Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II)

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1 Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II) Sh Schwermetall-Hyperakkumulation l im Wilden Westen modified from:

2 Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen!

3 Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität Ein scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensis darin war jedoch an Zn-Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295),

4 Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II) Wo? Wodurch? Für Wen? Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden (Cu: z.b. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.b. in Afrika, Australien, Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch genug für Toxizität gegen die meisten Organismen. Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.b. Sargasso-See): See): Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche Cyanobakterien. Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.b. CuSO 4, z.b. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen, v.a. Wasserpflanzen in angrenzenden Gewässern Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch sein. Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien Der Rhein enthielt Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien. Der Rhein enthielt in den 70er Jahren bis zu 0.5 µm Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie Stratiotes, Ceratophyllum oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.

5 Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizität und Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern --> Hemmung der Wurzelfunktion --> direkte Hemmung der Photosynthese --> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert. --> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen --> Hemmung der Atmung und anderer weniger g g g sensitiver Prozesse

6 1. Hemmung der Wurzelfunktion Warum Wurzeln? Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das mit den Schwermetallen in Berührung kommt. Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.b. Cu +, werden auch die höchsten Konzentrationen in der Wurzel erreicht Mechanismen Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen, da z.t. von denselben Proteinen transportiert: umstritten da widersprüchliche Daten Vermutlich Hemmung von Transportproteinen Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt) Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab

7 1. Hemmung der Wurzelfunktion: Resistenzmechanismen Strategien Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung Akti (ATP bhä i ) A hl d h Effl P W d fü C i Sil Aktive (ATP-abhängige) Ausschleusung durch Efflux-Pumpen: Wurde für Cu in Silene vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.

8 2. Direkte Hemmung der Photosynthese 2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischen Lichtreaktionen heavy metals P700* A0 A 1 4 h ν Antenna Chl-protein complexes, main protein: LHCII Chl Chl excitation Chl energy transfer P680* Pheo QA QB PQ Chl FeS/ Chl electron Rieske E transport PC P680 4 WSC e- 2 H 2 O O H + P700

9 2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischen Lichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig g Schatten-Reaktion Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil der Antennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg- Substitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.b. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben grün. Sonnen-Reaktion In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg- Substitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophylle bleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparates aus. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58,

10 Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese? Instabiler S1-Zustand Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chlbasierten System als schwarze Löcher für Anregungsenergie g g nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls müssen in Schwermetallchlorophyll umgewandelt werden, um komplette Hemmung der Photosynthese zu erreichen. Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung g durchzuführen. Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.b. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl)

11 Hemmung des PSIIRC Diskutierte Mechanismen Hemmung des wasserspaltenden Komplexes Hemmung der primären Ladungstrennung: - durch Bindung ans D1-Protein - durch Insertion ins Pheophytin Hemmung des Elektronentransports - durch Bindung an Q a -Domäne des D1-Proteins - durch Bindung an nicht-häm-fe- Dömäne des D1-Proteins

12 2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese (Calvin-Cyclus) Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik Mechanismus und Bedeutung unklar

13 3. Oxidativer Stress Bedeutung Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall-Konzentrationen zeigen oft keinen oxidativen Stress Mechanismen Direkt: Katalysiert von redox-aktiven Metallionen (Fe 2+, Cu + ) werden aus Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale: populärer aber in vivo höchstwahrscheinlich irrelevanter Mechanismus. Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten Metallionen wie Zn 2+ und Cd 2+ oxidativer Stress auftreten. Vermutlich der Normalfall. Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener Mechanismus.

14 3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften (Superoxid-Dismutase+Katalase. Problem: Hemmung der Zn-Aufnahme ( SOD) bei Cd-Stress. Synthese von nicht-enzym-antioxidantien, z.b. Ascorbat und Glutathion Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu machen: - Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen - Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid- Kopf - Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der Membran

15 Relevanz 4. Genotoxizität Hängt STARK vom Metall ab: NICHT relevant für Kupfer und Zink- Toxizität, weil andere Mechanismen (v.a. Photosynthese-Hemmung) VIEL effizienter sind SEHR relevant für Arsen, da effizient - andere Mechanismen hier wenig erforscht. Relevant für Cadmium, da ähnlich effizient wie Photosynthese-Inhibition Nicht sehr effizient für Blei, aber andere Mechanismen der Toxizität sind hier bei Pflanzen noch weniger effizient Pb- Toxizität für Pflanzen ist generell NICHT umweltrelevant! Hängt auch von der Pflanzenart ab! Point muta ations: spo ots per pla ant From: Kovalchuk O, Titov V, Hohn B, Kovalchuk I, 2001, Nature Biotechnol. 19,

16 5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen Schwermetall-Entgiftung lle t mit starken Liganden Phytochelatine Binden mit sehr hoher Affinität Cd 2+, andere Metallionen aber wenig Speziell zur Cd 2+ -Bindung synthetisiert von Phytochelatin-Synthase Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außer Hyperakkumulatoren) und vielen Tieren Phytochelatin-Synthase wird von (z.b. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert Phytochelatine binden Cd 2+ im Cytoplasma, dann Tranport des Komplexes in die Vakuole. In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate

17 5. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 5.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Freie Aminosäuren Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie Aminosäuren (v.a. Histidin+Nicotianamin) eine Rolle bei der Entgiftung von Schwermetallen zu spielen. Metallothionine MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher Affinität Cu 2+ und scheinen an dessen Entgiftung beteiligt zu sein. Aber: Hauptrolle der MTs in Pflanzen vermutllich Metall-Verteilung während des normalen (nicht- gestressten) Stoffwechsels

18 5.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung Mechanismen Generell: aktive Transportprozesse gegen den Konzentrationsgradienten Transportproteine beteiligt. Ausschluss aus der Zellen: - in Algen: bei Braunalgen beobachtet - in Wurzeln: siehe Wurzeln Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...) - sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält - spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkumulatoren Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.b. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.b. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese

19 Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit Schwermetall-Hyperakkumulation --> Biologische Funktion der Hyperakkumulation --> Mechanismen der Hyperakkumulation --> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung

20 Schwermetall-Aufnahme-Charakteristika verschiedener Pflanzentypen

21 Effekte von Ni 2+ auf das Wachstum und Ni 2+ -Konzentrationen im Sproß ight (g) Sh hoot dry we (a) 14 Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii Alyssum lesbiacum Ni concentratio on (µg g -1 ) (b) Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii Alyssum lesbiacum Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Alyssum lesbiacum Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

22 Komplexierung von Cadmium&Zink vs. Kupfer im Cd/Zn-Hyperakkumulator Thlaspi caerulescens (Ganges) hyperaccumulated non-accumulated Hyperakkumulierte Metalle durch SCHWACHE Liganden (Wasser, org. Säuren), nicht-akkumulierte Schwermetalle durch STARKE Liganden (PC, MT, NA) gebunden Cd: Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), Cu: Mijovilovich A, Leitenmaier B, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Götz B, Küpper H (2009) Plant Physiology 151,

23 Kompartimentierung der Metalle in Blättern Zn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen von Thlaspi und Alyssum -Arten mm / mm Ca Compartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens 8 young leaves Alyssum bertolonii 0 8 Zn Mg P S Cl K mature leaves mm / mm Ca Zn Mg P S Cl K upper epidermis upper mesophyll lower mesophyll lower epidermis Concentrations of elements Zn K α line scan and dot map Ni K α line scan and dot map in leaf tissues of a T. caerulescens leaf of a A. bertolonii leaf Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

24 Cd-transport in Protoplasten isoliert aus dem Cd/Zn Hyperakkumulator Thlaspi caerulescens In fast allen gemessenen Zellen wurde zugegebenes Cd während der ersten min im Cytoplasma angereichert Erst nach längerer Zeit (>1h) reicherte sich das Cd vorwiegend in der Vakuole an. Der Transport in die Vakuole ist der geschwindigkeitslimitierende Schritt der Metallaufnahme! Leitenmaier B, Küpper H (2010) Plant Cell & Environment DOI: /j x

25 Cd-Stress im Zn-/Cd-hyperakkumulator T. caerulescens: Verteilung von Photosystem II-Aktivität Control T. caerulescens 30 C Control D 20 B A T. fendleri Cellular F v /F m distribution in a control plant Distribution of F v /F m in a Cdstressed plant Stre essed Acclimatin ng Acc climated E F F v / F m Stre essed 10 0 Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175,

26 Regulation der ZNT1-Transkription analysiert durch quantitative mrna in situ-hybridisierung y g (QISH) in einer nicht-hyperakkumulierenden und einer hyperakkumulierenden Art µm Zn 2+ Thlaspi caerulescens 10 µm Zn 2+ Thlaspi arvense 1 µm Zn 2+ Thlaspi arvense mrna) / c( (18s rrna) c(znt spongy mesophyll phloem bundle dle sheath mesophyll rage cells palisade me epiderm rmal metal stora epid idermal subsidia diary cells epidermal gua uard cells Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1),

27 Quantitative cellular pattern of ZNT5 transcript abundance in young leaves of Thlaspi carulescens (Ganges ecotype) Das Expressionsmuster in der Epidermis deutet auf eine zentrale Rolle von ZNT5 bei der Hyperakkumulation von Zn hin. Küpper H, Kochian LV (2010) New Phytologist 185,

28 Scheme from: Solioz M, Vulpe C (1996) TIBS21, Reinigung und Characterisierung einer Zn/Cd transportierenden P 1B-typ ATPase aus natürlicher Überexpression in Thlaspi caerulescens T [ C] Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M, Welte W, Kroneck PMH, Lutz G, Papoyan A, Kochian LV, Küpper H (2007) BBRC 364, 51- Leitenmaier B, Witt A, Witzke A, Stemke A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Küpper H (2010) submitted to Biochemistry

29 Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung: Phytoremediation Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach diesem Prozess ist das Metall durch den hohen Bioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt. Pflanzenart Max. Cd Biomasse Cd-Entfernung mg/kg DW t DM/ha g/(ha*jahr) Arabidopsis halleri Thlaspi caerulescens (Prayon) Thlaspi caerulescens (S. France) Dichapetalum gelonoides Athyrium yokosense Arenaria patula Sedum alfredii Weide/Pappel Upland Rice Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA), präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005

30 Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung: Phytomining Vegetation auf natürlich nickelreichem Boden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz. viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig). Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 50% Nickel, so dass sie als Bio-Erz genutzt werden kann. Phytomining pictures from R. Chaney So eine Pflanzenmine kann, Feldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren. Beim derzeitigen ( ) 12 09) Nickelpreis von ca 11 pro Kilo Rohnickel sind das fast 2000.ha -1.

31 Alle Folien meiner Vorlesungen, ebenso wie Informationen über die Arbeitsgruppe, im Internet unter /FuF/Bio/kuepper/Homepage /AG G_ Kuepper _education.html (auch zu finden über Homepage der Biologie Arbeitsgruppen Küpper) weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage Interesse an Biochemie&Biophysik der Pflanzen im allgemeinen, und/oder Metallstoffwechsel bekommen? Bei uns gibt s 2 Bachelorplätze (zeitlich flexibel) und 5 Plätze im Vertiefungskurs Biochemie i & Biophysik ik der Pflanzen (1. Hälfte Sommersemester)