Importin 13 Eine Rundreise durch die Kernpore Importin 13 a round trip through the nuclear pore

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1 Importin 13 Eine Rundreise durch die Kernpore Importin 13 a round trip through the nuclear pore Bono, Fulvia Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Tübingen Korrespondierender Autor fulvia.bono@tuebingen.mpg.de Zusammenfassung In eukaryotischen Zellen befindet sich die DNA im Zellkern, wo auch die RNA-Transkription erfolgt, während die Protein-Biosynthese im Zytoplasma stattfindet. Zellkern und Zytoplasma sind durch Kernporen miteinander verbunden und der Transport von Makromolekülen wird durch spezielle Transport-Proteine, die Karyopherine, vermittelt. Die meisten Karyopherine befördern ihre Fracht (Kargos) nur in eine Richtung: in den Zellkern (Importine) oder heraus (Exportine). Importin 13 aber ist ein besonderes Karyopherin, das Kargo im- als auch exportieren kann; es agiert als bidirektionaler Transporter. Summary In eukaryotic cells DNA and transcription of RNAs are separated from protein biosynthesis occurring in the cytoplasm. Nucleus and cytoplasm are only connected via the nuclear pores. Transport between the compartments is aided by dedicated shuttling proteins, the karyopherins. Most karyopherins carry cargo only in one direction, either into (importins) or out of the nucleus (exportins), and then return empty handed. Importin 13 is an unusual karyopherin that can both import and export cargo. Our work revealed how Imp13 recognizes its cargoes and functions as a bidirectional transport factor. Nukleozytoplasmatischer Transport: Regeln und Ausnahmen In eukaryotischen Zellen organisieren komplexe Prozesse den Transport von Organellen und Makromolekülen im Zellinneren. Unser Interesse gilt der Erforschung der Mechanismen, die dem Transport von Makromolekülen zu Grunde liegen. Dazu gehört auch die Beförderung von Proteinen zwischen Zellkern und Zytoplasma. Die spezielle makromolekulare Zusammensetzung des Zellkerns wird durch einen aktiven Transport durch die Kernporen aufrechterhalten. Dabei wird die Transportrichtung durch einen molekularen Schalter das Protein Ran definiert. Ran tritt in zwei Zuständen auf, die durch die Bindung von GTP (RanGTP) oder GDP (RanGDP) bestimmt werden. RanGTP ist im Zellkern in hoher Konzentration vertreten, da DNA-gebundene Proteine zum Austausch von GDP durch GTP führen. Umgekehrt ist die RanGTP-Konzentration im Zytoplasma gering, weil GTP direkt beim Austritt aus dem Zellkern zu GDP hydrolysiert wird [1]. Der Transport zwischen Zellkern und Zytoplasma erfolgt überwiegend mit der Ausnahme des mrna-exports 2014 Max-Planck-Gesellschaft 1/5

2 durch Karyopherine [1]. Sie sind in der Lage, gezielt ihre Fracht (Kargos) zu binden und diese durch Spaghetti-ähnliche Hindernisse, die die Innenseite der Kernporen auskleiden, zu befördern. Karyopherine gleiten dabei durch diese Hindernisse wie durch ölige Spaghetti hindurch, während andere Proteine, die eine bestimmte Größe überschreiten, ausgeschlossen werden - sofern sie nicht von einem Karyopherin transportiert werden. Karyopherine haben keine Richtungspräferenz. Ihre Transportrichtung wird vielmehr durch RanGTP vorgegeben. Bei einigen Karyopherinen löst RanGTP die Bindung mit dem Kargo, sobald der Transportkomplex in den Zellkern eindringt. Solche Karyopherine werden als Importine bezeichnet. Andere Karyopherine können nur ihr Kargo binden, wenn sich RanGTP bei der Bindung beteiligt. Diese trimeren Komplexe, bestehend aus Karyopherin, Kargo und RanGTP, können so den Zellkern verlassen. Im Zytoplasma wird das gebundene GTP von Ran zu GDP hydrolisiert, was zeitgleich den Komplex in seine Einzelteile zerfallen lässt. Karyopherine, die auf diese Weise funktionieren, werden als Exportine bezeichnet [1]. Die eindeutige Unterteilung von Karyopherinen in Importine und Exportine wurde allerdings durch die Entdeckung von bidirektionalen Karyopherinen in Frage gestellt. Verwirrend an dieser Entdeckung war die Tatsache, dass RanGTP Importine und Exportine in entgegengesetzter Weise reguliert. Wie ist es möglich, dass ein einzelnes Karyopherin mit RanGTP auf zwei unterschiedliche Arten interagieren kann, indem es nämlich entweder seine Kargo-Bindung stimuliert oder aber seine Kargo-Freisetzung initiiert? Nur die gründliche strukturelle Untersuchung von einem bidirektionalen Karyopherin und dessen Interaktion mit RanGTP sowie Import- und Export-Kargo könnte eine Erklärung für dieses Rätsel liefern. Bidirektionaler Transporter: Importin 13 Wir haben uns intensiv mit einem der wenigen bekannten bidirektionalen Transporter, Importin 13 (Imp13), beschäftigt. Imp13 wurde zuerst in humanen Zellen entdeckt, wo es zwei Proteine eines dynamischen Proteinkomplexes, des Exon-Junction-Complex (EJC) [2], importiert und außerdem ein an der Translation beteiligtes Protein, eif1a, exportiert. Um zu verstehen, wie Imp13 als bidirektionaler Transporter arbeiten kann, haben wir eine umfassende Strukturanalyse von mehreren seiner Komplexe durchgeführt (Abb. 1) Max-Planck-Gesellschaft 2/5

3 --- Trenner --- A bb. 1: Im p13-zyklus. Die schem atische Darstellung zeigt die dynam ischen Interaktionen, die zwischen Im p13 und seinen Partnerproteinen in der Zelle stattfinden. Im p13 nim m t im Zytoplasm a im ungebundenen Zustand eine offene Konform ation an, die die Bindung m it den Im port-kargos erleichtern könnte. In den Im portkom plexen m it Mago-Y14 oder Ubc9 behält Im p13 eine relativ offene Konform ation und wandert durch die Kernpore in den Zellkern. Hier fördern die hohe Konzentration und die hochaffine Bindung von RanGTP an Im p13 die Abgabe der Im port-kargos. Y14-Mago ist dann frei und kann als EJC in ein m RNP (messenger ribonucleoprotein particle) eingebaut werden, während Ubc9 die SUMOylierung vieler Proteine im Zellkern fördert. Im binären Kom plex m it RanGTP nim m t Im p13 eine kom pakte Konform ation an, die das Andocken von eif1a begünstigt. Eine leichte Öffnung der Im p13-konform ation an seinem C-term inalen Ende erm öglicht die Aufnahm e von eif1a Seite an Seite m it RanGTP. Der trim ere Exportkom plex passiert die NPCs und das Export- Kargo wird nach der Hydrolyse von RanGTP im Zytoplasm a freigelassen. Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Bono Wir haben die Strukturen von Imp13 zusammen mit zwei verschiedenen Import-Kargos ermittelt. Zuerst wurde die Struktur des trimeren Komplex aus Imp13 und dem dimeren Kargo Y14-Mago, die Bestandteile des EJC sind, gelöst [3]. Imp13 ist für deren Rückführung in den Zellkern zuständig, um dort den Zusammenbau des EJC auf mrna-molekülen zu ermöglichen [1, 3]. Darüber hinaus haben wir die Struktur von Imp13 mit Ubc9, einem weiteren Import-Kargo, aufgeklärt [4]. Ubc9 ist ein wichtiger Akteur innerhalb eines Signalwegs, der das Protein Sumo an bestimmte Proteine im Zellkern anheftet (Sumoylierungs-Signalweg). Schließlich ermittelten wir die Struktur von Imp13 im Komplex mit einem seiner Export-Kargos und RanGTP [5]. Konformative Transportsignale Die Schnappschüsse dieser Komplexe lieferten wichtige Einblicke in die Arbeitsweise der Kargo-Erkennung. Imp13 erkennt seine Kargos durch einen Mechanismus, der sich von anderen Karyopherinen unterscheidet, die überwiegend lineare Motive als Transportsignale erkennen. Zum Beispiel erkennt Importin-Beta viele seiner Kargos über ein Adaptorprotein, Importin-Alpha, das kurze lineare Motive basischer Aminosäuren als Zellkern- Lokalisierungssignal (nuclear localization signals - NLSs) in seinen Kargos erkennt [1] Max-Planck-Gesellschaft 3/5

4 Dagegen haben unsere Struktur- und Mutationsanalysen ergeben, dass Imp13 seine Kargos durch Interaktion mit etlichen geladenen und polaren Aminosäuren erkennt, die über die Kargo-Oberfläche verteilt sind und so die gesamte Faltung des Proteins feststellen können. Die besondere Erkennung von Kargos durch Imp13 stützt sich also auf eine Kombination aus Form und Ladung, die mit speziellen Kontakten an konservierten Positionen verbunden sind. Das gilt sowohl für die Import-Kargos Ubc9 und Mago-Y14 als auch für das Export- Kargo eif1a [3, 4, 5]. Diese komplexen Lokalisierungssignale unterscheiden sich deutlich von den linearen NLS- und NES- (nukleäre Exportsignale) Sequenzen, die von anderen Karyopherinen wie Importin-Beta, Transportin und Crm1 erkannt werden. Importin 13: Zwei-Wege-Zyklus Wir haben außerdem die Struktur von Imp13 allein [5] und im Komplex mit RanGTP aufgeklärt [3]. Mit Hilfe dieser Strukturen konnte der gesamte Transportzyklus von Imp13, einschließlich eines Import- und eines Exportschrittes rekonstruiert werden. Imp13 bindet zunächst im Zytoplasma ein Import-Kargo mit seiner konkaven Innenseite. Nach dem Transport in den Zellkern trifft der Komplex auf eine hohe Konzentration von RanGTP. Aufgrund der hohen Affinität zu Imp13 bindet RanGTP effizient und verdrängt dabei das Import-Kargo aus dem Komplex. Das Import-Kargo und RanGTP sind aufgrund sterischer Hinderung nicht in der Lage, gleichzeitig zu binden. Der Imp13-RanGTP-Komplex kann dann ein eif1a-molekül aufnehmen, das im Gegensatz zu einem Import-Kargo klein genug ist, an Imp13 zu binden, ohne mit RanGTP zu kollidieren. RanGTP bildet sogar komplementär geladene Interaktionen mit eif1a, die den Komplex stabilisieren. Im Zytoplasma resultiert die Umwandlung von RanGTP in RanGDP in der Dissoziation des Komplexes. Jetzt ist freies Imp13 bereit, ein weiteres Import-Kargo aufzunehmen. Die fünf Schnappschüsse der unterschiedlichen Zustände, die wir erhielten, haben den Transportzyklus vervollständigt und gezeigt, dass Imp13 während des gesamten Zyklus markante Konformationsänderungen durchläuft. Im ungebundenen, zytoplasmatischen Zustand nimmt Imp13 eine offene Konformation ein. Imp13 weist auch bei der Bindung von Mago-Y14 und Ubc9 eine erweiterte Konformation auf. Die Bindung von RanGTP führt zu einer kompakten, ringartigen Konformation von Imp13. Im Komplex mit RanGTP und eif1a bewegen sich lediglich beide Enden von Imp13 leicht auseinander, wodurch das Export-Kargo binden kann und die relativ kompakte Konformation von Imp13 erhalten bleibt. Diese konformative Flexibilität und die Verwendung von unterschiedlichen Oberflächen für die Bindung von verschiedenen Kargos liefern eine Erklärung dafür, wie Imp13 verschiendene Kargos aufnehmen kann und dabei in entgegengesetzter Weise durch RanGTP reguliert wird, wodurch es sowohl beim Im- als auch beim Export fungieren kann. Ausblick Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Imp13 ein vielseitiges Transportprotein ist, das durch komplexe konformative Signale sehr unterschiedliche Kargos erkennt. Die Bindung seiner Kargos ist entweder gleichzeitig oder antagonistisch mit RanGTP, wodurch Imp13 als bidirektionaler Transportfaktor agieren kann. Die Kombination aus konformativer Flexibilität und komplexer Kargo-Erkennung ist ein Mechanismus, der von anderen Karyopherinen ebenfalls genutzt werden könnte. Dies deutet darauf hin, dass das Spektrum an bidirektionalen Karyopherinen vielleicht größer ist als bisher angenommen Max-Planck-Gesellschaft 4/5

5 Literaturhinweise [1] Cook, A.; Bono, F.; Jinek, M.; Conti, E. Structural biology of nucleo-cytoplasmic transport Annual Review of Biochemistry 76, (2007) [2] Bono F.; Gehring N. Assembly, disassembly and recycling: The dynamics of exon junction complexes RNA Biology 8, 1-6 (2011) [3] Bono, F.; Cook, A.; Grünwald, M.; Ebert, J.; Conti, E. Nuclear import mechanism of the EJC components Mago-Y14 revealed by structural studies of Importin 13 Molecular Cell 37, (2010) [4] Grünwald M.; Bono F. Structure of Importin13-Ubc9 complex: nuclear import and release of a key regulator of sumoylation The EMBO Journal 30, (2011) [5] Grünwald, M.; Lazzaretti, D.; Bono, F. Structural basis for the nuclear export activity of Importin13 The EMBO Journal 32, (2013) 2014 Max-Planck-Gesellschaft 5/5