VERSUCH II: REINIGUNG EINES REKOMBINANTEN PROTEINS AUS ESCHERICHIA COLI Literatur: Einschlägige Biochemie und Genetik Lehrbücher. Sambrook and Russel: Molecular Cloning, 3rd Edition (2001) Prinzip: In dieser Versuchseinheit soll ein in E. coli exprimiertes rekombinantes Protein biochemisch gereinigt werden. Bei dem Protein handelt es sich um den hitzestabilen Inhibitor (PKI) der camp abhängigen Proteinkinase. PKI ist 75 Aminosäuren groß und besitzt eine molare Masse von 7829 Dalton. Das Protein besitzt zwei Domänen, von denen die erste mit hoher Affinität die katalytische 4402,EcoRV 4161,ApaI 3954,MluI 4593,NarI tac promotor laciq 2924,AlwNI pgex-gst-pki 5255 bps AMPr GST BalI,463 PKI PstI,2204 ScaI,829 BamHI,930 SmaI,935 XmaI,935 EcoRI,961 NdeI,966 ScaI,1967 PstI,1191 AatII,1527 1223 NcoI AccI SalI XhoI Ecl136 SacI HindIII 1243 Untereinheit der Proteinkinase bindet (K i = 0,2 nm), während die zweite Domäne ein Kernexportsignal enthält. Dadurch kann PKI vermutlich den Transport der katalytischen Untereinheit aus dem Zellkern beschleunigen und indirekt eine durch camp-vermittelte Erhöhung der Transkriptionsrate regulieren. Bevor man das rekombinante Protein reinigen kann, muß es in ausreichender Menge in E. coli rekombinant exprimiert werden. Dies kann aus Zeitgründen nicht im Rahmen dieser Versuchseinheit durchgeführt werden, dennoch gehört die Theorie essentiell zum Verständnis des Gesamtversuches. Abb.1: Plasmid zur kontrollierten Expression rekombinanten PKI-Proteins (pgex-pki). 1
Das Protein kann in E. coli exprimiert werden, indem man einen sogenannten Expressionsvektor kloniert, dann einen geeigneten E. coli Wirtsstamm mit diesem Plasmid transformiert und die Zellen in Submerskultur kultiviert. Oft werden dazu Expressionskassetten verwendet, bei denen die Expression des gewünschten Proteins unter die Regulation eines Promotors gestellt wird, so dass die Proteinexpression durch Zugabe eines Induktors reguliert werden kann. Zur Expression des PKI wurde daher der durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) induzierbare tac Promotor vor das Gen des PKI kloniert. Der Vektor (pgex-kg) besitzt außerdem ein laci q Gen. Das LacI q Genprodukt ist ein Repressorprotein, das an die Operator-Region des tac Promotors bindet, bis die Zugabe von IPTG das Abdissoziieren des Repressors bewirkt, was wiederum die m-rna Synthese des Zielgens startet. Zwischen dem tac Promotor und dem PKI-Gen ist außerdem im gleichen Leserahmen wie das PKI-Gen- das Gen kloniert, welches für das Protein Glutathion S-Transferase (GST) aus Schistosoma japonicum kodiert. GSTs sind eine Klasse von Proteinen, die unter Umsatz von Glutathion (γ-glutamyl-cysteinylglycerin) toxische Moleküle durch Bildung von Mercaptosäuren inaktivieren. Durch m-rna Synthese und anschließende Translation entsteht ein Fusionsprotein aus GST und PKI in der Bakterienzelle. Man kann sich nun die Affinität des GST-Proteins zu seinem Substrat Glutathion zur Reinigung des Zielproteins zu Nutze machen. Abb.2: Struktur des immobilisierten Glutathions, gebunden an Agarose-Matrix. Die Struktur des Glutathions ist komplementär zu dessen Bindungsstelle in der Glutathion-S-Transferase (entnommen aus: GST-Gene Fusion System Handbook, Amersham Biosciences). 2
Affinitätschomatographie mit einer Agarose-Matrix, an der Glutathion kovalent immobilisiert wurde, führt zu einer Bindung des GST-Fusionsproteins an diese Matrix. Anschließend kann man das Protein durch Zugabe von freiem reduziertem Glutathion zum Elutionspuffer von der Säulenmatrix eluieren. Der Expressionsvektor ist außerdem so konstruiert, dass man durch Zugabe der Protease Thrombin das Zielprotein PKI von dem GST-Anteil abspalten könnte, was in diesem Versuch allerdings nicht durchgeführt wird. Die Expression des rekombinanten Proteins in E. coli funktioniert nach folgendem Schema: 1. Klonierung des Expressionsvektors pgex-pki (zur Theorie: siehe Literatur, z.b. Sambrook and Russel, 2001). 2. Transformation von E. coli Wirtsstamm [BL21 (DE3)], hier durch Elektroporation. 3. Animpfen einer 10 ml Vorkultur LB-Medium, das 100µg/ml Ampicillin enthält, mit einer Einzelkolonie, über Nacht bei 37 C und 225 rpm anwachsen lassen. 4. Morgens die Vorkultur in 1L Hauptkultur LB-Medium geben, das 100µg/ml Ampicillin enthält. (Jede Gruppe erhält zur Reinigung des PKI-Proteins etwa 1/3 dieser Kultur zur Versuchsdurchführung.) 5. Das Anwachsen der Kultur durch Bestimmung der Optischen Dichte (OD 600 ) in regelmäßigen Zeitintervallen verfolgen, bis eine OD 600 von 0,5-0,7 erreicht ist. 6. Zugabe von IPTG (0,4 mm Endkonzentration), aus 1000fach konzentrierter Stammlösung zur Induktion der Proteinexpression. 7. Ernte der Zellen nach 4h Induktion (auch kürzere/längere Induktion möglich) durch Zentrifugation bei 3000 xg für 15 min bei 4 C. 8. Resuspension des Pellets in etwas Medium, in 50 ml Falkonröhrchen überführen, nochmals pelletieren bei 2500 xg 15 min bei 4 C. Lagerung bei -20 C bis -80 C. 3
Arbeitsanleitung erster Versuchstag : 1.) Reinigung von GST-PKI Das Zellpellet von 1L Bakterienkultur wird mit ca. 15 ml kaltem Lysepuffer versetzt und langsam unter Schütteln aufgetaut. Eventuelle Zellklumpen werden dann mit Hilfe eines Potter-Homogenisators entfernt. Der Aufschluss der Zellen erfolgt mit Hilfe einer French Pressure Cell ( French Press ). Zum Aufschluss mit der French Press werden die aufgetauten Zellen in Lysepuffer (etwa 20 ml) zunächst in ein Eisbad gestellt. Der Aufschluss mit der French Pressure Cell (jeweils 2-3 Durchläufe) wird als Demonstrationsversuch durchgeführt. {20µl Probe für SDS-Gel (Polyacrylamid-Elektrophorese) entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Gesamtzelllysat} Der zellfreie Überstand wird dann durch Zentrifugation bei 10000 xg, 15 min bei 4 C im SS34-Rotor gewonnen. Der Überstand (sollte bräunlich-opaque sein) wird dann vorsichtig in ein 50 ml Falkonröhrchen überführt, ohne dass Teile des Pellets mit überführt werden. An dieser Stelle erhalten die einzelnen Gruppen etwa 1/3 (ca. 7 ml) des Aufschlusses zur weiteren Reinigung in einem 15 ml Falkonröhrchen. {20µl Probe für SDS-Gel entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Zellfreier Überstand} Anschließend werden zu dem zellfreien Überstand 250 µl 1:1 Suspension GST-Agarose zugegeben, die zuvor in Lysepuffer äquilibriert wurde. Das Falkonröhrchen wird dann mit Lysepuffer aufgefüllt. Der Ansatz wird über Nacht bei 4 C mit Hilfe eines über-kopf-rollers inkubiert. Das Pellet wird im Ausgangsvolumen (20ml) Lysepuffer resuspendiert und nach der Probennahme verworfen. {20µl Probe für SDS-Gel entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Pellet} 4
2.) Herstellung einer Eichkurve zur Proteinbestimmung mit Hilfe des Bradfordreagenz Nach Untersuchungen von BRADFORD führt die Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blau G250 an Proteine in saurer Lösung zu einer erheblichen bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm nach 595 nm. Die Extinktion bei 595 nm ist der Proteinkonzentration proportional. Die Vorteile der Bradford-Methode sind Praktikabilität, Schnelligkeit und geringe Störanfälligkeit. Es wird nur ein einziges Reagenz benötigt, und die maximale Extinktion wird nach 5-15 min erreicht. Störfaktoren sind vor allem Detergenzien wie Triton X-100 oder SDS. Proteinbestimmung nach BRADFORD: Protein-Standardlösung: Rinderserumalbumin (BSA): 10 mg/ml Stocklösung; davon wurden 10 µl in 4 ml Aqua bidest verdünnt (1:400). Küvette Nr. 1 2 3 4 5 6 7 Bidest 800µl - 400µl 600µl 700µl 750µl 775µl BSA (1:400) - 800µl 400µl 200µl 100µl 50µl 25µl Bradford- 200µl 200µl 200µl 200µl 200µl 200µl 200µl Reagenz [2] [Protein µg] 0 20 10 5 2,5 1,25 0,625 OD 595 Die 1 ml Einwegküvetten mit Parafilm verschließen, durch umdrehen mischen, 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Extinktion bei 595 nm gegen Ansatz Nr.1 (Küvette Nr.1) als Referenz vermessen. Auswertung: Durch Auftrag der OD 595 -Werte gegen die Proteinmenge, ergibt sich eine Punkteverteilung, durch die eine Gerade gelegt werden soll. Anhand dieser Eichgeraden soll die Bestimmung der Proteinkonzentration des gereinigten GST-PKI Proteins am zweiten Versuchstag erfolgen. Bradford-Reagenz, 4-fach konz.: 0,04% (w/v) Coomassie Brilliant Blau G250 20% (v/v) Ethanol 95% 40% Orthophosphorige Säure ad 100% H 2 0 Aqua bidest 5
Arbeitsanleitung zweiter Versuchstag: 1.) Fortsetzung der Reinigung von GST-PKI Zunächst wird das 50 ml Falkonröhrchen bei 500xg für 5 min auf Eis stehen gelassen, damit sich die Agarosematrix am Boden absetzt. Dann wird der Überstand (in Gegenwart eines Betreuers) vorsichtig in ein weiteres 50 ml Falkonröhrchen überführt {20µl Probe für SDS- Gel entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Säulendurchlauf}. Die Agarosematrix wird dann mit Hilfe einer 1 ml Pipette in eine Mobicol-Säule (800µl maximales Aufnahmevolumen) überführt. Dazu lässt man beim Überführen des Überstandes etwas (~ 400µl) über der Agarose stehen, oder gibt gegebenenfalls noch etwas Lysepuffer zu der Agarosematrix, mischt vorsichtig mit der Pipette, und überführt alles in das Mobicol-Säule. Nun kann der Schraubverschluss mit Luer- Adapter aufgeschraubt werden. In dem Säulchen befindet sich unten ein kleiner Filter (small filter), der eine Porengröße von 35 µm besitzt. Dann entfernt man den Stopfen am unteren Ende, setzt die Säule in ein 2 ml Eppendorfgefäß und lässt die Säule etwa 10 min stehen, so dass sich die Agarose absetzt. Die Säule sollte langsam anfangen zu tropfen. Abb. 3: Aufbau der Mobicol-Säule. Wenn die Flüssigkeit vollständig aus der Säule gelaufen ist, wird etwa mit dem 10-fachen Säulenvolumen (1,25 ml) Lysepuffer gewaschen, indem 5 x 250 µl des Puffers auf die Säulenmatrix gegeben werden. Der Durchlauf der Säule wird in jeweils einem Eppendorfgefäß aufgefangen. Nach dem Waschen können die wird von der ersten und der letzten Waschfraktion eine Probe genommen. {20µl Probe für SDS-Gel entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Säulenwasch 1, Säulenwasch 5}. Danach erfolgt die Elution mit dem 4-fachen Säulenvolumen Elutionspuffer (4x150 µl). Es werden vier 150µl Fraktionen aufgefangen, die anschließend durch einen BRADFORD- Schnelltest auf ihren groben Proteingehalt hin untersucht werden. Dazu werden 6 Tropfen mit jeweils 20 µl einfach konzentrierter Bradfordlösung auf einen Streifen Parafilm pipettiert, der auf ein weißes Blatt Papier gelegt wird. In den ersten Tropfen gibt man 2 µl Aqua bidest, 6
in den zweiten Tropfen 2 µl Elutionspuffer, und in die restlichen vier jeweils 2 µl der aufgefangenen Elutionsfraktionen. Die Elutionsfraktionen, die sich blau verfärben, werden vereinigt, und sofort auf einer mit Gelfiltrationspuffer equilibrierte NAP5 (maximales Ladevolumen 0,5 ml) Gelfiltrationssäule einem Puffertausch unterzogen, um das Glutathion aus der Proteinreinigung zu entfernen. Zunächst öffnet man dazu den Stopfen der NAP5 -Säule und stellt sie in ein geeignetes Gestell, so dass sie unten auslaufen kann, und man gegebenenfalls Fraktionen aufsammeln kann. Dann equilibriert man die Säule mit insgesamt drei Säulenvolumen (füllt die Säule drei Mal bis oben hin) Gelfiltrationspuffer. Dann gibt man die vereinigten Proben auf die Säule und lässt sie in die Säule einlaufen. Anschließend wird mit soviel Gelfilrationspuffer aufgefüllt wie zur maximalen Beladung notwendig ist (Beispiel: es werden auf eine Nap5-Säule 2 Fraktionen mit jeweils 150 µl Probenvolumen aufgetragen, dann müssen noch 200µl Gelfiltrationspuffer nach dem Einlaufen auf die Säule pipettiert werden). Eluiert wird mit Gelfiltrationspuffer, und zwar mit insgesamt 1 ml (2x500µl Fraktionen) im von der NAP5-Säule. {von den Elutionen 20µl Probe für SDS-Gel entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Elution 1, Elution 2}. Um die Effizienz der Elution zu überprüfen, wird auch von der GST-Agarose soll ein Aliquot auf ein SDS-Gel aufgetragen. Dazu werden 150 µl Lysepuffer zu der Agarose gegeben, gemischt und dann die Probe entnommen {20µl Probe für SDS-Gel entnehmen, mit 20µl 2x Probenpuffer versetzen Säule} Lysepuffer (1xPBS): SDS-Probenpuffer: Elutionspuffer: 140 mm NaCl 2,7 mm KCl 1,8 mm KH 2 PO 4 10 mm Na 2 HPO 4 ph 7.3 2% SDS 60 mm Tris-Base 20% Glycerin 0,02% (w/v) Bromphenolblau 20 mm DTT 50 mm Tris-HCl 10 mm reduziertes Glutathion ph 8 (Glutathion zuvor mit NaOH auf etwa ph 7-8 eingestellt) 7
Gelfiltrationspuffer: 20 mm MOPS 150 mm NaCl 2 mm β-mercaptoethanol ph7 2.) SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Die SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese wird zur Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht verwendet. Grundlage der Methode ist die Bindung des Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) an die Proteine, die dadurch denaturiert werden, und Protein- Protein-Wechselwirkungen unterbindet. Im Überschuss SDS binden etwa 1,4 g des Detergenz pro g Protein. Bei der Elektrophorese wandern die negativ geladenen SDS-Protein-Komplexe im elektrischen Feld zur Anode. Die poröse, puffergetränkte Polyacrylamidmatrix des Gels hat dabei den Effekt eines Molekularsiebes und trennt daher die SDS-Protein-Komplexe entsprechend ihres Molekulargewichtes auf. Elektrophoretische Wanderung [cm] ~ 1/log Molmasse In diesem Labor wird vorwiegend das Lämmli-System mit Tris-Glycin Puffern (Lämmli U.K., Nature 227: 689, 1970) verwendet. Prinzipiell durchlaufen die Proben bei beiden Systemen zunächst ein großporiges Sammelgel (3-5% Acrylamid) bevor sie im höherprozentigen Trenngel (7-18% Acrylamid) aufgetrennt werden, daher bezeichnet man diese Art Gele als diskontinuierlich. Aus Zeitgründen wird jeder Gruppe ein fertig gegossenenes 12%iges SDS-Gel zur Verfügung gestellt. Das Gelsystem ist ein Minigelsystem von Biorad. Zunächst werden die Gele in ihren Halterungen an das Gelsystem geklemmt (jeweils 2 pro Gelkammer) und Kathodenpuffer (innen) bzw. Anodenpuffer (außen) eingefüllt. Zur Vorbereitung der Proben aus der Proteinreinigung, werden diese für 5 min bei 95 C in einem Heizblock gekocht, und dann für 1 min bei 13000 rpm in einer Eppendorf- Tischzentrifuge zentrifugiert. Man trägt jeweils 10µl davon mit einer Mikroliterspritze auf das SDS-Gel auf (von den Betreuern einweisen lassen). Außerdem werden 5µl eines Molekulargewichtsstandards aufgetragen. Bitte protokollieren Sie sehr genau, in welche Bahn Sie welche Probe aufgetragen haben. Man kann sich an der Reihenfolge der gesammelten Proben während der Reinigung halten. Die Gele werden an ein Spannungsgerät angeschlossen und für 120 min bei 30 ma pro Gel, also 60 ma in der Doppelelektrophoresekammer (200 Volt, 12 Watt), laufen gelassen. Nach 8
dem Gellauf (etwa 1,5 h, Farbfront beachten!) wird das Gel in Coomassie-Färbebad (0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blau G250, 6% (w/v) Ammoniumsulfat, 1,7% (v/v) Phosphorsäure 85%ig) über Nacht angefärbt. Anschließend wird das Gel mit Aqua bidest über Nacht entfärbt. Ihr SDS-Gel wird im Versuch V (MS) weiter untersucht. Wir bitten daher die Studenten einen Tag nach Beendigung des Versuches nochmals zum Fotografieren und zur Auswertung der Gelbanden in das Labor zu kommen. 3.) Bestimmung der Proteinkonzentration des gereinigten GST-PKI-proteins Zur weiteren Verwendung der GST-PKI in den Großversuchen III und IV ist es notwendig, die Proteinkonzentration der Eluatfraktionen zu bestimmen. Die am ersten Tag dieses Versuches erstellte BSA-Eichgerade für das BRADFORD-Reagenz wird dazu verwendet. Es werden in Doppelbestimmung jeweils 5µl der Elutionsfraktionen von der NAP5-Säule mit 195µl Aqua bidest verdünnt, mit 600µl Aqua bidest aufgefüllt und 200µl BRADFORD- Reagenz dazugegeben. Als Referenz werden 800µl Aqua bidest mit 200µl BRADFORD- Reagenz gleich behandelt. Dann lässt man den Ansatz für 10 min stehen, und vermisst die OD 595 der Proben gegen die Referenz in 1 ml Einwegküvetten. Das gereinigte GST-PKI Protein wird bis zur weiteren Charakterisierung bei -20 C aufbewahrt. Wichtig: Bitte beschriften Sie das fertige Produkt (GST-PKI) mit ihrer Gruppennummer, der ermittelten Proteinkonzentration und dem Datum. Zur Vorbereitung auf den Versuch informieren Sie sich bitte genauestens in der Literatur über die theoretischen Grundlagen der heterologen Proteinexpression in E.coli, sowie der Proteinreinigungsschritte, wie sie in diesem Versuch Anwendung finden. Informieren sie sich über andere Arten der Affinitätschomatographie. Informieren Sie sich über Alternativen zur Proteinexpression in E.coli, sowie ihre Vorund Nachteile. Lesen Sie bitte das Script genauestens durch. Bitte fertigen Sie in Ihrem Protokollheft eine kurze, maximal einseitige, stichwortartige Zusammenfassung der Versuchsdurchführung der Proteinreinigung an (mit Volumenangaben). Dies wird im Antestat überprüft! 9