Ausgewählte biophysikalische Methoden zur Analyse von Pflanzen in vivo und in situ (II): UV/VIS-Spektroskopie - von der Pigmentanalyse bis zur

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1 Ausgewählte biophysikalische Methoden zur Analyse von Pflanzen in vivo und in situ (II): UV/VIS-Spektroskopie - von der Pigmentanalyse bis zur Quantifizierung von mrna

2 Voraussetzung der Messung von UV/VIS-Spektren: Lichtabsorption, Beispiel Chlorophyll S2 intersystem crossing S1 h ν h ν intersystem T1 crossing EET absorption phosphoresscence intersystem crossing absorption intersystem crossing fluorescence S0 Chlorophyll

3 Abstimmung der Absorptionsbanden

4 Messung von in vivo / in situ-uv/vis-spektren (nicht bildgebend) Warum in vivo / in situ? --> Direkte Korrelation mit physiologischen Parametern möglich --> keine Extraktionsartefakte --> Messung an einzelnen Zellen möglich --> Hohe Zeitauflösung bei Messung von Kinetiken Nachteile gegenüber der Messung von Extrakten: --> viele überlappende Banden desselben Pigments durch Proteinbindung --> Banden sehr breit --> Extinktionskoeffizienten in vivo meist unbekannt --> meist keine absolute Quantifizierung

5 Methoden der Analyse von in vivo-spektren: Dekonvolution

6 Beispiel zur Anwendung von in vivo-fluoreszenzspektren: Regulation der Photosynthese für die Stickstoff-Fixierung in Trichodesmium

7 Beispiel zur Anwendung von in vivo-absorptionsspektren: Bildung von Cu-Chl bei Kupferstress (und Pheo bei Ansäuerung) Elodea canadensis Ectocarpus siliculosus Antithamnion plumula Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, Küpper H, Šetlík I, Spiller M, Küpper FC, Prášil O (2002) Journal of Phycology 38(3),

8 Bildgebende in vivo-vis-spektroskopie: moderne Methoden der Fluoreszenzmikroskopie Wichtige Voraussetzungen und Fakten --> Apertur vs. Lichtsammlung --> richtige Messung --> Überlapp und Trennung von Signalen Methoden --> Trennung von Chromophoren über linear unmixing --> FRET --> FRAP --> FCS --> QISH --> GFP etc.

9 Entscheidend bei der Nutzung eines Mikroskops als für physiologische Messungen an lebenden Zellen: Präparat unter physiologischen Bedingungen halten! medium inlet glass window (0.17 mm thick); sample is placed between this window and the layer of cellophan medium outlet o-rings (silicon rubber) layer of cellophan

10 Entscheidend bei der Nutzung eines Mikroskops als für physiologische Messungen an lebenden Zellen: NICHT ZUVIEL LICHT! --> Lichtintensität bestimmern! Lens Light field diameter Measuring irradiance Actinic irradiance Saturating irradiance [mm] [µmol m -2 s -1 ][µmol m -2 s -1 ][µmol m -2 s -1 ] 6.3 / / / / / /

11 Apertur numerische Apertur NA = I * sinus q I = Brechungsindex des Mediums q = halber Öffnungswinkel des Objektivs

12 Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops als Spektrometer: Apertur bestimmt Effizienz der Lichtsammlung

13 Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops als Spektrometer: Korrekte Einstellung von Hintergrund und Verstärkung

14 Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops als Spektrometer: korrekte Eichung / Bestimmung der Linearität 100 Model: y = ax + b Levenberg-Marquardt, statistical weighting χ 2 = Pixel grey value 10 1 a = ± b = ± Irradiance [%]

15 Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops als Spektrometer: Überlapp von Absorptions-/Emissions-Banden

16 Preliminary tests with GFP in young leaves of Arabidopsis thaliana 40 µm Epidermis Mesophyll Fluorescence observed through GFP filterset NON-transformed plant... All the signal was AUTOFLUORESCENCE

17 Nutzung überlappender Abs/Em-Banden für FluorescenceResonanceEnergyTransfer (FRET)

18 Voraussetzungen für FluorescenceResonanceEnergyTransfer (FRET)

19 Bildgebendes holeburning : FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching (FRAP)

20 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

21 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) II

22 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) III --> info about molecular concentration, brightness, diffusion, and chemical kinetics

23 Overview of the hybridisation method cut out max. 2x5 mm vacuum infiltrate with alkaline fixation solution extract pigments and dehydrate extract hydrophobic compounds rehydrate digest proteins postfixate quantify record images in CLSM extract and quench background hybridise with fluorescent oligonucleotides

24 ZNT1 in young leaves of Thlaspi caerulescens Prayon: comparison of different probes full-length antisense RNA probe fragmented (200 b) antisense RNA probe 34 b synthetic oligonucleotide overlays of green autofluorescence and red fluorescence of ZNT1-probes

25 Characteristics of the method

26 Quantitative in situ hybridisation: Characteristics of the method: linearity of the detection

27 Quantitative in situ hybridisation effects of tissue optics

28 Regulation of ZNT1 transcription in young leaves of Thlaspi carulescens (Ganges ecotype)

29 Regulation of ZNT1 transcription in young leaves of Thlaspi carulescens (Ganges ecotype)

30 Qualitative Beobachtung der Transkription&Translation in vivo über fluoreszierende Proteine Construct vectors for plant transformation promoter EYFP transform Agrobacterium with the constructs transfrom plants by agrobacterium infection (floral dip with or without vacuum infiltration) germinate seeds of transformed plants on selective medium (e.g. agar containing Kanamycin) select healthy (resistant) seedlings select for YFP expression quantify record images in CLSM prepare tissue pieces or whole mounts

31 35S promoter in young leaves of Arabidopsis thaliana: epidermis Trichome base, epidermal cells and stoma Trichome Overlays of green autofluorescence, red (chlorophyll) autofluorescence and yellow YFP fluorescence

32 35S promoter in young leaves of Arabidopsis thaliana: mesophyll Clone with high YFP expression Clone with medium YFP expression Overlays of green autofluorescence, red (chlorophyll) autofluorescence and yellow YFP fluorescence

33 Comparison of our in situ hybridisation method with promoter-yfp/dsred constructs In situ hybridisation - Easy cellular quantification because whole cells are labelled - No macroscopic (whole plant) quantification possible because of diffusion limits - Low background fluorescence because chlorophyll, carotenoids, flavonoids and many further fluorescent compounds are extracted - No direct comparison of gene expression with physiology because samples are fixed (dead) - Very fast: Ordering the fluorescently labelled oligonucleotides takes 1-2 weeks, the hybridisation procedure itself takes 3 days - All plants can be analysed ( Thlaspi work) Fluorescent proteins - Quantification on a cellular level difficult because only the narrow ring of cytoplasm is labelled - Macroscopic (whole plant) observation and quantification easily possible with fluorescence measuring camera (so far only tested with GFP) - High background fluorescence because all autofluorescent compounds are present in the samples - Direct comparison of gene expression with physiological parameters (photosynthesis, electrophysiology) possible because samples are alive - Very time-consuming because of the cloning, transformation and plant growth/selection steps; - The plant has to be transformed ( Arabidopsis) - The gene sequence has to be known - The promoter has to be cloned