4 rgebnisse 4.1 Vorversuch 4.1.1 eurteilung der Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach der Kryokonservierung Im Nativsperma betrug die mittlere Vorwärtsbeweglichkeit des Spermas der drei engste des Vorversuchs zwischen 26,3 und 4,%, nach dem Tiefgefrieren nur noch 6,7 bis 34,%. Mit usnahme des engstes 2 war die Vorwärtsbeweglichkeit des nativen Spermas deutlich und statistisch signifikant höher als die des tiefgekühlten Spermas (bbildung 1, S. 41). lle drei engste wiesen einen direkten Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit des nativen und des tiefgekühlten Spermas auf. Sämtliche Spearman schen Rangkorrelationskoeffizienten R waren positiv (Tabelle 1), d.h. dass mit zunehmender Vorwärtsbeweglichkeit des nativen Spermas auch die Vorwärtsbeweglichkeit des tiefgekühlten Spermas zunahm. llerdings erreichte dieser Zusammenhang nur für engst 3 die Schwelle zur statistischen Signifikanz. 4
Tabelle 1: Prozentsatz vorwärtsbeweglicher Spermien vor und nach dem Tiefgefrieren bei den drei engsten des Vorversuches Nativ- sperma Wilcoxon- Test Spearman scher Rangkorrelationskoeffizient p R p engst 1 (n = 9) 28,9 ± 12,7 6,7 ± 5, <,1,36 engst 2 (n = 8) 4, ± 5,3 34, ± 7,4,24 engst 3 (n = 8) 26,3 ± 7,4 2, ±,3 <,5,79 <,5 nteil vorwärtsbeweglicher Spermien (%) 5 4 3 2 engst 1 engst 2 engst 3 Nativsperma bbildung 1: nteil vorwärtsbeweglicher Spermien in Nativ- und bei den drei engsten des Vorversuchs 41
4.1.2 Mukuspenetrationstest Im Vorversuch wurden die rgebnisse des Mukuspenetrationstests an Nativ- und verdünntem Sperma denjenigen an gegenübergestellt. Im Nativsperma legten die Spermien durchschnittlich zwischen 24,5 ± 7, (engst 1) und 67,1 ± 2,6 mm (engst 3) zurück. Im verdünnten Sperma waren die zurückgelegten Strecken geringfügig länger (Tabelle 2). Im war bei den engsten 1 und 3, jedoch nicht bei engst 2, eine signifikante bnahme der Penetrationsstrecken gegenüber dem Nativsperma zu verzeichnen. egenüber dem verdünnten Sperma fielen die Penetrationsstrecken im tiefgefroreren Sperma bei engst 1 signifikant kürzer, bei engst 2 signifikant länger aus (bbildung 2). ei nwendung des Wilcoxon-Tests zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen Nativ- und verdünntem Sperma (p >,5). 42
Tabelle 2: Penetrationsstrecken (mm) im Mukuspenetrationstest bei den drei engsten des Vorversuchs Nativ- sperma verdünntes Sperma engst 1 (n = 9) 24,5 ± 7, a 34,2 ± 17,2 b 4,2 ± 11,1 c engst 2 (n = 8) 56,3 ± 14,1 65,6 ± 4,4 d 67,1 ± 5,2 e engst 3 (n = 8) 67,1 ± 2,6 f 69,4 ± 1,8 39,1 ± 3,3 g Wilcoxon-Test: a : c: p <,1 b : c, d : e, f : g: p <,5 8 7 6 5 Nativsperma Verdünntes Sperma mm 4 3 2 engst 1 engst 2 engst 3 bbildung 2: Zurückgelegte Strecken im Mukuspenetrationsversuch bei den drei engsten des Vorversuchs Die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen den unterschiedlich aufbereiteten Spermaproben mittels Spearman schem Rangkorrelationskoeffizienten R gibt die folgende Tabelle 3 wieder. lle drei engste wiesen einen indirekten Zusammenhang zwischen der Penetrationsstrecke des nativen und des tiefgekühlten Spermas auf. Mit zunehmender Penetrationsstrecke im Nativsperma nahm die Strecke im tiefgekühlten Sperma ab. llerdings war dieser Zusammenhang nur für engst 3 statistisch signifikant (bbildung 3). 43
Tabelle 3: Mukuspenetrationstest: Zusammenhänge zwischen unterschiedlich aufbereitetem Sperma bei 3 engsten des Vorversuches, Spearman scher Rangkorrelationskoeffizient Nativsperma/ engst 1 (n = 9) R = -,16 n.s. engst 2 (n = 8) R = -,58 n.s. engst 3 (n = 8) R = -,78 p <,5 Nativsperma/ verdünntes Sperma R =,5 p <,5 R =,73 p <,5 R = -,42 n.s. / verdünntes Sperma R = -,9 n.s. R = -,51 n.s. R =,51 n.s. 8 7 Penetrationsstrecke T (mm) 6 5 4 3 2-63 64 65 66 67 68 69 7 71 Penetrationsstrecke nativ (mm) bbildung 3: Zusammenhang zwischen Penetrationsstrecke in Nativsperma (=nativ) und (= T) bei engst 3 44
4.1.3 krosinbestimmung mittels elatinolyse 4.1.3.1 Prozentualer nteil der Spermien mit alobildung uch bei der krosinbestimmung mittels elatinolyse wurden die rgebnisse bei Nativ- und verdünntem Sperma denjenigen von gegenübergestellt (bbildung 4). Im Nativsperma zeigten zwischen 4,2 ± 4,4% (engst 3) und 83,2 ± 1,2% (engst 2) der Spermien eine alobildung. Die Werte im verdünnten Sperma wichen nur geringfügig hiervon ab. ei allen drei engsten war im der nteil der Spermien mit alo deutlich geringer. Mittels Wilcoxon-Test waren diese Unterschiede bei engst 1 und 2 statistisch signifikant (Tabelle 4). ei keinem der drei engste bestanden zwischen Nativ- und verdünntem Sperma signifikante Unterschiede. 45
Tabelle 4: Prozentualer nteil der Spermien mit einer alobildung bei den drei engsten des Vorversuchs Nativ- sperma verdünntes Sperma engst 1 (n = 9) 67, ± 11,7 a 62,3 ± 12, b 3,4 ± 18,3 c engst 2 (n = 8) 83,2 ± 1.2 d 81,6 ± 3,8 e 72,7 ± 1,6 f engst 3 (n = 8) 4,2 ± 4,4 42,2 ± 5,7 37,5 ± 3,5 Wilcoxon-Test: a : c, b : c, d : f, e : f p <,5 Prozent 9 8 7 6 5 4 3 Nativsperma Verdünntes Sperma 2 engst 1 engst 2 engst 3 bbildung 4: nteil der Spermien mit alobildung bei der krosinbestimmung mittels elatinolyse bei den drei engsten des Vorversuchs 46
Zur ufdeckung der Zusammenhänge zwischen alobildung und rt des verwendeten Spermas wurde der Spearman sche Rangkorrelationskoeffizient R eingesetzt (Tabelle 5). ei keinem der drei engste bestand ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen nativem und tiefgekühltem Sperma. Die Richtung des Zusammenhangs war zudem nicht einheitlich: bei engst 1 und 2 war der Korrelationskoeffizient positiv, bei engst 3 negativ, so dass aufgrund der vorliegenden Daten keine ussagen hinsichtlich eines Zusammenhangs möglich sind. Tabelle 5: nteil der Spermien mit alobildung bei der krosinbestimmung mittels elatinolyse. Zusammenhänge zwischen unterschiedlich aufbereitetem Sperma bei 3 engsten des Vorversuches, Spearman scher Rangkorrelationskoeffizient Nativsperma/ engst 1 (n = 9) R =,21 engst 2 (n = 8) R =,31 engst 3 (n = 8) R = -,2 Nativsperma/ verdünntes Sperma R =,75 p <,5 R =,51 R =,24 / verdünntes Sperma R =,32 R =,6 R = -,14 4.1.3.2 Messfehleranalyse des alodurchmessers Die folgenden bbildungen zeigen den Verlauf der Fehlerperzentilen für die estimmung des alodurchmessers der drei engste für unterschiedlich aufbereitetes bzw. Nativ-Sperma. Für das native Sperma des engstes 1 (bbildung 5) ist bei der estimmung des alodurchmessers aus nur einer Messung mit einer Wahrscheinlichkeit von 99% (obere Linie) ein Fehler von höchstens 11,5 µm zu erwarten. Mit 5%iger Wahrscheinlichkeit liegt der Fehler unter 2,2 µm (Linie mit ausgefüllten Quadraten) und 47
ein Fehler kleiner als 5 µm kann in etwa 8 von Messungen erwartet werden (Interpolation zwischen den Punkten 75% und 95%). estimmt man den alodurchmesser als Mittelwert aus allen Messungen eines Objektträgers, dann wird der Fehler kleiner. So ist mit einer Wahrscheinlichkeit von 99% ein Fehler kleiner als etwa 9,5 µm und mit einer Wahrscheinlichkeit von 5% ein Fehler kleiner als etwa 1,4 µm zu erwarten, und ein Fehler von 5 µm wird mit rund 9 %iger Wahrscheinlichkeit nicht überschritten. Mit zunehmender nzahl der einbezogenen Messungen gehen die Messfehler weiter zurück. Der Vergleich zwischen den verschiedenen Spermakonditionen des engstes 1 zeigt, dass sich die rössenordnungen der Fehler für natives (bbildung 5), verdünntes (bbildung 6) und tiefgefrorenes Sperma (bbildung 7) nur geringfügig unterscheiden. uch die rössenordnungen der Messfehler des Nativspermas für die engste 2 (bbildung 8) und 3 (bbildung 9) unterscheiden sich nur geringfügig. Für den engst 1 sind dagegen insbesondere im ereich der 95%- und der 99%-Perzentile höhere Fehler festzustellen. 12 8 6 4 2 Fehler bei der estimmung des alodurchmessers (µm)14 J J J J 1 alo 1 Objektträger 2 Objektträger 3 Objektträger...bei estimmung aus... 1% J 5% 25% 75% 95% 99% 5%(Median) bbildung 5: engst 1, Nativsperma. ntwicklung der Messfehler-Perzentilen in bhängigkeit von der nzahl der Messungen 48
22 2 18 16 14 12 8 6 4 2 Fehler bei der estimmung des alodurchmessers (µm)24 1% J 5% 25% 5%(Median) 75% 95% 99% J J J J 1 alo 1 Objektträger 2 Objektträger 3 Objektträger...bei estimmung aus... bbildung 6: engst 1, verdünntes Sperma. ntwicklung der Messfehler-Perzentilen in bhängigkeit von der nzahl der Messungen Fehler bei der estimmung des alodurchmessers (µm) 14 12 8 6 4 2 1% J 5% 25% 5%(Median) 75% 95% 99% J J J J 1 alo 1 Objektträger 2 Objektträger 3 Objektträger...bei estimmung aus... bbildung 7: engst 1,. ntwicklung der Messfehler-Perzentilen in bhängigkeit von der nzahl der Messungen 49
Fehler bei der estimmung des alodurchmessers (µm) 14 12 8 6 4 2 J J J J 1 alo 1 Objektträger 2 Objektträger 3 Objektträger...bei estimmung aus... 1% J 5% 25% 75% 95% 99% 5%(Median) bbildung 8: engst 2, Nativsperma. ntwicklung der Messfehler-Perzentilen in bhängigkeit von der nzahl der Messungen 12 8 6 4 2 Fehler bei der estimmung des alodurchmessers (µm)14 J J J J 1 alo 1 Objektträger 2 Objektträger 3 Objektträger...bei estimmung aus... 1% J 5% 25% 75% 95% 99% 5%(Median) bbildung 9: engst 3, Nativsperma. ntwicklung der Messfehler-Perzentilen in bhängigkeit von der nzahl der Messungen 5
4.1.3.3 alodurchmesser Der alodurchmesser bei der estimmung der krosinaktivität durch elatinolyse betrug zwischen 24,6 ± 3,9 µm (engst 1) und 31,3 ± 3,9 µm (engst 2). ei allen drei engsten fiel der mittlere Durchmesser im verdünnten Sperma geringfügig grösser aus (Tabelle 6). Nach dem Tiefgefrieren waren bei den drei engsten grössere Durchmesser als im Nativsperma zu verzeichnen. egenüber dem verdünnten Sperma waren die Durchmesser bei engst 2 (p <,5) und engst 3 im grösser, während bei engst 1 eine leichte bnahme auftrat (bbildung ). Tabelle 6: alodurchmesser (µm) bei den drei engsten des Vorversuchs Nativ- sperma verdünntes Sperma engst 1 (n = 9) 24,6 ± 3,9 31,6 ± 11, 26, ± 6,5 engst 2 (n = 8) 31,3 ± 3,9 31,4 ± 3,8 a 4,3 ± 7,2 b engst 3 (n = 8) 27,3 ± 3,8 28,4 ± 5,1 31,4 ± 4,4 Wilcoxon-Test: a : b: p <,5 51
µm 5 45 4 35 3 25 Nativsperma Verdünntes Sperma 2 15 5 engst 1 engst 2 engst 3 bbildung : alodurchmesser bei den drei engsten des Vorversuchs Mittels Spearman schem Rangkorrelationskoeffizienten R konnten keine Zusammenhänge zwischen dem alodurchmesser und der rt des verwendeten Spermas nachgewiesen werden, zudem traten Wechsel zwischen positiven und negativen Rangkorrelationskoeffizienten auf (Tabelle 7). Tabelle 7: alodurchmesser bei der krosinbestimmung mittels elatinolyse. Zusammenhänge zwischen unterschiedlich aufbereitetem Sperma bei 3 engsten des Vorversuches, Spearman scher Rangkorrelationskoeffizient Nativsperma/ engst 1 (n = 9) R = -,37 engst 2 (n = 8) R =,3 engst 3 (n = 8) R = -,14 Nativsperma/ verdünntes Sperma R =,41 R =,43 R =,55 / verdünntes Sperma R =,29 R =,43 R = -,9 52
4.2 auptversuch 4.2.1 Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach der Kryokonservierung Im auptversuch wurden 25 jakulate von 13 engsten ausgewertet. ier betrug der mittlere nteil vorwärtsbeweglicher Spermien im Nativsperma 31,6 ±,7%. Nach dem Tiefkühlen zeigten nur noch 19,6 ± 13,6% der Spermien eine Vorwärtsbewegung (Wilcoxon-Test, p <,1). s bestand jedoch kein Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach dem Tiefgefrieren (Spearman scher Rangkorrelationskoeffizient R =,26, p >,5). Tabelle 8: Prozentualer nteil vorwärtsbeweglicher Spermien vor und nach dem Tiefgefrieren bei 25 jakulaten von 13 engsten des auptversuchs Nativsperma auptversuch (n = 25) 28,9 ± 12,7 a 6,7 ± 5, b Wilcoxon-Test: a : b p <,1 4 3 2 nteil vorwärtsbeweglicher Spermien (%)5 31,6 19,6 Nativsperma bbildung 11: Prozentualer nteil vorwärtsbeweglicher Spermien vor und nach dem Tiefgefrieren bei 25 jakulaten von 13 engsten des auptversuchs 53
4.2.2 Mukuspenetrationstest Im Nativsperma betrug die durchschnittliche Penetrationsstrecke 48,5 ± 2,9 mm, im verdünnten Sperma 55,5 ± 19,3 mm (bbildung 12). Durch das Tiefgefrieren kam es gegenüber diesen beiden Werten zu einer statistisch signifikanten Reduzierung auf 35,5 ± 31,9 mm (Wilcoxon-Test, p <,1). Tabelle 9: Penetrationsstrecken (mm) im Mukuspenetrationstest bei 25 jakulaten von 13 engsten des auptversuchs Nativ- sperma Verdünntes Sperma auptversuch (n = 25) 48,5 ± 2,9 a 55,5 ± 19,3 b 35,5± 31,9 c Wilcoxon-Test: a : c, b : c p <,1 8 7 6 mm 5 4 48,5 55,5 3 35,5 2 Nativsperma Verdünntes Sperma bbildung 12: Penetrationsstrecken im Mukuspenetrationstest bei 25 jakulaten von 13 engsten des auptversuchs 54
Zwischen den Penetrationsstrecken im nativen und im zeigte sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang (R =,76, p <,1), d. h. je länger die Penetrationsstrecken vor dem Tiefgefrieren waren, desto länger fielen sie auch nach dem Tiefgefrieren aus (bbildung 13). 8 7 Penetrationsstrecke T (mm) 6 5 4 3 2-25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 Penetrationsstrecke nativ (mm) bbildung 13: Zusammenhang zwischen Penetrationsstrecken des nativen und tiefgefrorenenem (T) Sperma 55
4.2.3 krosinbestimmung mittels elatinolyse 4.2.3.1 Prozentualer nteil der Spermien mit einer alobildung Der prozentuale nteil an Spermien mit einer alobildung fiel im Nativsperma und im verdünnten Sperma nahezu gleich gross aus (bbildung 14). r betrug im Nativsperma durchschnittlich 63,2 ± 19,1%, im verdünnten Sperma 63,8 ± 12,9%. Nach dem Tiefgefrieren war der nteil der Spermien mit alobildung auf 45,3 ± 21,9% abgesunken (Wilcoxon-Test, p <,5). Mit ilfe des Spearman schen Rangkorrelationskoeffizienten liess sich kein Zusammenhang zwischen dem prozentualen nteil der Spermien mit alobildung und der rt des Spermas nachweisen (R =,24, p >,5). 56
Tabelle : Prozentualer nteil der Spermien mit alobildung bei der krosinbestimmung mittels elatinolyse bei 25 jakulaten von 13 engsten des auptversuchs Nativ- sperma Verdünntes Sperma auptversuch (n = 25) 63,2 ± 19,1 a 63,8 ± 12,9 b 45,3 ± 21,9 c Wilcoxon-Test: a : c, b : c p <,5 9 8 7 Prozent 6 5 4 63,2 63,8 45,3 3 2 Nativsperma Verdünntes Sperma bbildung 14: Prozentualer nteil der Spermien mit alobildung bei der krosinbestimmung mittels elatinolyse bei 25 jakulaten von 13 engsten des auptversuchs 57
4.2.3.2 alodurchmesser Der alodurchmesser betrug bei Spermien aus dem Nativsperma im Mittel 27,6 ± 4,6 µm, im verdünnten Sperma 3,5 ± 7,4µm (bbildung 15). Im zeigte sich ein geringfügig höherer Durchmesser von durchschnittlich 31,9 ± 8,5µm. Der Unterschied zwischen dem mittleren Durchmesser im Tiefgefrierund im Nativsperma war statistisch signifikant (Wilxocon-Test, p <,5). Zusammenhänge zwischen dem mittleren alodurchmesser bei unterschiedlicher Spermaaufbereitung bzw. Nativsperma konnten nicht nachgewiesen werden (Spearman scher Rangkorrelationskoeffizient R =,27, p >,5). 58
Tabelle 11: alodurchmesser (µm) bei der krosinbestimmung durch elatinolyse bei 25 jakulaten von13 engsten des auptversuchs Nativ- sperma Verdünntes Sperma auptversuch (n = 25) 27,6 ± 4,6 a 3,5 ± 7,4 31,9 ± 8,5 b Wilcoxon-Test: a : b, p <,5 5 45 4 35 µm 3 25 27,6 3,5 31,9 2 15 5 Nativsperma Verdünntes Sperma bbildung 15: alodurchmesser (µm) bei der krosinbestimmung durch elatinolyse bei 25 jakulaten von13 engsten des auptversuchs 59
4.3 Statistische nalyse der Zusammenhänge zwischen Vorwärtsbeweglichkeit und Parametern des Mukuspenetrationstests bzw. der krosinbestimmung mittels elatinolyse bei Nativ- und s bestand ein statistisch signifikanter und direkter Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit und dem nteil der Spermien mit alobildung für (R =,73, p <,1). uch für natives Sperma war dieser Zusammenhang vorhanden (R =,47, p =,67), allerdings war hier die Schwelle zur statistischen Signifikanz nicht ganz erreicht. Für war zudem ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit und der Penetrationsstrecke gegeben (R =,84, p <,1). in solcher Zusammenhang war für natives Sperma nicht nachzuweisen (Tabelle 12). Tabelle 12: Nativsperma Statistische nalyse der Zusammenhänge zwischen Vorwärtsbeweglichkeit und Parametern des Mukuspenetrationstests bzw. der krosinbestimmung mittels elatinolyse bei Nativ- und Variablenpaar n R p % vorwärtsbewegliche Spermien/ % Spermien mit alobildung 16,47 % vorwärtsbewegliche Spermien/ 16 -,4 n.s. alodurchmesser % vorwärtsbewegliche Spermien/ 16,17 n.s. Penetrationsstrecke % vorwärtsbewegliche Spermien/ 16,73 <,1 % Spermien mit alobildung % vorwärtsbewegliche Spermien/ 16,4 n.s. alodurchmesser % vorwärtsbewegliche Spermien/ Penetrationsstrecke 16,84 p <,1 6