Genetische Information WS2018/19

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1 Genetische Information WS2018/19 Lysosomale Speicherkrankheiten Funktion von Lysosomen - Sorting lysosomaler Hydrolasen - Morbus Gaucher und I-cell disease - Theraspiestrategien für lysosomale Speicherkrankheiten

2 Was passiert in Lysosomen gesunder Zellen? CYTOSOL ph ~ 7,2 Saure Hydrolasen Nukleasen Proteasen Lipasen Phosphatasen Sulfatasen Phospholipasen Lysozym ph ~ 5,0 Lysosomen = Müllverwertungsanlage der Zellen Kontrollierter intrazellulärer Abbau von Makromolekülen zur anabolen Wiederverwendung besitzen ~ 40 hydrolytische Enzyme (saure Hydrolasen) Cytosol der Zelle doppelt geschützt vor lysosomalen Enzymen: 1. Lysosomale Membran 2. ph im Lysosom = 5 Lysosomen verfügen über eine einzigartige Enzymausstattung!

3 Lysosomen verfügen über eine einzigartige Membran Aminosäure-Transporter Zucker-Transporter Extrem glykosylierte Proteine Nukleotid-Transporter ph ~ 5,0 H + H + Pumpe ATP ADP + P

4 Was wird alles in Lysosomen abgebaut: Heterophagie versus Autophagie Endozytiertes Material Phagozytiertes Material Heterophagie Gealterte, zelleigene Komponenten Autophagie Viele unterschiedliche Wege liefern Material zum Abbau in Lysosomen.

5 Kurzer Exkurs in die Zellbiologie: Ein Autophagiemodell Membranherkunft?? Alternde Organellen werden selektiv für den Abbau in Autophagosomen eingefangen - Entsorgung alter Bestandteile - Restrukturierung differenzierender Zellen (zur Vernichtung nicht mehr benötigter Teile) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

6 Wie kommen lysosomale Hydrolasen in die Lysosomen? Rauhes ER Golgi-Apparat Transgolgi-Netzwerk Lysosom

7 Rauhes ER Golgi Lysosom: Woher weiß Trans-Golgi welche Proteine wohin geschickt werden sollen? Kernmembran Kernpore rauhes ER Ribosom Golgi- Apparat Golgizisternen glattes ER Transport- Vesikel mit Proteinen cis-golgi Modfiziert nach trans-golgi Lysosomen Plasmamembran

8 Lysosomale Hydrolasen tragen einzigartige Erkennungssignale Für diese Erkennungssignale gibt es Rezeptoren im Trans-Golgi: M6P-Rezeptoren Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

9 M6P Rezeptoren erkennen M6P-markierte lysosomale Hydrolasen und bringen sie zu Lysosomen. Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

10 Golgi-Enzyme müssen lysosomale Hydrolasen an irgendetwas erkennen M6P darf nur an die richtigen Gykoproteine angefügt werden! Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

11 Was passiert wenn GlcNAc Phosphotransferase defekt ist? Inclusion cell disease: alle lysosomalen Hydrolasen werden in den Extrazellulärraum ausgeschleust! Wie therapiert man diese Erkrankung?

12 Therapierbare lysosomale Speicherkrankheiten zb Erkrankungen, bei denen der Abbau von Membranlipiden gestört ist, zb von Sphingolipiden Sphingolipide: Fettsäure + Sphingosin R definiert die Untergruppe

13 Phospholipide versus Sphingolipide Phosphatidylethanolamin Phosphatidylserin Phosphatidylcholin Sphingomyelin Figure 10-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

14 Sphingolipide R definiert die Untergruppe Sphingolipide Ceramide R=H Sphingomyeline R= Phosphocholin R= Phosphoethanolamin Glykolipide/Glykosphingolipide R= 1-40 Zucker Galakto- Cerebrosid R= Galaktose Cerebroside Gluko- Cerebroside R= Glucose Ganglioside R= mind. 3 Zucker davon mindestens einer Sialinsäure Sulfatide

15 Sphingolipide R definiert die Untergruppe Sphingolipide Ceramide R=H Sphingomyeline R= Phosphocholin R= Phosphoethanolamin Glykolipide/Glykosphingolipide R= 1-40 Zucker Galakto- Cerebrosid R= Galaktose Cerebroside Gluko- Cerebroside R= Glucose Ganglioside R= mind. 3 Zucker davon mindestens einer Sialinsäure Sulfatide Morbus Krabbe Morbus Gaucher

16 Übersicht lysosomale Speicherkrankheiten (Sphingolipidosen) G M1 GM1 gangliosidosis Cer b-galaktosidase G A1 Cer G M2 Cer G b4 Glc, glucose Gal, galactose GalNAc, N-Acetylgalactosamin SA, sialic acid (neuraminic acid) Cer b-galaktosidase Tay Sachs b-hexosaminidase Sandhoff a-galactosidase G A2 Cer G M3 Cer G b3 Cer b-hexosaminidase Sandhoff Neuraminidase Fabry a-galactosidase lactosylceramid Cer b-galaktosidase galactosylceramide Cer Glucosylceramide Cer sphingomyelin b-galaktosidase Glucocerebrosidase sphingomyelinase Krabbe Gaucher Niemann-Pick ceramide (Cer)

17 Lysosom bei lysosomaler Speicherkrankheit Glykolipid Lysosom gesund Ceramid Zucker Lysosom bei lysosomaler Speicherkrankheit

18 Lysosom bei Morbus Gaucher Ceramid Ceramid Ceramid Glc Glc Glc Gaucher-Zelle Morbus Gaucher Glucocerebrosidase Ceramid Glc

19 Morbus Gaucher Genetisch bedingte Erkrankung (autosomal rezessiv) Häufigkeit: weltweit 1: (2000 Patienten in Deutschland) ABER bei Ashkenazi-Juden 1:1000! Mangel, Funktionsdefekt an Glucocerebrosidase Akkumulation von Glucocerebrosid Besonders betroffen sind die Fresszellen des Körpers (Monozyten, Makrophagen) Diese werden durch die Glykolipidspeicherung enorm aufgebläht Die aufgeblähten Gaucherzellen verdrängen normale Zellen, quetschen Blutgefässe ab, was viele Symptome der Krankheit erklärt

20 Morbus Gaucher In der Milz gespeicherte Gaucherzellen führen zur Milzvergrösserung und Überaktivität, das wiederum führt zu verstärktem Abbau von Erythrozyten Anämie Milz Thrombozyten Thrombozytopenie, Blutgerinnungsneigung sinkt Leukozyten Leukopenie, Immunschwäche Es werden in der vergrösserten Milz mehr Blutzellen abgebaut als im Knochenmark gebildet werden können. Zum ersten Mal wurden Gaucherzellen in der vergrösserten Milz einer 32-jährigen Frau gesehen (1882, Philippe Gauchet)

21 Morbus Gauchet: Geschichte 1882: Philippe Gaucher sieht vergrösserte Splenozyten bei einer 32-jährigen Frau mit Splenomegalie 1934: Identifizierung von Glukosylceramid als gespeichertem Material 1966: Brady et al. (JCI, 1966) entdecken, dass die Ansammlung von Glukosylceramid in Milzzellen auf einen Enzymdefekt der GC zurückzuführen ist 2019: > 200 Mutationen der GC bekannt, die mit Morbus Gaucher assoziiert sind.

22 Therapie Strategien ERT (= enzyme replacement therapy) Substratreduktionstherapie Chemical chaperones Enzymverstärkungstherapie

23 Christian de Duve, Nobelpreis fuer Physiologie oder Medizin 1974 für seine Entdeckungen zur strukturellen und funktionellen Organisation der Zelle DIE WELT, Okt 2006 EVOLUTION Der Ursprung des Lebens Gottes Werk oder Wirken der Natur Entdecker der Lysosomen und der Peroxisomen Zitat: Any substance that is taken up intracellularly by an endocytic process is likely to end up within lysosomes. This obviously opens up many possibilities for interaction, including enzyme replacement therapy.

24 ERT Initial wurde GC aufgereinigt aus humaner Plazenta (Brady et al., N Engl. J. Med. 1974; Beutler et al., PNAS 1977) Resultate waren wenig beeindruckend: GC gelangte nicht in die Zielzellen 1978: Entdeckung eines Mannose-spezifischen Rezeptors auf Makrophagen (Achord et al., Cell, 1978; Sly et al.,prog. Clin. Biol. Res., 1978) glycoprotein recognition system on reticuloendothelial cells

25 Herstellung Mannose-terminierter Glucocerebrosidase Neuraminidase b-galaktosidase Asparagin N-Acetylglucosamin Fucose Mannose Galaktose Sialinsäure b-n-acetylglucosaminidase Quelle: Dingermann, Hänsel, Zündorf, Pharmazeutische Biologie, Springer Verlag

26 ERT 1990: partiell deglykosylierte, Mannose-terminierte, aus Plazenta aufgereinigte GC wurde von Makrophagen erkannt und aufgenommen (Barton et al. PNAS 1990) deutliche Besserung des Krankheitsbildes 1991: erste klinische Studie mit kommerziell produzierter, Mannoseterminierter GC wurde an 12 Patienten durchgeführt (2 x pro Woche i.v. über 9-12 Monate) großer Erfolg (Barton et al., N Engl J Med 1991) 1985: Klonierung der GC 1995: gentechnisch hergestellte GC erzielt vergleichbare Effekte wie die Mannose-terminierte GC aus humaner Plazenta 1997: Imiglucerase (Cerezyme ) 2010: Velaglucerase (VPRIV ) 2012: Taliglucerase (Elelyso )

27 Heute wird Glucocerebrosidase gentechnisch hergestellt Tag 1 1,5 ml Ampulle CHO-Zellen 5 l Fermenter Anzucht- Produktionsbioreaktor 5000 l Erntetank Mehrstufige Reinigung Enzymatische Modifikation Tag 100 Fertiges Medikament

28 Glucocerebrosidase-Präparate Präparat Imiglucerase Cerezyme Velaglucerase Vpriv Taliglucerase Elelyso Aminosäuresequenz Mutein: R495H Wildtyp- Protein Mutein GC Wirt CHO-Zellen HT-1080 Karrotten-Zellen Glykosylierung Sicherheit/ Unbedenklichkeit Bei allen unterschiedlich!! Bisher scheinbar keine Unterschiede Großproduktion: Produktionsengpässe! Großproduktion bei deutlich reduzierten Kosten!

29 Substratreduktionstherapie Miglustat Ceramid + Glucose X Glucosylceramidsynthase Glucosylceramid Eliglustat Ceramid, R= H

30 Cyp2D6 Genotypisierung Miglustat vs. Eliglustat Grapefruit Vielen Therapien geht inzwischen eine Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks voraus. Auch vor dem Beginn einer Behandlung mit Eliglustat muss eine CYP2D6- Genotypisierung erfolgen. Aus PZ, Ausgabe 11, 2015 Eliglustat Cerdelga Primärtherapie Spezifität Nebenwirkungen orale Applikation für langsame, intermediäre und schnelle Metabolisierer

31 Chemical chaperones (Isofagomin): interessantes Konzept, versagte in klinischer Prüfung Glucocerebrosidase (falsch gefaltet) Glucocerebrosidase (richtig gefaltet) Endoplasmatisches Retikulum Golgi Lysosom GC stabilisiert inaktiv GC stabilisiert inaktiv GC aktiv