gele Papier- und Dünnschichtelektrophorese heute kaum noch gebräuchlich (bessere Trennung und höhere Beladbarkeit von Agarose- und PAA-Gelen) Silikagel-Platten in Puffertanks Celluloseacetatmembran (große Poren, daher schlechte Auftrennung für Proteine) Trenneffekt basiert vollständig auf Ladungsdichte; aber einfaches Handling Ideal einstellbare, regelmäßige Porengröße, chemische Inertheit, keine Elektroosmose Stärke (seit 1955) 5-10 mm dick, geringe Reproduzierbarkeit, unpraktisches Handling der Gele Agarose charakterisiert durch Schmelzpunkt und Ausmaß der auftretenden Elektroosmose, Porengröße abhängig von Konzentration (150-500 nm) Polyacrylamid seit 1959, chemisch inert, mechanisch stabil, wenig Elektroosmose Kontrolle der Porengröße bei Synthese möglich
Zonenelektrophorese Trennprinzip für Trägersysteme (schematisch) v i = u i E
Zonenelektrophorese Trennprinzip für trägerfreie Systeme (Kapillare) v i = u i E
Isotachophorese zwei Puffer - Leitelektrolyt (L) / Terminator (T) µ L,eff > µ i,eff > µ T,eff Gesetz von Kohlrausch c x = c L µ x µ x µ G µ L µ µ L G X Probeion, G Gegenion, L Leition je geringer die Mobilität von x, desto geringer ist auch seine Konzentration in der entsprechenden Zone die Konzentration des Probeions in seiner Zone richtet sich nach der Konzentration des Leitions das Gegenion G ist in jeder Zone in entsprechender Menge vorhanden µ G,L µ G, X µ G,T c G,L 1 = c G, X 1 = c G,T 1 = µ L,L µ X, X µ T,T konst.
Isotachophorese Auswahl der Elektrolytlösungen Löslichkeit und Stabilität 1-10 mm (wasserlöslich), alternativ Zugabe organischer LM Auswahl Gegenion Redoxprozesse, Fällung vermeiden Ionisierung und Pufferung Dissoziationsgrad 10 % notwendig für ausreichenden µ eff -Effekt sinnvolle Grenze ph LE pk A ±1 und pk B ±1
Isotachophorese v i = u i E
Isotachophorese Trennung der Lanthaniden Elektrolytsystem: Leitelektrolyt: 2.7 mm KOH + 1.5 mm α-hydroxyisobuttersäure + Essigsäure (ph 4.92) + 0.0025 % PVA Terminator: β-alanin Detektion: Potentialgradient Probe: 5 nmol je Element L 4 3 1 2 5 6 7 8 9 10 11 12 Methode des komplexierenden Gegenions L K + 13 14 15 E T t /min 1 Na + 2 La 3+ 3 Ce 3+ 4 Pr 3+ 5 Nd 3+ 6 Sm 3+ 7 Eu 3+ 8 Gd 3+ 9 Tb 3+ 10 Dy 3+ 11 Ho 3+ 12 Er 3+ 13 Tm 3+ 14 Yb 3+ 15 Lu 3+ T β-alanin
Elektrolytsysteme Kontinuierlich Diskontinuierlich E 2 T E 1 L v = µ. E
Isoelektrische Fokussierung Ampholyte mit Isoelektrischem Punkt Immobilisiert oder frei 1 ph = pk S + pk B 2 ( ) Trägermaterial : Polyacrylamid (PAGE), Sephadex Kovalente Bindung der Ampholyte an die Gelmatrix ph bleibt über gesamte Trennung konstant Gradient vorausberechenbar - damit anpassbar an Analysenproblem extrem hohe Auflösung erreichbar (bis 0,01 ph/cm) Trägerfrei : Dichtegradienten (Sucrose), Freie Lösung
Isoelektrische Fokussierung bei niedrigem ph R-COO - + H + R-COOH R-NH 2 + H + R-NH 3 + bei hohem ph R-COOH R-COO - + H+ R-NH 3+ R-NH 2 + H + ph = pi B ph = pi A
Isoelektrische Fokussierung Entwicklung des ph-gradienten für die IEF
Isoelektrische Fokussierung Grundstrukturen von Trägerampholyten Polyamino-Polycarbonsäuren N N x freie Trägerampholyte R = H COOH NR 2 COOH x = 2 oder 3 Acrylamid-Derivate H 2 C NH immobilisierte Ampholyte CH 3 O R R = R = N CH 3 O SO H 3 COOH H 5 C 2 N + C 2H 5 C 2 H 5 sauer basisch
Isoelektrische Fokussierung Agarose-IEF mit Elektroden- und Probeaufgabe-Streifen Struktur der Agarose und des bei der Polymerisation gebildeten Gels
Isoelektrische Fokussierung IEF von Isoformen des α-antitrypsin (Protease-Inhibitor) in immobilisiertem ph-gradient ph 4.0 5.0 IEF von Kartoffelsaft unterschiedlicher Kartoffelarten in einem Polyacrylamidgel (angefärbt mit Coomassie Brilliant Blue)
Kombinierte Prinzipien - 2D Erste Dimension IEF mit immobilisiertem ph-gradienten ph 3-12 in 24 cm langem Gelstreifen Zweite Dimension SDS-PAGE In 13%igem Gel Detektion durch Silberfärbung Erste Dimension Zweite Dimension
SDS-PAGE Sodium docecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach SDS-Zusatz SDS überdeckt Eigenladung des Proteins je Gramm Protein binden ca. 1.4 g SDS Proteine im Gemisch mit konstanter Ladungsverteilung Sekundär- und Tertiärstrukturen werden in Vorbehandlung durch Brechen der Wasserstoffbrücken und Streckung des Moleküls aufgebrochen Disulfidbrücken werden durch Reduktion gespalten In anschließender Trennung spielt nur noch Größe eine Rolle
Trennprinzipien Zonenelektrophorese (C)ZE Isoelektrische Fokussierung IEF Puffer homogene ZSS Gemisch von Ampholyten E / ph homogen Kontinuierlicher Gradient Isotachophorese ITP Zwei Elektrolyte Stufenförmiger Gradient Probe Keine Begrenzung Für Molekulargewicht Kationen, Anionen, Neutralverbindungen Ampholyte, pi µ T < µ S < µ L nur eine Ionenart Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen: Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC), Kapillargelelektrophorese (CGE)