Liquid anti-rabies nucleocapsid conjugate

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1 Liquid anti-rabies nucleocapsid conjugate FOR IN VITRO DETECTION OF RABIES VIRUS BY IMMUNOFLUORESCENCE, 1 x 0.5 ml BIO-RAD offers a fluorescein labelled anti-rabies nucleocapsid conjugate for direct immunofluorescence applied to the detection of rabies virus in cell cultures. For the histological diagnosis of rabies in brain smears, the use of an adsorbed conjugate is recommended to limit the risk of non-specific reactions. I - COMPOSITION The anti-rabies nucleocapsid globulin is obtained by immunising rabbits with purified nucleocapsids from the fixed Pasteur virus strain, maintained in cell cultures (primary cells). It is purified and coupled with fluorescein isothiocyanate. II. - INTENDED USE With the Rabies-specific labelled polyclonal Antibodies contained in the product which are targeted against the ribo-nucleoprotein complex of the Rabies virus, all currently known Lyssavirusgenotypes can be detected with the direct immunofluorescencetest (IFT) irrespective of the animal species tested. Polyclonal antibodies, which are produced by the means of the Pasteur strain (PV) are known for their good specificity. The sensitivity of the anti-rabies nucloecapsid conjugate may be reduced when testing Lyssavirus Genotype 3 (Mokola Virus), 5 (European Bat Lyssavirus, EBLV-1) and 6 (EBLV-2) strains. In this case the samples should be examined more carefully. In all cases an appropriate working dilution should be tested in advance.

2 III - DIRECTION FOR USE It is necessary to distinguish between: 1 - Detection of rabies virus in cell cultures Different laboratory studies require testing for rabies virus on cell cultures: Virus proliferation for the production of virus-antigen Breeding of virus to confirm Rabies diagnostic with IFT-doubtful results or IFT-negative results in case of contact with people. Titration of viral suspensions For the detection of virus-neutralising antibodies in sera-neutralisation tests (RFFIT or FAVN) Procedure The conjugate must be diluted in a phosphate buffer at ph 7.2. Prior to use, the appropriate working dilution needs to be established by titrating the anti-rabies nucleocapsid conjugate. As an indication, a 1/20 dilution has usually shown to be sufficient. Wash the cells with phosphate buffer (PBS). Fix the cells in acetone at - 20 C. Rapidly air dry the cells. Add enough diluted conjugate to cover the slide. Incubate at 37 C for 30 minutes in a moist chamber. Wash in phosphate buffer Apply a few drops of glycerine buffer. Note: Counter staining in Evans Blue may improve the contrast and is sometimes useful for better fluorescent observation. A final 1/2000 dilution in Evans Blue is usually satisfactory. Low positive samples may however be difficult to detect using Evans Blue. 2 - Histological Diagnosis of rabies from animal brain smears (not recommended) Note: For histological diagnosis from brain smears, the use of the Liquid Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate may lead to results of limited quality due to interference. Therefore, we recommend the use of the Lyophilised, Adsorbed Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (Bio-Rad reference ) when performing histological Rabies diagnosis in brain samples. Protocol for Histological Diagnosis: The conjugate may be used: either directly after a 1/20 dilution in a phosphate buffer solution at ph 7.2. or according to WHO recommendations, after saturation. 2

3 Saturation technique 1 - Dilution of the conjugate to 1/10 in a phosphate buffer solution at ph 7.2 (PBS). 2 - Prepare two 20 % suspensions. One is from the brain of a native mouse (not infected), the other from the brain of a mouse infected with the CVS-rabies virus Strain (e.g. 2 g of brain matter + 8 ml of P.B.S. for example, well ground until homogenisation, centrifuged, and the supernatant then collected). 3 - Saturation: Add to 2.5 ml of the 1/10 diluted conjugate (or see paragraph 1 to determine the appropriate working dilution) 2.5 ml of the supernatant of the 20% brain suspension of the non-infected mouse. Add to 2.5 ml of the 1/10 diluted conjugate (or see paragraph 1 to determine the appropriate working dilution) 2.5 ml of the supernatant of the 20% Rabies-positive mouse brain suspension; incubate for 30 min at 37 C with stirring every 10 minutes. Procedure Brain smears suspected of bearing rabies, after they are fixed in acetone, are treated with one or two drops of conjugate diluted to 1/20 and/or saturated (diluted to 1/20) so as to completely recover the histological sample. lncubate at 37 C for 30 minutes in a moist chamber Wash in phosphate buffer and rinse in glycerine buffer Observe under a microscope (fluorescent equipment). Other reagents required for the I.F. reaction ph 7.2 phosphate buffer (10 X concentrated) glycerine buffer for I.F. acetone resistant I.F. slides; 2 x 6 wells (7 mm) Ask your Bio-Rad representative for more information on the availability of these reagents. IV- AVAILABLE AS Kit 1 vial of 0.5 ml of liquid conjugate Reference V - STORAGE C protected from light until the expiration date marked on the packaging The product should be diluted just before use. VI REFERENCES: See German version. 3

4 Conjugué anti-nucléocapside rabique liquide POUR LA DETECTION IN VITRO DU VIRUS RABIQUE EN IMMUNOFLUORESCENCE, 1 flacon 0,5 ml BIO-RAD propose une globuline anti-nucléocapside rabique conjuguée à la fluorescéine pour immunofluorescence directe appliquée à la détection des virus rabiques dans les cultures cellulaires. Pour le diagnostic histologique de la rage sur calques de cerveaux, l utilisation d un conjugué adsorbé est recommandé afin de limiter le risque de réactions non-spécifiques. I - COMPOSITION La globuline anti-nucléocapside rabique est obtenue par immunisation de lapins avec des nucléocapsides purifiées à partir de la souche de virus fixe Pasteur entretenue sur cultures cellulaires (1 er explant). Elle est purifiée puis couplée à l isothiocyanate de fluorescéine. II - UTILISATION Avec les anticorps polyclonaux marqués contenus dans le produit et dirigés contre le complexe ribo-nucléoprotéique du virus rabique, tous les génotypes de Lyssavirus connus peuvent être détectés par le test d'immunofluorescence (IFT) et ceci quelle que soit l'espèce animale testée. Les anticorps polyclonaux, produits à partir de la souche virale Pasteur (PV) sont reconnus pour leur spécificité. La sensibilité du conjugué Antinucléocapside Rabique peut être diminuée lors du test sur des souches de Lyssavirus de génotypes 3 (Mokolavirus), 5 (European Bat Lyssavirus ou EBLV-1) et 6 (EBLV-2) Dans ce cas, les échantillons doivent être examinés avec précaution. Dans tous les cas il est recommandé de tester à l'avance la dilution la plus appropriée.

5 III - MODE OPERATOIRE Il est nécessaire de distinguer 1 - Détection du virus rabique dans les cultures cellulaires Divers travaux de laboratoire nécessitent la recherche du virus rabique dans des cultures cellulaires : contrôle de l'infection de cultures en vue de la production d'antigènes; culture du virus pour la confirmation du diagnostique de la Rage en cas de résultats par le Test d Immunofluorescence directe (IFT) douteux ou négatifs après un contact suspect ; titrage des suspensions virales sur cellules; dosage des anticorps neutralisants par un test de séro-neutralisation (RFFIT ou FAVN). Procédure Le conjugué doit être dilué dans du tampon phosphate à ph 7,2. Avant utilisation, la dilution la plus appropriée doit être établie par titrage du Conjugué Anti-nucléocapside Rabique. A titre d information, une dilution au 1/20 est généralement considérée comme satisfaisante. Laver les cellules avec du tampon phosphate (PBS) Fixer les cellules à l'acétone à - 20 C. Sécher rapidement les cellules à l'air. Ajouter suffisamment de conjugué dilué pour couvrir la lame. Incuber à 37 C pendant 30 minutes en chambre humide. Laver en tampon phosphate Ajouter quelques gouttes de glycérine tamponnée. N.B. : Une contre-coloration au Bleu d'evans peut améliorer le contraste et est parfois favorable à une meilleure observation de la fluorescence. Une dilution finale de Bleu d'evans à 1/2000 est généralement satisfaisante. Certains échantillons faiblement positifs peuvent toutefois s avérer difficile à détecter avec le bleu d Evans. 2 - Diagnostic histologique de la rage sur des calques de cerveaux animaux (non recommandé) Remarque : pour le diagnostic histologique de la rage à partir de calques de cerveaux, l utilisation du conjugué anti-nucléocapside Rabique liquide peut aboutir à des résultats limités en raison de possibles interférences. C est pourquoi il est recommandé d utiliser le Conjugué Anti-nucléocapside Lyophilisé, Adsorbé (référence Bio-Rad ) pour le diagnostic histologique de la rage à partir de calques de cerveaux. 5

6 Protocole pour le Diagnostic Histologique Le conjugué peut être utilisé : soit directement après dilution au 1/20 e dans un tampon phosphate à ph 7,2 soit selon recommandations de l'o.m.s., après saturation. Techniques de saturation 1 - Dilution du conjugué au 1/10 e dans un tampon phosphate ph 7,2 (P.B.S) 2 - Préparer 2 suspensions de cerveau à 20%, l'une de cerveau de souris normale (non infectée), et l'autre à partir de cerveau de souris infectée par la souche CVS de virus rabique : (par exemple 2 g de matière cérébrale + 8 ml de P.B.S., bien broyer jusqu'à homogénéisation, centrifuger, recueillir le surnageant). 3 - Saturation : à 2,5 ml de conjugué dilué au 1/10 e (ou voir paragraphe 1 pour la détermination de la dilution appropriée), ajouter 2,5 ml de surnageant de cerveau normal de souris à 20%. A 2,5 ml de conjugué dilué au 1/10 e (ou voir paragraphe 1 pour la détermination de la dilution appropriée), ajouter 2,5 ml du surnageant de cerveau de souris rabique à 20% ; incuber 30 mn à 37 C en agitant toutes les 10 minutes. Mode opératoire Les calques d'organes suspects de rage sont traités, après fixation à l'acétone, avec 1 ou 2 gouttes de conjugué dilué au 1/20 e et/ou saturé (dilué au 1/20 e )de manière à recouvrir parfaitement l'échantillon histologique. Incuber à 37 C pendant 30 minutes en chambre humide. Laver en tampon phosphate et monter dans la glycérine tamponnée. Observer au microscope (équipement fluorescent). Réactifs complémentaires nécessaires a la reaction en I.F. Tampon phosphate ph 7,2 pour I.F. (concentrée 10 fois) Glycérine tamponnée pour I.F. Lames pour I.F., résistants à l'acétone 2 x 6 puits (7 mm) Contactez votre représentant Bio-Rad pour plus d information sur la disponibilité de ces réactifs. IV - PRÉSENTATION Kit 1 flacon de 0,5 ml de conjugué liquide Code V - CONSERVATION Conservation à +2 C-+8 C à l obscurité jusqu'à la date indiquée sur le conditionnement. Le produit doit être dilué juste avant usage. VI - BIBLIOGRAPHIE : Voir version allemande. 6

7 Notes 7

8 Flüssiges Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugat ZUM IN VITRO-NACHWEIS DES TOLLWUT-VIRUS DURCH IMMUNFLUORESZENZ 1 Fläschchen mit 0,5 ml Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach 17c TierSG zugelassen Zul.-Nr. FLI-B 456 Gebrauchsinformation Bio-Rad bietet ein Fluorescein-markiertes Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugat für eine direkte Immunfluoreszenz zum Nachweis von Tollwutviren in Zellkulturen an. Für eine histologische Diagnose von Tollwut an Gehirnabstrichen wird die Verwendung des adsorbierten Konjugates empfohlen, um die Risiken von unspezifischen Reaktionen zu begrenzen. I - ZUSAMMENSETZUNG Das Anti-Tollwut Nukleokapsidglobulin wird durch Immunisierung von Kaninchen gewonnen, die mit gereinigten Nukleokapsiden eines festgelegten Pasteur-Virusstamms infiziert wurden, der in Zellkulturen (Primärzellen) gewonnen wurde. Es wird gereinigt und mit Fluoreszein-Isothiocyanat gekoppelt. II. - ZWECKBESTIMMUNG Unter Verwendung der, im Produkt enthaltenen tollwutspezifischen gelabelten polyklonalen Antikörpern, die gegen den Ribonukleoproteinkomplex des Tollwutvirus gerichtet sind, können alle derzeit bekannten Lyssavirusgenotypen unabhängig von der Tierspezies im direkten Immunfluoreszenztest (IFT) antigenetisch erkannt werden. Polyklonale Antikörper, die mit Hilfe des Pasteur

9 Virus (PV) Stammes hergestellt wurden, sind für ihre gute Spezifität bekannt. Die Sensitivität des Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugates kann je nach Verwendung des Herstellungsstammes bei Lysssaviren der Genotypen 3 (Mokola Virus), 5 (European Bat Lyssavirus, EBVL-1) und 6 (EBLV-2) geringer sein. In diesem Falle ist eine sorgfältige Untersuchung entsprechender Proben zu fordern. In allen Fällen sollte jedoch vorab eine geeignete Gebrauchsverdünnung bestimmt werden. III. - HANDHABUNG Es muss folgendes unterschieden werden: 1 - Nachweis des Tollwutvirus in Zellkulturen Bei diversen Laboruntersuchungen wird der Nachweis des Tollwutvirus in Zellkulturen erforderlich: Virusvermehrung zur Herstellung von Virusantigen; Virusanzucht zur Bestätigung der Tollwutdiagnose bei IFT-fraglichen Ergebnissen bzw. IFT-negativen Ergebnissen mit Personenkontakt; Zur Titration viraler Suspensionen; Zum Nachweis virusneutralisierender Antikörper in Serumneutralisationstesten (RFFIT oder FAVN). Testdurchführung Das Konjugat in Phosphatpuffer ph 7.2 verdünnen. Vor Verwendung muß die geeignete Gebrauchsverdünnung durch Titration des Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugates bestimmt werden. Als Hinweis: Wie sich gezeigt hat, ist normalerweise eine 1/20 Verdünnung ausreichend. Die Zellen mit Phosphatpuffer waschen. Die Zellen in Azeton bei -20 C fixieren. Die Zellen schnell an der Luft trocknen. Ausreichend verdünntes Konjugat hinzufügen, sodass der Objektträger bedeckt ist. Bei 37 C für 30 Minuten in feuchter Kammer inkubieren. In Phosphatpuffer waschen. Einige Tropfen gepuffertes Glyzerin aufbringen. Anmerkung: Eine Gegenfärbung mit Evans-Blau kann den Kontrast verbessern und in einigen Fällen zur verbesserten Auswertung der Fluoreszenz eingesetzt werden; eine Endverdünnung in Evans-Blau im Verhältnis 1:2000 ist im Allgemeinen zufrieden stellend. Bei schwach positiven Proben kann der Nachweis unter Verwendung von Evans Blue schwierig sein. 9

10 2 - Histologische Diagnose von Tollwut an Gehirnabstrichen von Tieren (nicht empfohlen) Für die histologische Diagnose an Gehirnabstrichen kann die Verwendung des Flüssigen Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugats zu einer verminderten Qualität der Ergebnisse aufgrund von Interferenzen führen. Deshalb wird die Verwendung des lypophilisierten, Adsorbierten Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugat (Bio-Rad Best.-Nr.: ) empfohlen, wenn eine histologische Diagnose von Tollwut in Gehirnproben durchgeführt wird. Protokoll für die histologische Diagnose: Das Konjugat kann verwendet werden: entweder direkt oder nach Bestimmung einer anderen geeigneten Gebrauchsverdünnung in gepufferter Phosphatlösung ph 7.2; oder gemäß den Empfehlungen der WHO nach Sättigung. Sättigungstechnik 1 - Das Konjugat 1:10 in einer gepufferten Phosphatlösung ph 7.2 (PBS) verdünnen. 2 - Herstellung einer jeweils 20%-igen Gehirnsuspension aus dem Gehirn einer nativen (nicht infizierten) Maus und einer mit dem CVS-Stamm des Tollwutvirus infizierten Maus (z. B. 2 g Gehirnmasse + 8 ml PBS bis zum Erhalt einer homogenen Suspension mischen, zentrifugieren und anschließend den Überstand aufheben). 3 - Sättigung: zu 2,5 ml des 1/10 verdünntes Konjugates (oder zur Bestimmung der geeigneten Gebrauchsverdünnung siehe Abschnitt III/1.) 2,5 ml des Überstandes der 20%-igen Gehirnsuspension einer nicht infizierten Maus hinzufügen. Zu 2,5 ml des 1/10 verdünntes Konjugates (oder zur Bestimmung der geeigneten Gebrauchsverdünnung siehe Abschnitt III/1.) 2,5 ml des Überstandes der 20%-igen Gehirnsuspension einer Tollwut-positiven Maus hinzufügen; 30 min bei 37 C inkubieren und dabei alle 10 Minuten schütteln. Testdurchführung Die Abstrichpräparate verdächtiger Tollwutorgane werden nach Fixierung in Azeton mit 1 oder 2 Tropfen Konjugat, das 1:20 verdünnt wurde oder das gesättigt ist (1:20 verdünnt), behandelt, so dass die histologische Probe vollständig bedeckt ist. Bei 37 C für 30 Minuten in einer feuchten Kammer inkubieren. In gepuffertem Phosphatlösung waschen und in gepuffertem Glyzerin spülen. Unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. 10

11 Zusätzliche Reagenzien, die zur I.F.-Tollwutdiagnostik Erforderlich Sind Phosphatpuffer ph 7.2 (10-fach konzentriert) Gepuffertes Glyzerin für I.F. Objektträger für I.F., resistent gegen Azeton Für weitere Informationen und bei Fragen zur Verfügbarkeit dieser Reagenzien kontaktieren Sie bitte Ihre Bio-Rad Niederlassung. IV - DARREICHUNGSFORM Kit mit 1 Fläschchen mit 0.5 ml des flüssigen Anti-Tollwut Nukleokapsid Konjugat Best.-Nr.: V - LAGERUNG Lagerung bei C im Dunkeln. Das Verfallsdatum ist auf der Verpackung angegeben. Das Produkt darf erst kurz vor der Verwendung verdünnt werden. VI - LITERATUR 1. ATANASIU P., PERRIN P., FAVRE S., CHEVALLIER G. and TSIANG, lmmunofluorescence and immuno-peroxidase in the diagnosis of rabies in Viral Immuno-diagnosis edited by KURSTAK E. and MORISSET R. Acad. Press., N.Y., (1974), BOURHY H, ROLLIN P.E., VINCENT J and SUREAU P, Comparative Field Evaluation of the Fluorescent-Antibody Test,Virus Isolation from Tissue Culture, and Enzyme Immunodiagnosis for Rapid Laboratory Diagnosis of Rabies. J Clin Microbiol. (1989) Mar;27(3): BARRAT J, BARRAT MJ, PICARD M and AUBERT M.F.A., Diagnostic de la rage sur culture cellulaire. Comparaison des résultats de l inoculation au neuroblastome murin et de l inoculation à la souris. Comp. lmmun. Microbiol. Infect. Dis. (1988) Vol. I1, No. 3/4, pp DEAN D.J. et ABELSETH M.K. Epreuve des anticorps fluorescents. La Rage : Techniques de laboratoire OMS série de monographie (Genève), FITZGERALD A.A. et Coll. A collaborative study on the testing of rabies immune globulin (human) by the mouse neutralisation test (N. M.T.), and the rapid fluorescent focus inhibition test (R.F.F.I.T.). J. Biol, Stand (1979) 7 (1) p GOLDAWSSER R.A., KISSLING H.E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proc. Soc. Exp. Biol. (NY), (1958), 58,

12 Notes 12

13 Notes 13

14 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-La-Coquette - France Tel.: /2007 Fax.: Code: