Schwermetallstress und Schwermetallresistenz

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1 Schwermetallstress und Schwermetallresistenz Schwermetall-Hyperakkumulation im Wilden Westen modified from:

2 Tafelbild: Dosis-Wirkungsdiagramme

3 Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität Ein scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensis darin war jedoch an Zn- Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn- Chlorophyll umgewandelt hatte. Zn-Fluosilikat. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295),

4 Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizität und Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern --> Hemmung der Wurzelfunktion, Substitution von aktiven Zentren in Enzymen, Hemmung der Atmung und anderer weniger sensitiver Prozesse --> 5. Sem-KK --> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert. --> Iara s Vortrag --> direkte Hemmung der Photosynthese --> Resistenz-Mechanismen

5 Angriffspunkte in den photosynthetischen Lichtreaktionen (I)

6 Angriffspunkte in den photosynthetischen Lichtreaktionen (II) heavy metals P700* A 0 A 1 Antenna Chl-protein complexes, main protein: LHCII 4 h ν Chl Chl excitation energy transfer Chl P680* P680 Pheo QA Q B PQ electron transport FeS/ Rieske PC P700 Chl Chl E 4 WSC e- 2 H 2 O O H +

7 Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischen Lichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig Schatten-Reaktion Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil der Antennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg- Substitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.b. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben grün. Sonnen-Reaktion In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg- Substitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophylle bleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparates aus. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58,

8 Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese? (I) S2 intersystem crossing S1 h ν h ν intersystem T1 crossing EET photochemistry absorption phosphoresscence intersystem crossing absorption intersystem crossing fluorescence S0 Chlorophyll

9 Vergleich von Gausaustausch und steady state-fluoreszenz in Elodea gestresst mit 0.2 µm Cu 2+ im Schwachlicht µ y net photosynthetic oxygen release photosynthesis fluorescence fluorescence days of heavy metal stress

10 Warum sind Schwermetallchlorophyl le untauglich zur Photosynthese? (II)

11 Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese? (III) Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung wie in den Reaktionszentren erforderlich durchzuführen. Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.b. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl), was die Bindung im Protein und damit die ganze Proteinstruktur (zer)stört.

12 UV/VIS -Spektroskopie: Sonnen vs. Schattenreaktion Spektren von E. canadensis Extrakten In vivo Spektren von E. canadensis Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58,

13 Photosyntheseaktivität: Sonnen vs. Schattenreaktion shade reaction sun reaction F m : % of control F v / F m : % of control GPOR: % of control Mg-subst.: % of control x10

14 UV/VIS -Spektroskopie: nicht-chlorophyta Braunalge Ectocarpus siliculosus: Chl a/c-lhc immer der Substitution zugänglich --> immer Schattenreaktion Rotalge Antithamnion plumula: Phycobilis: kein Chl --> immer Sonnenreaktion Küpper H, Šetlík I, Spiller M, Küpper FC, Prášil O (2002) Journal of Phycology 38(3),

15 Photosyntheseparameter: nicht-chlorophyta Braunalge Ectocarpus siliculosus: Chl a/c-lhc immer der Substitution zugänglich --> immer Schattenreaktion 120 Fv/Fm (% of control) GPOR (% of control) Fm (% of control) low light, copper high light, copper low light, zinc Metal concentration / µm Küpper H, Šetlík I, Spiller M, Küpper FC, Prášil O (2002) Journal of Phycology 38(3),

16 Hemmung des PSIIRC Diskutierte Mechanismen Hemmung des wasserspaltenden Komplexes Hemmung der primären Ladungstrennung: - durch Bindung ans D1-Protein - durch Insertion ins Pheophytin Hemmung des Elektronentransports - durch Bindung an Q a -Domäne des D1-Proteins - durch Bindung an nicht-häm-fe- Dömäne des D1-Proteins

17 Oxidativer Stress durch Chlorophylle: Transfer von Anregungsenergie auf Singulett-Sauerstoff S2 intersystem crossing S1 h ν h ν S0 intersystem T1 crossing EET photochemistry absorption phosphorescence intersystem crossing absorption intersystem crossing fluorescence chlorophyll S1 phosphorescence intersystem crossing T1 oxygen

18 NIR-Lumineszenz-Studie: Sind Schwermetallchlorophylle am schwermetallinduzierte oxidativen Stress beteiligt? lifetime of Chl triplet excited state / % of Mg-Chl a efficiency of singlet oxygen production / % of Mg-Chl a Chl a derivatives Chl b derivatives lifetime of singlet oxygen / % of Mg-Chl a Chl a derivatives Chl b derivatives Mg 2+ H + (=pheophytin) Cu 2+ Zn 2+ Mg 2+ H + (=pheophytin) Cu 2+ Zn 2+ --> Schwermetall-Chlorophylle haben niedrigere oder gleiche Effizienz der Bildung von Singulett-O 2 ( 1 O 2 ) wie Mg- Chl, aber sie quenchen dieses weniger. Pheophytin erzeugt mehr und quencht weniger 1 O 2 als Mg-Chl. Küpper H, Dedic R, Svoboda A, Hála J, Kroneck PMH (2002) Biochim Biophys Act 1572,

19 Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit Schwermetall-Hyperakkumulation --> Biologische Funktion der Hyperakkumulation --> Mechanismen der Hyperakkumulation --> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung

20 Cadmium-Mangel im Cd/Zn-hyperaccumulator Thlaspi caerulescens With 10 µm cadmium in the nutrient solution --> healthy plants Without cadmium in the nutrient solution --> damage due to attack of insects Küpper H, Kroneck PMH (2004) MIBS 44 (Sigel et al., eds), chapter 5

21 Effekte von Ni 2+ auf das Wachstum und Ni 2+ -Konzentrationen im Sproß Shoot dry weight (g) (a) 14 Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii 12 Alyssum lesbiacum Ni concentration (µg g -1 ) (b) Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii Alyssum lesbiacum Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Alyssum lesbiacum Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

22 Cu-stressed Thlaspi Comparison of damage in different species Thlaspi caerulescens: Cd/Zn hyperaccumulator Thlaspi ochroleucum: non-accumulator control control 10 µm Cu µm Cu 2+

23 mm / mm Ca Kompartimentierung der Metalle in Blättern Zn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen von Thlaspi und Alyssum -Arten Compartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens Alyssum bertolonii 8 young leaves Zn Mg P S Cl K mature leaves mm / mm Ca Zn Mg P S Cl K upper epidermis upper mesophyll lower mesophyll lower epidermis Concentrations of elements in leaf tissues Zn K α line scan and dot map of a T. caerulescens leaf Ni K α line scan and dot map of a A. bertolonii leaf Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

24 Kompartimentierung von Zn und Ni in Blättern Funktionelle Differenzierung von Epidermis-Zellen in Thlaspi Linear Regression: Y = A + B * X 8 6 Parameter Value Error A B R SD N P mm Zn / mm Ca data points regression line confidence limits cell width Upper leaf surface of T. goesingense Correlation between cell size and zinc concentration Dot map of the Ni K alpha line Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

25 Kompartimentierung von Ni in Blättern Subzelluläre Lokalisation in Epidermis-Zellen von Thlaspi goesingense

26 Kompartimentierung von Metallen in Blättern Zn/Cd-Akkumulation in Blatthaaren von Arabidopsis halleri Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84

27 4.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung Mechanismen Generell sind hier aktive Transportprozesse gegen den Konzentrationsgradienten, also Transportproteine beteiligt. - CDF s - Nramp s - CAX s Ausschluss aus der Zellen: - in Algen: bei Braunalgen beobachtet - in Wurzeln: siehe Wurzeln Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...) - Sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält - Spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkus Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.b. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese

28 Kompartimentierung von Metallen in Blättern Korrelation zwischen Metallkonzentrationen im Mesophyll von Arabidospis halleri Cd / mm 6 4 Mg / mm data points regression line (R = 0.94; P < ) 95% confidence limits Zn / mm 5 0 data points regression line (R = 0.79; P < ) 95% confidence limits Cd / mm Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84

29 Compartmentation of elements in leaves: Cells with differing physiology in the mesophyll of metal-stressed hyperaccumulators Mg / mm data points regression line (R = 0.79; P < ) 95% confidence limits Cd / mm Mg / mm Ni / mm Arabidopsis halleri Thlaspi goesingense Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

30 Cd-stressed Thlaspi caerulescens Images of PS II activity parameters C Cu Cd Fluorescence yield during F m Efficiency of PS II F v /F m Light saturation F m /F p Electron flow trhough PS II during actinic irradiance (F m '-F t )/F m '

31 Cd-stress in the Zn-/Cd-hyperaccumulator T. caerulescens images of PSII activity parameters Image of F m of an unstressed mature leaf Image of F m of a leaf stressed with 50µM Cd 2, showing unusually bright cells Image of F m of the same sample as on the left, but with lower magnification Image of F v /F m of the same sample as above, showing the homogeneously high photosynthtic activity of a healthy leaf of this plant Image of F v /F m of the same sample as above, showing the low photosynthtic activity of the bright cells Image of F v /F m of the same sample as on the left, but with lower magnification

32 Cd-stress in the non-accumulator Thlaspi ochroleucum images of PSII activity parameters Image of F m of an unstressed mature leaf Image of F m of a mature leaf stressed with 10µM Cd 2+ Image of F m of sample on the left, but with lower magnification Image of F v /F m of the same sample as above, showing the homogeneously high photosynthtic activity of a healthy leaf of this plant Image of F v /F m of the same sample as above, showing a gradient of photosynthtic activity instead of the localised damage in T. caerulescens Image of F v /F m of the same sample as on the left, but with lower magnification

33 Heterogenität als Resistenzmechanismus? Normal: Sequestration in epidermal storage cells Stressed: additional sequestration in selected mesophyll cells Acclimated: Enhanced sequestration in epidermal storage cells v v v Küpper H, Šetlík I (2005) in preparation

34 Komplexierung von Metallen hyperakkumuliert von Thlaspi caerulescens (Ganges-Typ) Analysiert mit Röntgenabsorptions-Spektroskopie gefrorener Gewebe Fourier Transform of χ*k Zn Cd histidine contribution increase in sulphur contribution young leaves mature leaves mature stems young leaves senescent leaves mature stems Distance [Å] Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2004) Plant Physiology 134,

35 Komplexierung von Cadmium hyperakkumuliert von Thlaspi caerulescens (Ganges-Typ) Analysiert mit Röntgenabsorptions-Spektroskopie gefrorener Gewebe Percent of all ligands binding to Cd young mature senescent dead 0 stems petioles leaves Developmental stage of leaves Tissue sulphur ligands N/O ligands Percent of all ligands binding to Cd Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2),

36 Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Phytochelatine Glutathion Metallothionine Freie Aminosäuren Andere Liganden

37 Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren Aktiv, durch natürliche Überexpression von Metall-Transportproteinen Viele Transporter überexprimiert, aber bisher unklar, was primäre und was dadurch verursachte sekundäre Überexpression ist Regulation der Überexpression weitgehend unbekannt

38 Beispiel: Expressionslevel (mrna) des Metalltransporters ZNT1 in einer nicht-hyperakkumulierendem und einer hyperakkumulierenden Thlaspi -Art 10 µm Zn 2+ Thlaspi caerulescens 10 µm Zn 2+ Thlaspi arvense 1 µm Zn 2+ Thlaspi arvense epidermal guard cells epidermal subsidiary cells epidermal metal storage cells palisade mesophyll bundle sheath phloem spongy mesophyll c(znt1 mrna) / c(18s rrna)

39 Regulation of ZNT1 transcription in young leaves of Thlaspi carulescens (Ganges ecotype)

40 complexation by strong ligands (e.g. phytochelatins) Übersicht Schwermetall-Toxizität und -Resistenz metal-induced damage to photosynthesis (e.g. Mg-substitution) complexation by strong ligands (e.g. phytochelatins) oxidative stress and other damage cytoplasm cell walls vacuole epidermis cells (not present e.g. in Elodea) vacuole photosynthetic cells (e.g. mesophyll cells, stomatal guard cells) cytoplasm cell walls stem epidermis regulation by boundary cells? leaf phloem stem phloem leaf xylem stem xylem ± root to shoot translocation in the case of submerged aquatic plants cell walls vacuole root root uptake exclusion mechanisms damage to roots Heavy metals in soil or water Küpper H, Kroneck PMH (2004) MIBS 44 (Sigel et al., eds), chapter 5

41 Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung: Phytoremediation Abraumhalde: zu giftig für normale Pflanzen Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach deisem Prozess ist das Metall durch den hohen Bioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt. Die gleiche Halde nach der grünen Bodenentgiftung: normales Pflanzenwachstum ist wieder möglich.

42 Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren

43 Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren

44 Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung: Phytomining Vegetation auf natürlich nickelreichem Boden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz. viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig). Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 20% Nickel, so dass sie als Bio-Erz genutzt werden kann. So eine Pflanzenmine kann, Feldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren. Beim derzeitigen Nickelpreis von gut 11 pro Kilo Rohnickel sind das etwa 2000.ha -1.