F-I Molekulare Zoologie: Teil II: Expressionsanalysen Proteinexpressionsanalyse mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western Blot Analyse Inhalt: Seite I. Allgemeines 1 II. Durchführung der Elektrophorese 3 III. Western Blot Analyse 7 I. Allgemeines: Die Elektrophorese ist eine elektrokinetische Methode, um geladene Teilchen, z.b. Protein- oder Nukleinsäuregemische, unter Anlegen eines elektrischen Feldes im ionisierenden Milieu zu trennen. Die Bewegung der Teilchen wird beeinflusst u.a. von der Ladung der Teilchen, vom elektrischen Feld, von der Temperatur, von der Viskosität der Flüssigkeit und von der Teilchengröße. Erste Elektrophoresen wurden in U-Rohren durchgeführt. Nachteile dieser Methode waren unscharfe Banden und hohe Diffusion durch Konvektion. Die getrennten Proteine mussten abpipettiert werden. Um dies zu umgehen, führte man die Elektrophorese auf Trägermaterialien durch, wie man sie aus der Chromatographie kannte, z.b. Papier, Kieselgel, Kieselgur uam. Celluloseacetatstreifen wurden auch verwendet. Heute werden meist Gele verwendet, bei denen sich das ionisierende Milieu sich in dem Maschenwerk der jeweiligen Makromoleküle befindet. Die getrennten Substanzen lassen sich leicht zu weiteren Untersuchungen verwenden. Einen besonders wichtigen Platz nimmt die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) ein, die den Nachweis der Reinheit von Proteinen und Nukleinsäuren zuläßt. Auch Proteinmuster sowie Oligonukleotidsequenzen können untersucht werden. Aufgrund der definierbaren Porengröße lassen sich auch Molekulargewichte näherungsweise bestimmen. Die Elektrophorese von Proteinen auf Polyacrylamidgelen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (= Sodium-Dodecyl-Sulfate = SDS) ist eine einfache, schnelle und empfindliche Methode zur Analyse von Proteinen, zur Bestimmung ihres Molekulargewichts und zur Vorbereitung ihrer weiteren Charakterisierung (z.b. durch spezielle Färbetechniken, zum Nachweis radioaktiver Markierung durch Autoradiographie zum Nachweis der Antigenizität oder von Lektinbindungseigenschaften nach Elektrotransfer (Blottechniken) auf Membranen). Entsprechend den unterschiedlichen Anforderungen an die SDS-PAGE existieren verschiedene Modifikationen dieser Methode. Infolge der geringen Materialmengen, die für die SDS-PAGE benötigt werden, kann diese Methode zur Analyse von Proteinextrakten aus sehr kleinen Gewebeproben eingesetzt werden. Die Trennung der Proteine und die Molekulargewichtsbestimmung erfolgt auf Platten- (Slab-)Gelen mit einer einheitlichen Acrylamidkonzentration von 12%. Es wird das diskontinuierliche System nach Laemmli (1970) verwendet. 1
Zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen wird parallel zu den Proben eine Mischung von Proteinen mit bekannter molekularer Masse (M r ) elektrophoretisch getrennt. Die Eichkurven (log M r zur Laufstrecke der einzelnen Proteinbanden) sind über einen weiten M r -Bereich linear. Bei der SDS-PAGE werden die Proteine denaturiert. Durch Zusatz von 2-Mercaptoethanol werden die Disulfidbrücken zwischen den Peptidketten eines Proteins bzw. innerhalb einer Peptidkette reduziert, so dass die Quartär- bzw. Tertiärstruktur aufbricht. An die gestreckten Peptidketten lagern sich entsprechend ihrer Länge SDS-Moleküle an, so dass die Proteine insgesamt negativ geladen werden. Die Gesamtladung des Proteins ist annähernd proportional zur molekularen Masse der Peptidkette. Die negativ geladenen Proteine wandern im elektrischen Feld gemäß ihrem relativen Molekulargewicht zur Anode (unten). Sie gelangen um so schneller durch die Maschen des Gels je kleiner sie sind. Vergleiche zwischen dem tatsächlichen Mr eines Proteins (ermittelt z.b. durch Aminosäuresequenz) und dem nach SDS-PAGE erhaltenen Wert zeigen, dass bei einer Reihe von Proteinen die Molekulargewichtsbestimmung durch SDS-PAGE abweichende Werte ergibt. Die Differenzen können darauf beruhen, dass bei basischen Proteinen nicht alle Ladungen durch SDS- Moleküle kompensiert werden, dass bei hydrophoben Proteinen überdurchschnittlich viel SDS gebunden wird oder dass die Proteine glykosyliert sind. Eichproteine müssen in jedem Lauf mitgetrennt werden, nicht nur, wenn eine Eichgerade erstellt werden soll. Nur die Eichproteine geben eine Kontrolle über den korrekten Lauf und die Qualität der Elektrophorese. Proteinmuster einer SDS-PAGE ohne Bezug zu Eichproteinbanden sind nahezu wertlos. Polyacrylamid-Polymerisation: 2
II. Durchführung der Elektrophorese (Mini-PROTEAN 3 Cell, BIO-RAD) 3
Lösungen: Modifizierter RIPA-Puffer: 10 mm TRIS-HCl (ph 7,4) 1 mm CaCl 2 0,5% (v/v) NP-40 0,5% (v/v) Desoxycholinsäure 0,1% (w/v) SDS 150 mm NaCl 10 mm NaF 20 mm β-glycerophasphat In H 2 O Rotiphorese Gel 30 (acrylamide-bisacrylamide solution (37,5:1) Trenngelpuffer: Sammelgelpuffer: Probenpuffer: 1,5 M TRIS 0,8% SDS 0,4% NaN 3, ph 8,0 0,5 M TRIS 0,4% SDS, ph 6,8 125 mm TRIS 4% SDS 20% Glycerol 10% ß-Mercaptoethanol 2 mm EDTA 0,04% Bromphenol Blau in H 2 O, ph 6,8 (mit HCl) Ammoniumpersulfat: 10% (Polymerisationsstarter) TEMED 100% (N,N,N`,N`,-Tetramethylethylendiamin) (Polymerisationskatalysator) Elektrodenpuffer: Trenngel (12%): Sammelgel (6%) 250 mm TRIS 1,92 M Glycin, ph 8,4 1% SDS 1600 µl Acrylamid-Bisacrylamid-Lsg 1000 µl Trenngelpuffer 1377 µl H 2 O 400 µl Acrylamid-Bisacrylamid-Lsg 500 µl Sammelgelpuffer 1088 µl H 2 O Gießen der Gele: Die Platten müssen vor der Benutzung mit Ethanol gesäubert werden. Eine Spacerplatte und eine kleine Platte werden aufeinander gelegt, so dass die Ränder sich decken und in das Gießgestell eingespannt. Die kleine Platte zeigt nach vorne. TEMED und APS unmittelbar vor dem Gießen zugeben! 4
Trenngel: Trenngel (ca 2 ml) blasenfrei bis unter den Gestellrand einfüllen, mit 200 µl Isopropanol überschichten (verhindert das Antrocknen des oberen Randes). Polymerisation bei 55-60 C, ca. 15-30 Min. Sammelgel: Isopropanol abgießen, abspülen und trocknen. Kamm zur Hälfte einstecken und Sammelgel bis zum Rand einfüllen, den Kamm ganz einstecken. Polymerisation bei 55-60 C für ca. 15 Min. Probenvorbereitung Das zu untersuchende Gewebe wird frisch aus dem Organismus entnommen oder liegt tiefgefroren in Eppis vor. Das Gewebe wird mit 0,5 ml mod. RIPA-Puffer versetzt und mit einem Pistill homogenisiert. Nach kurzer Zentrifugation wird der Überstand abpipettiert. Eine Proteinbestimmung zeigt, wie konzentriert die Proteine in dem Puffer vorliegen. Ein Aliquot des Überstandes wird mit dem Probenpuffer 1:1 vermischt, auf 90 C aufgeheizt, zentrifugiert und aufgetragen. Um sicher zu gehen, dass keine festen Proteine aufgetragen werden (sie verhindern klare Banden), werden 20 µl Probenvolumen angesetzt und 15 µl davon in die Geltaschen pipettiert. Richtwert: 30-40 µg Protein in 15 µl pro Geltasche. (Hier 10µg). Vor dem Pipettieren ist es ratsam ein Auftragsschema zu erstellen bei dem berücksichtigt wird, dass im Anschluss an die Elektrophorese Immunoblotting-Techniken durchgeführt werden, d.h.: Gewebeextrakte, die später auf dem Blot mit gleichen Antikörpern inkubiert werden, sollen im Gel nebeneinander aufgetragen werden. Zwischen Proben, die später mit unterschiedlichen Antikörpern behandelt werden soll im Gel eine Spur frei bleiben. Noch fragen? -Bitte an uns wenden- Auftragen: Die Gelkassetten werden beschriftet und mit der kleinen Platte nach innen in die Kammer eingespannt. Die Wanne wird mit Elektrodenpuffer ca. 5 cm hoch beschickt. Der Innenraum wird ganz gefüllt. Die Taschen im Gel werden markiert, der Kamm kann dann herausgezogen werden. In die linke Spur wird die Lösung mit den Eichproteinen gefüllt, die anderen Spuren dienen den Proben (Reihenfolge protokollieren!). 5
Proteinmarker I 12 % SDS-PAGE Elektrophorese: Nach dem Schließen wird die Kammer mit dem Spannungsgeber (BIO-RAD Power-Pac 300) verbunden. Es wird eine konstante Spannung von zunächst 100 Volt, bis die Laufmittelfront das Sammelgel passiert hat, dann (im Trenngel) von 200 Volt angelegt. Mit dem Startsignal beginnt die Elektrophorese. Die Entwicklung dauert bis die Farbmarkierung das untere Ende des Gels erreicht hat. Nachweis der Proteine (Coomassie-Färbung, Western-Blot (s.u.)) Coomassie-Färbung: Rotiphorese-Lsg, Färbung bei Raumtemperatur, (oder: 0,2% Serva Blue R in 50% Methanol +10% Essigsäure, 15 Min bei 40 C), Entfärbe-Lsg.: 25% Methanol + 10% Essigsäure Wird im Anschluss an die Elektrophorese ein Western-Blot durchgeführt, findet die Coomassie- Färbung erst nach dem Blotten statt! Die Gelkassetten werden aus der Kammer entfernt und die Platten voneinander getrennt. Das Gel wird in die Schale mit der Färbelösung überführt und für ca. 30 Min. auf den Schüttler (langsam) gestellt. Danach wird 2 x 30 Min. in der Entfärbelösung der überschüssige Farbstoff ausgewaschen. Literatur: Laemmli UK (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685. 6
III. Western-Blot Analyse Beim Western-Blot werden elektrophoretisch getrennte Proteine durch das Anlegen eines elektrischen Feldes aus dem Gel auf eine Membran übertragen. Der Nachweis der gewünschten Proteine erfolgt (neben der direkten Färbung) durch Inkubation mit spezifischen Antikörpern, deren Bindung anschließend durch ein geeignetes Nachweissystem sichtbar gemacht wird. Antikörper können auf diese Weise auf ihre Eignung überprüft werden. Die Bezeichnung Western -Blot ist ein Wortspiel. Die Übertragung von DNA bzw DNA- Fragmenten auf Nitrozellulosemembran wurde nach ihrem Erfinder als Southern-Blot bezeichnet. Entsprechende Methoden RNA oder Proteine zu übertragen wurden danach als Northern-Blot oder Western-Blot bezeichnet. Durchführung des Blot (Trans-Blot SD, BIO-RAD) (Semi-Dry Blotapparatur) 1 = Filterpapier 2 = Membran 3 = Gel 7
Lösungen: Blotting-Puffer: 25 mm Tris 200 mm Glycin 0,66 mm CaCl 2 0,01% SDS 20% Methanol Waschpuffer (Tween 20-WB): 0,05% Tween 10 mm Tris 150 mm NaCl 1 mm CaCl 2, ph 7,4 Blockierungslösung I: 5% Non Fat Dry Milk 10 mm Tris-HCl 150 mm NaCl 1 mm CaCl 2 0,04% NaN 3, ph 7,4 Blockierungslösung II: 5g Boehringer Blocking Reagenz 1,21 g Tris 6,78 g NaCl 4 ml 10% NaN 3 aufkochen, abkühlen lassen, in einem Liter, ph 7,4 Äquilibrierungslösung: 100 mm TRIS HCl ph 9,6 50 mm MgCl 2 100 mm NaCl 2 Vor dem Blotten wird das Gel für 5 Minuten in MetOH-haltigen Blotting Puffer eingelegt. Ein Membranstück von der Größe des Gels wird für 1 Min. in eine Petrischale mit Methanol eingelegt (Schüttler), danach für 10 Min. in Blotting-Puffer. Die Grundplatte des Trans-Blot wird angefeuchtet. Vier Lagen mit Blotting-Puffer getränktes Filterpapier werden blasenfrei auf die Grundplatte aufgebracht. Die Membran wird auf das Filterpapier gelegt und darauf das Gel ebenfalls blasenfrei. Das Ganze wird mit vier Lagen puffergetränktem Filterpapier bedeckt, der Deckel aufgelegt und mit der Stromquelle (BIO-RAD Power Pac 200) verbunden. Geblottet wird bei 10 Volt konstant (entspricht 3 ma/cm 2 ) für 45 Min. Bevor man das Gel von der Membran abhebt, sollte man die Lage der Spuren markieren. Die Proteinleiter und das Gel werden mit Coomassie gefärbt, um die Banden zuzuordnen und um die Übertragung der Proteine auf die Membran zu kontrollieren. 8
Coomassie-Färbung: Das Gel wird in die Schale mit der Färbelösung überführt und für ca. 30 Min. auf den Schüttler (langsam) gestellt. Die Proteinleiter wird von der übrigen Membran abgetrennt und für ca. 2 min gefärbt. Danach wird 2 x 30 Min. in der Entfärbelösung der überschüssige Farbstoff ausgewaschen. Antikörperbindung und Nachweis: Die zu untersuchenden Membranstreifen werden ausgeschnitten und den folgenden Reaktionen zugeführt: Blockieren: Je 1 Stunde in Blockierungslösung I und II. Antikörperbindung des primären Antikörpers: AK α-tubulin (monoclonal, Klon DM 1A) aus Maus 1:1000 AK α-aktin (monoclonal, 4A) aus Maus 1:2000 Waschen: 3x 10 Min im Waschpuffer Sekundärer Antikörper (Anti-Maus IgG)-Alkalische Phosphatase-Konjugat: AM-AP-Konjugat in 10 ml Blockierungs-Lsg II, 1:25.000, 1-2 Stunden. Waschen: 3 x 10 Min im Waschpuffer 2 Min in Äquilibrierungs-Lsg. Färbung: 100 µl 3% NBT (Nitrotetrazoliumblauchlorid) in 75% Dimethylformamid, 75 µl 2% BCIP (6-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidinsalz) in 100% Dimethylformamid, 10 ml Äquilibierungslösung bis zu 30 Minuten im Dunkeln. Sobald die Banden gut sichtbar sind, wird mit Wasser gewaschen. Danach werden die Membranstreifen zwischen Filterpapier getrocknet und können so aufbewahrt werden. 9