Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II)

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1 Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II) Schwermetall-Hyperakkumulation im Wilden Westen modified from:

2 Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen! hemmend Effekt förderlich nur Schadstoff (z.b. Quecksilber) Mikronährstoff (z.b. Kupfer) Konzentration

3 Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität Ein scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensis darin war jedoch an Zn-Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295),

4 Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II) Wo? Wodurch? Für Wen? Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden (Cu: z.b. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.b. in Afrika, Australien, Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch genug für Toxizität gegen die meisten Organismen. Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.b. Sargasso-See): Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche Cyanobakterien. Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.b. CuSO 4, z.b. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen, v.a. Wasserpflanzen in angrenzenden Gewässern Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch sein. Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien. Der Rhein enthielt in den 70er Jahren bis zu 0.5 µm Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie Stratiotes oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.

5 Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizität und Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern --> Hemmung der Wurzelfunktion --> direkte Hemmung der Photosynthese --> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert. --> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen --> Hemmung der Atmung und anderer weniger sensitiver Prozesse

6 1. Hemmung der Wurzelfunktion Warum Wurzeln? Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das mit den Schwermetallen in Berührung kommt. Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.b. Cu +, werden auch die höchsten Konzentrationen in der Wurzel erreicht Mechanismen Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen, da z.t. von denselben Proteinen transportiert: umstritten da widersprüchliche Daten Vermutlich Hemmung von Transportproteinen dazu diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen und Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt) Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab

7 1. Hemmung der Wurzelfunktion: Resistenzmechanismen Strategien Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung Aktive (ATP-abhängige) Ausschleusung durch Efflux-Pumpen: Wurde für Cu in Silene vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.

8 2. Direkte Hemmung der Photosynthese 2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischen Lichtreaktionen heavy metals P700* Antenna Chl-protein complexes, main protein: LHCII 4 h ν Chl Chl excitation energy transfer Chl P680* P680 Pheo QA Q B PQ electron transport FeS/ Rieske PC P700 A 0 A 1 Chl Chl E 4 WSC e- 2 H 2 O O H +

9 2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischen Lichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig Schatten-Reaktion Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil der Antennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg- Substitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.b. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben grün. Sonnen-Reaktion In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg- Substitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophylle bleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparates aus. Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58,

10 Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese? Instabiler S1-Zustand: Aufgenommene Anregungsenergie wird vor allem thermisch relaxiert, so dass die anderen Prozesse (Fluoreszenz, Energie- und Ladungsübertragung) nicht oder nur mit geringer Effizienz ablaufen Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes: verringert die Überlappung der Absorptions/Emissionsbanden in dem auf Mg-Chl abgestimmten System, wodurch erneut die Effizienz der Energieübertragung sinkt Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chlbasierten System als schwarze Löcher für Anregungsenergie, so dass nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls in Schwermetallchlorophyll umgewandelt werden müssen, um komplette Hemmung der Photosynthese zu erreichen. Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung wie in den Reaktionszentren erforderlich durchzuführen. Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.b. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl), was die Bindung im Protein und damit die ganze Proteinstruktur (zer)stört.

11 Vergleich von Gausaustausch und steady state-fluoreszenz in Elodea gestresst mit 0.2 µm Cu 2+ im Schwachlicht µ y net photosynthetic oxygen release photosynthesis fluorescence fluorescence days of heavy metal stress

12 UV/VIS -Spektroskopie: Sonnen vs. Schattenreaktion Spektren von E. canadensis Extrakten In vivo Spektren von E. canadensis Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58,

13 UV/VIS -Spektroskopie: nicht-chlorophyta Braunalge Ectocarpus siliculosus: Chl a/c-lhc immer der Substitution zugänglich --> immer Schattenreaktion Rotalge Antithamnion plumula: Phycobilis: kein Chl --> immer Sonnenreaktion Küpper H, Šetlík I, Spiller M, Küpper FC, Prášil O (2002) Journal of Phycology 38(3),

14 Hemmung des PSIIRC Diskutierte Mechanismen Hemmung des wasserspaltenden Komplexes Hemmung der primären Ladungstrennung: - durch Bindung ans D1-Protein - durch Insertion ins Pheophytin Hemmung des Elektronentransports - durch Bindung an Q a -Domäne des D1-Proteins - durch Bindung an nicht-häm-fe- Dömäne des D1-Proteins

15 2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese (Calvin-Cyclus) Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik Mechanismus und Bedeutung unklar

16 3. Oxidativer Stress Bedeutung Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall-Konzentrationen zeigen oft keinen oxidativen Stress Mechanismen Direkt: Katalysiert von redox-aktiven Metallionen (Fe 2+, Cu + ) werden aus Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale: Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten Metallionen wie Zn 2+ und Cd 2+ oxidativer Stress auftreten. Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener Mechanismus.

17 Oxidativer Stress durch Chlorophylle: Transfer von Anregungsenergie auf Singulett-Sauerstoff S2 intersystem crossing S1 h ν h ν S0 intersystem T1 crossing EET photochemistry absorption phosphorescence intersystem crossing absorption intersystem crossing fluorescence chlorophyll S1 phosphorescence intersystem crossing T1 oxygen

18 NIR-Lumineszenz-Studie: Sind Schwermetallchlorophylle am schwermetallinduzierte oxidativen Stress beteiligt? lifetime of Chl triplet excited state / % of Mg-Chl a efficiency of singlet oxygen production / % of Mg-Chl a Chl a derivatives Chl b derivatives lifetime of singlet oxygen / % of Mg-Chl a Chl a derivatives Chl b derivatives Mg 2+ H + (=pheophytin) Cu 2+ Zn 2+ Mg 2+ H + (=pheophytin) Cu 2+ Zn 2+ --> Schwermetall-Chlorophylle haben niedrigere oder gleiche Effizienz der Bildung von Singulett-O 2 ( 1 O 2 ) wie Mg- Chl, aber sie quenchen dieses weniger. Pheophytin erzeugt mehr und quencht weniger 1 O 2 als Mg-Chl. Küpper H, Dedic R, Svoboda A, Hála J, Kroneck PMH (2002) Biochim Biophys Act 1572,

19 3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften, d.h. Superoxid-Dismutase und Katalase. Nicht immer möglich, da z.b. Cd-Stress die Zn- Aufnahme und damit die Expression von Zn-abhängigen Enzymen wie der SOD hemmt. Synthese von nicht-enzym-antioxidantien, z.b. Ascorbat und Glutathion Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu machen: - Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen - Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid- Kopf - Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der Membran

20 4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Phytochelatine Binden mit sehr hoher Affinität Cd 2+, andere Metallionen aber wenig (höchsten noch für Hg und As relevant). Speziell zur Cd 2+ -Bindung synthetisiert von γ-glutamylcystein-dipeptidyl- Transpeptidase = Phytochelatin-Synthase Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außer Hyperakkus...) und vielen Tieren Phytochelatin-Synthase wird von (z.b. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert Phytochelatine binden das Cd 2+ im Cytoplasma, woraufhin der gesamte Komplex aktiv in die Vakuole befördert wird. In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate

21 4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Glutathion Auch Glutathion selbst, der Baustein der Phytochelatine, könnte Schwermetalle binden und somit entgiften. Ob dies in vivo aber von Bedeutung ist, scheint eher fraglich. Metallothionine MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher Affinität Cu 2+ und scheinen an dessen Entgiftung beteiligt zu sein. Die Hauptrolle der MTs in Pflanzen scheint aber nicht Schwermetallresistenz, sondern Metall- Verteilung während des normalen (nichtgestressten) Stoffwechsels zu sein.

22 4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen 4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden Freie Aminosäuren Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie Aminosäuren wie Histidin, Nicotianamin und Prolin eine Rolle bei der Entgiftung von Schwermetallen zu spielen. Die Bedeutung von Prolin als Schwermetall-Ligand ist aber umstritten; einige Autoren stellen es eher in einen Zusammenhang mit Trockenresistenz Andere Liganden Diverse Proteine wurden als Schwermetall-Entgiftungs-Liganden vorgeschlagen, z.b. ATFP (A. thaliana farnesylated protein) Anthocyane: Scheinen in Brassicaceen Molybdän zu binden (zur Entgiftung? zur Speicherung?) Zellwand Manche Algen scheiden unter Cu-Stress noch unidentifizierte Thiol-Liganden aus

23 4.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung Mechanismen Generell sind hier aktive Transportprozesse gegen den Konzentrationsgradienten, also Transportproteine beteiligt. - CDF s - Nramp s - CAX s Ausschluss aus der Zellen: - in Algen: bei Braunalgen beobachtet - in Wurzeln: siehe Wurzeln Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...) - Sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält - Spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkus Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.b. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese

24 4.3. Weitere Resistenz-Mechanismen Reduktion durch Reduktasen, z.b. Hg 2+ --> Hg 0, Cu 2+ --> Cu + Ausfällung unlöslicher Sulfide außerhalb der Zelle (auf der Zellwand) Methylierung, z.b. von Arsen

25 Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit Schwermetall-Hyperakkumulation --> Biologische Funktion der Hyperakkumulation --> Mechanismen der Hyperakkumulation --> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung

26 Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren Größter Bioakkumulationskoeffizient bei kleinen Schwermetall-Konzentrationen (--> Tafelbild) Aktiv, durch natürliche Überexpression von Metall-Transportproteinen Viele Transporter überexprimiert, aber bisher unklar, was primäre und was dadurch verursachte sekundäre Überexpression ist Regulation der Überexpression unbekannt

27 Effekte von Ni 2+ auf das Wachstum und Ni 2+ -Konzentrationen im Sproß Shoot dry weight (g) (a) 14 Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii 12 Alyssum lesbiacum Ni concentration (µg g -1 ) (b) Thlaspi goesingense Alyssum bertolonii Alyssum lesbiacum Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Ni added to the substrate (mg kg -1 ) Alyssum lesbiacum Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

28 mm / mm Ca Kompartimentierung der Metalle in Blättern Zn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen von Thlaspi und Alyssum -Arten Compartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens Alyssum bertolonii 8 young leaves Zn Mg P S Cl K mature leaves mm / mm Ca Zn Mg P S Cl K upper epidermis upper mesophyll lower mesophyll lower epidermis Concentrations of elements in leaf tissues Zn K α line scan and dot map of a T. caerulescens leaf Ni K α line scan and dot map of a A. bertolonii leaf Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

29 Kompartimentierung von Zn und Ni in Blättern Funktionelle Differenzierung von Epidermis-Zellen in Thlaspi Linear Regression: Y = A + B * X 8 6 Parameter Value Error A B R SD N P mm Zn / mm Ca data points regression line confidence limits cell width Upper leaf surface of T. goesingense Correlation between cell size and zinc concentration Dot map of the Ni K alpha line Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365),

30 Kompartimentierung von Metallen in Blättern Zn/Cd-Akkumulation in Blatthaaren von Arabidopsis halleri Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84

31 Kompartimentierung von Metallen in Blättern Korrelation zwischen Metallkonzentrationen im Mesophyll von Arabidospis halleri Cd / mm 6 4 Mg / mm data points regression line (R = 0.94; P < ) 95% confidence limits Zn / mm 5 0 data points regression line (R = 0.79; P < ) 95% confidence limits Cd / mm Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84

32 Komplexierung von Cadmium hyperakkumuliert von Thlaspi caerulescens (Ganges-Typ) Analysiert mit Röntgenabsorptions-Spektroscopie gefrorener Gewebe Percent of all ligands binding to Cd young mature senescent dead 0 stems petioles leaves Developmental stage of leaves Tissue sulphur ligands N/O ligands Percent of all ligands binding to Cd Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2),

33 1. Heterogenität als Resistenzmechanismus? Normal: Sequestration in epidermal storage cells Stressed: additional sequestration in selected mesophyll cells Acclimated: Enhanced sequestration in epidermal storage cells v v v Küpper H, Šetlík I (2004) in preparation

34 Übersicht Schwermetall-Toxizität und -Resistenz complexation by strong ligands (e.g. phytochelatins) metal-induced damage to photosynthesis (e.g. Mg-substitution) complexation by strong ligands (e.g. phytochelatins) oxidative stress and other damage cytoplasm cell walls vacuole epidermis cells (not present e.g. in Elodea) vacuole photosynthetic cells (e.g. mesophyll cells, stomatal guard cells) cytoplasm cell walls stem epidermis regulation by boundary cells? leaf phloem stem phloem leaf xylem stem xylem ± root to shoot translocation in the case of submerged aquatic plants cell walls vacuole root root uptake exclusion mechanisms damage to roots Heavy metals in soil or water Küpper H, Kroneck PMH (2004) MIBS 44 (Sigel et al., eds), chapter 5

35 Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung: Phytoremediation Abraumhalde: zu giftig für normale Pflanzen Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach deisem Prozess ist das Metall durch den hohen Bioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt. Die gleiche Halde nach der grünen Bodenentgiftung: normales Pflanzenwachstum ist wieder möglich.

36 Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung: Phytomining Vegetation auf natürlich nickelreichem Boden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz. viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig). Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 20% Nickel, so dass sie als Bio-Erz genutzt werden kann. So eine Pflanzenmine kann, Feldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren. Beim derzeitigen Nickelpreis von gut 11 pro Kilo Rohnickel sind das etwa 2000.ha -1.

37 Alle Folien meiner Vorlesungen im Internet unter /FuF/Bio/kuepper/Homepage /AG_Kuepper_education.html weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage