Hohe Sensitivität und Spezifität: Alle Komponenten sind genauestens aufeinander abgestimmt

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1 BACTOTYPE PCR Amplification Kit Mycobacterium paratuberculosis Gebrauchsanweisung Technologie Die Produktgruppe BACTOTYPE PCR Amplification Kit umfasst optimierte Systeme zum Nachweis von pathogenen Bakterien mittels Polymerasekettenreaktion (PCR): Hohe Sensitivität und Spezifität: Alle Komponenten sind genauestens aufeinander abgestimmt Einfache und praktikable Anwendung: Die Reagenzien sind inklusive Gel-Beladungspuffer vorpipettiert Zuverlässige Ergebnisse: Das Testkit enthält eine interne Amplifikationskontrolle Die Primer des Testkits sind spezifisch für ein Genfragment von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Das PCR-Produkt wird auf einem herkömmlichen Agarosegel ausgewertet. Die ready-to-load Reagenzien erlauben eine direkte Auftragung auf das Gel ohne Zugabe von Gel-Beladungspuffer. Falsch-negative Ergebnisse werden durch eine interne Amplifikationskontrolle minimiert. Der Arbeitsaufwand im Labor reduziert sich damit auf ein Minimum. Mit Ausnahme der Taq DNA Polymerase enthält das Testkit alle benötigten Reagenzien. Nur für Forschungszwecke geeignet // Stand 08/2012 Pathogener Erreger Das Testkit wurde zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis entwickelt, dem Erreger der Paratuberkulose (Johne sche Krankheit) bei Haus- und Wildwiederkäuern. Die Paratuberkulose ist eine weltweit stark zunehmende Infektionskrankheit, die praktisch alle Wiederkäuer befällt und speziell bei Rindern zu den meldepflichtigen Tierkrankheiten in Deutschland zählt. Der Erreger gehört zu den säurefesten Stäbchen aus der Ordnung der Actinomycetales, lebt im Darm infizierter Tiere und kann in der Umwelt bis zu einem Jahr überleben. M. paratuberculosis wächst sehr langsam, so dass bei kultureller Anzucht ein negatives Ergebnis erst nach bis zu 12 Wochen feststeht. Das BACTOTYPE PCR Amplification Kit Mycobacterium paratuberculosis liefert sensitive und spezifische Ergebnisse bereits nach einem Arbeitstag. Bestellinformation BACTOTYPE Mycobacterium paratuberculosis 10 Reaktionen Artikelnummer BACTOTYPE Mycobacterium paratuberculosis 50 Reaktionen Artikelnummer

2 Mycobacterium paratuberculosis 2 08/20012 Inhalt PCR Mix (gelbe Verschlusskappe) PCR Puffer, dntps, Primergemisch (speziesspezifisch und Amplifikationskontrolle), DNA für Amplifikationskontrolle, NaN 3 Magnesiumchlorid (grüne Verschlusskappe) MgCl 2, Gel-Beladungspuffer Positivkontrolle (rote Verschlusskappe) nicht-infektiöse DNA mit erregerspezifischen Sequenzen, NaN 3 10 Reaktionen 50 Reaktionen 221 μl 935 μl 80 μl 300 μl 25 μl 25 μl Nuklease-freies Wasser (blaue Verschlusskappe) 1.0 ml 1.0 ml Lagerung Die Reagenzien zur Amplifikation sollten im Dunkeln bei -20 C gelagert werden. Bei vorschriftsmäßiger Lagerung ist das Testkit mindestens 12 Monate haltbar. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren sollte vermieden werden. Zusätzlich benötigte Reagenzien - Taq DNA Polymerase BACTOTYPE Testkits werden mit der JumpStart Taq DNA Polymerase (Sigma-Aldrich, Art. Nr. D4184) validiert. Nur bei Verwendung dieser Polymerase garantieren wir eine optimale Funktion der BACTOTYPE Produkte. Für Bestellungen oder weitere Informationen zu der o.g. Taq Polymerase kontaktieren Sie bitte Sigma-Aldrich. - Agarose und Ethidiumbromid (für Gelelektrophorese) bp DNA Leiter (für Gelelektrophorese) Warenzeichen und Patente - BACTOTYPE ist ein eingetragenes Warenzeichen der Biotype Diagnostic GmbH. - JumpStart ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich. - Die PCR ist patentrechtlich geschützt. Patentinhaber sind die Firmen Hoffmann-La Roche Inc. und F. Hoffmann-La Roche (Roche).

3 Mycobacterium paratuberculosis 3 08/20012 Produktgarantie Der gesamte Inhalt des BACTOTYPE PCR Amplification Kit wurde einer intensiven Qualitätssicherung durch die Biotype Diagnostic GmbH unterzogen. Bitte melden Sie jedes aufgetretene Problem. Hinweise Die Einhaltung dieses Protokolls ist unbedingt erforderlich! Um Kontaminationen jeglicher Art auszuschließen, empfehlen wir alle Pipettiervorgänge mit gestopften Pipettenspitzen durchzuführen. DNA Probenvorbereitung, Amplifikation und Elektrophorese sollten in getrennten Räumlichkeiten stattfinden. Beachten Sie die Sicherheitsbestimmungen für das Arbeiten in Laboratorien und tragen Sie Handschuhe. Der PCR Mix und die Positivkontrolle enthalten Natriumazid (NaN 3 ). Natriumazid ist ein Gefahrstoff: Sehr giftig beim Verschlucken, entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase (R /53, S1/ ). Ebenso ist Ethidiumbromid ein Gefahrstoff. Bitte lesen Sie das entsprechende Sicherheitsdatenblatt und tragen Sie Nitrilhandschuhe. Für BACTOTYPE Komponenten sind die Sicherheitsdatenblätter bei der Biotype Diagnostic GmbH erhältlich. Für Sicherheitsdatenblätter von Reagenzien, die nicht im Testkit enthalten sind, kontaktieren Sie bitte den jeweiligen Hersteller. DNA Isolation Eine erfolgreiche Amplifikation setzt die Verfügbarkeit von hochreiner DNA voraus. Für die DNA Isolierung von Mycobacterium paratuberculosis aus Flüssigkulturmedium oder Festkulturabschwemmungen werden folgende Kitsysteme empfohlen: - NucleoSpin Tissue Kit; Macherey-Nagel, Düren - QIAamp DNA Mini Kit; QIAGEN, Hilden Bitte folgen Sie dem entsprechenden Protokoll des Herstellers.

4 Mycobacterium paratuberculosis 4 08/20012 Protokoll Vorbereitung der Reagenzien: Vor Verwendung der Reagenzien empfehlen wir, alle Röhrchen zu vortexen und ca. 5 s bei 3000 U/min zu zentrifugieren. Die blaue Farbe in der Magnesiumchlorid-Lösung ist durch den Gel-Beladungspuffer bedingt. Das PCR-Ergebnis wird hierdurch nicht beeinflusst. Vermeiden Sie zu intensives Zentrifugieren der Magnesiumchlorid- Lösung, das zu einer Aufkonzentrierung des Gel-Beladungspuffers im unteren Bereich des Röhrchens führen kann. 1. A) PCR Protokoll bei einer Probenanzahl ungleich der Verpackungseinheit (Multiplikator) Sollte die Probenanzahl kleiner als die der Verpackungseinheit des Testkits sein, so pipettieren Sie wie folgt in ein PCR- Gefäß (siehe auch Pipettierschema Tabelle 1): 17.0 μl PCR Mix μl Magnesiumchlorid μl Nuklease-freies Wasser + 0,4 μl Taq DNA Polymerase (hier: JumpStart 2.5 U/ μl) - Pipettieren Sie von diesem Master-Mix 22.5 μl in ein PCR-Gefäß und fügen 2.5 μl Ihrer DNA-Probe bzw. der Kontrolle hinzu. - Hinweis: Das Reaktionsvolumen sollte immer in Abhängigkeit der verwendeten Taq Polymerase mit Nuklease-freiem Wasser auf 25 μl aufgefüllt werden. 1. B) PCR Protokoll bei einer Probenanzahl entsprechend der Verpackungseinheit Sollte Ihre Probenanzahl der Verpackungseinheit des Testkist entsprechen, empfehlen wir die direkte Zugabe von Magnesiumchlorid, Nuklease-freiem Wasser und Taq DNA Polymerase zum PCR Mix. Für 10 Proben (entsprechend der Verpackungseinheit von 10 Reaktionen) PCR Mix μl Magnesiumchlorid μl Nuklease-freies Wasser μl Taq DNA Polymerase (hier: JumpStart 2.5 U/μL) Für 50 Proben (entsprechend der Verpackungseinheit von 50 Reaktionen) PCR Mix μl Magnesiumchlorid + 33 μl Nuklease-freies Wasser + 22 μl Taq DNA Polymerase (hier: JumpStart 2.5 U/μL) - Pipettieren Sie von diesem Master-Mix 22.5 μl in ein PCR-Gefäß und fügen 2.5 μl Ihrer DNA-Probe bzw. der Kontrolle hinzu. 2. Positivkontrolle Im Testkit ist eine gebrauchsfertige Positivkontrolle (rote Verschlusskappe) enthalten, die neben den DNA Proben stets mitgeführt werden sollte. Hierbei handelt es sich um nicht-infektiöse DNA mit erregerspezifischen Sequenzen. 3. Negativkontrolle Neben den DNA Proben sollte stets eine Negativkontrolle (z. B. Nuklease-freies Wasser) mitgeführt werden.

5 Mycobacterium paratuberculosis 5 08/20012 Tabelle 1: Pipettierschema Probe (x1) Positivkontrolle PCR Kontrolle PCR Mix 17.0 μl 17.0 μl 17.0 μl Magnesiumchlorid 4.5 μl 4.5 μl 4.5 μl DNA Proben 2.5 μl - - Positivkontrolle μl - Nuklease-freies Wasser 0.6 μl 0.6 μl 3.1 μl Taq DNA Polymerase (1 U) * 0.4 μl 0.4 μl 0.4 μl * 1 Unit pro Amplifikation verwenden (hier: JumpStart 2.5 U/μL). Die Menge der einzusetzenden DNA richtet sich nach ihrer Konzentration und kann zwischen 1 und 3 μl variiert werden. Die Menge an Nuklease-freiem Wasser ist entsprechend zu korrigieren, so dass das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes immer 25 μl beträgt. PCR Amplifikationsparameter Wir empfehlen unbedingt die Verwendung der Sigma JumpStart Taq DNA Polymerase. Temperatur Zeit 94 C 3 min Hot Start * 94 C 30 s 60 C 30 s (RAMPING 1 C/s ** ) 72 C 30 s 72 C 5 min 35 Zyklen 10 C Bis zum Ende * Bei der Verwendung von hot start -Polymerasen sollten die vom Hersteller vorgegebenen Aktivierungszeiten eingehalten werden (für JumpStart Taq DNA Polymerase: 3 min). ** Dieser Wert ist bei den Thermocyclern gerätespezifisch einzustellen. Eine Kontrolle und ggf. Korrektur wird empfohlen. 4. Elektrophorese Die Analyse der PCR-Produkte erfolgt mit einem 2%igen Agarosegel und Anfärbung mit Ethidiumbromid ( μg/ml) in TAE-Puffer. 10 μl des PCR-Ansatzes werden pro Bahn aufgetragen. Die Zugabe von Gel-Beladungspuffer entfällt, da dieser bereits im Master-Mix enthalten ist. Zum Größenvergleich wird ein Längenstandard im niedermolekularen Bereich empfohlen (100 bp DNA Leiter). Die Elektrophorese sollte gerätespezifisch durchgeführt werden.

6 Mycobacterium paratuberculosis 6 08/ Auswertung und Interpretation der Ergebnisse Die Größe der Amplifikate wird durch Vergleich mit dem DNA-Längenstandard bestimmt. Eine Fotodokumentation ist für Archivierungszwecke empfehlenswert. Schützen Sie Augen und Haut vor UV-Bestrahlung! Positives Ergebnis: Ein Fragment von 209 bp (Basenpaaren) ist vorhanden (erregerspezifische Bande). Bei niedriger Erregerkonzentration kann es vorkommen, dass die Bande von 838 bp (Amplifikationskontrolle) ebenfalls sichtbar ist. Der Test ist in diesen Fällen dennoch gültig. Die erregerspezifische Bande muss jedoch deutlich erkennbar sein. Negatives Ergebnis: Ist nur die Bande von 838 bp (Amplifikationskontrolle) sichtbar, ist das Resultat negativ. Ungültiges Ergebnis: Sollte keine der oben genannten Banden erkennbar sein, ist der Test nicht auswertbar und muss wiederholt werden. Möglicherweise wurde die PCR inhibiert. 838 bp Amplifikationskontrolle 209 bp erregerspezifische Bande Spur 1: 100 bp DNA Leiter (Invitrogen) Spur 2: erregerspezifische Bande (209 bp); DNA Probe positiv Spur 3: nur Amplifikationskontrolle sichtbar (838 bp); DNA Probe negativ Bitte fragen Sie uns, wenn Sie weitere Informationen wünschen.

7 BACTOTYPE PCR Amplification Kit Mycobacterium paratuberculosis Manual Technology The product group BACTOTYPE PCR Amplification Kit comprises optimised systems for the identification of bacterial pathogens via polymerase chain reaction (PCR): Highest sensitivity and specificity: All components are carefully developed and perfectly optimised Easy and comfortable work: The reagents are ready-to-use and ready-to-load Reliable results: The test kit contains an internal amplification control The primer pair of the test kit is specific for a gene fragment of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. The PCR products are analysed on a conventional agarose gel. The ready-to-load reagents allow direct loading of the samples on the gel without addition of gel loading buffer. False negative results are minimized by using an internal amplification control. Manual work is reduced to a minimum. With exception of Taq DNA Polymerase, the test kit consists of all reagents necessary for the detection of the bacterial germs. For research use only // 08/2012 Pathogenic Germ The test kit has been developed for detection of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, a germ causing paratuberculosis (Johne`s disease) in domestic or wild game ruminants. Paratuberculosis is an increasing infectious disease and is able to infect theoretically every kind of ruminants. In Germany, it belongs to the notifiable infectious diseases for cattle. M. paratuberculosis belongs to the order of actinomycetales, lives in the gut of infected animals and is able to survive in soil for months or even years. Growing rates of M. paratuberculosis are very slow and lead to difficult and time consuming bacteriologic culture with incubation times up to 12 weeks. BACTOTYPE PCR Amplification Kit Mycobacterium paratuberculosis provides sensitive and specific results in about one day. Ordering Information BACTOTYPE Mycobacterium paratuberculosis 10 Reactions Cat. No BACTOTYPE Mycobacterium paratuberculosis 50 Reactions Cat. No

8 Mycobacterium paratuberculosis 2 08/20012 Content PCR Mix (yellow cap) PCR buffer, dntps, primer mix (species-specific and amplification control), DNA for amplification control, NaN 3 Magnesium Chloride (green cap) MgCl 2, gel loading buffer Positive Control (red cap) non-infectious DNA with germ-specific sequences, NaN 3 10 reactions 50 reactions 221 μl 935 μl 80 μl 300 μl 25 μl 25 μl Nuclease-free Water (blue cap) 1.0 ml 1.0 ml Storage Conditions Reagents of the test kit are stable for at least 12 months when stored at -20 C in darkness. Repeated freezing and thawing should be avoided. Additionally Reagents - Taq DNA Polymerase BACTOTYPE test kits are validated with JumpStart Taq DNA Polymerase (Sigma-Aldrich, Cat. No. D4184). Solely, the use of this DNA Polymerase assures precise function of the BACTOTYPE products. For ordering and further information, please contact Sigma-Aldrich. - Agarose and Ethidium bromide (for gel electrophoresis) bp DNA ladder (for gel electrophoresis) Trademarks and Patents - BACTOTYPE is a registered trade mark of the Biotype Diagnostic GmbH. - JumpStart is a registered trademark of Sigma-Aldrich. - The PCR is under patent laws. Patentees are Hoffmann-La Roche Inc. and F. Hoffmann-La Roche (Roche).

9 Mycobacterium paratuberculosis 3 08/20012 Product Warranty All contents of the BACTOTYPE PCR Amplification Kit are subjected to extensive quality procedures by Biotype Diagnostic GmbH. In case of any problem, please report immediately. Notes Please, carry out precisely the instructions of the protocol! In order to avoid any kind of contamination we recommend pipetting with filter tips. DNA preparation, amplification, and electrophoresis should be carried out in separate rooms. Take note of safety regulations for working in laboratories, and wear gloves. The PCR Mix and the Positive Control contain sodium azide (NaN 3 ). Sodium azide is hazardous: Very toxic if swallowed, develops toxic gases when it gets in contact with acids (R /53, S1/ ). Ethidium bromide is hazardous, too. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) and wear nitrile gloves. MSDS of all BACTOTYPE components are available from Labor Diagnostic Leipzig. For MSDS of additional reagents to be needed, please contact the corresponding manufactures. DNA Isolation Solely, ultrapure DNA implies the successful amplification. For DNA isolation of Mycobacterium paratuberculosis from culture medium or solid culture avulsions of faeces samples the following test systems are recommended: - NucleoSpin Tissue Kit; Macherey-Nagel, Düren - QIAamp DNA Mini Kit; QIAGEN, Hilden Please perform isolation according to the manufacturer s information.

10 Mycobacterium paratuberculosis 4 08/20012 Protocol Preparation of the reagents: Before using the reagents of the test kit the first time, mix thoroughly and centrifuge the reagents for 5 sec at 3000 rpm. The blue colour in the magnesium chloride solution arises from the gel loading buffer and does not affect the PCR reaction. Please, avoid elongated centrifugation steps of the magnesium chloride solution. The gel loading buffer could be concentrated onto the bottom of the tube. 1. A) PCR Protocol for a Number of Samples different from the Packaging Unit (Multiplicator) If there are less samples than the packaging unit, pipette as followed into a PCR reaction tube (also see pipetting scheme table 1): 17.0 μl PCR Mix μl Magnesium Chloride μl Nuclease-free Water μl Taq DNA Polymerase (here: JumpStart 2.5 U/μL) - Pipet 22.5 μl of the master mix into a PCR reaction tube and add 2.5 μl of your DNA sample or control. - Attention: Depending on the used Taq Polymerase, complete with Nuclease-free Water to a total volume of 25 μl per reaction. 1. B) PCR protocol for an Amount of Samples corresponding to Packaging Unit If the number of samples corresponds to the packaging unit, we recommend the addition of Magnesium Chloride, Nuclease-free Water, and Taq DNA Polymerase directly to the PCR Mix. For 10 samples (corresponding to the content of 10 reactions) PCR Mix μl Magnesium Chloride μl Nuclease-free Water μl Taq DNA Polymerase (here: JumpStart 2.5 U/μL) For 50 samples (corresponding to the content of 50 reactions) PCR Mix μl Magnesium Chloride + 33 μl Nuclease-free Water + 22 μl Taq DNA Polymerase (here: JumpStart 2.5 U/μL) - Pipet 22.5 μl of the master mix into a PCR reaction tube and add 2.5 μl of your DNA sample or control. 2. Positive Control The test kit is provided with a ready-to-use Positive Control (red cap) of non-infectious DNA with germ-specific sequences. We strongly recommend performing a positive control for each run. 3. Negative Control It is strongly recommended to perform a negative control (e. g. Nuclease-free Water) for each run.

11 Mycobacterium paratuberculosis 5 08/20012 Table 1: Pipetting Scheme Sample (x1) Positive Control PCR Control PCR Mix 17.0 μl 17.0 μl 17.0 μl Magnesium Chloride 4.5 μl 4.5 μl 4.5 μl Sample DNA 2.5 μl - - Positive Control μl - Nuclease-free Water 0.6 μl 0.6 μl 3.1 μl Taq DNA Polymerase (1 U) * 0.4 μl 0.4 μl 0.4 μl * Use 1 Unit for amplification (here: JumpStart 2.5 U/μL). The volume of the DNA to be employed depends on its concentration and may be varied from 1 to 3 μl. Adjust the volume with Nuclease-free Water to a reaction volume of 25 μl in total. PCR Amplification Parameters We strongly recommend the use of Sigma JumpStart Taq DNA Polymerase. Temperature Time 94 C 3 min Hot Start * 94 C 30 s 60 C RAMPING 1 C/s ** 30 s 72 C 30 s 72 C 5 min 10 C hold 35 Cycles * For hot start Polymerase, please follow the activation time conditions specified by the manufacturer (for JumpStart Taq DNA Polymerase: 3 minutes). ** The value is adjusted for most of the thermocyclers. Cyclers that exceed the ramping rate should be monitored and corrected as required. 4. Electrophoresis PCR fragments are analysed on a 2% agarose gel and staining is done with ethidium bromide ( μg/ml) in TAE buffer. Put 10 μl of the PCR product per lane onto the gel (gel loading buffer already included). In order to compare the molecular size of the amplification products a size standard (100 bp DNA ladder) is recommended. Run the electrophoresis as described in the manufacturer s handbook.

12 Mycobacterium paratuberculosis 6 08/ Analysis and Interpretation of the Results Size designation of the PCR fragments is done by comparison with the DNA size standard on a transilluminator. Photographic documentation is recommended. Protect eyes and skin against UV-radiation! Positive result: The germ-specific amplificat of 209 bp (base pairs) is clearly visible. The 838 bp (amplification control) band may be weak or may not appear at all due to low concentrations of bacterial DNA. Negative result: If the 838 bp band (amplification control) appears only, germ detection is considered to be negative. Invalid result: If none of the bands mentioned above are detectable, the assay is invalid and has to be repeated. Possibly, the PCR has been inhibited. 838 bp amplification control bp germ-specific band Lane 1: 100 bp DNA ladder (Invitrogen) Lane 2: germ-specific signal (209 bp); sample is positive Lane 3: only the amplification control is visible (838 bp); sample is negative Please contact us for further information.